Summary
Le bioessai sur cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du fer (Fe) représente une approche rentable et polyvalente pour évaluer la biodisponibilité du Fe dans les aliments, les produits alimentaires, les suppléments, les repas et même les régimes alimentaires. Rigoureusement validé par les études humaines, il représente l’état de l’art pour les études de biodisponibilité du Fe.
Abstract
La connaissance de la biodisponibilité du Fe est essentielle à l’évaluation de la qualité nutritionnelle du Fe dans les aliments. La mesure in vivo de la biodisponibilité du Fe est limitée par le coût, le débit et les mises en garde inhérentes au marquage isotopique du Fe alimentaire. Il existe donc un besoin critique d’une approche à haut débit et rentable. Le bioessai sur cellules Caco-2 a été développé pour répondre à ce besoin. Le bioessai sur les cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du Fe utilise une digestion gastrique et intestinale simulée couplée à la culture d’une lignée cellulaire épithéliale intestinale humaine connue sous le nom de Caco-2. Dans les cellules Caco-2, l’absorption de Fe stimule la formation intracellulaire de ferritine, une protéine de stockage Fe facilement mesurée par dosage immuno-enzymatique (ELISA). La ferritine se forme proportionnellement à l’absorption de Fe; ainsi, en mesurant la production de ferritine cellulaire Caco-2, on peut évaluer l’absorption intestinale de Fe à partir de digestions alimentaires simulées dans l’entérocyte.
Grâce à cette approche, le modèle reproduit l’étape initiale clé qui détermine la biodisponibilité du Fe alimentaire. Depuis sa création en 1998, cette approche de modèle a été rigoureusement comparée à des facteurs connus pour influencer la biodisponibilité du Fe humain. De plus, il a été appliqué dans des études parallèles, avec trois études d’efficacité humaine évaluant les cultures biofortifiées en Fe. Dans tous les cas, l’essai biologique a correctement prédit les quantités relatives de biodisponibilité du Fe à partir des facteurs, des cultures et de l’alimentation globale. Cet article fournit des méthodes détaillées sur la culture cellulaire Caco-2 couplée au processus de digestion in vitro et ELISA de ferritine cellulaire nécessaire pour effectuer le bioessai biologique sur cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du Fe.
Introduction
Pour bien comprendre le besoin et les avantages de recherche de l’essai biologique sur cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du Fe, il faut d’abord comprendre les approches qui étaient en place avant l’avènement de ce modèle. La mesure de la biodisponibilité du Fe à partir d’un aliment ou d’un repas in vivo est une tâche difficile, en particulier lorsque des combinaisons d’aliments doivent être évaluées dans un repas ou un régime. Le marquage isotopique a été l’approche la plus courante pour mesurer la biodisponibilité du Fe au cours des 50 dernières années1. Le marquage isotopique est utilisé pour les études à repas unique et à repas multiples et n’est pas pratique pour les études à long terme. Les isotopes stables du Fe tels que 57Fe et 58Fe sont les plus couramment utilisés; cependant, des études ont été menées avec des radio-isotopes tels que le 59Fe, en utilisant le comptage du corps entier2. Pour les aliments végétaux, l’étiquetage isotopique a été effectué via un étiquetage extrinsèque ou intrinsèque. Pour l’étiquetage extrinsèque, une quantité connue d’isotope est ajoutée à l’aliment ou au repas. La nourriture est ensuite mélangée et une période d’équilibration de 15 à 30 minutes est incorporée dans le protocole avant la consommation. La culture hydroponique, c’est-à-dire l’ajout de l’isotope à la solution nutritive pour l’incorporer dans la plante pendant sa croissance et son développement, est nécessaire pour l’étiquetage intrinsèque des aliments végétaux. Les avantages et les inconvénients de chaque approche sont discutés ci-dessous.
Marquage isotopique extrinsèque
Du début au milieu des années 1970, l’absorption humaine du Fe a été étudiée par marquage extrinsèque du Fe dans les aliments, dans lequel une quantité connue d’isotope est ajoutée à la quantité connue de Fe dans l’aliment ou le repas, mélangée et équilibrée pendant 15 à 30 minutes avant les mesures. Diverses quantités d’isotopes extrinsèques ont été utilisées, allant de 1 % à 100 % du Fe intrinsèque, mais le plus souvent entre 7 % et 30 %3. L’étiquetage extrinsèque est basé sur l’hypothèse que l’isotope Fe extrinsèque est complètement équilibré avec le Fe intrinsèque de l’aliment ou du repas. L’absorption isotopique extrinsèque est ensuite mesurée, et chaque atome de l’isotope extrinsèque est calculé pour représenter un nombre donné d’atomes intrinsèques de Fe. Ce calcul est basé sur les quantités molaires relatives. En 1983, de multiples études de validation de la technique ont été résumées dans un document de synthèse4. La validation de la technique a été effectuée en comparant simultanément le pourcentage d’absorption de l’étiquette isotopique extrinsèque au pourcentage d’absorption d’une étiquette isotopique intrinsèque. Ainsi, un rapport de l’absorption extrinsèque à l’absorption intrinsèque proche de 1 suggère que chaque pool de Fe a été absorbé de manière égale. À l’époque, un rapport proche de 1 était également considéré comme représentant l’équilibre de l’isotope extrinsèque avec le Fe intrinsèque de l’aliment ou du repas. Les rapports d’absorption extrinsèque / intrinsèque du Fe variaient de valeurs moyennes de 0,40 à 1,62, avec un rapport moyen (±ET) de 1,08 ± 0,14 dans 63 comparaisons. Il est important de noter que, dans toutes les études résumées dans cette revue, aucune n’a testé directement l’équilibre de l’étiquette extrinsèque avec le Fe intrinsèque. En résumé, les auteurs de la revue ont conclu ce qui suit :
« La technique de l’étiquette extrinsèque s’est avérée valable pour plusieurs aliments dans certaines conditions expérimentales. Mais, cette méthode ne peut pas encore être considérée comme prouvée en ce qui concerne tous les types d’aliments. La méthode de l’étiquette extrinsèque n’est pas appropriée pour surveiller l’absorption du fer d’un régime alimentaire contenant des formes insolubles de fer. La validité de cette technique repose sur l’hypothèse de base que l’étiquette extrinsèque échange complètement avec tout le fer alimentaire endogène non hémique. À l’heure actuelle, on ne sait pas à quel point les différentes formes de fer non hémique sont étiquetées par une étiquette extrinsèque. Ceci est important à la lumière des études qui ont suggéré que les inhibiteurs de fer peuvent affecter l’étiquette extrinsèque différemment de certaines formes de fer non hémique dans les aliments. Les recherches sur les facteurs alimentaires qui peuvent nuire à un échange isotopique complet sont rares. Ainsi, l’interprétation des données de biodisponibilité issues de la recherche sur les marqueurs extrinsèques nécessite la prise en compte des inhibiteurs de l’échange qui peuvent être présents dans l’aliment ou le régime alimentaire.
Depuis 1983, seules deux études ont été publiées évaluant la précision du marquage extrinsèque du Fe 3,5. Dans ces deux études, l’équilibre d’une étiquette isotopique extrinsèque a été directement comparé au Fe intrinsèque des aliments, qui, dans ces études, étaient des cultures vivrières de base. Des variétés de haricots blancs, rouges et noirs ont été testées, ainsi que des lentilles et du maïs. En utilisant des techniques de digestion in vitro établies et la mesure de la solubilité et de la précipitation du Fe, les deux études ont démontré que le marquage isotopique extrinsèque n’aboutit pas systématiquement à un équilibre complet, avec des preuves que, pour certaines variétés de haricots, le déséquilibre peut être très élevé en fonction de la quantité d’isotope extrinsèque et de la couleur du tégument3. Malgré les conclusions du document de synthèse de 1983, les études d’étiquetage extrinsèque des haricots se sont poursuivies 6,7,8,9,10,11,12. Aucune de ces études n’incluait le test de l’équilibre de l’étiquette extrinsèque avec le Fe intrinsèque.
Étiquetage intrinsèque
L’étiquetage intrinsèque des aliments végétaux pour l’évaluation de la biodisponibilité du Fe élimine les problèmes de précision de l’équilibre dans l’étiquetage extrinsèque. Cependant, cette approche ne peut pas produire de grandes quantités de matériel en raison de l’exigence d’espace de serre pour la culture hydroponique. La culture hydroponique exige beaucoup de main-d’œuvre, nécessite une grande quantité d’isotopes stables coûteux et entraîne souvent une croissance des plantes différente en termes de rendement et de concentration de Fe des graines. En raison de son coût, l’étiquetage intrinsèque ne convient que pour les études à petite échelle visant à comprendre les mécanismes sous-jacents à l’absorption du Fe ou les facteurs influençant l’absorption du Fe par les aliments. La production de 1 à 2 kg d’une culture vivrière de base coûte environ 20 000 à 30 000 dollars pour les matériaux seuls, selon l’approche isotopique et hydroponique13,14.
Compte tenu des défis associés au marquage isotopique, les chercheurs ont cherché à développer des approches in vitro. Les premières méthodes utilisaient des aliments gastriques et intestinaux simulés, couplés à la mesure de la solubilité du Fe ou de la dialysabilité du Fe comme estimation de la biodisponibilité15. De telles études ont rapidement révélé que la dialysabilité du Fe n’était pas une mesure cohérente de la biodisponibilité, car le Fe peut être soluble, étroitement lié aux composés et, par conséquent, non échangeable, ce qui conduit à une surestimation de la biodisponibilité. Pour résoudre ces problèmes, la méthodologie d’utilisation d’une lignée cellulaire intestinale humaine a évolué, ajoutant ainsi une composante vivante et permettant de mesurer l’absorption du Fe16. Les cellules intestinales humaines - cellules Caco-2 - proviennent d’un carcinome du côlon humain et ont été largement utilisées dans les études sur l’absorption des nutriments. Cette lignée cellulaire est utile car, en culture, les cellules se différencient en entérocytes qui fonctionnent de manière similaire aux cellules de bordure de brosse de l’intestin grêle. Des études ont montré que les cellules Caco-2 présentent les transporteurs appropriés et la réponse aux facteurs qui influencent l’absorption de Fe17,18.
Les études initiales, utilisant des radio-isotopes pour mesurer l’absorption de Fe dans les cellules Caco-2, ont été affinées pour mesurer l’absorption de Fe en fonction de la formation de ferritine des cellules Caco-2. La mesure de la ferritine cellulaire Caco-2 a amélioré le débit de l’échantillon et éliminé les problèmes de manipulation des radio-isotopes et d’équilibration du Fe extrinsèque avec le Feintrinsèque 19,20. La mesure de l’absorption de Fe par la formation de ferritine a permis aux chercheurs d’étudier un large éventail d’aliments, y compris des repas complexes21. Ainsi, la digestion simulée (in vitro) couplée à l’absorption de Fe par les cellules Caco-2 a fourni une meilleure évaluation physiologique de l’absorption de Fe par les aliments. Il est important de noter que ce modèle détermine principalement les différences relatives dans la biodisponibilité du Fe. Comme beaucoup de lignées cellulaires utiles, les cellules Caco-2 ont également montré une variabilité dans la réactivité, mais ont maintenu des différences relatives constantes dans l’absorption de Fe entre les aliments. Une technique appropriée et une attention particulière aux détails peuvent améliorer la réponse constante de la formation de ferritine cellulaire dans les cellules Caco-2.
Le modèle de digestion in vitro/cellule Caco-2 est également connu sous le nom de bioessai sur cellules Caco-2. Ce test a été validé de manière approfondie par comparaison directe avec des études humaines et animales22. En plus de la comparaison parallèle directe des essais biologiques aux essais d’efficacité chez l’homme, il a été démontré que ce modèle présente une réponse qualitativement similaire à celle des humains18,19,23 dans l’absorption du Fe. Par conséquent, en tant qu’approche in vitro, l’essai biologique sur cellules Caco-2 mérite une grande crédibilité en tant qu’outil de dépistage pour évaluer la nutrition Fe à partir des aliments. Il a été largement appliqué à de nombreux aliments et produits alimentaires 21,24,25,26,27,28.
Depuis sa création en 1998, l’essai biologique sur cellules Caco-2 a fait progresser le domaine de la nutrition Fe car il a aidé à identifier les facteurs qui influencent l’absorption intestinale du Fe. Ce faisant, ce modèle a développé et affiné des objectifs de recherche pour des études humaines plus définitives et moins coûteuses. On pourrait également soutenir que l’utilisation du modèle annule la nécessité de certains essais humains.
En résumé, l’apport relatif de Fe à partir d’un aliment ou d’un repas peut être mesuré avec le bioessai sur cellules Caco-2. Quelle que soit la quantité de Fe dans la farine d’essai, l’essai biologique définit la quantité relative de Fe absorbée dans l’entérocyte - la première étape du processus d’absorption. C’est l’étape la plus importante dans la définition de la biodisponibilité du Fe, car le plus souvent, l’objectif est de mesurer avec l’intention d’améliorer ou, à tout le moins, de surveiller la qualité nutritionnelle du Fe dans un aliment. Étant donné que le statut en fer est régulé par absorption, et donc l’absorption de Fe est régulée à la hausse chez les individus déficients en Fe pour répondre aux besoins nutritionnels, les conditions standard du modèle sont conçues de manière à ce que l’absorption de Fe par les cellules soit maximale. De cette façon, l’essai biologique fournit une véritable mesure du potentiel de l’aliment à fournir du Fe.
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Protocol
NOTA : À titre de point de référence pratique pour les lecteurs, la méthodologie suivante décrit les conditions de culture et les matériaux spécifiques requis pour mesurer la biodisponibilité du Fe à partir de 20 échantillons expérimentaux, ainsi que les contrôles de qualité requis, dans une série de l’essai biologique. L’augmentation du nombre d’échantillons au-delà de cette capacité n’est pas recommandée en raison du temps requis pour diverses étapes de culture cellulaire et de digestion in vitro dans le cadre du bioessai.
1. Choix de la quantité d’échantillons
- Pour les aliments solides ou liquides, déterminer une quantité d’aliment qui peut être considérée comme représentative de l’échantillon à analyser.
- Lors de l’analyse de la biodisponibilité du Fe à partir d’une variété de haricot, utiliser 100 à 150 g de graines de haricot et traiter cette quantité en un échantillon homogène.
- Pour les échantillons liquides tels que les jus enrichis, les produits laitiers et les boissons pour sportifs, assurez-vous que les aliments sont bien mélangés avant l’échantillonnage.
REMARQUE : La quantité de semences de haricots mentionnée ci-dessus est essentielle pour tenir compte des différences inhérentes entre les semences de cette culture de base.
2. Préparation des échantillons
- Rincer la terre et la poussière de tout échantillon d’aliment avec de l’eau distillée-désionisée avant le traitement.
- Traiter la quantité appropriée d’échantillon selon les objectifs expérimentaux, par exemple par la méthode de cuisson et le broyage.
REMARQUE : Pour la cuisson et la transformation, il est essentiel d’utiliser des ustensiles de cuisine et de l’équipement qui ne sont pas une source potentielle de contaminant Fe. L’équipement en acier inoxydable ne contamine pas; cependant, des équipements tels que les moulins à pierre, les ustensiles de cuisine en fonte et tout équipement non en acier inoxydable contenant du Fe peuvent ajouter des quantités importantes de contaminants Fe. Un moulin à café en acier inoxydable standard est souvent adéquat pour la mouture. - Lyophiliser et broyer en une poudre homogène.
REMARQUE : Une fois homogénéisé, la recherche a montré que trois réplications indépendantes de l’analyse sont adéquates pour chaque aliment mesuré.- Si l’homogénéité de l’échantillon est difficile à atteindre, réviser la formulation ou la transformation du produit. Si cela n’est pas possible, ajoutez des réplications si la non-homogénéité n’est pas grave.
- Pour la plupart des aliments solides homogènes, utiliser 0,5 g d’échantillon lyophilisé par répétition. Si nécessaire, utiliser jusqu’à 1,0 g d’échantillon par répétition, mais vérifier si plus de 0,5 g donne un avantage dans le degré de réponse.
REMARQUE : Des quantités supérieures à 0,5 g d’aliments solides peuvent obstruer la membrane de dialyse (voir ci-dessous). - Utilisez 1 à 2 mL d’échantillons liquides.
REMARQUE: La lyophilisation n’est souvent pas nécessaire pour les échantillons liquides.
3. Culture cellulaire Caco-2
- Cultures de stock
- Acquérir des cellules Caco-2 auprès d’un fournisseur certifié.
- Culture des cellules à partir de flacons de stock à 37 °C dans un incubateur avec une atmosphère d’air de 5% de CO 2 (humidité constante) en utilisant le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 25 mM HEPES (pH7,2 ), 10% (v/v) sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de solution antibiotique-antimycotique.
- Une fois que suffisamment de cellules sont disponibles, généralement après 7 à 10 jours de culture, ensemencez-les dans des flacons non enrobés de collagène à une densité de 30 000 cellules/cm2.
- Choisissez la taille du flacon en fonction du nombre de cellules disponibles et nécessaires pour l’ensemencement des plaques multipuits.
NOTA : En général, les flacons T225 (225 cm 2) fonctionnent mieux pour les expériences où 11 plaques multipuits (6 puits; 9,66 cm2/puits) sont utilisées (10 plaques pour les comparaisons d’échantillons, 1 plaque pour les contrôles de qualité) par essai biologique. - Cultiver les cellules dans des flacons pendant 7 jours, en changeant le milieu tous les deux jours, et utiliser le 7ème jour pour ensemencer les plaques multipuits.
REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser une plage de passages ne dépassant pas 10 à 15 passages à partir du moment où les cellules sont démarrées à partir de la culture mère et ensuite utilisées dans une série d’expériences. Les passages de culture cellulaire devraient être limités, car un large éventail de passages peut entraîner des changements adaptatifs dans la lignée cellulaire et, par conséquent, une variabilité dans la réponse du modèle.
- Culture cellulaire sur plaques multipuits
- Ensemencer les cellules Caco-2 à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans des plaques recouvertes de collagène à 6 puits.
REMARQUE: Cette étape fonctionne généralement mieux si elle est effectuée un mercredi. Les étapes suivantes montreront pourquoi ce jour de la semaine est optimal. - Cultiver les cellules pendant 12 jours à 37 °C dans un incubateur avec une atmosphère d’air de 5% de CO 2 (humidité constante) en utilisant DMEM complété par 25 mM HEPES (pH7,2 ), 10% (v / v) FBS et 1% de solution antibiotique-antimycotique.
REMARQUE: La culture des monocouches cellulaires de plus de 12 jours peut entraîner une prolifération cellulaire. Des recherches antérieures ont clairement montré que, dans ces conditions, 12 jours après l’ensemencement, la monocouche cellulaire est mature, bien attachée à la plaque et optimale dans la cohérence de la réponse 29,30,31. La croissance des cellules plus longtemps, par exemple jusqu’à 19-21 jours, entraîne une prolifération cellulaire et le milieu s’épuise rapidement en nutriments, ce qui entraîne des monocouches malsaines. - Pendant la période de 12 jours, changez le milieu au moins tous les 2 jours selon un horaire quotidien cohérent.
- Le 12e jour suivant l’ensemencement, remplacer le milieu de culture par 2 mL de milieu essentiel minimal (MEM [pH 7]) complété par des PIPES à 10 mM (acide pipérazine-N,N'-bis-[2-éthanesulfonique]), une solution antibiotique-antimycotique à 1 %, de l’hydrocortisone (4 mg/L), de l’insuline (5 mg/L), du sélénium (5 μg/L), de la triiodothyronine (34 μg/L) et du facteur de croissance épidermique (20 μg/L).
NOTE: Si l’ensemencement a commencé un mercredi, le 12e jour serait un lundi. - Le lendemain (c.-à-d. jour 13), retirez le MEM et remplacez-le par 1 mL de MEM (pH 7).
Remarque : Cette étape se produirait un mardi. C’est le jour où l’essai biologique commence; Ainsi, le calendrier de 13 jours offre l’avantage d’un calendrier hebdomadaire cohérent, ce qui permet de mener l’essai biologique de manière cohérente le même jour de semaine.
- Ensemencer les cellules Caco-2 à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans des plaques recouvertes de collagène à 6 puits.
4. Digestion in vitro
- Préparation des bagues d’insertion
- Créez une bague d’insertion stérilisée à l’aide d’un joint torique en silicone muni d’une membrane de dialyse lavée à l’acide (Figure 1A).
NOTA : Préparer les plaquettes 1 jour à l’avance (c.-à-d. lundi, jour 12) du jour de l’essai biologique et conserver dans 18 MΩ d’eau à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées. - Le jour de l’essai biologique (mardi, jour 13), retirez les inserts du réfrigérateur, égouttez et remplacez l’eau par 0,5 M de HCl. Laisser à température ambiante dans une hotte à flux laminaire pendant au moins 1 h avant utilisation.
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée avant de retirer le MEM des plaques de culture. Le lavage à l’acide de la membrane sert à éliminer les éventuels contaminants Fe et stérilise la bague d’insertion et la membrane. - Égoutter le HCl 0,5 M des inserts et rincer à l’eau stérile de 18 MΩ. Conserver dans de l’eau stérile de 18 MΩ à température ambiante dans une hotte à flux laminaire jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
- Insérez un anneau dans chaque puits des plaques à 6 puits avec des cellules Caco-2, créant ainsi un système à deux chambres. Remettez les plaques avec les inserts dans l’incubateur.
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée juste après l’ajout de 1,0 mL frais de MEM à chaque puits (voir l’étape 3.2.5.).
- Créez une bague d’insertion stérilisée à l’aide d’un joint torique en silicone muni d’une membrane de dialyse lavée à l’acide (Figure 1A).
- Préparation de la solution de pepsine
- Le jour de l’expérience, préparer la solution de pepsine en dissolvant 0,145 g de pepsine dans 50 mL de HCl 0,1 M . Agiter doucement la solution sur une plate-forme agitatrice pendant 30 min à température ambiante.
- Préparation de la solution pancréatine-bile
- Le même jour que l’expérience, préparer 0,1 M de NaHCO3 en dissolvant 2,1 g deNaHCO3 dans 250 mL d’eau 18 MΩ.
- Mélanger 0,35 g de pancréatine et 2,1 g d’extrait biliaire dans 175 mL de NaHCO3 0,1 M.
- Une fois la pancréatine et l’extrait biliaire solubilisés, ajouter 87,5 g d’une résine échangeuse de cations faibles (voir le tableau des matières) et mélanger en agitant pendant 30 min à température ambiante.
- Versez le lisier dans une grande colonne et recueillez l’éluat.
- Éluer la colonne avec 70 mL supplémentaires de NaHCO3 0,1 M, en recueillant ce volume dans la solution biliaire de pancréatine.
REMARQUE: Le but de la résine est d’éliminer le contaminant Fe couramment trouvé dans les extraits de pancréatine-bile.
- Initier la digestion in vitro .
- Peser l’échantillon dans un tube centrifuge stérile de 50 mL (polypropylène), suivi de l’ajout de 10 mL de solution saline physiologique à pH 2, contenant 140 mM de NaCl et 5 mM de KCl.
- Amorcer le processus de digestion gastrique en ajoutant 0,5 mL de la solution de pepsine porcine préparée à l’échantillon et incuber sur un agitateur à bascule à un réglage doux et doux pendant 1 h à 37 °C.
- Après cette période, initier le processus de digestion intestinale de chaque échantillon en ajustant le pH à 5,5-6,0 avec 1,0 M NaHCO3.
- Ajouter 2,5 mL de la solution pancréatine-bile à chaque tube d’échantillon et ajuster le pH à 6,9-7,0 avec 1,0 M NaHCO3.
- Une fois le pH ajusté, égaliser le volume dans chaque tube en utilisant 140 mM de NaCl, 5 mM de solution KCl (pH 6,7), en mesurant le poids du tube avec une valeur cible de 15 g.
NOTE: Pour certains aliments, il peut être nécessaire de porter le volume total à 16 g ou 17 g, selon le pouvoir tampon des aliments. - Transférer 1,5 mL de chaque digestion intestinale dans la chambre supérieure (c.-à-d. contenant l’anneau d’insertion avec la membrane de dialyse) d’un puits correspondant de la plaque de culture à 6 puits contenant les cellules Caco-2 (Figure 1B).
- Remettre le couvercle de la plaque et incuber à 37 °C (5 % CO 2 air atmosphérique) sur un agitateur à bascule à 6 oscillations/min pendant2 h.
- Retirez l’anneau d’insertion avec le digest et ajoutez 1 mL supplémentaire de MEM (pH 7) à chaque puits.
- Remettre la plaque de culture cellulaire dans l’incubateur (37 °C; 5% CO2 air atmosphère) pendant 22 heures supplémentaires.
- Après 22 h, retirer le milieu de culture cellulaire et ajouter 2,0 mL de 18 MΩ d’eau à la monocouche cellulaire.
REMARQUE: L’eau lysera osmotiquement les cellules. - Récoltez le lysat cellulaire entier dans des tubes microcentrifugés en polypropylène standard ou similaires pour les analyses ultérieures des protéines cellulaires et de la ferritine cellulaire.
5. Mesure de la ferritine cellulaire Caco-2 et des protéines cellulaires
- Utilisez le lysat cellulaire de l’étape 4.4.10. pour la mesure de la ferritine cellulaire et des protéines.
- Pour mesurer la teneur en ferritine des cellules Caco-2, suivez les instructions du kit (voir le tableau des matériaux), à l’exception de l’augmentation du temps d’incubation de 30 min à 2 h pour le conjugué anticorps antiferritine-peroxydase de raifort (HRP) chez la souris.
- Pour mesurer les protéines cellulaires, suivez les instructions fournies dans la trousse de protéines cellulaires (voir le tableau des matériaux).
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Representative Results
Identification et mesure de la biodisponibilité du Fe dans les cultures vivrières de base
L’une des principales raisons de l’élaboration de ce modèle était d’identifier les facteurs qui influencent la biodisponibilité du Fe dans les cultures vivrières de base et de fournir aux sélectionneurs de plantes un outil qui leur permettrait d’identifier et de développer des variétés présentant une biodisponibilité accrue du Fe. Le haricot commun (Phaseolus vulgaris) a été ciblé à l’échelle mondiale comme culture pour la biofortification du Fe; ainsi, le modèle a été largement appliqué pour évaluer la qualité nutritionnelle du Fe dans un large éventail de classes de marché de haricots et de programmes de sélection de haricots. Par exemple, les haricots jaunes sont une classe de marché émergente aux États-Unis. Dans des régions comme l’Afrique de l’Est, ils sont très populaires et sont largement connus pour être à cuisson rapide et considérés par beaucoup comme « faciles à digérer ». Des études récentes avec le test biologique sur cellules Caco-2 ont démontré que certaines variétés de haricots jaunes peuvent avoir une biodisponibilité élevée du Fe par rapport à d’autres classes de couleurs (Figure 2). Dans cette étude, les variétés Manteca ont été identifiées comme étant à haute biodisponibilité Fe par rapport aux contrôles de référence des classes de couleur tachetées de blanc et de rouge. De plus, les résultats ont été constants sur deux années de récolte consécutives. De telles comparaisons ne sont tout simplement pas réalisables dans d’autres modèles, en particulier les modèles in vivo , en raison du coût élevé et du débit beaucoup plus faible des essais sur les animaux et les humains.
Évaluation des effets de la transformation des aliments sur la biodisponibilité du Fe
Le bioessai sur cellules Caco-2 peut également être appliqué pour évaluer les effets de la transformation des aliments sur la biodisponibilité du Fe. Par exemple, les résultats de la figure 3 proviennent d’une analyse de haricots et de pâtes à base de haricots de plusieurs classes de couleurs. Les résultats démontrent comment la transformation des haricots en farine a augmenté la biodisponibilité du Fe des variétés de haricots blancs (Snowdon, Alpena et Samouraïs) et jaunes (Canario). Pour les variétés canneberge (Etna), red kidney (Red Hawk) et noire (Zenith), la biodisponibilité du Fe a diminué dans les préparations de farine de pâtes. Des analyses connexes ont démontré que la transformation des haricots en farine perturbait les parois cellulaires du cotylédon, rendant ainsi le Fe intracellulaire accessible à l’absorption. L’absorption de fer a augmenté dans les pâtes aux haricots blancs et jaunes, car les téguments de ces variétés ne contenaient pas de composés polyphénoliques inhibant la biodisponibilité du Fe. En revanche, les téguments de canneberge, de rognons rouges et de haricots noirs contiennent des niveaux élevés de polyphénols inhibiteurs, diminuant ainsi l’absorption de Fe. Ces résultats indiquent clairement l’utilité du modèle pour exposer les facteurs qui peuvent influencer la qualité nutritionnelle du Fe, qui autrement ne seraient pas détectés.
Figure 1 : Insérer une bague pour l’absorption du Fe des cellules Caco-2. (A) Image des cellules Caco-2 et anneau d’insertion avec membrane de dialyse attachée. (B) Schéma de la procédure globale de digestion in vitro associée à l’absorption de Fe par les cellules Caco-2 dans un seul puits de la plaque multipuits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Scores de biodisponibilité du fer des génotypes de graines entières non trempées et cuites dans un panel diversifié de haricots jaunes. (A) Saison sur le terrain 2015; (B) saison sur le terrain 2016. Les valeurs sont des moyennes (écart-type) de mesures en triple exemplaire à partir de deux répétitions de champ par génotype (n = 6). Les génotypes sont classés sur l’axe des x par classe de cuisson, classés du génotype de cuisson la plus rapide à l’entrée de cuisson la plus lente. *Score de biodisponibilité du fer significativement inférieur (p < 0,05) que les autres entrées YBP. **Scores de biodisponibilité du fer significativement plus élevés (p < 0,05) que les autres génotypes YBP. Ce chiffre a été modifié par rapport à32. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Biodisponibilité du fer exprimée en formation de ferritine cellulaire Caco-2 (nanogramme de ferritine par milligramme de protéine cellulaire) des variétés de haricots et de leurs spaghettis correspondants à base de haricots. A) Trois variétés de haricots blancs et leurs spaghettis à base de haricots correspondants; (B) quatre variétés de haricots colorés et leurs spaghettis à base de haricots correspondants. Les valeurs sont les moyennes (± l’écart-type) de six mesures de chaque variété. La ligne bleue avec trait d’union indique la biodisponibilité en fer d’une pâte de blé dur non enrichie extrudée, cuite et transformée de la même manière que les spaghettis à base de haricots. * Formation significativement (p ≤ 0,05) de ferritine cellulaire Caco-2 plus élevée que les haricots entiers après cuisson. **La formation de ferritine cellulaire Caco-2 significativement inférieure (p ≤ 0,05) à celle des haricots entiers après cuisson. Ce chiffre a été modifié par rapport à33. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Depuis sa création, de nombreuses études ont été publiées qui décrivent cette méthode pour le bioessai sur cellules Caco-2. Les conditions de base sont restées relativement inchangées depuis la publication initiale en 199818. Cependant, au cours des 20 dernières années, de nombreux détails techniques ont été affinés et normalisés pour obtenir une cohérence sans précédent dans la réponse du bioessai. Une adhésion minutieuse et précise à la culture cellulaire et aux conditions de digestion in vitro est la clé de la réponse cohérente et sensible du bioessai.
D’après notre expérience dans la formation de nombreuses personnes à l’utilisation de cette méthode, la lutte la plus courante est la culture appropriée des cellules Caco-2. Une culture cohérente de monocouches saines est la clé de monocouches de cellules Caco-2 saines et réactives. Si les concentrations de protéines cellulaires ne sont pas très constantes d’un puits à l’autre et ne se situent pas dans la plage de protéines cellulaires indiquée dans le protocole, l’investigateur doit réexaminer les conditions de culture cellulaire pour déceler tout écart par rapport au protocole. Alternativement, une contamination par de micro-organismes de faible niveau peut exister, l’incubateur de culture cellulaire peut ne pas fonctionner correctement ou le milieu de culture cellulaire peut ne pas être correctement formulé.
Le processus de digestion in vitro est une autre source de problèmes potentiels. L’élimination du contaminant Fe des enzymes digestives est essentielle. Malgré les affirmations du fabricant, il est prudent de vérifier périodiquement la concentration de Fe des enzymes et de s’assurer que le processus d’élimination du Fe (voir protocole) est efficace. Si la contamination par le Fe est présente dans les enzymes digestives, le contrôle de la qualité de la digestion de base donnera des valeurs de ferritine cellulaire supérieures à la plage recommandée.
Un chercheur expérimenté et formé devrait être en mesure d’analyser 20 échantillons expérimentaux, en plus des contrôles de qualité, en une seule série de l’essai biologique. Ainsi, environ 12 plaques de six puits sont nécessaires pour chaque cycle de l’essai biologique. Un nombre plus élevé d’échantillons par essai biologique n’est pas recommandé, car le délai de titrage du pH pendant le processus de digestion peut être trop long, ce qui peut entraîner une incohérence entre les temps de digestion des échantillons.
Les inconvénients de ce modèle sont relativement peu nombreux. Il faut des chercheurs hautement qualifiés en culture cellulaire et capables d’une attention précise aux détails et au protocole. L’espace de laboratoire doit être exempt de sources de contamination par le Fe, et les réactifs et autres matériaux doivent faire l’objet d’une surveillance régulière pour détecter la contamination par le Fe. Ainsi, l’utilisateur devrait avoir la capacité ou l’accès à des instruments pour mesurer la concentration de Fe. Ce modèle n’est qu’une mesure relative ou semi-quantitative. Cependant, avec l’utilisation appropriée des contrôles de référence, le modèle peut fournir des estimations quantitatives de l’absorption du Fe. En effet, une équation de conversion des rapports d’absorption du matériel témoin par rapport au matériau d’essai a été générée19.
Le test biologique fonctionne selon le principe suivant: les cellules Caco-2 produisent plus de protéines ferritines en réponse à l’augmentation des concentrations cellulaires de Fe. Par conséquent, la biodisponibilité du Fe est proportionnelle à l’augmentation de la production de ferritine cellulaire Caco-2. Cette augmentation est exprimée en rapport entre la ferritine cellulaire et la protéine cellulaire Caco-2 totale (nanogramme de ferritine par milligramme de protéine cellulaire totale) après exposition à un échantillon digéré19. Les mesures de ferritine sont effectuées à l’aide d’un kit ELISA (voir le tableau des matériaux) testé pour la réponse dans ce test biologique. Les concentrations totales de protéines cellulaires sont quantifiées à l’aide d’un kit de dosage des protéines. Comme mentionné précédemment, dans les conditions utilisées pour cette méthode, les niveaux typiques de protéines cellulaires Caco-2 dans une plaque à six puits varient de 2,0 mg à 2,6 mg de protéines cellulaires par puits. Les valeurs en dehors de cette plage indiquent des cultures cellulaires malsaines, une prolifération possible de cellules ou une mauvaise technique d’ensemencement cellulaire. Au cours d’une série donnée de l’essai biologique, les valeurs ne devraient varier que jusqu’à 0,2 mg par puits. De plus, compte tenu des densités de semis et des conditions de culture utilisées dans cette méthodologie, il y a une activité enzymatique importante en bordure de brosse 13 jours après l’ensemencement, ce qui indique la maturation de la plupart, sinon de la totalité, de la monocouche cellulaire28,29,30. Surveiller les monocouches cellulaires tout au long des 13 jours précédant l’utilisation pour détecter la contamination ou le stress, comme la formation de vacuoles ou les lacunes dans la formation de monocouches. Si de telles conditions sont évidentes, les cellules ne doivent pas être considérées comme valides pour une utilisation dans le bioessai.
Pour surveiller la réactivité du test biologique Caco-2, chaque expérience doit être exécutée avec plusieurs contrôles de qualité, y compris un condensé blanc, contenant uniquement la solution saline physiologiquement équilibrée et les enzymes gastro-intestinales. Ces contrôles garantissent qu’il n’y a pas de contamination au Fe dans le bioessai. Les valeurs de ferritine des cellules Caco-2 exposées au mélange blanc varient généralement de 1 ng à 6 ng de protéine cellulaire ferritine/mg. La ferritine de base dans cette plage indique également que les cellules ont un statut Fe relativement faible et, par conséquent, devraient présenter une sensibilité maximale au Fe disponible.
Pour les 15 premières années d’utilisation, les contrôles de qualité supplémentaires comprenaient 1) un digest blanc avec FeCl 3 (66 μM) et 2) un digest blanc de FeCl 3 (66 μM) plus l’ajout de1,3 mM d’acide ascorbique. Les valeurs de ferritine pour le digest FeCl 3 étaient généralement comprises entre 30 et 50 ng de ferritine / mg de protéine cellulaire, et la digestion de FeCl3 avec de l’acide ascorbique était comprise entre 250 et 400 ng de ferritine / mg de protéine cellulaire. Au cours des dernières années, le digest blanc demeure un contrôle de la qualité; cependant, nous sommes passés à l’utilisation d’un échantillon alimentaire avec et sans acide ascorbique dans un rapport de 20: 1, ascorbate: Fe. L’échantillon alimentaire utilisé était une farine de haricots blancs contenant environ 65 μg Fe/g d’échantillon. Ces contrôles de qualité donnent une gamme de réponse plus étroite et plus cohérente, donnant 20-30 ng de ferritine/mg de protéines cellulaires pour la farine de haricots blancs et 70-150 ng de ferritine/mg de protéines cellulaires pour la farine de haricots blancs plus ascorbate. Il convient de noter que la nouvelle plage de valeurs provient du kit référencé dans le tableau des matériaux, qui a tendance à être légèrement inférieur au kit Ramco ELISA, aujourd’hui disparu. Au moment de la publication de ce manuscrit, seulement 2-3 mois de données ont été acquis avec le kit référencé.
Il est important de reconnaître les résultats et les conditions de culture cellulaire qui indiquent une exécution invalide ou sous-optimale du bioessai. Premièrement, comme indiqué dans les méthodes, si les conditions de digestion à blanc donnent des concentrations de ferritine cellulaire supérieures à la plage suggérée, cela pourrait indiquer une contamination par le Fe des milieux de culture cellulaire, des enzymes digestives ou de la membrane de dialyse. Les concentrations acceptables de Fe pour les milieux de culture cellulaire et les enzymes digestives sont de <20 μg Fe/mL. Les valeurs en dehors de la plage pour les autres contrôles de qualité, en particulier si elles sont faibles, indiquent également que la validité des résultats est discutable.
En résumé, ce modèle est très sensible au Fe biodisponible, car les conditions de culture cellulaire sont conçues pour créer des cellules à faible statut Fe; ainsi, leurs mécanismes d’absorption du Fe sont fortement régulés à la hausse. C’est un modèle robuste capable d’un débit élevé. Tout aliment ou régime alimentaire pouvant être administré aux humains peut être évalué dans ce modèle et, par conséquent, l’essai biologique a un large éventail d’applications. Les sélectionneurs de plantes peuvent utiliser ce modèle pour mesurer la biodisponibilité du Fe dans les aliments de base, en identifiant les traits et les régions chromosomiques qui affectent la biodisponibilité du Fe. Les scientifiques de l’alimentation peuvent appliquer le modèle pour déterminer les formulations optimales et évaluer les effets de la transformation pour assurer une biodisponibilité adéquate du Fe. Les nutritionnistes peuvent utiliser le modèle pour évaluer et surveiller la biodisponibilité alimentaire du Fe à partir d’aliments individuels, de combinaisons d’aliments et même de régimes alimentaires. Il a été soigneusement validé pour des essais humains, prédisant correctement la direction et l’ampleur des effets dans chaque application. Ainsi, en combinant la digestion simulée avec l’absorption de Fe par les cellules épithéliales intestinales, ce modèle représente la première étape critique du processus d’absorption du Fe et est donc capable de prédire la livraison ou la biodisponibilité du Fe à partir des aliments.
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Disclosures
L’auteur n’a pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
L’auteur est profondément reconnaissant pour les efforts techniques de Yongpei Chang et Mary Bodis. L’application extrêmement réussie de ce modèle dans le domaine de la nutrition est le résultat direct de leur expertise et de leur souci du détail. Le développement de ce modèle a été entièrement financé par le Service de recherche agricole du Département de l’agriculture des États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
