Summary
本协议描述了三维运动跟踪/评估，以描绘暴露于模拟废弃环境后大鼠的步态运动改变。
Abstract
众所周知，废弃会影响神经系统，关节运动会发生变化;然而，哪些结局正确表现出这些特征尚不清楚。本研究描述了一种运动分析方法，该方法利用视频捕获的三维（3D）重建。使用这项技术，在暴露于模拟微重力环境的啮齿动物中，通过尾巴卸载后肢，观察到了废弃引起的行走性能的改变。卸货2周后，大鼠在跑步机上行走，用四个电荷耦合器件（CCD）相机捕捉它们的步态运动。使用图像处理软件重建3D运动曲线并与对照受试者的运动曲线进行比较。重建的结局测量成功地描绘了畸形步态运动的不同方面：膝关节和踝关节的过度伸展以及站立阶段髋关节的较高位置。运动分析很有用，原因有几个。首先，它支持定量行为评估而不是主观观察（例如，在某些任务中通过/失败）。其次，一旦获得基本数据集，就可以提取多个参数以满足特定需求。尽管存在更广泛应用的障碍，但通过确定综合测量和实验程序，可以减轻该方法的缺点，包括劳动强度和成本。
Introduction
缺乏体力活动或废用会导致运动效应器的恶化，例如肌肉萎缩和骨质流失1和全身失调2。此外，最近人们注意到，不活动不仅影响肌肉骨骼组件的结构方面，还影响运动的定性方面。例如，即使在干预结束后1个月，暴露于模拟微重力环境的大鼠的肢体位置也与完整动物的肢体位置不同3，4。然而，关于不活动造成的运动缺陷的报告很少。此外，劣化的综合运动特性尚未完全确定。
目前的协议演示并讨论了运动学评估的应用，通过参考在承受后肢卸载的大鼠中因废弃而引起的步态运动缺陷来可视化运动改变。
已经表明，在模拟微重力环境后行走时四肢的过度伸展在人类5和动物4，6，7，8中都观察到。因此，为了普遍性，我们在本研究中重点关注一般参数：膝关节和踝关节的角度以及跖趾关节与髋关节之间的垂直距离（大致相当于髋关节的高度）在站立阶段（中间）。此外，讨论了视频运动学评估的潜在应用。
一系列运动学分析可能是评估神经控制功能方面的有效措施。然而，尽管运动分析已经从足迹观察或对捕获的视频9，10的简单测量发展到多个相机系统11，12，但通用方法和参数尚未建立。本研究旨在为该关节运动分析提供全面的参数。
在之前的工作13中，我们尝试使用综合视频分析来说明神经病变模型大鼠的步态改变。然而，一般来说，运动分析的潜在结果通常仅限于分析框架中提供的预定变量。出于这个原因，本研究进一步详细说明了如何纳入广泛适用的用户定义的参数。如果实施适当的参数，使用视频分析的运动学评估可能会进一步有用。
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Protocol
本研究已获得京都大学动物实验委员会（Med Kyo 14033）的批准，并符合国立卫生研究院的指导方针（实验动物护理和使用指南，第8版）。7周龄的雄性Wistar大鼠用于本研究。 补充文件1中提供了代表程序顺序的示意图。
1. 让老鼠熟悉跑步机行走
注意：有关该程序的详细信息，请参阅先前发布的报告13 。
- 将大鼠放在专为啮齿动物设计的跑步机上（见 材料表）。在第一次训练中，让动物探索跑步机以习惯环境。
注意：此过程大约需要 5 分钟。 - 逐渐将皮带的速度增加到所需的水平（20 cm / s）并行走大鼠。如果需要，在跑步机末端使用电击14.
注意：一次步行大约持续10-20分钟。 - 每隔一天重复此过程 1 周，如果需要，更频繁地重复此过程15，16，17。
注意：在步骤 1 之前 2 周开始熟悉期。 - 将大鼠分组在笼子里（每个笼子里有2-3只大鼠），12小时明暗循环。 随意提供食物和水。
2.后肢卸荷对大鼠的应用及关节标志物的设置
注意：使用连接到尾巴的线和胶带抬高大鼠的后肢，如先前的报告18，19，20中所述。确保线和胶带固定在尾巴的底部，以防止尾皮打滑。彻底监控动物，并根据需要调整胶带的卸载高度或松紧度。
- 在用麻醉面罩吸入2-5%异氟醚的情况下，将30厘米长的胶带的前半部分缠绕在大鼠尾巴的近端部分。
- 将一根 1 米长的棉线（棉制厨房麻线，直径约 1 毫米）对折。通过在折叠的 50 厘米中点打一个结来做一个循环。结必须距离尖端约 5 厘米，才能留下 10 厘米的周长环。
- 让胶带的剩余 15 厘米穿过线环一次以固定胶带。将剩余的胶带缠绕在尾巴的远端部分。
- 将螺纹的另一端固定在保持架的架空平台上。将动物关在足够高的笼子里，以便用尾巴抬起它们的后肢。除卸载外，提供与 Ctrl 组相同的环境，例如食物、水和地板垫料。
- 按照以下步骤设置关节标记和软件（请参阅 材料表）。
注：有关此步骤的详细信息，请参阅 Wang 等人 13。- 在2-5%异氟醚吸入下，将彩色半球形标记（直径3毫米）附着在与骨标志物相对应的剃光皮肤上。保持异氟醚水平尽可能低，以防止非常深的麻醉。
- 确保标志是髂前上棘 （ASIS）、转子大肌（髋关节）、膝关节（膝关节）、外踝（踝关节）和第五跖趾关节 （MTP）21。
注意：如果需要脚趾的角度，请涂上脚趾的尖端。使用油性油漆标记（见 材料表）。液体胶更适合粘合剂，因为液体形式干燥得更快。
3. 使用捕获的视频进行标记跟踪
- 打开 MotionRecorder 应用程序（请参阅 材料表）并打开跑步机。将老鼠放在跑步机皮带上。
注意：用于视频捕获的四个摄像头（见 材料表）沿着跑步机的长边缘布置：每个边缘有两个摄像头，相距约 50 厘米 x 50 厘米，面向跑步机皮带区域的中心。 - 将传送带速度提高到 20 厘米/秒。当老鼠开始以所需的速度正常行走时，单击 记录 图标开始视频捕获。获得足够的步骤（5 个连续步骤，最好是 10 个步骤）后，再次单击“ 记录 ”图标停止捕获。
注意：在一个实验中捕获多只动物的数据。每只大鼠最多尝试五次。如果一只老鼠不走路，捕捉另一只，稍后再尝试第一只。相机的捕获速率为120帧/秒。 - 打开 3DCalculator 应用程序（请参阅 材料表）和要分析的视频文件。
- 通过调整顶部的水平滑块来裁剪视频，以包含足够数量的连续步长。通过拖动黄色滑动条的末端提示图标来更改捕获的图像。
- 要捕获标记，请通过单击简笔画模型上的标记图例，将它们拖动到捕获的视频上的相应标记，然后松开按钮来选择 标记图例 。此过程将标记的颜色分配给简笔图片中的标记图例。对要跟踪的每个标记重复此过程。
- 单击 自动跟踪 图标。如果系统无法准确跟踪标记或跟踪过程因标记丢失而停止，请切换到手动模式。
注意：除非错过标记，否则此自动过程不会停止。如果停止的频率超过每隔几帧发生一次，请考虑重新定位丢失的标记。 - 如果需要手动模式，请单击 手动 图标进行切换。单击简笔画上 缺少的标记图例 和视频上的相应标记。在手动模式下，视频每单击一次，视频就会继续一帧。
注意：利用免费提供的应用程序启用自动单击，以防止跟踪（数字化）标记的人员疲劳（请参阅 材料表）。
4. 所需参数的计算
- 打开 KineAnalyzer 应用程序（请参阅 材质表）并加载文件。
- 转到 “查看>编辑标记母版 ”菜单。它将打开“标记主编辑”窗口。
注意：捕获的标记在标记之前具有简单的数字。 - 单击标记选项卡上所需的标签（地标），然后单击所需的颜色。此过程将每个标记指定为特定地标。
- 转到 链接 选项卡。通过连续单击两个 标记 来创建线条。此过程使用标记创建对应于每个肢体的线条。
- 通过从“颜色”列中选择所需的颜色，为创建的线条指定 颜色 。
- 通过指定参考/移动线和角度的方向来定义角度。转到角度选项卡。命名角度后，通过单击与每个地标对应的标记来分配矢量 A（参考线）和矢量 B（移动线）。然后，在同一选项卡的操作部分中使用值定义角度的方向。
注：对于本研究，主要关注的参数是在站立阶段的中间（中间）：KSt（膝盖角度），ASt（踝角），MHD（跖骨髋关节距离：相当于髋关节的高度，见下一节）。膝关节角和踝关节角分别定义为股骨和胫骨与胫骨和第五跖骨之间的夹角。0° 角意味着接头完全弯曲。 - 在距离选项卡上，定义 距离 参数 （MHD）。在 距离设置 部分中选择两个相应的标记。关节轨迹作为归一化步进周期的函数也将可用。
注意： 定义角度/参数只需执行一次。完成此定义过程后，参数的设置将可用于以后的评估。
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Representative Results
12只动物被随机分配到两组之一：卸载组（UL，n = 6）或对照组（Ctrl，n = 6）。对于UL组，动物的后肢被尾巴卸载2周（UL期），而Ctrl组动物则保持自由。卸载 2 周后，与 Ctrl 组相比，UL 组表现出明显的步态模式。 图1 显示了代表性受试者的归一化关节轨迹。在站立阶段，UL组在膝盖和脚踝的伸展（即脚踝的跖屈）比Ctrl组更突出，称为“脚趾行走”3，16。本研究的目的是确定这些运动劣化的综合特征。为了阐明这些总体结局中的定量测量，如上所述实施了三个参数：KSt，膝盖中间的角度;ASt，脚踝角度;MHD，跖骨髋关节距离（第五跖趾关节和髋关节之间的垂直距离），几乎相当于髋关节中部的高度。
在2周（卸荷后2周），UL组的KSt和ASt均显著大于Ctrl组（图2A，B，未配对t检验：p < 0.01）。此外，UL组的MHD明显更高（图3，未配对t检验：p < 0.01）。中间的爪子位置如补充图1所示。
通过卸载减少活动可能会导致神经改变22，23，24，25。这些改变可能导致运动系统3，4的功能特征和肌肉骨骼特征的恶化。上述参数的显着变化可能归因于这些神经改变。
图1：代表性受试者的归一化关节轨迹。 调整纵坐标，使图中的轨迹大致显示在中心。（A）卸载组的膝关节和（B）踝关节在站立阶段比对照组表现出进一步的伸展（踝关节的足底屈曲）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：膝盖和踝关节中间的关节角。 卸载组在（A）KSt（膝关节）和（B）Ast（脚踝）方面的角度明显大于对照组（未配对t检验： p < 0.01）。误差线表示 95% 置信区间。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：髋关节中部的高度。 卸荷载组跖骨髋关节距离显著高于对照组（未配对t检验： p < 0.01）。误差线表示 95% 置信区间。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：表示程序顺序的示意图。请点击此处下载此文件。
补充图1：大鼠在中间的爪子位置。请点击此处下载此文件。
补充视频1：从底部跟踪脚步声。请点击此处下载此视频。
补充视频2：评估到达动作。请点击此处下载此视频。
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Discussion
环境的改变导致运动系统的功能方面和肌肉骨骼成分波动26，27。收缩结构或环境中的畸变可能会影响功能能力，即使在解决机械/环境变形后仍然存在19.客观的运动分析有助于定量测量这些功能能力。如上所示，视频分析是获取此类参数的强大方法。
为了跟踪联合地标进行视频分析，使用红外标记和摄像头很普遍，而手动跟踪也很常见10，28。将彩色半球形标记与自动捕获过程结合使用将使该跟踪过程更简单且更具成本效益。尽管由于皮肤滑脱而导致结果的潜在波动，但这种跟踪方法仍被纳入本研究。为了解决这种皮肤滑移，Bojados等人还尝试了一种射线照相方法，将标记物直接植入皮肤下方的骨骼上17。
运动分析的另一个优点是，一旦获得基本数据集，它就会提取多个功能方面。由于特征运动在受影响的函数方面有所不同，因此即使在数据收集之后将数据转换为不同的参数也将是一个实质性的好处。甚至可以通过放置在步行平台下方倾斜 45º 的镜子来实现脚步跟踪。此外，视频分析的应用不仅限于步行运动（补充视频1，补充视频2）。
尽管有这些优点，但运动分析，尤其是3D分析方法，仍然存在局限性。首先，由于该方法作为一组设备（即动物跑步机，多个相机，应用程序）工作，因此设备的整个设置可能很昂贵。其次，实验程序是劳动密集型的，操作人员需要完全习惯这些程序。
然而，考虑到其对步态分析和关节角的适用性，如果它被广泛使用，其利大于弊。未来的工作可能会在更广泛的功能评估中使用视频分析，以提供本分析系列。
3D 运动跟踪/评估是定量评估运动功能变化的强大工具。实施这种方法的障碍可以通过进一步的研究来解决。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了日本科学促进会（JSPS）KAKENHI（编号18H03129，21K19709，21H03302，15K10441）和日本医学研究与发展机构（AMED）（编号15bk0104037h0002）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive Tape | NICHIBAN CO.,LTD. | SEHA25F | Adhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Auto clicker | N.A. | N.A. | free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker) |
| CCD Camera | Teledyne FLIR LLC | GRAS-03K2C-C | CCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture |
| Cotton Thread | N.A. | N.A. | Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| Joint marker | TOKYO MARUI Co., Ltd | 0.12g BB | 6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification |
| Kine Analyzer | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for analysis |
| Konishi Aron Alpha | TOAGOSEI CO.,LTD. | #31204 | Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats |
| Motion Recorder | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for video recording |
| Paint Marker | MITSUBISHI PENCIL CO., LTD | PX-21.13 | Oil based paint marker to mark toes of animals |
| Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals) | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | 3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/) |
| Three-dimensional(3D) Calculator | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software fo marker tracking |
| Treadmill | MUROMACHI KIKAI CO.,LTD | MK-685 | Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit |
| Wistar Rats (male, 7-week old) | N.A. | N.A. | Commercially available at experimental animal sources |
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