Summary
El presente protocolo describe el seguimiento/evaluación tridimensional del movimiento para representar la alteración del movimiento de la marcha de las ratas después de la exposición a un entorno de desuso simulado.
Abstract
Es bien sabido que el desuso afecta a los sistemas neuronales y que los movimientos articulares se alteran; sin embargo, aún no está claro qué resultados exhiben adecuadamente estas características. El presente estudio describe un enfoque de análisis de movimiento que utiliza la reconstrucción tridimensional (3D) a partir de capturas de video. Usando esta tecnología, se observaron alteraciones evocadas por el desuso de los rendimientos de caminar en roedores expuestos a un entorno de microgravedad simulado descargando su extremidad posterior por la cola. Después de 2 semanas de descarga, las ratas caminaron en una cinta de correr, y sus movimientos de marcha fueron capturados con cuatro cámaras de dispositivo de carga acoplada (CCD). Los perfiles de movimiento 3D se reconstruyeron y compararon con los de los sujetos de control utilizando el software de procesamiento de imágenes. Las medidas de resultado reconstruidas retrataron con éxito distintos aspectos del movimiento distorsionado de la marcha: hiperextensión de las articulaciones de la rodilla y el tobillo y posición más alta de las articulaciones de la cadera durante la fase de postura. El análisis de movimiento es útil por varias razones. Primero, permite evaluaciones cuantitativas del comportamiento en lugar de observaciones subjetivas (por ejemplo, aprobado / reprobado en ciertas tareas). En segundo lugar, se pueden extraer múltiples parámetros para satisfacer necesidades específicas una vez que se obtienen los conjuntos de datos fundamentales. A pesar de los obstáculos para una aplicación más amplia, las desventajas de este método, incluida la intensidad y el costo de la mano de obra, pueden aliviarse determinando mediciones integrales y procedimientos experimentales.
Introduction
La falta de actividad física o el desuso conduce al deterioro de los efectores locomotores, como la atrofia muscular y la pérdida ósea1 y el desacondicionamiento de todo el cuerpo2. Además, recientemente se ha observado que la inactividad afecta no solo a los aspectos estructurales de los componentes musculoesqueléticos, sino también a los aspectos cualitativos del movimiento. Por ejemplo, las posiciones de las extremidades de las ratas expuestas a un entorno de microgravedad simulado fueron diferentes de las de los animales intactos incluso 1 mes después de que la intervención terminara 3,4. Sin embargo, poco se ha informado sobre los déficits de movimiento causados por la inactividad. Además, las características de movimiento integrales de los deterioros no se han determinado completamente.
El protocolo actual demuestra y discute la aplicación de la evaluación cinemática para visualizar alteraciones del movimiento al referirse a los déficits de movimiento de la marcha evocados por el desuso en ratas sometidas a descarga de extremidades posteriores.
Se ha demostrado que las hiperextensiones de las extremidades al caminar después de un ambiente de microgravedad simulado se observan tanto en humanos5 como en animales 4,6,7,8. Por lo tanto, para la universalidad, nos centramos en los parámetros generales en este estudio: ángulos de las articulaciones de la rodilla y el tobillo y distancia vertical entre la articulación metatarsofalángica y la cadera (aproximadamente equivalente a la altura de la cadera) en el punto medio de la fase de postura (postura media). Además, en la discusión se sugieren posibles aplicaciones de la evaluación cinemática de video.
Una serie de análisis cinemáticos puede ser una medida efectiva para evaluar los aspectos funcionales del control neuronal. Sin embargo, aunque los análisis de movimiento se han desarrollado a partir de la observación de la huella o la simple medición en video capturado9,10 hasta sistemas de múltiples cámaras11,12, aún no se han establecido métodos y parámetros universales. El método en este estudio está destinado a proporcionar este análisis de movimiento articular con parámetros completos.
En el trabajo anterior13, intentamos ilustrar las alteraciones de la marcha en ratas modelo de lesión nerviosa utilizando un análisis de video exhaustivo. Sin embargo, en general, los resultados potenciales de los análisis de movimiento a menudo se limitan a variables predeterminadas proporcionadas en los marcos de análisis. Por esta razón, el presente estudio detalla cómo incorporar parámetros definidos por el usuario que son ampliamente aplicables. Las evaluaciones cinemáticas que utilizan análisis de video pueden ser de mayor utilidad si se implementan los parámetros adecuados.
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Protocol
El presente estudio fue aprobado por el Comité Experimental de Animales de la Universidad de Kyoto (Med Kyo 14033) y realizado de conformidad con las directrices del Instituto Nacional de Salud (Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8ª edición). Se utilizaron ratas Wistar macho de 7 semanas de edad para el presente estudio. En el Fichero Suplementario 1 se presenta un esquema que representa la secuencia de procedimientos.
1. Familiarizar a las ratas con caminar en la cinta de correr
NOTA: Consulte el informe13 publicado anteriormente para obtener detalles sobre el procedimiento.
- Coloque la rata en una cinta de correr diseñada para roedores (consulte la Tabla de materiales). En la primera sesión, permita que el animal explore la cinta de correr para acostumbrarse al medio ambiente.
NOTA: Este proceso dura aproximadamente 5 minutos. - Aumente gradualmente la velocidad del cinturón hasta el nivel deseado (20 cm / s) y camine con la rata. Use una descarga eléctrica al final de la cinta si es necesario14.
NOTA: Una sesión de caminata dura aproximadamente 10-20 min. - Repita este proceso cada dos días durante 1 semana o con más frecuencia si es necesario15,16,17.
NOTA: Comience el período de familiarización 1 semana antes del paso 2. - Mantener a las ratas en grupos en jaulas (2-3 ratas en cada jaula) con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Proporcionar alimentos y agua ad libitum.
2. Aplicación de la descarga de las extremidades posteriores a las ratas y establecimiento de marcadores articulares
NOTA: Elevar las extremidades posteriores de la rata utilizando hilo y cinta adhesiva adherida a la cola como se describe en informes anteriores18,19,20. Asegúrese de que el hilo y la cinta estén unidos en la base de la cola para evitar el deslizamiento de la piel de la cola. Controle a fondo a los animales y ajuste la altura de descarga o la estanqueidad de la cinta si es necesario.
- Bajo inhalación de isoflurano al 2-5% con una máscara anestésica, envuelva la primera mitad de una tira de cinta adhesiva de 30 cm de largo alrededor de la porción proximal de la cola de la rata.
- Doblar un hilo de algodón de 1 m de largo (cordel de cocina de algodón, aproximadamente 1 mm de diámetro) por la mitad. Haga un lazo atando un nudo en el punto medio plegado de 50 cm. El nudo debe estar aproximadamente a 5 cm de la punta para dejar un bucle de circunferencia de 10 cm.
- Deje que los 15 cm restantes de la cinta adhesiva pasen una vez a través del bucle de rosca para asegurar la cinta. Envuelva la cinta restante alrededor de la parte distal de la cola.
- Asegure la otra punta del hilo en la plataforma superior de la jaula. Mantenga a los animales en una jaula que sea lo suficientemente alta como para elevar sus extremidades posteriores por sus colas. Además de la descarga, proporcione el mismo entorno que los del grupo Ctrl, como alimentos, agua y ropa de cama en el piso.
- Configure los marcadores conjuntos y el software (consulte la Tabla de materiales) siguiendo los pasos a continuación.
NOTA: Para obtener detalles sobre este paso, consulte Wang et al.13.- Bajo inhalación de isoflurano al 2-5%, adhiera marcadores semiesféricos de colores (3 mm de diámetro) a la piel afeitada correspondiente a puntos de referencia óseos. Mantenga el nivel de isoflurano lo más bajo posible para evitar una anestesia muy profunda.
- Asegúrese de que los puntos de referencia sean la columna ilíaca superior anterior (ASIS), el trocánter mayor (articulación de la cadera), la articulación de la rodilla (rodilla), el maléolo lateral (tobillo) y la quinta articulación metatarsofalángica (MTP)21.
NOTA: Pinte la punta del dedo del pie si se necesita el ángulo del dedo del pie. Use un marcador de pintura a base de aceite (consulte la Tabla de materiales). El pegamento líquido es preferible para el adhesivo ya que la forma líquida se seca más rápido.
3. Seguimiento de marcadores utilizando videos capturados
- Abra la aplicación MotionRecorder (consulte Tabla de materiales) y encienda la cinta de correr. Coloque la rata en el cinturón de la cinta de correr.
NOTA: Las cuatro cámaras para la captura de vídeo (consulte la Tabla de materiales) están dispuestas a lo largo de los bordes largos de la cinta de correr: dos cámaras en cada borde, aproximadamente a 50 cm x 50 cm de distancia, orientadas hacia el centro del área del cinturón de la cinta de correr. - Aumente la velocidad de la correa hasta 20 cm/s. Cuando la rata comienza a caminar normalmente a la velocidad deseada, haga clic en el icono Grabar para iniciar la captura de video. Una vez que se obtengan suficientes pasos (5 pasos consecutivos, preferiblemente 10 pasos), detenga la captura haciendo clic nuevamente en el icono Grabar .
NOTA: Capture datos sobre varios animales en un experimento. Pruebe hasta cinco veces por cada rata. Si una rata no camina, captura una diferente y prueba la primera más tarde. La velocidad de captura de la cámara fue de 120 fotogramas/s. - Abra la aplicación 3DCalculator (consulte Tabla de materiales) y el archivo de video que se va a analizar.
- Recorte el video ajustando la barra deslizante horizontal en la parte superior para que contenga suficientes pasos consecutivos. La imagen capturada cambia arrastrando los iconos de punta final de la barra deslizante amarilla.
- Para capturar los marcadores, seleccione las leyendas del marcador haciendo clic en las leyendas del marcador en el modelo de imagen de palo, arrastrándolas al marcador correspondiente en el video capturado y soltando el botón. Este proceso asigna el color del marcador a la leyenda del marcador en la imagen del palo. Repita este proceso para cada marcador que desee rastrear.
- Haga clic en el icono Seguimiento automático . Si el sistema no realiza un seguimiento preciso de los marcadores o el proceso de seguimiento se detiene debido a la pérdida del marcador, cambie al modo manual.
NOTA: Este proceso automático no se detiene a menos que se pierdan los marcadores. Si las interrupciones ocurren con más frecuencia que cada pocos fotogramas, considere reposicionar los marcadores perdidos. - Si se necesita el modo manual, haga clic en el icono Manual para cambiar. Haga clic en la leyenda del marcador que falta en la imagen del palo y en el marcador correspondiente en el video. El video procede con un cuadro por cada clic en el modo manual.
NOTA: Utilice aplicaciones disponibles gratuitamente que permiten el clic automático para evitar la fatiga de aquellos que rastrean (digitalizan) los marcadores (consulte la Tabla de materiales).
4. Cálculo de los parámetros deseados
- Abra la aplicación KineAnalyzer (consulte Tabla de materiales) y cargue el archivo.
- Vaya al menú Ver > editar maestro de marcadores . Se abre la ventana "Marker master edit".
NOTA: Los marcadores capturados tienen números simples hasta que se etiquetan. - Haga clic en la etiqueta deseada (punto de referencia) en la pestaña del marcador , luego haga clic en el color deseado. Este proceso designa cada marcador a un punto de referencia específico.
- Vaya a la pestaña de enlace . Cree líneas haciendo clic en dos marcadores consecutivamente. Este proceso crea líneas que corresponden a cada extremidad utilizando marcadores etiquetados.
- Asigne colores a las líneas creadas seleccionando el color deseado en la columna Color .
- Defina ángulos asignando líneas de referencia/móviles y direcciones de los ángulos. Vaya a la pestaña de ángulo . Después de nombrar el ángulo, asigne el vector A (línea de referencia) y el vector B (línea móvil) haciendo clic en los marcadores correspondientes a cada punto de referencia. A continuación, defina la dirección del ángulo con un valor en la sección de operación en la misma pestaña.
NOTA: Para el presente estudio, los parámetros principalmente enfocados fueron en la mitad de la fase de postura (postura media): KSt (ángulo de rodilla), ASt (ángulo del tobillo), MHD (distancia de cadera metatarso: equivalente a la altura de la cadera, ver la siguiente sección). El ángulo de la rodilla y el ángulo del tobillo se definieron como el ángulo entre el fémur y la tibia y la tibia y el quinto hueso metatarsiano, respectivamente. Un ángulo de 0° significa que la articulación estaba completamente flexionada. - En la pestaña distancia , defina el parámetro de distancia (MHD). Seleccione dos marcadores correspondientes en la sección Configuración de distancia . También estarán disponibles trayectorias conjuntas en función del ciclo escalonado normalizado.
NOTA: La definición de ángulos/parámetros debe realizarse solo una vez. La configuración de los parámetros estará disponible para evaluaciones posteriores una vez que se complete este proceso de definición.
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Representative Results
12 animales fueron asignados aleatoriamente a uno de dos grupos: el grupo de descarga (UL, n = 6) o el grupo de control (Ctrl, n = 6). Para el grupo UL, las extremidades posteriores de los animales fueron descargadas por la cola durante 2 semanas (período UL), mientras que los animales del grupo Ctrl se dejaron libres. 2 semanas después de la descarga, el grupo UL mostró un patrón de marcha distinto en comparación con el grupo Ctrl. La Figura 1 muestra trayectorias articulares normalizadas de sujetos representativos. Durante la fase de postura, el grupo UL exhibió extensiones adicionales en la rodilla y el tobillo (es decir, flexión plantar para el tobillo) que el grupo Ctrl, llamado "caminar del pie"3,16. El objetivo de este estudio fue determinar las características integrales de estos deterioros de movimiento. Para dilucidar las medidas cuantitativas de estos resultados generales, se implementaron tres parámetros como se indicó anteriormente: KSt, ángulo de rodilla en la postura media; ASt: ángulo del tobillo; MHD, distancia metatarsiana de la cadera (distancia vertical entre la quinta articulación metatarsofalángica y la articulación de la cadera), que es prácticamente equivalente a la altura de la articulación de la cadera en la postura media.
A las 2 semanas (2 semanas después de la descarga), tanto el KSt como el ASt del grupo UL fueron significativamente mayores que los del grupo Ctrl (Figura 2A, B, prueba t no pareada: p < 0,01). Además, la MHD fue considerablemente mayor en el grupo UL (Figura 3, prueba t no pareada: p < 0,01). La posición de la pata durante la postura media se muestra en la Figura suplementaria 1.
Una menor actividad a través de la descarga puede causar alteraciones neuronales22,23,24,25. Estas alteraciones podrían conducir a un deterioro de las características funcionales de los sistemas locomotores 3,4 y de las características musculoesqueléticas. Los cambios significativos en los parámetros descritos anteriormente pueden atribuirse a esas alteraciones neuronales.
Figura 1: Trayectorias conjuntas normalizadas de los sujetos representativos. La ordenada se ajusta para que las trayectorias del diagrama aparezcan aproximadamente en el centro. (A) Las articulaciones de rodilla y (B) tobillo en el grupo de descarga mostraron una extensión adicional (flexión plantar para el tobillo) que el grupo de control durante la fase de postura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ángulos articulares de la rodilla y el tobillo en la postura media. El grupo de descarga mostró ángulos significativamente mayores tanto en (A) KSt (rodilla) como en (B) Ast (tobillo) que el grupo control (prueba t no pareada: p < 0,01). La barra de error representa el intervalo de confianza del 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Altura de la articulación de la cadera en la postura media. La distancia metatarsiana de cadera del grupo de descarga fue significativamente mayor que la del grupo control (prueba t no pareada: p < 0,01). La barra de error representa el intervalo de confianza del 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Un esquema que representa la secuencia de procedimientos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 1: La posición de la pata de la rata durante la posición media. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video complementario 1: Seguimiento de pasos desde abajo. Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario 2: Evaluación de los movimientos de alcance. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
La alteración de los ambientes conduce a la fluctuación de los aspectos funcionales y componentes musculoesqueléticos de los sistemas locomotores26,27. Las aberraciones en estructuras o ambientes contráctiles pueden afectar las capacidades funcionales, persistiendo incluso después de resolver distorsiones mecánicas/ambientales19. El análisis de movimiento objetivo ayuda a medir cuantitativamente esas habilidades funcionales. Como se muestra arriba, el análisis de video es una metodología poderosa para adquirir dichos parámetros.
Con el fin de rastrear puntos de referencia conjuntos para el análisis de video, el uso de marcadores infrarrojos y cámaras es frecuente, mientras que el seguimiento manual también es común10,28. La utilización de marcadores semiesféricos de colores combinados con el proceso de captura automatizado haría que este proceso de seguimiento sea más simple y rentable. Este método de seguimiento se incorporó en el presente estudio a pesar de la posible fluctuación de los resultados debido al deslizamiento de la piel. Para abordar este deslizamiento cutáneo, Bojados et al. también intentaron un abordaje radiográfico con marcadores implantados directamente sobre el hueso debajo de la piel17.
Otra ventaja del análisis de movimiento es que extrae múltiples aspectos funcionales una vez que se obtiene el conjunto de datos fundamentales. Dado que los movimientos característicos difieren en términos de funciones afectadas, la transformación de datos a parámetros distintos incluso después de la recopilación de datos sería un beneficio sustancial. Incluso el seguimiento de pasos se puede lograr con un espejo colocado a 45º inclinado debajo de la plataforma para caminar. Además, la aplicación del análisis de vídeo no se limita al movimiento al caminar (Videos suplementarios 1, Video complementario 2).
A pesar de estas ventajas, el análisis de movimiento, especialmente el enfoque de análisis 3D, tiene limitaciones. Primero, dado que la metodología funciona como una constelación de dispositivos (es decir, una cinta de correr para animales, múltiples cámaras, aplicaciones), toda la configuración de aparatos puede ser costosa. En segundo lugar, el procedimiento experimental requiere mucha mano de obra, y los operadores deben acostumbrarse completamente a los procedimientos.
Sin embargo, teniendo en cuenta su aplicabilidad tanto al análisis de la marcha como al ángulo articular, sus beneficios superan sus desventajas si se vuelve ampliamente disponible. El trabajo futuro puede utilizar el análisis de video en una gama más amplia de evaluaciones funcionales para permitir esta serie de análisis.
El seguimiento/evaluación de movimiento 3D es una herramienta sólida para evaluar cuantitativamente las alteraciones funcionales de los movimientos. Los obstáculos para la implementación de esta metodología pueden resolverse a través de estudios adicionales.
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Disclosures
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI (no. 18H03129, 21K19709, 21H03302, 15K10441) y la Agencia Japonesa para la Investigación y Desarrollo Médico (AMED) (no. 15bk0104037h0002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive Tape | NICHIBAN CO.,LTD. | SEHA25F | Adhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Auto clicker | N.A. | N.A. | free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker) |
| CCD Camera | Teledyne FLIR LLC | GRAS-03K2C-C | CCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture |
| Cotton Thread | N.A. | N.A. | Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| Joint marker | TOKYO MARUI Co., Ltd | 0.12g BB | 6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification |
| Kine Analyzer | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for analysis |
| Konishi Aron Alpha | TOAGOSEI CO.,LTD. | #31204 | Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats |
| Motion Recorder | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for video recording |
| Paint Marker | MITSUBISHI PENCIL CO., LTD | PX-21.13 | Oil based paint marker to mark toes of animals |
| Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals) | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | 3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/) |
| Three-dimensional(3D) Calculator | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software fo marker tracking |
| Treadmill | MUROMACHI KIKAI CO.,LTD | MK-685 | Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit |
| Wistar Rats (male, 7-week old) | N.A. | N.A. | Commercially available at experimental animal sources |
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