Summary
Il presente protocollo descrive il tracciamento / valutazione del movimento tridimensionale per rappresentare l'alterazione del movimento dell'andatura dei ratti dopo l'esposizione a un ambiente di disuso simulato.
Abstract
È noto che il disuso colpisce i sistemi neurali e che i movimenti articolari vengono alterati; Tuttavia, quali risultati mostrino correttamente queste caratteristiche non è ancora chiaro. Il presente studio descrive un approccio di analisi del movimento che utilizza la ricostruzione tridimensionale (3D) da acquisizioni video. Utilizzando questa tecnologia, sono state osservate alterazioni evocate dal disuso delle prestazioni di deambulazione nei roditori esposti a un ambiente di microgravità simulato scaricando l'arto posteriore dalla coda. Dopo 2 settimane di scarico, i ratti camminavano su un tapis roulant e i loro movimenti di andatura venivano catturati con quattro telecamere CCD (charge-coupled device). I profili di movimento 3D sono stati ricostruiti e confrontati con quelli dei soggetti di controllo utilizzando il software di elaborazione delle immagini. Le misure di esito ricostruite hanno rappresentato con successo aspetti distinti del movimento distorto dell'andatura: iperestensione delle articolazioni del ginocchio e della caviglia e posizione più elevata delle articolazioni dell'anca durante la fase di posizione. L'analisi del movimento è utile per diversi motivi. In primo luogo, consente valutazioni comportamentali quantitative anziché osservazioni soggettive (ad esempio, superato / fallito in determinati compiti). In secondo luogo, è possibile estrarre più parametri per soddisfare esigenze specifiche una volta ottenuti i set di dati fondamentali. Nonostante gli ostacoli per un'applicazione più ampia, gli svantaggi di questo metodo, tra cui l'intensità e il costo del lavoro, possono essere alleviati determinando misurazioni complete e procedure sperimentali.
Introduction
La mancanza di attività fisica o il disuso porta al deterioramento degli effettori locomotori, come l'atrofia muscolare e la perdita ossea1 e il decondizionamento di tutto il corpo2. Inoltre, è stato recentemente notato che l'inattività influisce non solo sugli aspetti strutturali delle componenti muscolo-scheletriche, ma anche sugli aspetti qualitativi del movimento. Ad esempio, le posizioni degli arti dei ratti esposti a un ambiente di microgravità simulato erano diverse da quelle degli animali intatti anche 1 mese dopo la fine dell'intervento 3,4. Tuttavia, poco è stato riportato sui deficit di movimento causati dall'inattività. Inoltre, le caratteristiche di movimento complete dei deterioramenti non sono state completamente determinate.
L'attuale protocollo dimostra e discute l'applicazione della valutazione cinematica per visualizzare le alterazioni del movimento facendo riferimento ai deficit di movimento dell'andatura evocati attraverso il disuso nei ratti sottoposti a scarico degli arti posteriori.
È stato dimostrato che iperestensioni degli arti nel camminare dopo un ambiente di microgravità simulato sono osservate sia nell'uomo5 che negli animali 4,6,7,8. Pertanto, per l'universalità, ci siamo concentrati sui parametri generali in questo studio: angoli delle articolazioni del ginocchio e della caviglia e distanza verticale tra l'articolazione metatarso-falangea e l'anca (approssimativamente equivalente all'altezza dell'anca) nel punto medio della fase di posizione (midstance). Inoltre, nella discussione vengono suggerite potenziali applicazioni della valutazione cinematica video.
Una serie di analisi cinematiche può essere una misura efficace per valutare gli aspetti funzionali del controllo neurale. Tuttavia, sebbene le analisi del movimento siano state sviluppate dall'osservazione dell'impronta o dalla semplice misurazione su video acquisiti9,10 a sistemi di telecamere multiple11,12, i metodi e i parametri universali devono ancora essere stabiliti. Il metodo in questo studio ha lo scopo di fornire questa analisi congiunta del movimento con parametri completi.
Nel lavoro precedente13, abbiamo cercato di illustrare le alterazioni dell'andatura nei ratti modello di lesione nervosa utilizzando un'analisi video completa. Tuttavia, in generale, i potenziali risultati delle analisi del movimento sono spesso limitati a variabili predeterminate fornite nei quadri di analisi. Per questo motivo, il presente studio ha ulteriormente dettagliato come incorporare parametri definiti dall'utente che sono ampiamente applicabili. Le valutazioni cinematiche mediante analisi video possono essere di ulteriore utilità se vengono implementati parametri adeguati.
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Protocol
Il presente studio è stato approvato dal Comitato sperimentale sugli animali dell'Università di Kyoto (Med Kyo 14033) ed eseguito in conformità con le linee guida del National Institute of Health (Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8a edizione). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Wistar maschi di 7 settimane. Uno schema che rappresenta la sequenza delle procedure è fornito nel fascicolo supplementare 1.
1. Familiarizzare i ratti con il tapis roulant che cammina
NOTA: Si prega di consultare la relazione13 precedentemente pubblicata per i dettagli relativi alla procedura.
- Posiziona il ratto su un tapis roulant progettato per i roditori (vedi Tabella dei materiali). Nella prima sessione, consentire all'animale di esplorare il tapis roulant per abituarsi all'ambiente.
NOTA: questo processo richiede circa 5 minuti. - Aumentare gradualmente la velocità della cintura al livello desiderato (20 cm/s) e camminare con il topo. Utilizzare una scossa elettrica alla fine del tapis roulant se necessario14.
NOTA: Una sessione di camminata dura circa 10-20 minuti. - Ripetere questo processo a giorni alterni per 1 settimana o più frequentemente se necessario15,16,17.
NOTA: iniziare il periodo di familiarizzazione 1 settimana prima del passaggio 2. - Tenere i ratti in gruppi in gabbie (2-3 ratti in ogni gabbia) con un ciclo luce-buio di 12 ore. Fornire cibo e acqua ad libitum.
2. Applicazione dello scarico degli arti posteriori ai ratti e creazione di marcatori articolari
NOTA: Sollevare gli arti posteriori del ratto usando filo e nastro adesivo attaccato alla coda come descritto nelle precedenti relazioni18,19,20. Assicurarsi che il filo e il nastro siano attaccati alla base della coda per evitare lo slittamento della pelle della coda. Monitorare accuratamente gli animali e regolare l'altezza di scarico o la tenuta del nastro, se necessario.
- Sotto inalazione di isoflurano al 2-5% con una maschera anestetica, avvolgere la prima metà di una striscia di nastro adesivo lunga 30 cm attorno alla porzione prossimale della coda del ratto.
- Piegare un filo di cotone lungo 1 m (spago da cucina in cotone, diametro circa 1 mm) a metà. Fai un cappio legando un nodo al punto medio piegato di 50 cm. Il nodo deve essere a circa 5 cm dalla punta per lasciare un anello di circonferenza di 10 cm.
- Lasciare passare i restanti 15 cm del nastro adesivo una volta attraverso l'anello di filettatura per fissare il nastro. Avvolgere il nastro rimanente attorno alla porzione distale della coda.
- Fissare l'altra punta del filo sulla piattaforma aerea della gabbia. Tieni gli animali in una gabbia abbastanza alta da sollevare gli arti posteriori per la coda. Oltre allo scarico, fornire lo stesso ambiente di quelli per il gruppo Ctrl, ad esempio cibo, acqua e lettiera sul pavimento.
- Impostare i marcatori di giunzione e il software (vedere Tabella dei materiali) seguendo i passaggi seguenti.
NOTA: Per i dettagli relativi a questo passaggio, vedere Wang et al.13.- Sotto l'inalazione di isoflurano al 2-5%, attaccare marcatori semisferici colorati (diametro 3 mm) alla pelle rasata corrispondente ai punti di riferimento ossei. Mantenere il livello di isoflurano il più basso possibile per prevenire l'anestesia molto profonda.
- Assicurarsi che i punti di riferimento siano la colonna iliaca anteriore superiore (ASIS), il grande trocantere (articolazione dell'anca), l'articolazione del ginocchio (ginocchio), il malleolo laterale (caviglia) e la quinta articolazione metatarso-falangea (MTP)21.
NOTA: dipingere la punta della punta se è necessario l'angolo della punta. Utilizzare un pennarello a base di olio (vedere Tabella dei materiali). La colla liquida è preferibile per l'adesivo poiché la forma liquida si asciuga più velocemente.
3. Tracciamento dei marcatori utilizzando i video acquisiti
- Apri l'app MotionRecorder (vedi Tabella dei materiali) e accendi il tapis roulant. Posizionare il topo sulla cintura del tapis roulant.
NOTA: Le quattro telecamere per l'acquisizione video (vedi Tabella dei materiali) sono disposte lungo i bordi lunghi del tapis roulant: due telecamere su ciascun bordo, distanti circa 50 cm x 50 cm, rivolte verso il centro dell'area della cintura del tapis roulant. - Aumentare la velocità del nastro fino a 20 cm/s. Mentre il topo inizia a camminare normalmente alla velocità desiderata, fai clic sull'icona Registra per avviare l'acquisizione video. Una volta ottenuti un numero sufficiente di passaggi (5 passaggi consecutivi, preferibilmente 10 passaggi), interrompere l'acquisizione facendo nuovamente clic sull'icona Registra .
NOTA: acquisire dati su più animali in un unico esperimento. Prova fino a cinque volte per ogni ratto. Se un topo non cammina, catturane uno diverso e prova il primo più tardi. La velocità di acquisizione della fotocamera era di 120 fotogrammi/s. - Aprire l'app 3DCalculator (vedere Tabella dei materiali) e il file video da analizzare.
- Ritaglia il video regolando la barra di scorrimento orizzontale in alto in modo da contenere un numero sufficiente di passaggi consecutivi. L'immagine acquisita cambia trascinando le icone delle punte finali della barra di scorrimento gialla.
- Per acquisire i marcatori, selezionare le legende dei marcatori facendo clic sulle legende dei marcatori sul modello dell'immagine stilista, trascinandole sul marcatore corrispondente sul video acquisito e rilasciando il pulsante. Questo processo assegna il colore del marcatore alla legenda del marcatore nell'immagine stilista. Ripeti questa procedura per tenere traccia di ogni marcatore.
- Fare clic sull'icona Traccia automatica . Se il sistema non traccia accuratamente i marcatori o il processo di tracciamento si interrompe a causa della perdita dei marcatori, passare alla modalità manuale.
NOTA: questo processo automatico non si interrompe a meno che i marcatori non vengano persi. Se le interruzioni si verificano più spesso di ogni pochi fotogrammi, prendi in considerazione il riposizionamento degli indicatori persi. - Se è necessaria la modalità manuale, fare clic sull'icona Manuale per cambiare. Fai clic sulla legenda del marcatore mancante sull'immagine stilizzata e sul marcatore corrispondente sul video. Il video procede con un fotogramma per ogni clic in modalità manuale.
NOTA: Utilizzare app disponibili gratuitamente che consentono il clic automatico per evitare l'affaticamento di coloro che tracciano (digitalizzano) i marcatori (vedere Tabella dei materiali).
4. Calcolo dei parametri desiderati
- Apri l'app KineAnalyzer (vedi Tabella dei materiali) e carica il file.
- Vai al menu Visualizza > Modifica schema marcatore . Si apre la finestra "Modifica master marcatore".
NOTA: i marcatori acquisiti hanno numeri semplici finché non vengono etichettati. - Fare clic sull'etichetta desiderata (punto di riferimento) nella scheda marcatore , quindi fare clic sul colore desiderato. Questo processo designa ogni marcatore a un punto di riferimento specifico.
- Vai alla scheda dei collegamenti . Crea linee facendo clic su due marcatori consecutivamente. Questo processo crea linee che corrispondono a ciascun arto utilizzando marcatori etichettati.
- Assegnare colori alle linee create selezionando il colore desiderato dalla colonna Colore .
- Definite gli angoli assegnando linee di riferimento/spostamento e direzioni degli angoli. Vai alla scheda angolo. Dopo aver nominato l'angolo, assegna il vettore A (linea di riferimento) e il vettore B (linea in movimento) facendo clic sugli indicatori corrispondenti a ciascun punto di riferimento. Quindi, definite la direzione dell'angolo con un valore nella sezione Operate nella stessa scheda.
NOTA: Per il presente studio, i parametri principalmente focalizzati su erano al centro della fase di posizione (midstance): KSt (angolo del ginocchio), ASt (angolo della caviglia), MHD (distanza dell'anca metatarso: equivalente all'altezza dell'anca, vedere la prossima sezione). L'angolo del ginocchio e l'angolo della caviglia sono stati definiti come l'angolo tra il femore e la tibia e la tibia e il quinto osso metatarsale, rispettivamente. Un angolo di 0° significa che il giunto era completamente flesso. - Nella scheda distanza definire il parametro distanza (MHD). Selezionare due indicatori corrispondenti nella sezione Impostazione distanza . Saranno disponibili anche traiettorie articolari in funzione del ciclo di passi normalizzato.
NOTA: la definizione di angoli/parametri deve essere eseguita una sola volta. Le impostazioni dei parametri saranno disponibili per valutazioni successive una volta completato questo processo di definizione.
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Representative Results
12 animali sono stati assegnati in modo casuale a uno dei due gruppi: il gruppo di scarico (UL, n = 6) o il gruppo di controllo (Ctrl, n = 6). Per il gruppo UL, gli arti posteriori degli animali sono stati scaricati dalla coda per 2 settimane (periodo UL), mentre gli animali del gruppo Ctrl sono stati lasciati liberi. 2 settimane dopo lo scarico, il gruppo UL ha mostrato un modello di andatura distinto rispetto al gruppo Ctrl. La Figura 1 mostra traiettorie articolari normalizzate di soggetti rappresentativi. Durante la fase di posizione, il gruppo UL ha mostrato ulteriori estensioni nel ginocchio e nella caviglia (cioè plantarflessione per la caviglia) rispetto al gruppo Ctrl, chiamato "toe walking"3,16. L'obiettivo di questo studio era determinare le caratteristiche complete di questi deterioramenti del movimento. Per chiarire le misure quantitative da questi risultati complessivi, sono stati implementati tre parametri come indicato sopra: KSt, angolo del ginocchio al centro; ASt, angolo della caviglia; MHD, distanza dell'anca metatarso (distanza verticale tra la quinta articolazione metatarso-falangea e l'articolazione dell'anca), che è praticamente equivalente all'altezza dell'articolazione dell'anca a metà posizione.
A 2 settimane (2 settimane dopo lo scarico), sia il KSt che l'ASt del gruppo UL erano significativamente maggiori di quelli del gruppo Ctrl (Figura 2A,B, t-test spaiato: p < 0,01). Inoltre, l'MHD era considerevolmente più alto nel gruppo UL (Figura 3, test t spaiato: p < 0,01). La posizione della zampa durante la posizione centrale è mostrata nella figura supplementare 1.
Una minore attività attraverso lo scarico potrebbe causare alterazioni neurali22,23,24,25. Tali alterazioni potrebbero portare a un deterioramento delle caratteristiche funzionali dei sistemi locomotori 3,4 e delle caratteristiche muscoloscheletriche. Cambiamenti significativi nei parametri sopra descritti possono essere attribuiti a tali alterazioni neurali.
Figura 1: Traiettorie articolari normalizzate dei soggetti rappresentativi. L'ordinata viene regolata in modo che le traiettorie nel diagramma appaiano approssimativamente al centro. (A) Le articolazioni del ginocchio e (B) della caviglia nel gruppo di scarico hanno mostrato un'ulteriore estensione (flessione plantare per la caviglia) rispetto al gruppo di controllo durante la fase di posizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Angoli articolari del ginocchio e della caviglia a metà posizione. Il gruppo di scarico ha mostrato angoli significativamente maggiori sia in (A) KSt (ginocchio) che (B) Ast (caviglia) rispetto al gruppo di controllo (test t spaiato: p < 0,01). La barra di errore rappresenta l'intervallo di confidenza del 95%. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Altezza dell'articolazione dell'anca a metà posizione. La distanza dell'anca metatarso del gruppo di scarico era significativamente superiore a quella del gruppo di controllo (test t spaiato: p < 0,01). La barra di errore rappresenta l'intervallo di confidenza del 95%. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: Schema che rappresenta la sequenza delle procedure. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 1: La posizione della zampa del ratto durante la posizione centrale. Clicca qui per scaricare questo file.
Video supplementare 1: Tracciamento del passo dal basso. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 2: Valutazione dei movimenti di raggiungimento. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
L'alterazione degli ambienti porta a fluttuazioni degli aspetti funzionali e delle componenti muscolo-scheletriche dei sistemi locomotori26,27. Le aberrazioni nelle strutture o negli ambienti contrattili possono influire sulle capacità funzionali, persistendo anche dopo aver risolto le distorsioni meccaniche/ambientali19. L'analisi oggettiva del movimento aiuta a misurare quantitativamente queste abilità funzionali. Come mostrato sopra, l'analisi video è una potente metodologia per acquisire tali parametri.
Al fine di tracciare punti di riferimento comuni per l'analisi video, l'uso di marcatori a infrarossi e telecamere è prevalente, mentre il tracciamento manuale è anche comune10,28. L'utilizzo di marcatori semisferici colorati combinati con il processo di acquisizione automatizzato renderebbe questo processo di tracciamento più semplice ed economico. Questo metodo di tracciamento è stato incorporato nel presente studio nonostante la potenziale fluttuazione dei risultati dovuta allo slittamento della pelle. Per affrontare questo slittamento cutaneo, Bojados et al. hanno anche provato un approccio radiografico con marcatori impiantati direttamente sull'osso sotto la pelle17.
Un altro vantaggio dell'analisi del movimento è che estrae molteplici aspetti funzionali una volta ottenuto il set di dati fondamentale. Poiché i movimenti caratteristici differiscono in termini di funzioni interessate, la trasformazione dei dati in parametri distinti anche dopo la raccolta dei dati sarebbe un vantaggio sostanziale. Anche il tracciamento dei passi è realizzabile con uno specchio posizionato a 45º inclinato sotto la piattaforma pedonale. Inoltre, l'applicazione dell'analisi video non si limita al movimento del camminare (Video supplementari 1, Video supplementari 2).
Nonostante questi vantaggi, l'analisi del movimento, in particolare l'approccio di analisi 3D, ha dei limiti. Innanzitutto, poiché la metodologia funziona come una costellazione di dispositivi (ad esempio, un tapis roulant per animali, più telecamere, app), l'intera configurazione degli apparati può essere costosa. In secondo luogo, la procedura sperimentale è laboriosa e gli operatori devono abituarsi pienamente alle procedure.
Tuttavia, considerando la sua applicabilità sia all'analisi dell'andatura che all'angolo articolare, i suoi benefici superano i suoi svantaggi se diventa ampiamente disponibile. Il lavoro futuro potrebbe utilizzare l'analisi video in una gamma più ampia di valutazioni funzionali per consentire questa serie di analisi.
Il monitoraggio/valutazione del movimento 3D è un potente strumento per valutare quantitativamente le alterazioni funzionali dei movimenti. Gli ostacoli all'attuazione di questa metodologia possono essere risolti attraverso ulteriori studi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto in parte dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI (n. 18H03129, 21K19709, 21H03302, 15K10441) e dall'Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (AMED) (n. 15bk0104037h0002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive Tape | NICHIBAN CO.,LTD. | SEHA25F | Adhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Auto clicker | N.A. | N.A. | free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker) |
| CCD Camera | Teledyne FLIR LLC | GRAS-03K2C-C | CCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture |
| Cotton Thread | N.A. | N.A. | Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| Joint marker | TOKYO MARUI Co., Ltd | 0.12g BB | 6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification |
| Kine Analyzer | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for analysis |
| Konishi Aron Alpha | TOAGOSEI CO.,LTD. | #31204 | Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats |
| Motion Recorder | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for video recording |
| Paint Marker | MITSUBISHI PENCIL CO., LTD | PX-21.13 | Oil based paint marker to mark toes of animals |
| Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals) | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | 3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/) |
| Three-dimensional(3D) Calculator | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software fo marker tracking |
| Treadmill | MUROMACHI KIKAI CO.,LTD | MK-685 | Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit |
| Wistar Rats (male, 7-week old) | N.A. | N.A. | Commercially available at experimental animal sources |
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