Summary
Le présent protocole décrit le suivi/évaluation tridimensionnel des mouvements pour décrire l’altération du mouvement de la démarche des rats après exposition à un environnement de désuétude simulé.
Abstract
Il est bien connu que la désuétude affecte les systèmes neuronaux et que les mouvements articulaires sont altérés; Cependant, les résultats qui présentent correctement ces caractéristiques ne sont toujours pas clairs. La présente étude décrit une approche d’analyse de mouvement qui utilise la reconstruction tridimensionnelle (3D) à partir de captures vidéo. Grâce à cette technologie, des altérations des performances de marche évoquées par la désuétude ont été observées chez des rongeurs exposés à un environnement de microgravité simulé en déchargeant leur membre postérieur par la queue. Après 2 semaines de déchargement, les rats ont marché sur un tapis roulant et leurs mouvements de démarche ont été capturés avec quatre caméras à dispositif à couplage de charge (CCD). Les profils de mouvement 3D ont été reconstruits et comparés à ceux des sujets témoins à l’aide du logiciel de traitement d’image. Les mesures de résultats reconstruites ont réussi à dépeindre des aspects distincts du mouvement de la démarche déformée: hyperextension des articulations du genou et de la cheville et position plus élevée des articulations de la hanche pendant la phase de position. L’analyse de mouvement est utile pour plusieurs raisons. Tout d’abord, il permet des évaluations comportementales quantitatives au lieu d’observations subjectives (par exemple, réussite / échec dans certaines tâches). Deuxièmement, plusieurs paramètres peuvent être extraits pour répondre à des besoins spécifiques une fois que les ensembles de données fondamentaux sont obtenus. Malgré les obstacles à une application plus large, les inconvénients de cette méthode, y compris l’intensité de la main-d’œuvre et le coût, peuvent être atténués en déterminant des mesures complètes et des procédures expérimentales.
Introduction
Le manque d’activité physique ou la désuétude entraîne la détérioration des effecteurs locomoteurs, tels que l’atrophie musculaire et la perte osseuse1 et le déconditionnement du corps entier2. De plus, il a récemment été remarqué que l’inactivité affecte non seulement les aspects structurels des composants musculo-squelettiques, mais aussi les aspects qualitatifs du mouvement. Par exemple, la position des membres des rats exposés à un environnement de microgravité simulé était différente de celle des animaux intacts, même 1 mois après la fin de l’intervention 3,4. Néanmoins, peu de choses ont été rapportées sur les déficits de mouvement causés par l’inactivité. De plus, les caractéristiques de mouvement globales des détériorations n’ont pas été entièrement déterminées.
Le protocole actuel démontre et discute de l’application de l’évaluation cinématique pour visualiser les altérations du mouvement en se référant aux déficits de mouvement de la démarche évoqués par la désuétude chez les rats soumis au déchargement des membres postérieurs.
Il a été démontré que des hyperextensions des membres en marchant après un environnement de microgravité simulé sont observées à la fois chez l’homme5 et chez l’animal 4,6,7,8. Par conséquent, pour l’universalité, nous nous sommes concentrés sur les paramètres généraux dans cette étude: les angles des articulations du genou et de la cheville et la distance verticale entre l’articulation métatarsophalangienne et la hanche (à peu près équivalente à la hauteur de la hanche) au point médian de la phase de position (médio-stance). En outre, des applications potentielles de l’évaluation cinématique vidéo sont suggérées dans la discussion.
Une série d’analyses cinématiques peut être une mesure efficace pour évaluer les aspects fonctionnels du contrôle neuronal. Cependant, bien que les analyses de mouvement aient été développées à partir de l’observation de l’empreinte ou de la simple mesure sur vidéo capturée9,10 à plusieurs systèmes de caméras11,12, des méthodes et des paramètres universels doivent encore être établis. La méthode utilisée dans cette étude vise à fournir à cette analyse de mouvement articulaire des paramètres complets.
Dans le travail précédent13, nous avons essayé d’illustrer les altérations de la démarche chez des rats modèles de lésions nerveuses à l’aide d’une analyse vidéo complète. Cependant, en général, les résultats potentiels des analyses de mouvement sont souvent limités à des variables prédéterminées fournies dans les cadres d’analyse. Pour cette raison, la présente étude a détaillé comment incorporer des paramètres définis par l’utilisateur qui sont largement applicables. Les évaluations cinématiques utilisant des analyses vidéo peuvent être d’une autre utilité si des paramètres appropriés sont mis en œuvre.
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Protocol
La présente étude a été approuvée par le Comité expérimental sur les animaux de l’Université de Kyoto (Med Kyo 14033) et réalisée conformément aux directives de l’Institut national de la santé (Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, 8e édition). Des rats Wistar mâles âgés de 7 semaines ont été utilisés pour la présente étude. Un schéma représentant la séquence des procédures est fourni dans le dossier supplémentaire 1.
1. Familiariser les rats avec la marche sur tapis roulant
NOTE: Veuillez consulter le rapport13 publié précédemment pour plus de détails concernant la procédure.
- Placez le rat sur un tapis roulant conçu pour les rongeurs (voir le tableau des matériaux). Lors de la première séance, permettez à l’animal d’explorer le tapis roulant pour s’habituer à l’environnement.
REMARQUE: Ce processus prend environ 5 min. - Augmentez progressivement la vitesse de la ceinture jusqu’au niveau souhaité (20 cm/s) et promenez le rat. Utilisez un choc électrique au bout du tapis roulant si nécessaire14.
NOTE: Une séance de marche dure environ 10-20 min. - Répétez ce processus tous les deux jours pendant 1 semaine ou plus fréquemment si nécessaire15,16,17.
REMARQUE: Commencez la période de familiarisation 1 semaine avant l’étape 2. - Gardez les rats en groupes dans des cages (2-3 rats dans chaque cage) avec un cycle lumière-obscurité de 12 heures. Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum.
2. Application du déchargement des membres postérieurs aux rats et mise en place de marqueurs articulaires
NOTE: Élever les membres postérieurs du rat à l’aide de fil et de ruban adhésif attachés à la queue, comme décrit dans les rapports précédents18,19,20. Assurez-vous que le fil et le ruban sont attachés à la base de la queue pour éviter le glissement de la peau de la queue. Surveillez attentivement les animaux et ajustez la hauteur de déchargement ou l’étanchéité du ruban si nécessaire.
- Sous inhalation d’isoflurane à 2-5% avec un masque anesthésique, enrouler la première moitié d’une bande de ruban adhésif de 30 cm de long autour de la partie proximale de la queue du rat.
- Pliez un fil de coton de 1 m de long (ficelle de cuisine en coton, d’environ 1 mm de diamètre) en deux. Faites une boucle en nouant un nœud au milieu plié de 50 cm. Le nœud doit être à environ 5 cm de la pointe pour laisser une boucle de circonférence de 10 cm.
- Laissez passer les 15 cm restants du ruban adhésif une fois à travers la boucle de filetage pour fixer le ruban. Enroulez le ruban adhésif restant autour de la partie distale de la queue.
- Fixez l’autre extrémité du fil sur la plate-forme aérienne de la cage. Gardez les animaux dans une cage suffisamment haute pour élever leurs membres postérieurs par la queue. Outre le déchargement, fournissez le même environnement que ceux du groupe Ctrl, tels que la nourriture, l’eau et la litière au sol.
- Configurez les marqueurs et le logiciel des joints (voir le tableau des matériaux) en suivant les étapes ci-dessous.
REMARQUE : Pour plus de détails concernant cette étape, veuillez consulter Wang et coll.13.- Sous inhalation d’isoflurane à 2-5%, fixer des marqueurs semi-sphériques colorés (3 mm de diamètre) sur la peau rasée correspondant aux repères osseux. Maintenez le taux d’isoflurane aussi bas que possible pour éviter une anesthésie très profonde.
- Assurez-vous que les points de repère sont la colonne iliaque supérieure antérieure (ASIS), le trochanter majeur (articulation de la hanche), l’articulation du genou (genou), la malléole latérale (cheville) et la cinquième articulation métatarsophalangienne (MTP)21.
REMARQUE: Peignez la pointe de l’orteil si l’angle de l’orteil est nécessaire. Utilisez un marqueur de peinture à base d’huile (voir le tableau des matériaux). La colle liquide est préférable pour l’adhésif car la forme liquide sèche plus rapidement.
3. Suivi des marqueurs à l’aide de vidéos capturées
- Ouvrez l’application MotionRecorder (voir Tableau des matériaux) et allumez le tapis roulant. Placez le rat sur la ceinture du tapis roulant.
REMARQUE: Les quatre caméras pour la capture vidéo (voir le tableau des matériaux) sont disposées le long des longs bords du tapis roulant: deux caméras sur chaque bord, distantes d’environ 50 cm x 50 cm, face au centre de la zone de la ceinture du tapis roulant. - Augmentez la vitesse de la bande jusqu’à 20 cm/s. Lorsque le rat commence à marcher normalement à la vitesse souhaitée, cliquez sur l’icône Enregistrer pour démarrer la capture vidéo. Une fois que suffisamment d’étapes (5 étapes consécutives, de préférence 10 étapes) sont obtenues, arrêtez la capture en cliquant à nouveau sur l’icône Enregistrer .
REMARQUE: Capturez des données sur plusieurs animaux en une seule expérience. Essayez jusqu’à cinq fois pour chaque rat. Si un rat ne marche pas, capturez-en un autre et essayez le premier plus tard. Le taux de capture de la caméra était de 120 images / s. - Ouvrez l’application 3DCalculator (voir Tableau des matériaux) et le fichier vidéo à analyser.
- Recadrez la vidéo en ajustant le curseur horizontal en haut pour contenir un nombre suffisant d’étapes consécutives. L’image capturée change en faisant glisser l’icône de pointe de la barre de défilement jaune.
- Pour capturer les marqueurs, sélectionnez les légendes de marqueur en cliquant sur les légendes de marqueur sur le modèle d’image en bâton, en les faisant glisser vers le marqueur correspondant sur la vidéo capturée et en relâchant le bouton. Ce processus attribue la couleur du marqueur à la légende du marqueur dans l’image en bâton. Répétez ce processus pour chaque marqueur à suivre.
- Cliquez sur l’icône Trace automatique . Si le système ne suit pas avec précision les marqueurs ou si le processus de suivi s’arrête en raison d’une perte de marqueur, passez en mode manuel.
Remarque : Ce processus automatique ne s’arrête pas sauf si les marqueurs sont manqués. Si les arrêts se produisent plus souvent que toutes les quelques images, envisagez de repositionner les marqueurs perdus. - Si le mode manuel est nécessaire, cliquez sur l’icône Manuel pour basculer. Cliquez sur la légende du marqueur manquant sur l’image du bâton et sur le marqueur correspondant sur la vidéo. La vidéo se poursuit avec une image pour chaque clic en mode manuel.
REMARQUE : Utilisez des applications disponibles gratuitement qui permettent le clic automatique pour éviter la fatigue de ceux qui suivent (numérisent) les marqueurs (voir le tableau des matériaux).
4. Calcul des paramètres souhaités
- Ouvrez l’application KineAnalyzer (voir Tableau des matériaux) et chargez le fichier.
- Accédez au menu Afficher > modifier le maître des marqueurs . Il ouvre la fenêtre « Modification du maître marqueur ».
REMARQUE: Les marqueurs capturés ont des nombres simples jusqu’à ce qu’ils soient étiquetés. - Cliquez sur l’étiquette souhaitée (point de repère) dans l’onglet marqueur , puis cliquez sur la couleur souhaitée. Ce processus désigne chaque marqueur à un point de repère spécifique.
- Accédez à l’onglet lien . Créez des lignes en cliquant sur deux marqueurs consécutivement. Ce processus crée des lignes qui correspondent à chaque membre à l’aide de marqueurs étiquetés.
- Attribuez des couleurs aux lignes créées en sélectionnant la couleur souhaitée dans la colonne Couleur .
- Définissez les angles en attribuant des lignes de référence/déplacement et des directions des angles. Accédez à l’onglet angle. Après avoir nommé l’angle, attribuez le vecteur A (ligne de référence) et le vecteur B (ligne mobile) en cliquant sur les marqueurs correspondant à chaque point de repère. Ensuite, définissez la direction de l’angle avec une valeur dans la section d’exploitation du même onglet.
NOTE: Pour la présente étude, les paramètres principalement ciblés étaient au milieu de la phase de position (position médiane): KSt (angle du genou), ASt (angle de la cheville), MHD (distance de la hanche du métatarse: équivalent à la hauteur de la hanche, voir la section suivante). L’angle du genou et l’angle de la cheville ont été définis comme l’angle entre le fémur et le tibia et le tibia et le cinquième os métatarsien, respectivement. Un angle de 0° signifie que le joint a été complètement fléchi. - Sous l’onglet distance , définissez le paramètre distance (MHD). Sélectionnez deux marqueurs correspondants dans la section Réglage de la distance . Des trajectoires articulaires en fonction du cycle d’étapes normalisé seront également disponibles.
REMARQUE: La définition des angles/paramètres ne doit être effectuée qu’une seule fois. Les paramètres seront disponibles pour des évaluations ultérieures une fois ce processus de définition terminé.
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Representative Results
12 animaux ont été répartis au hasard dans l’un des deux groupes suivants : le groupe de déchargement (UL, n = 6) ou le groupe témoin (Ctrl, n = 6). Pour le groupe UL, les membres postérieurs des animaux ont été déchargés par la queue pendant 2 semaines (période UL), tandis que les animaux du groupe Ctrl ont été laissés libres. 2 semaines après le déchargement, le groupe UL a montré un schéma de marche distinct par rapport au groupe Ctrl. La figure 1 montre les trajectoires articulaires normalisées de sujets représentatifs. Au cours de la phase de position, le groupe UL présentait d’autres extensions du genou et de la cheville (c.-à-d. flexion plantaire pour la cheville) que le groupe Ctrl, appelé « marche des orteils »3,16. Le but de cette étude était de déterminer les caractéristiques globales de ces détériorations de mouvement. Pour élucider les mesures quantitatives de ces résultats globaux, trois paramètres ont été mis en œuvre comme indiqué ci-dessus : KSt, angle du genou à mi-ligne ; ASt, angle de la cheville; MHD, distance de la hanche métatarse (distance verticale entre la cinquième articulation métatarsophalangienne et l’articulation de la hanche), qui est pratiquement équivalente à la hauteur de l’articulation de la hanche à mi-position.
À 2 semaines (2 semaines après le déchargement), les KSt et ASt du groupe UL étaient significativement plus élevés que ceux du groupe Ctrl (Figure 2A,B, test t non apparié : p < 0,01). De plus, la MHD était considérablement plus élevée dans le groupe UL (Figure 3, test t non apparié : p < 0,01). La position de la patte à mi-parcours est illustrée à la figure supplémentaire 1.
Moins d’activité lors du déchargement pourrait provoquer des altérations neuronales22,23,24,25. Ces altérations pourraient entraîner une détérioration des caractéristiques fonctionnelles des systèmes locomoteurs 3,4 et musculo-squelettiques. Des changements significatifs dans les paramètres décrits ci-dessus peuvent être attribués à ces altérations neuronales.
Figure 1 : Trajectoires articulaires normalisées des sujets représentatifs. L’ordonnée est ajustée de sorte que les trajectoires du diagramme apparaissent approximativement au centre. (A) Les articulations du genou et (B) de la cheville dans le groupe de déchargement ont montré une extension plus longue (flexion plantaire pour la cheville) que le groupe témoin pendant la phase de position. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Angles articulaires du genou et de la cheville à mi-position. Le groupe de déchargement a montré des angles significativement plus élevés à la fois dans (A) KSt (genou) et (B) Ast (cheville) que dans le groupe témoin (test t non apparié: p < 0,01). La barre d’erreur représente l’intervalle de confiance de 95 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Hauteur de l’articulation de la hanche à mi-position. La distance de hanche du métatarse du groupe de déchargement était significativement plus élevée que celle du groupe témoin (test t non apparié : p < 0,01). La barre d’erreur représente l’intervalle de confiance de 95 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : Schéma représentant la séquence des procédures. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 1 : Position de la patte du rat à mi-position. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Vidéo supplémentaire 1 : Suivi des pas à pas à partir du bas. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire 2 : Évaluation des motions de réalisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
L’altération des environnements entraîne des fluctuations des aspects fonctionnels et des composants musculo-squelettiques des systèmes locomoteurs26,27. Les aberrations dans les structures ou les environnements contractiles peuvent affecter les capacités fonctionnelles, persistant même après la résolution des distorsions mécaniques/environnementales19. L’analyse objective du mouvement aide à mesurer quantitativement ces capacités fonctionnelles. Comme indiqué ci-dessus, l’analyse vidéo est une méthodologie puissante pour acquérir de tels paramètres.
Afin de suivre les points de repère communs pour l’analyse vidéo, l’utilisation de marqueurs infrarouges et de caméras est répandue, tandis que le suivi manuel est également courant10,28. L’utilisation de marqueurs semi-sphériques colorés combinée au processus de capture automatisé rendrait ce processus de suivi plus simple et plus rentable. Cette méthode de suivi a été intégrée à la présente étude malgré la fluctuation potentielle des résultats due au glissement cutané. Pour remédier à ce glissement cutané, Bojados et al. ont également essayé une approche radiographique avec des marqueurs implantés directement sur l’os sous la peau17.
Un autre avantage de l’analyse du mouvement est qu’elle extrait plusieurs aspects fonctionnels une fois que l’ensemble de données fondamentales est obtenu. Étant donné que les mouvements caractéristiques diffèrent en termes de fonctions affectées, la transformation des données en paramètres distincts, même après la collecte des données, serait un avantage substantiel. Même le suivi des pas est réalisable avec un miroir placé à 45º incliné sous la plate-forme de marche. De plus, l’application de l’analyse vidéo ne se limite pas au mouvement de marche (vidéos supplémentaires 1, vidéo supplémentaire 2).
Malgré ces avantages, l’analyse de mouvement, en particulier l’approche d’analyse 3D, a des limites. Tout d’abord, étant donné que la méthodologie fonctionne comme une constellation d’appareils (c.-à-d. un tapis roulant pour les animaux, plusieurs caméras, applications), l’ensemble de la configuration des appareils peut être coûteux. Deuxièmement, la procédure expérimentale exige beaucoup de main-d’œuvre et les opérateurs doivent s’y habituer pleinement.
Cependant, compte tenu de son applicabilité à la fois à l’analyse de la démarche et à l’angle articulaire, ses avantages l’emportent sur ses inconvénients s’il devient largement disponible. Les travaux futurs pourraient utiliser l’analyse vidéo dans un plus large éventail d’évaluations fonctionnelles pour permettre cette série d’analyses.
Le suivi/évaluation des mouvements 3D est un outil puissant pour évaluer quantitativement les altérations fonctionnelles des mouvements. Les obstacles à la mise en œuvre de cette méthodologie peuvent être résolus par d’autres études.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue en partie par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) KAKENHI (n° 18H03129, 21K19709, 21H03302, 15K10441) et l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) (n° 15bk0104037h0002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive Tape | NICHIBAN CO.,LTD. | SEHA25F | Adhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Auto clicker | N.A. | N.A. | free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker) |
| CCD Camera | Teledyne FLIR LLC | GRAS-03K2C-C | CCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture |
| Cotton Thread | N.A. | N.A. | Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| Joint marker | TOKYO MARUI Co., Ltd | 0.12g BB | 6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification |
| Kine Analyzer | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for analysis |
| Konishi Aron Alpha | TOAGOSEI CO.,LTD. | #31204 | Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats |
| Motion Recorder | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for video recording |
| Paint Marker | MITSUBISHI PENCIL CO., LTD | PX-21.13 | Oil based paint marker to mark toes of animals |
| Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals) | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | 3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/) |
| Three-dimensional(3D) Calculator | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software fo marker tracking |
| Treadmill | MUROMACHI KIKAI CO.,LTD | MK-685 | Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit |
| Wistar Rats (male, 7-week old) | N.A. | N.A. | Commercially available at experimental animal sources |
References
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