Summary
Denne protokollen beskriver induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt i en musemodell ved bruk av myelin oligodendrocyttglykoprotein og overvåking av sykdomsprosessen ved hjelp av et klinisk skåringssystem. Eksperimentelle autoimmune encefalomyelittrelaterte symptomer analyseres ved hjelp av mus femur mikro-computertomografi analyse og åpent felt test for å vurdere sykdomsprosessen omfattende.
Abstract
Multippel sklerose (MS) er en typisk autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) preget av inflammatorisk infiltrasjon, demyelinisering og aksonal skade. For tiden er det ingen tiltak for å kurere MS helt, men flere sykdomsmodifiserende terapier (DMT) er tilgjengelige for å kontrollere og redusere sykdomsprogresjonen. Det er signifikante likheter mellom CNS-patologiske trekk ved eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) og MS-pasienter. EAE har blitt mye brukt som en representativ modell for å bestemme MS-stoffets effekt og utforske utviklingen av nye terapier for MS-sykdom. Aktiv induksjon av EAE hos mus har en stabil og reproduserbar effekt og er spesielt egnet for å studere effekten av legemidler eller gener på autoimmun nevroinflammasjon. Metoden for immunisering av C57BL/6J-mus med myelinoligodendrocyttglykoprotein (MOG35-55) og daglig vurdering av sykdomssymptomer ved hjelp av et klinisk skåringssystem deles i hovedsakelig. Gitt den komplekse etiologien til MS med ulike kliniske manifestasjoner, kan det eksisterende kliniske poengsystemet ikke tilfredsstille vurderingen av sykdomsbehandling. For å unngå manglene ved en enkelt intervensjon, opprettes nye indikatorer for å vurdere EAE basert på kliniske manifestasjoner av angstlignende stemninger og osteoporose hos MS-pasienter for å gi en mer omfattende vurdering av MS-behandling.
Introduction
Autoimmune sykdommer er et spekter av lidelser forårsaket av immunsystemets immunrespons mot egne antigener som resulterer i vevskader eller dysfunksjon1. Multippel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun sykdom av polyneuropati i sentralnervesystemet (CNS), preget av inflammatorisk infiltrasjon, demyelinisering og neuronal aksonal degenerasjon 2,3. For tiden har MS påvirket så mange som 2,5 millioner mennesker over hele verden, for det meste unge og middelaldrende mennesker i alderen 20-40, som ofte er ryggraden i deres familier og samfunn. Dette har ført til betydelig innvirkning og skade for familier og samfunn 2,4.
MS er en multifaktoriell sykdom med varierte og komplekse kliniske manifestasjoner. I tillegg til klassiske nevrologiske lidelser preget av inflammatorisk infiltrasjon og demyelinisering, viser MS ofte synshemming, lemmer dyskinesi og kognitive og emosjonelle lidelser 5,6,7. Hvis MS-pasienter ikke får riktig og riktig behandling, vil halvparten av dem sitte i rullestol etter 20 år, og nesten halvparten av dem vil oppleve depressive og angstsymptomer, noe som fører til mye høyere nivåer av selvmordstanker enn den generelle befolkningen 8,9.
Til tross for en lang forskningsperiode forblir etiologien til MS unnvikende, og patogenesen av MS er ennå ikke belyst. Dyremodeller av MS har gjort det mulig å tjene som testverktøy for å utforske sykdomsutvikling og nye terapeutiske tilnærminger, til tross for de betydelige forskjellene mellom gnagere og humane immunsystemer, samtidig som de deler noen grunnleggende prinsipper. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er for tiden den ideelle dyremodellen for å studere MS, som bruker autoantigenimmunitet fra myelinproteiner for å indusere autoimmunitet mot CNS-komponenter hos følsomme mus, med tillegg av komplett Freunds adjuvans (CFA) og kikhostetoksin (PTX) for å forbedre den humorale immunresponsen. Avhengig av genetisk bakgrunn og immunantigener, oppnås forskjellige sykdomsprosesser, inkludert akutt, relapsing-remitting eller kronisk, for å etterligne ulike kliniske former for MS10,11,12. De relevante immunogenene som vanligvis brukes i konstruksjonen av EAE-modeller, kommer fra selv-CNS-proteiner, som myelin basisk protein (MBP), proteolipidprotein (PLP) eller myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG). MBP- eller PLP-immuniserte SJL / L-mus utvikler et relapsing-remitting kurs, og MOG utløser kronisk progressiv EAE i C57BL / 6 mus11,12,13.
Hovedformålet med sykdomsmodifiserende terapi (DMT) er å minimere sykdomssymptomer og forbedre funksjon6. Flere legemidler brukes klinisk for å lindre MS, men ingen medisiner har ennå blitt brukt til å helbrede det helt, noe som avslører nødvendigheten av synergistisk behandling. C57BL / 6-mus er for tiden de mest brukte til å konstruere transgene mus, og i dette arbeidet ble en EAE-modell indusert av MOG35-55 i C57BL / 6J-mus med en 5-punkts skala brukt til å overvåke sykdomsprogresjonen. EAE-modeller lider også av angstlignende stemninger og bentap, og de allment kjente demyeliniserende lesjonene. Her beskrives også metoden for å vurdere symptomene på EAE fra flere perspektiver ved hjelp av åpen felttest og mikro-computertomografi (Micro-CT) analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Care Committee of Tongji University godkjente det nåværende arbeidet, og alle retningslinjer for dyrepleie ble fulgt. Mannlige eller kvinnelige C57BL / 6J-mus mellom 8-12 ukers alder ble brukt til forsøkene. Det ble sørget for at alder og kjønn var det samme i forsøksgruppene; Ellers ble følsomheten for sykdommen påvirket. Musene ble plassert i et spesifikt patogenfritt miljø med vekslende 12 timers lyse og mørke sykluser under konstante forhold (romtemperatur 23 ± 1 °C, fuktighet 50 % ± 10 %), med fri tilgang til musemat og vann.
1. Fremstilling av MOG35-55 emulsjon
- Tilsett varmeinaktivert lyofilisert Mycobacterium tuberculosis (MTB, H37Ra) for å fullføre Freunds adjuvans (som i seg selv inneholder 1 mg/ml varmeinaktivert MTB, H37Ra), noe som resulterer i en endelig MTB-konsentrasjon på 5 mg/ml (se materialtabell).
MERK: Hele operasjonen må fullføres i biosikkerhetsskapet; Ikke åpne blåseluften. - Oppløs det lyofiliserte MOG35-55-peptidet (se materialtabell) med sterilt forkjølt fosfatbufret saltvann (PBS) (uten kalsium- og magnesiumioner, pH 7,4) for å fremstille antigenoppløsningen i konsentrasjonen av 2 mg / ml.
- Ta et rent 2 ml mikrosentrifugerør og tilsett en sterilisert 5 mm stålkule (se materialtabell) til hvert rør.
- Tilsett 500 μL komplett Freunds adjuvans inneholdende 5 mg/ml MTB og 500 μL MOG35-55 antigenoppløsning til mikrosentrifugerøret ovenfor som inneholder en stålkule.
- Osciller røret ovenfor på en TissueLyser (se materialtabell) i 10 minutter, avkjøl på is i 10 minutter, og gjenta fire ganger for å blande det godt og til slutt danne en hvit viskøs løsning.
MERK: God emulgering er et viktig trinn i fremstillingen av MOG35-55 emulsjon, så grundig blanding er nødvendig. TissueLyser er satt til en hastighet på 28 Hz.
2. Tilberedning av kikhostetoksin (PTX)
- Forbered PTX med ddH2O i en konsentrasjon på 100 μg / ml og oppbevar ved 4 ° C.
- Fortynn PTX-stamløsningen 50 ganger med steril 1x PBS (uten kalsium- og magnesiumioner, pH 7,4) for å lage en 200 ng / 100 μL-løsning for bruk.
3. Etablering av EAE dyremodell
- Konstruer EAE-modellen ved hjelp av de 8-12 uker gamle mannlige eller kvinnelige C57BL / 6J-musene. Sørg for at musene er tilstrekkelig akklimatisert til fôringsmiljøet før immunisering.
- Sentrifuge den fremstilte MOG35-55 emulsjonen (trinn 1) ved 4 °C i 2-3 s ved å trykke på pulsknappen på utstyret (se materialtabell) for å utfelle alle emulsjonene i bunnen av røret.
MERK: MOG35-55 emulsjon kan oppbevares ved -20 °C i flere dager. For å unngå narkotikafeil anbefales det å bruke det så snart som mulig. - Fest en 22 G kanyle til en 1 ml sprøytesylinder, aspirer MOG 35-55 emulsjonen, og overfør MOG35-55 emulsjonen til en ny 1 ml sprøytesylinder. Fest forbindelsen mellom 1 ml sprøytesylinder og en 26 G kanyle med forseglingsfilm (se Materialfortegnelse).
MERK: Unngå luftbobler når du legger MOG35-55 emulsjon i 1 ml sprøytefat. - Tørk og desinfiser injeksjonsstedet med 70% etanol.
- Injiser MOG35-55-emulsjonen subkutant på hver side av musenes ryggrad, 100 μL på hver side. Vær oppmerksom på automatisk dannelse av pæremasser under huden på musens dorsum etter at injeksjonsoperasjonen er fullført.
MERK: Sørg for at erfarne eksperimenter utfører immuniseringsprosessen og at injeksjonen gjøres forsiktig og sakte for å minimere trykket på mus. - Injiser ovennevnte mus intraperitonealt med 100 μL PTX (trinn 2).
MERK: Dagen for immunisering er dag 0. Sørg også for at musene kan identifiseres nøyaktig for påfølgende daglig evaluering, for eksempel å bruke en fargemarkør på musenes hale. - Injiser samme dose PTX på dag 2 etter immunisering.
- Forbered en gruppe ikke-immuniserte mus som villtype (WT) mus.
4. Klinisk overvåking av mus
- Registrer kroppsvekten til EAE- og WT-mus daglig.
MERK: Alvorlighetsgraden av EAE er positivt korrelert med vekttap av mus, så kroppsvekt er også en svært viktig overvåkingsindeks. - Overvåk musens status fra 0-21 dager etter immunisering ved hjelp av 0-5 skåringssystemet oppført i tabell 1.
MERK: Symptomer i mellom telles som pluss eller minus 0,5 poeng.
5. Åpne felttest
MERK: Forsøksdyrene som er valgt for dette trinnet er EAE-mus i de tidlige utbrudds-, topp- og remisjonsperiodene. I tillegg ble WT-mus brukt som kontroll. Det skal bemerkes at alle mus ble testet for angstlignende oppførsel før modellering for å utelukke mus med angstlidelser for EAE-modellering. I tillegg ble EAE-mus i topp- og remisjonsperioder med fullstendig motorisk uførhet ekskludert fra testen.
- Forbered et 40 × 40 × 40 cm3 åpent feltreaksjonskammer og et bevegelsesaktivitet (åpent felt) videoanalysesystem (se materialtabell).
MERK: Kameraet er installert i en posisjon som helt dekker boksen, reaksjonsrommet er jevnt opplyst, og testrommet må være et rolig område. - Plasser testmusene i testrommet for tilvenning 1 time før du starter forsøket.
- Spray hele området med 70% etanol og tørk av med et rent papirhåndkle for å sikre at reaksjonskammeret er rent før du starter testen.
- Fjern hver mus individuelt fra buret og plasser den i samme hjørne av arenaen før du begynner å utforske.
MERK: Bunnen av boksen er delt inn i 16 rutenett, hvorav det midterste fire rutenettområdet er det sentrale området og det omkringliggende området er det perifere området. - Klikk på Start Capture-knappen i menylinjen i videoanalysesystemet, registrer tid og begynn å skyte.
- Vær stille i testrommet.
- La musen bevege seg fritt i 5 minutter under opptaksprosessen.
- Stopp anskaffelsessystemet og lagre videoen.
- Ta musen ut av arenaen, sett den tilbake i buret, og fortsett til neste mus.
MERK: Rengjør testområdet med 70% etanol mellom løpene for å fjerne lukt og andre stoffer. - Analyser resultatene ved hjelp av videoanalysesystemet.
6. Analyse av beinfenotype
- Avlive EAE- og WT-musene ved cervikal dislokasjon den 21.
MERK: Personell som utfører cervikale dislokasjonsoperasjoner må være godt trent for å minimere smerten som utholdes under dyrets død. - Få musen til å ligge flatt i et dissekeringsbrett og fikse ekstremiteter.
- Hold musens bakre lemhud med tang og åpne musens hud og muskelvev med saks.
- Skill lårbenet fra tibia og hoftebenet forsiktig med saks.
- Fjern muskelen som fester seg til lårbenet med saks og legg lårbenet i 70% etanol ved romtemperatur.
- Skann det distale lårbenet ved hjelp av et mikro-CT-system (se materialtabell) med en isotropisk voxelstørrelse på 10 μm, med en topp røntgenrørspenning på 70 kV og en røntgenintensitet på 0,114 mA.
MERK: Et Gauss-3D-filter gjør det mulig å denoisere 2D-terskelbilder. - Analyser de 100 skivene som er skannet fra den midterste lårbensakselen for å måle lårbensparametere, inkludert beinvolum, vevsvolum, beinmineraltetthet, trabekulært separasjon, trabekulært tall, trabekulært forbindelsestetthet og trabekulært og kortikal tykkelse.
MERK: Fra den proksimale enden av den distale lårbensvekstplaten hos mus, ble det funnet seksjoner helt uten epifyseale hettestrukturer og fortsatte å utvide 100 skiver mot det proksimale lårbenet, som manuelt ble skissert konturer ved flere voxels vekk fra den indre kortikale overflaten for å identifisere epifyseale trabeculae. - Lag 3D-rekonstruksjonene ved å stable terskel 2D-bilder fra konturområder i mikro-CT-systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter immunisering av musene registreres musens kroppsvekt daglig, og deres kliniske symptomer evalueres i henhold til protokollen beskrevet ovenfor (trinn 4). I C57BL / 6J mus immunisert med MOG-peptid, fordi lesjonens plassering hovedsakelig er begrenset til ryggmargen, sprer patogenesen av EAE-mus seg fra haleenden til hodet. I begynnelsen av sykdommen viser EAE-mus svakhet og hengende i halen, etterfulgt av svakhet i bakre lemmer, ukoordinert bevegelse og lammelse. Etter hvert som sykdommen forverres, utvikler den seg gradvis til svakheten i forbenene, lammelse, og i alvorlige tilfeller forårsaker vanskeligheter med å bevege musene og til og med nær døden. Som vist i figur 1A viser tilstandsdiagrammet til musene med ulik grad av EAE-patologi et forbilledlig bilde av en gruppe mus som skifter fra asymptomatiske til høyskårne EAE-symptomer (skår 4). Det har også blitt nevnt tidligere at kroppsvekten til EAE-mus er korrelert med kliniske symptomer. Sammenlignet med WT-mus, kan vekttap hos EAE-mus begynne å forekomme i de første dagene etter immunisering, mens de kliniske symptomene på EAE-mus vanligvis begynner på dag 6-9 etter immunisering og vil nå en topp på dag 14-16. Etter dette gjenoppretter symptomene på EAE-mus vanligvis delvis, og samtidig vil vekttapet til musene bli lindret (figur 1B, C). Dermed er løpet av EAE-utbruddet vanligvis delt inn i tidlig utbrudd, topp og remisjonsperioder, og prediksjonen av disse tidspunktene er viktig for å vurdere utfallsparametere. Generelt, for å analysere produksjonen av immunceller og cytokiner på stedet for EAE-lesjoner, kan immunceller i hjernen og ryggmargen til EAE-mus på toppen av sykdommen isoleres og viderebehandles, som kan analyseres ved flowcytometri14,15. Ryggmargsvevet ved topp debut er også mest egnet for fremstilling av hematoksylin og eosin (H&E) farging og Luxol rask blå farging for videre å undersøke inflammatorisk celleinfiltrasjon og demyelinisering av ryggmargen14,16. For overvåking av endringer i immunsystemet ved ulike utbruddstider av EAE, milt og lymfeknuter ved tidlig debut er også viktige alternativer17,18. I tillegg brukes celler fra milten eller lymfeknuter av MOG-immuniserte EAE-mus ofte til å konstruere overføringsmodeller, som overføres til mottakermus etter restimulering av MOG in vitro for å indusere passiv immunisering av EAE-mus18.
MS er en autoimmun inflammatorisk indusert demyeliniserende lesjon i sentralnervesystemet preget av inflammatorisk demyelinisering og nevronalt tap 2,3. Denne sykdommen er vanligvis ledsaget av psykiatriske comorbiditeter, for eksempel affektive lidelser, hvorav angstlidelse er svært vanlig hos MS-pasienter, med opptil 30% av MS-pasientene som lider av angst 9,19. Angstlidelse er en psykiatrisk abnormitet preget av overdreven følelsesmessig stress og bekymring. Åpne felttest brukes ofte til å analysere atferd for angst hos gnagere20,21. Ved hjelp av å analysere utforskningsatferdene til EAE-mus i åpne felttester under tidlige begynnelses-, topp- og remisjonsperioder, ble det funnet at EAE-mus også hadde angstlignende atferd som ligner på MS-pasienter (figur 2A). I den åpne felttesten har engstelige gnagere en tendens til å ha redusert aktivitet og økt stereotyp oppførsel, inkludert en preferanse for å være nærmere hjørner, en skjevhet mot det perifere domenet og mangel på ønske om å utforske det sentrale området. Sammenlignet med WT-mus hadde EAE-mus signifikant lavere gangavstand og bevegelsestid i alle tre perioder av sykdommen, selv i tidlig sykdomsutbrudd da EAE-mus ennå ikke hadde motorisk svekkelse (figur 2B, C). I tillegg passerer EAE-mus betydelig mindre avstand og holder seg i det sentrale området mindre enn normale mus, og beveger seg til og med bare i det perifere området, og viser åpenbar angstlignende stemning (figur 2D, E). EAE-mus viser fortsatt et sterkt angstlignende humør når utbruddet er mildt, det vil si motorisk koordinering. Noen studier tyder på at dette kan tilskrives mild nevroinflammasjon, noe som ytterligere påvirker nevrotransmittersekresjonen22,23. Åpne felttester som overvåker angstlignende humørutløsere hos EAE-mus, kan hjelpe forskere å forstå og behandle MS-psykiatriske comorbiditeter.
Med sykdommens fremgang manifesterer MS seg til slutt som dyskinesi. Studier har funnet at MS-pasienter har høyere følsomhet for osteoporose og brudd, hovedsakelig på grunn av tap av benmasse, og at alvorlighetsgraden av dyskinesi er sterkt korrelert med pasientens bentetthet24,25. Et lignende fenomen kan observeres ved mikro-CT-analyse ved hjelp av EAE-dyremodellen (figur 3A, H). Fra trabekulære analysedata av lårben hos mus gjennomgikk EAE-mus en signifikant reduksjon i beinmineraltetthet (BMD) sammenlignet med WT-mus, noe som er en viktig indikator på responsen på beinstyrke og et viktig grunnlag for diagnosen osteoporose (figur 3B). Videre analyse viste at trabekulært bentap forekom signifikant hos EAE-mus sammenlignet med friske WT-mus og ble ledsaget av en reduksjon i trabekulært forbindelsestetthet, trabekulære tall og trabekulært tykkelse. Disse er alle karakteristiske for redusert benmasse, noe som tyder på at EAE også forårsaker trabekulært bentap i lårbenet til mus (figur 3C-F). Samtidig endret den strukturelle morfologien til beintrabekulaene, og avstanden mellom trabeculae økte betydelig; jo større avstand, jo mer osteoporotisk bein (figur 3G). Dette er i samsvar med forestillingen om at MS-pasienter er utsatt for osteoporose. I kortikale bein i lårbensdiafysen var tykkelsen av kortikal bein i EAE-modellen signifikant mindre enn hos normale mus (figur 3I). Ved MS er redusert motilitet og økt muskeldystrofi sterkt assosiert med osteoporose, brudd og økt benresorpsjon på grunn av reduserte mekaniske krefter, gradvis redusert beinintegritet, og øker dermed risikoen for osteoporose og brudd26. Mikro-CT-analyse av lårbenet hos EAE-mus kan overvåke beinhelsen godt, og intervensjonen er gunstig for å kontrollere tilstanden til EAE.
Figur 1: Overvåking av kliniske symptomer på EAE. (A) Det eksemplariske bildet av musene med forskjellige grader av EAE-patologi. (B) Vektendring i WT- og EAE-mus. (C) Klinisk score hos WT- og EAE-mus. Data er oppgitt som gjennomsnitt ± SEM (n = 5), ***p < 0,001 versus WT-mus,toveis ANOVA-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Angstlignende oppførsel hos EAE-mus i den åpne felttesten. (A) Representative sporplott av den åpne felttesten. Reiseavstand (B), varighet av aktivitet (C), reiseavstand i sentrum (D) og tid brukt i sentrum (E) av WT-mus og EAE-mus i tidlige, topp- og ettergivelsesperioder. Data er gjennomsnitt ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus WT-mus, Student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mikro-CT-analyse av beinhelse hos EAE-mus. (A) Representative 3D-bilder av femoral trabekulært arkitektur (skala barer, 100 μm). Benmineraltetthet (B), benvolum/vevsvolumforhold (C), forbindelsestetthet (D), tall (E), tykkelse (F) og separasjon (G) av femoralt trabekulært ble bestemt ved mikro-CT-analyse. (H) Representative 3D-bilder av kortikale bein (skalastenger, 100 μm). (I) Kortikal tykkelse oppnådd fra mikrocomputertomografidata. Data er gjennomsnitt ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus WT-mus, Student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Score | Klinisk tegn | ||
| 0 | Ingen kliniske tegn | ||
| 0.5 | Hale svakhet, foran på halen slippe | ||
| 1 | Halen helt lammet | ||
| 2 | Mild lammelse av bakre lemmer (svakhet i begge bakre lemmer eller ensidig lammelse, ukoordinert gange, respons på klemme) | ||
| 3 | Fullstendig lammelse av bakre lemmer, bakre lemmer som drar og går, bakre lemmer reagerer ikke på å klemme | ||
| 4 | Lammelse av bakre lemmer og svakhet i forbenene | ||
| 5 | Nær døden eller døende | ||
Tabell 1: Klinisk skåringssystem.
| Antigen | Belastning | Karakteristisk | Søknad | Begrensning | ||
| PLP | SJL/J34 | Relapsing-remitting EAE | Studie av cellulære og molekylære hendelser involvert i klinisk tilbakefall | Begrenset til T-cellespesifikke responser; Å studere spesifikke gener og veier i SJL / J-stammen er utfordrende | ||
| MBP | SJL/J35 | Relapsing lammelse fulgt hos delvis eller total mottaker etter utvinning fra akutt lammelse | Studie av nevroinflammasjon og immunsystemaktivering | Begrenset til T-cellespesifikke responser; Å studere spesifikke gener og veier i SJL / J-stammen er utfordrende | ||
| MOG35-55 | C57BL/631 | Primær progressiv EAE; Kronisk progressiv EAE | Studie av aksonale skademekanismer; Studie av molekylære sykdomsmekanismer i transgene modeller og knockoutmodeller | Studier av primær demyelinisering og myelinregenerering har begrenset verdi | ||
| Ryggmargen homogenat | Biozzi ABH36 | Relapsing-remitting EAE | Studie av myelinregenerering og nevrobeskyttende terapi for MS | Ikke klinisk progressiv, med akkumulering av nevrologiske underskudd over tid; Begrenset til CD4 T-cellespesifikke responser | ||
| Theilers murine encefalomyelittvirus | Flere musestammer er svært utsatt, inkludert SJL/J, SWR, PL/J12,31 | Virale modeller av inflammatorisk demyelinisering | Studie av aksonal skade og betennelsesindusert demyelinisering | Ingen MS-spesifikke virusinfeksjoner er identifisert; Myelinregenerering er vanskelig å vurdere, demyelinisering og myelinregenerering forekommer samtidig | ||
| Cuprizone | Mye brukt i C57BL / 6-mus, mens andre stammer, som CD1-stammen, er mindre utsatt for kobbercuprizonindusert skade37,38 | Giftig modell for demyelinisering og remyelinisering | Studie av T-celleuavhengig demyelinisering, spesielt myelinregenerering og grunnleggende myelinreparasjonsprosesser | Signifikant spontan myelinregenerering oppstår etter opphør av giftig skade; Demyelinisering er hjerneregionsspesifikk og ikke nyttig for å studere demyelinisering av ryggmargen | ||
| Lysolecitin | SJL/J12, C57BL/639 osv. | Giftig modell for demyelinisering og remyelinisering | Studie av T-celleuavhengig demyelinisering, spesielt myelinregenerering og grunnleggende myelinreparasjonsprosesser | Mangel på immunrespons observert under MS | ||
| Ethidiumbromid | C57BL/640 osv. | Giftig modell for demyelinisering og remyelinisering | Studie av fokale demyeliniserende lesjoner og prediksjon av kinetikken til demyelinisering og myelinregenerering | Ethidiumbromid skader alle nukleolusholdige celler; Begrenset korrelasjon med MS | ||
Tabell 2: Ulike musemodeller av MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MS er en demyeliniserende inflammatorisk sykdom i CNS og er en av de vanligste nevrologiske lidelsene som forårsaker kronisk funksjonshemming hos unge mennesker, og pålegger familier og samfunnen stor byrde 3,4. MS har alltid vært klassifisert som en organspesifikk T-cellemediert autoimmun sykdom, noe som induserer det autoimmune systemet til sakte å erodere CNS, som vil involvere flere systemer i hele kroppen27. Typiske kliniske symptomer inkluderer synshemming, motoriske lidelser, kognitive og emosjonelle forstyrrelser, etc 6,7. MS er en ødeleggende sykdom som gradvis vil forverres hvis den ikke behandles riktig, noe som fører til alvorlig blindhet og lammelse28. Patogenesen av MS er ennå ikke fullt ut forstått, da dets kliniske manifestasjoner og patologiske progresjon er heterogene, og derfor er dyremodeller avgjørende for forskning og utvikling av behandling av MS.
Den mest studerte dyremodellen for MS er EAE, som hovedsakelig har to modelleringsmetoder: aktiv immunisering og passiv immunisering29. Den førstnevnte er allment vedtatt på grunn av sin enkelhet, mangel på musebestråling og kort syklustid. EAE aktiv immunmodell induserer autoimmune responser i CNS ved å immunisere gnagere med selvmyelinantigener eller deres påfølgende peptider, vanligvis manifestert som hale svakhet og lemmer lammelse13. Spesielt er EAE-modellen indusert av MOG 35-55 i C57BL / 6J-mus preget av vekslende remisjon-tilbakefallssykluser, ledsaget av CNS-betennelse, demyelinisering og aksonal skade, noe som gjør MOG35-55-indusert EAE til den foretrukne modellen 11,12. EAE kan godt induseres hos mus sensibilisert ved subkutan injeksjon av MOG 35-55 peptid, emulgert med immunopotentiator CFA beriket med MTB, og gitt en intraperitoneal injeksjon av PTX med blod-hjernebarriereforstyrrende effekt på dagene0-2 30. Den største utfordringen for EAE-modellen er den lave forekomsten av svake symptomer, og flere påvirkningsfaktorer er kritiske for forsøksforløpet. (1) Musens alder og miljø vil påvirke følsomheten for EAE. Derfor må mus av samme alder velges før forsøket. Musene skal vektes og grupperes tilfeldig før burallokering, og vekten av hver gruppe må holdes nær. Sørg også for at miljøforholdene mellom uavhengige eksperimenter er sammenlignbare. (2) Konsentrasjonen av PTX: Hovedrollen til PTX er å øke permeabiliteten til blod-hjernebarrieren, noe som gjør at patogene T-celler kan komme inn i CNS for å utskille relevante cytokiner og fremme inflammatorisk respons, noe som til slutt fører til hydrolyse av myelinproteiner innpakket i det ytre laget av nerveaksoner. Sykdomsdebuten hos EAE-mus ble forsinket med redusert PTX-administrasjonskonsentrasjon, og alvorlighetsgraden av sykdommen ville bli svekket dersom PTX ble redusert med mer enn 60%. (3) Oppløsning av MOG 35-55 antigen: For å unngå frysing og tining anbefales det å anskaffe det lyofiliserte MOG35-55 antigenet i separate pakker, 4 mg/rør, for å unngå frysing og tining. PTX brukes også til oppløsning i stedet for sterilt vann fordi det er bedre å emulgere med CFA ved bruk av PTX. (4) MOG35-55 antigen og CFA må være tilstrekkelig emulgert ved å svinge for å danne en vann-i-olje-struktur, og emulsjonsdråpene sprer seg ikke på vannoverflaten i lang tid, noe som indikerer god emulgering. (5) To-punkts injeksjon ble brukt til mus EAE modellering. Injeksjonsstedet er fortrinnsvis plassert over midjen og under nakken, nær ryggraden, for å unngå at mus slikker og biter huden, noe som resulterer i søl av MOG35-55 emulsjon.
Imidlertid har EAE-modellen indusert av MOG35-55-antigenet fortsatt noen begrensninger. Som en inflammatorisk encefalopatimodell av primær aksonal skade mediert av CD4 T-celler, er hovedlesjonen massiv aksonal degenerasjon med sekundær demyelinisering og mindre primær demyelinisering, noe som er forskjellig fra MS-patologien31,32,33. EAE-modellen indusert av MOG 35-55 reflekterer hovedsakelig immunresponsen drevet av CD4 T-celler, mens andre immunceller som CD8 T- ogB-celler ikke har en sterk følelse av deltakelse i denne modellen31. En annen begrensende faktor er at EAE indusert av MOG 35-55 har en viss skjevhet mot den immunologiske komponenten av MS-patofysiologi, og andre dyremodeller kan vurderes når man vurderer studier fokusert på CNS-patologier, for eksempel studiet av demyelinisering og myelinregenereringsprosesser 34,35,36,37,38,39,40, som beskrevet i tabell 2 .
EAE er en effektiv prediktor for å etterligne de autoimmune egenskapene til MS, så vel som dens betennelse og demyeliniseringsmekanisme12, noe som gjør mange lærde opptatt av å studere immunmodulerende mekanismer, og ignorerer andre kliniske symptomer på MS. Studier har vist at MS-assosiert angst tilskrives patofysiologiske prosesser som immundysregulering og hjernebetennelse22, 23,41. Psykiske problemer, som angst, er spesielt vanlige hos personer med MS, og angstlidelse kan hindre utførelsen av grunnleggende daglige oppgaver og påvirke livskvaliteten betydelig42,43. Endringer i den lokomotoriske evnen til EAE-mus kan forutsi endringer i nevrale prosesser. I åpne felteksperimenter oppstod angstlignende atferd hos EAE-mus, inkludert en reduksjon i utforskende atferd som startet tidlig sykdomsutbrudd (i hovedsak testpersoner med kliniske score <0,5 og lokomotorisk evne nesten like god som normale mus), noe som tyder på at utbruddet av angstlignende atferd går foran motorisk svekkelse. I tillegg forbedret EAE-mus i ettergivelsesperioden ikke angstlignende oppførsel med økt motorisk evne. Fremveksten av den inflammatoriske responsen kan være ansvarlig for mental svekkelse hos EAE-mus gjennom nevronaktivitet, noe som fører til endringer i humør, og oppregulering av inflammatoriske cytokinnivåer forstyrrer striatal synaptisk funksjon før utbruddet av motorisk svekkelse23,41. Den åpne felttesten krever imidlertid oppmerksomhet på at testrommet må være et rolig område, og testmusene må akklimatisere seg til rommet i 1 time på forhånd for å unngå for høyt trykk forårsaket av det nye miljøet. Ytterligere rengjøring med etanol er nødvendig mellom testene for å fjerne lukt og andre stoffer etterlatt av den siste testpersonen. Hovedbegrensningen til den åpne felttesten er forstyrrelsen forårsaket av motorisk dysfunksjon hos EAE-mus, og testen for evaluering av gnagerangstlignende oppførsel er basert på avstand, tid og rekkevidde av gnageraktivitet i reaksjonskammeret, og kan ikke utelukke effekten av motorisk dysfunksjon på angstlignende oppførsel. Derfor må fremtidige studier ta hensyn til lokomotorisk svekkelse.
Tradisjonelle metoder for å analysere beinvevsrelaterte studier bruker ofte todimensjonal beinseksjonsmikroskopi, noe som kan ha større vanskeligheter med å analysere strukturell morfologi, tetthetsfordeling, orienteringsfordeling og andre egenskaper på grunn av påvirkning av todimensjonale plan og inhomogenitet av biologiske prøver. Mange studier har bekreftet nøyaktigheten og effektiviteten til Micro-CT-systemet for å beskrive beinmorfologi, og mange studier44,45,46 har bekreftet mikrostrukturdeteksjonsresultater. Den tredimensjonale avbildningen av beinvev ved mikro-CT muliggjør mer intuitive og nøyaktige benhistomorfometriresultater. Det har blitt oppnådd å skanne små dyr og prøver uten å utføre dyret eller skade vevsprøven, noe som muliggjør detaljert tredimensjonal romlig strukturinformasjon inne i vevet44. Studier har vist at MS-pasienter er utsatt for benmassetap og osteoporose24,25; Ved å skanne og avbilde lårbenet til EAE-mus med et mikro-CT-system, kunne en åpenbar forverring av beinmikroarkitektur og redusert beinstyrke observeres i lårbenet til EAE-mus sammenlignet med WT-mus som hadde utviklet osteoporose. Mikro-CT-analyse er relativt enkel å utføre og relativt billig, og Micro-CT live imaging kan brukes til å overvåke beinhelse i fremtiden når behandling administreres til EAE-mus. Ulempen er imidlertid fraværet av beinomsetningsmarkører vurdert gjennom blodprøver eller beinhistomorfometri for å observere grunnleggende endringer i benmetabolsk homeostase hos EAE-mus47. Regulering av osteoblaster og osteoklaster kan vurderes i studien i fremtiden.
MS er en multisymptomsykdom, og det eneste målet med sykdomsbehandling er å minimere sykdomssymptomer. I protokollen nevnt ovenfor kan de kliniske symptomene på MS simuleres ved å konstruere den MOG35-55-induserte EAE-modellen . EAE-mus viste kliniske symptomer på motorisk dysfunksjon og angstlignende oppførsel og osteoporose. 5-punkts poengsystemet, åpen felttest og mikro-CT-analyse beskrevet i denne protokollen kan overvåke de patologiske symptomene på EAE-mus fra flere perspektiver og gi et referanseskjema for behandling av EAE. I mangel av effektive sykdomsmodifiserende legemidler kan en potensiell kombinasjon av synergistisk terapi gi den beste muligheten til å lindre symptomer og forbedre funksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner støtten fra National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) og State Key Laboratory of Drug Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe(with 26 G needle) | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017031 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | HAIKELASI | KY-LXG2A | |
| 22 G needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017208 | |
| Complete Freund’s Adjuvant | Sigma | F5881 | Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL |
| Conditioned place preference system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | Stored at RT |
| Locomotion activity (open field) video analysis system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | DigBehv-002 | Animal behavior |
| MOG35-55 peptide | Gill Biochemical Co., Ltd | GLS-Y-M-03590 | Stored at -20 °C |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | BD | 231141 | Stored at 4 °C |
| Open field reaction chamber | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Pertussis toxin | Calbiochem | 516560 | Stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | Made in our laboratory | ||
| Scissor | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | J21010 | |
| Sealing film | Heathrow Scientific | HS 234526B | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002447 | |
| Steel ball | QIAGEN | 69975 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tweezer | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | JD1060 | |
| μCT 35 desktop microCT scanner | Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland |
References
- Zhernakova, A., Withoff, S., Wijmenga, C. Clinical implications of shared genetics and pathogenesis in autoimmune diseases. Nature Reviews Endocrinology. 9 (11), 646-659 (2013).
- Filippi, M., et al.
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. Europen Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Rietberg, M. B., Veerbeek, J. M., Gosselink, R., Kwakkel, G., van Wegen, E. E. Respiratory muscle training for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 12 (12), (2017).
- O'Brien, K., Gran, B., Rostami, A. T-cell based immunotherapy in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Immunotherapy. 2 (1), 99-115 (2010).
- Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
- Li, H., Lian, G., Wang, G., Yin, Q., Su, Z. A review of possible therapies for multiple sclerosis. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (9), 3261-3270 (2021).
- Lewis, V. M., et al. depression and suicide ideation in people with multiple sclerosis. Journal of Affective Disorders. 208, 662-669 (2017).
- Boeschoten, R. E., et al. Prevalence of depression and anxiety in Multiple Sclerosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of the Neurological Sciences. 372, 331-341 (2017).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164, 1079-1106 (2011).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as Animal Models of Multiple Sclerosis (MS). Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (11), 028977 (2018).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G.
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis-potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17 regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667 (2020).
- Jain, R., et al. Interleukin-23-induced transcription factor Blimp-1 promotes pathogenicity of T helper 17 cells. Immunity. 44 (1), 131-142 (2016).
- Du, C., et al. Kappa opioid receptor activation alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis and promotes oligodendrocyte-mediated remyelination. Nature Communications. 7, 11120 (2016).
- Yang, C., et al. Betaine Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by Inhibiting Dendritic Cell-Derived IL-6 Production and Th17 Differentiation. The Journal of Immunology. 200 (4), 1316-1324 (2018).
- McGinley, A. M., et al. Interleukin-17A serves a priming role in autoimmunity by recruiting IL-1β-producing myeloid cells that promote pathogenic T cells. Immunity. 52 (2), 342-356 (2020).
- Kocovski, P., et al. Differential anxiety-like responses in NOD/ShiLtJ and C57BL/6J mice following experimental autoimmune encephalomyelitis induction and oral gavage. Laboratory Animals. 52 (5), 470-478 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
- Walsh, R. N., Cummins, R. A. The Open-Field Test: a critical review. Psychological Bulletin. 83 (3), 482-504 (1976).
- Tauil, C. B., et al. Depression and anxiety disorders in patients with multiple sclerosis: association with neurodegeneration and neurofilaments. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (3), 10428 (2021).
- Gentile, A., et al. Interaction between interleukin-1beta and type-1 cannabinoid receptor is involved in anxiety-like behavior in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 13, 231 (2016).
- Hearn, A. P., Silber, E.
- Gibson, J. C., Summers, G. D.
- Ye, S., Wu, R., Wu, J.
- Zamvil, S. S., et al. Lupus-prone' mice are susceptible to organ-specific autoimmune disease, experimental allergic encephalomyelitis. Pathobiology. 62 (3), 113-119 (1994).
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X.
- Smith, P.
- Aharoni, R., Globerman, R., Eilam, R., Brenner, O., Arnon, R. Titration of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-Induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. Journal of Neuroscience Methods. 351, 108999 (2021).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathological. 133 (2), 223-244 (2017).
- Goverman, J., Perchellet, A., Huseby, E. S. The role of CD8(+) T cells in multiple sclerosis and its animal models. Current Drug Targets. Inflammation and Allergy. 4 (2), 239-245 (2005).
- Schultz, V., et al. Acutely damaged axons are remyelinated in multiple sclerosis and experimental models of demyelination. Glia. 65 (8), 1350-1360 (2017).
- McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
- Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
- Jackson, S. J., Lee, J., Nikodemova, M., Fabry, Z., Duncan, I. D. Quantification of myelin and axon pathology during relapsing progressive experimental autoimmune encephalomyelitis in the Biozzi ABH mouse. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (6), 616-625 (2009).
- Gudi, V., Gingele, S., Skripuletz, T., Stangel, M. Glial response during cuprizone-induced de- and remyelination in the CNS: lessons learned. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 73 (2014).
- Yu, Q., et al.
- Dehghan, S., Aref, E., Raoufy, M. R., Javan, M. An optimized animal model of lysolecithin induced demyelination in optic nerve; more feasible, more reproducible, promising for studying the progressive forms of multiple sclerosis. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109088 (2021).
- Kuypers, N. J., James, K. T., Enzmann, G. U., Magnuson, D. S., Whittemore, S. R. Functional consequences of ethidium bromide demyelination of the mouse ventral spinal cord. Experimental Neurology. 247, 615-622 (2013).
- Haji, N., et al. TNF-alpha-mediated anxiety in a mouse model of multiple sclerosis. Experimental Neurology. 237, 296-303 (2012).
- Butler, E., Matcham, F., Chalder, T. A systematic review of anxiety amongst people with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 10, 145-168 (2016).
- Peres, D. S., et al. TRPA1 involvement in depression- and anxiety-like behaviors in a progressive multiple sclerosis model in mice. Brain Research Bulletin. 175, 1-15 (2021).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Baslé, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (7), 1177-1184 (2005).
- Akhter, M. P., Lappe, J. M., Davies, K. M., Recker, R. R. Transmenopausal changes in the trabecular bone structure. Bone. 41 (1), 111-116 (2007).
- Wei, H., et al. Identification of Fibroblast Activation Protein as an Osteogenic Suppressor and Anti-osteoporosis Drug Target. Cell Reports. 33 (2), 108252 (2020).
