Summary
Microfluidics er et kraftfuldt værktøj til udvikling af diagnostiske tests. Imidlertid kræves ofte dyrt udstyr og materialer samt besværlige fabrikations- og håndteringsteknikker. Her beskriver vi fremstillingsprotokollen for en akrylmikrofluidisk enhed til magnetiske mikro- og nanopartikelbaserede immunoassays i en billig og brugervenlig indstilling.
Abstract
Mikrofluidiske systemer har stærkt forbedrede immunassayteknikker. Imidlertid kræver mange mikrofabrikationsteknikker specialiseret, dyrt eller kompliceret udstyr, hvilket gør fabrikation dyr og uforenelig med masseproduktion, hvilket er en af de vigtigste forudsætninger for, at point-of-care-tests (POCT) kan vedtages i miljøer med lav ressource. Dette arbejde beskriver fremstillingsprocessen for en akryl (polymethylmethacrylat, PMMA) enhed til nanopartikelkonjugeret enzymatisk immunoassay test ved hjælp af computer numerisk kontrol (CNC) mikromilling teknik. Funktionen af den mikrofluidiske enhed er vist ved at udføre et immunoassay for at detektere et kommercielt antistof ved anvendelse af lysozym som et modelantigen konjugeret til 100 nm magnetiske nanopartikler. Denne enhed integrerer en fysisk forskudt begrænsning på kun 5 μm i højden, der bruges til at fange magnetiske mikropartikler, der udgør en magnetisk fælde ved at placere en ekstern magnet. På denne måde er den magnetiske kraft på immunstøtten af konjugerede nanopartikler nok til at fange dem og modstå strømningstræk. Denne mikrofluidiske enhed er særligt velegnet til billig masseproduktion uden tab af præcision til immunassayydelse.
Introduction
I de senere år har mikrofluidik spillet en vigtig rolle i immunassayteknikker1. Miniaturiseringsteknologi har mange fremragende fordele sammenlignet med traditionelle immunassays, såsom reduceret prøve- og reagensforbrug, kortere inkubationstider, effektiv løsningsudveksling og højere integration og automatisering2.
Desuden reducerer mikrofluidiske systemer i immunassays i forbindelse med magnetiske nanopartikler som immunstøtte inkubationstiderne betydeligt og opnår høj detektionsfølsomhed på grund af det øgede overflade-til-volumen-forhold3. Brownsk bevægelse af partiklerne forbedrer reaktionskinetikken under dannelsen af antigen-antistofkomplekset 4,5. Desuden giver nanopartiklernes magnetiske egenskaber alsidigheden, der skal integreres i forskellige mikrofluidiske enhedskonfigurationer, hvilket gør dem til en ideel kandidat til signalering og molekylefangst i miniaturiserede on-chip biosensingsystemer5. Magnetiske kræfter er dog betydeligt svagere end trækkræfter på nanometerskalaen på grund af det høje forhold mellem overflade og volumen6. Derfor kan det være udfordrende at fange nanopartikler til vigtige immunassaytrin såsom vask og detektion, og en konventionel magnet er utilstrækkelig4.
En effektiv måde at manipulere nanopartiklerne på er brugen af en mikrofluidisk magnetisk fælde dannet af jernmikropartikler, som er pakket i en mikrofluidisk struktur3. Derfor, når en ekstern magnet nærmer sig, skabes en kompleks interaktion inden for det magnetiserede porøse medium mellem magnetiske og fluxkræfter. Den magnetiske kraft, der virker på nanopartiklerne, er stærk nok til at fange dem og modstå strømningstræk 3,4,7. Denne tilgang kræver mikrofabrikationsteknikker, der opnår opløsninger i størrelsesordenen et par mikrometer for at generere mikrometriske strukturer, der bevarer mikropartiklerne.
Nuværende mikrofabrikationsteknikker tillader fremstilling af strukturer i høj opløsning fra et par mikron til hundreder af nanometer8. Imidlertid kræver mange af disse teknikker specialiseret, dyrt eller kompliceret udstyr. En af de største vanskeligheder er kravet om et renrum til fremstilling af skimmelsvamp, som fortsat er dyrt og tidskrævende 8,9. For nylig har mikrofluidiske ingeniører overvundet denne ulempe ved at udvikle en række alternative fremstillingsmetoder med forskellige fordele såsom reducerede omkostninger, hurtigere behandlingstider, billigere materialer og værktøjer og øget funktionalitet8. På denne måde bragte udviklingen af nye mikrofabrikationsteknikker billige, ikke-renrumsmetoder, der opnår opløsninger så lave som 10 μm8. Mønster kan bruges direkte på et substrat uden at generere et dyrt støbemønster og dermed undgå en tidskrævende proces. Direkte fabrikationsmetoder omfatter CNC-fræsning, laserablation og direkte litografi8. Alle disse metoder er egnede til fremstilling af kanaler med højt aspektforhold i en bred vifte af materialer, uanset deres hårdhed9, hvilket muliggør nye og fordelagtige geometrier, fysisk adfærd og kvaliteter i mikrofluidiske enheder8.
CNC-mikrofræsning skaber mikroskalastrukturer ved hjælp af skæreværktøjer, der fjerner bulkmateriale fra et substrat og er en effektiv fremstillingsmetode til mikrofluidiske enheder10,11. Mikrofræseteknikken kan være nyttig i mikrofluidiske applikationer til at skabe mikrokanaler og funktioner direkte på arbejdsfladen, hvilket giver en vigtig fordel: et emne kan fremstilles på kort tid (mindre end 30 min.), hvilket reducerer behandlingstiden betydeligt fra design til prototype12. Derudover gør den brede tilgængelighed af skæretilbehør af forskellige materialer, størrelser og former CNC-fræsemaskiner til et passende værktøj, der har gjort det muligt at fremstille forskellige funktioner i mange typer billige engangsmaterialer13.
Blandt alle de materialer, der almindeligvis anvendes til mikrofræsning, forbliver termoplast et førende valg på grund af deres mange gunstige egenskaber og kompatibilitet med biologiske anvendelser10,14. Termoplast er et attraktivt substrat for mikrofluidiske systemer på grund af deres betydelige fordele ved udvikling af billige engangsanalysesystemer9. Derudover er disse materialer meget modtagelige for fremstillingsprocesser med høj volumen, hvilket gør dem velegnede til kommercialisering og masseproduktion. Af disse grunde er termoplast som PMMA blevet betragtet som pålidelige og robuste materialer siden de tidlige år af mikrofluidik10. Forskellige protokoller er blevet beskrevet for at fremstille lukkede kanaler i termoplast, såsom opløsningsmiddelbinding15, varmebinding 16 og ultraviolet (UV) / ozonoverfladebehandlingsbinding17.
I mange tilfælde er den positioneringsopløsning, der opnås med konventionelle mikrofræsemaskiner, ikke tilstrækkelig til nogle mikrofluidiske applikationer, der kræver strukturer mindre end 10 μm. High-end mikrofræsning har tilstrækkelig opløsning. På grund af høje priser er brugen desværre begrænset til en håndfuld brugere12. Tidligere rapporterede vores forskningsgruppe fabrikation og manipulation af et billigt værktøj, der muliggør bearbejdning af strukturer på mindre end 10 μm, hvilket overvinder opløsningen af konventionelle fræsemaskiner12. Armaturet er en platform fremstillet ved 3D-print med simpel elektronik, der indeholder tre piezoelektriske aktuatorer. Overfladen indeholder hængselformede samlinger, der gør det muligt at løfte det, når de piezoelektriske elementer virker samtidigt. Z-aksens forskydning kan styres med en opløsning på 500 nm og en nøjagtighed på ±1,5 μm12.
Dette papir præsenterer trinene i fremstillingsprocessen for en akrylanordning (PMMA) gennem en mikrofræsningsteknik. Chipdesignet består af en hovedkanal 200 μm bred og 200 μm høj og en sidekanal med samme dimensioner for at rense strømmen af reagenserne. I den centrale region afbrydes kanalen af en fysisk begrænsning på kun 5 μm i højden, fremstillet med den 3D-printede piezoelektriske platform fremstillet af denne gruppe12, for at fange magnetiske mikropartikler, der udgør en magnetisk fælde for nanopartikler ved at placere en ekstern magnet. Vi viser driften af den mikrofluidiske enhed ved at udføre et immunoassay for at detektere et kommercielt antistof ved hjælp af lysozym som et modelantigen konjugeret til 100 nm magnetiske nanopartikler. Denne enhed kombinerer forskellige funktioner, der gør den unik4: brugen af magnetiske nanopartikler som immunstøtte reducerer den samlede testtid fra timer til minutter; anvendelse af et fluorogent enzym til påvisning giver mulighed for detektionsgrænser, der kan sammenlignes med dem, der gælder for standardenzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er); og brugen af en termoplast som fabrikationsmateriale gør den kompatibel med masseproduktion, hvilket ikke var tilfældet for tidligere mikrofluidiske nanopartiklers magnetiske fælder3, og gør det til en fremragende kandidat til at udvikle POCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrofræsning
- Overfladeslibning
- Tænd for mikrofræsemaskinen og den piezoelektriske controller. Start deres respektive kontrolsoftware12.
- Vælg de ønskede pindfræsebits (200 μm og 800 μm diametre). Anbring dem i det passende rum på fræsemaskinen (figur 1).
- Skær 9 mm x 25 mm rektangler med en tykkelse på 1,3 mm PMMA med 800 μm pindfræserbit. Fastgør et af disse rektangler forsigtigt med dobbeltklæbende tape til den piezoelektriske platform (figur 2).
BEMÆRK: Sørg for altid at placere akrylrektanglet i samme position, så et af hjørnerne falder sammen med oprindelseskoordinaterne på x- og y-akserne til bearbejdning. - Tilslut og placer z-sensoren på overfladen af PMMA-rektanglet. Vælg detektionsstiften, og flyt den over sensoroverfladen. Sænk stiften manuelt uden at kontakte sensoren. Aktiver Z0-sensortilstanden (figur 3).
- Vælg 200 μm slutfræserbitten, og flyt den til x, y oprindelse. Fjern z-sensoren. Sænk bitten forsigtigt uden at komme i kontakt med akryloverfladen.
- Drej 200 μm endemøllebitten ved 14.500 o / min. Sænk det langsomt til oprindelseskoordinaten på z-aksen (z = 0). Nulstil z-aksen 30 μm under oprindelsen. Indstil denne koordinat som den nye z-oprindelse.
BEMÆRK: Sænk aldrig bitten, hvis den ikke roterer. Ellers risikerer det at gå i stykker. - Klik på knappen Klip i softwaren til mikrofræsemaskinen for at aktivere skærepanelet . Klik på knappen Tilføj , og vælg den .txt fil (Supplerende kodningsfil 1) med en tidligere oprettet kode til slibning af akryloverfladen. Klik på Produktion knappen for at starte processen.
- Bring pindmøllebitten til koordinaten, hvor begrænsningen vil blive bearbejdet. Undgå, at pindfræserbitten løftes fra jordoverfladen, når denne koordinat er nået, ved at klikke på knappen Pause . Ellers skal du manuelt flytte pindfræserbitten til denne koordinat (figur 4A).
- Fræsning af 5 μm-begrænsningen
- Indstil rotationshastigheden for pindfræserbiten til 11.000 o / min. Hæv platformen 6,5 μm med grænsefladen til den piezoelektriske platform (supplerende figur S1). Flyt pindmøllebitten langs y-aksen med 500 μm. Returner den piezoelektriske platform til sin oprindelige værdi på z-aksen med kontrolgrænsefladen.
- Fræsning af mikrokanaler
- Åbn den tidligere oprettede designfil fra designsoftwaren (Supplerende designfil 1). Klik på knappen Udskriv . Åbn menuen Egenskaber , og klik på farvevinduet, der svarer til det lag, der indeholder det design, der skal bearbejdes. Indstil fabrikationsparametrene i værktøjspanelet som angivet i supplerende figur S2.
- Inaktiver uønskede lag ved at vælge indstillingen Ingen i rullemenuen Værktøjer .
- Fræsning af huller
- Skift til 800 μm pindfræserbit. Aktiver designlaget af hullerne med en diameter på 1,2 mm ved at klikke på det tilsvarende farvevindue.
- Gentag trin 1.3.2., men i dette tilfælde skal du indstille de tilsvarende fabrikationsparametre som beskrevet i supplerende figur S3A for hullerne.
BEMÆRK: Dybden af de bearbejdede huller er halvdelen af akryltykkelsen. - Maskine to yderligere huller på kontralaterale hjørner af rektanglet til justeringen af akrylen på en omvendt måde på en ny platform (figur 4B). Skræl akrylrektanglet af fra den piezoelektriske platform. Vend akrylen og tape den med dobbeltklæbende tape over adapteren med de bearbejdede søjler (figur 4C, D).
- Åbn filen med design af hullerne til det modsatte ansigt fra designsoftwaren (Supplerende designfil 2). Indstil de tilsvarende fabrikationsparametre som beskrevet i supplerende figur S3B. Fræs den resterende halvdel af reagensindløbs- og udløbshullerne med en diameter på 1,5 mm og en dybde på 0,7 mm (supplerende figur S3C).
Figur 1: Placering af pindstrimmer . (A) 200 μm og 800 μm pindfræserbits placeres og fastgøres gennem en skrue til stålstøtten. (B) Hver pindfræser placeres i mikrofræsemaskinens specifikke rum til automatisk valg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Piezoelektrisk platform. Platformen er fremstillet ved 3D-print og består af to sekskantede baser forbundet med hængsler, der muliggør en fin forskydning i z-aksen styret af tre piezoelektriske aktuatorer. Der observeres også en akryladapter, hvorpå PMMA-rektanglet er fastgjort, og som gør det muligt at indstille koordinaternes justeringshjørne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kalibrering af Z-aksen. Trinene i z-aksekalibreringen er detaljerede. (A) Z-sensoren indeholder et kabel, der tilsluttes mikrofræsemaskinen. (B) Sensoren placeres direkte på den overflade, der skal bearbejdes. (C) Detektionsstiften består af en metalstang placeret i et specielt rum ved siden af pindfræsebits. (D) Når begge tilbehør kommer i kontakt, beregner mikrofræsemaskinen automatisk oprindelseskoordinaten på z-aksen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Korrigeret akryloverflade . (A) Endemøllebitten med en diameter på 200 μm fejer hele overfladen af akrylrektanglet og fjerner et lag, der er ca. 30 μm højt. (B) Billedet viser de forskellige strukturer, der er fræset på forsiden af den tidligere korrigerede akryl. Kanaler og huller til reagensindløb og udløb observeres. 5 μm-begrænsningen kan ikke ses med det blotte øje. (C) Mikrofræset overflade med justeringshuller og adapter med justeringssøjler i modsatte hjørner. (D) Akrylen er justeret på hovedet på adapteren med søjler, hvori justeringshullerne passer. Skala bar = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Kanalforsegling
- Akryl rengøring
- Fjern akrylrektanglet fra søjleadapterplatformen. Tag et andet ubearbejdet akrylrektangel. Vask begge akrylplader med isopropylalkohol (IPA) og skyl med destilleret vand. Brug handsker og undgå kontakt med IPA.
- Dyp akrylen i et ultralydsbad i 10 minutter (figur 5A, B).
- Eksponering for gasformige chloroforme bakterier
- Tør begge akrylplader perfekt. Tape dem til indersiden af et glas petriskål låg med dobbeltsidet tape. Sørg for at placere siden af den bearbejdede kanal eksponeret (figur 5C). Brug handsker og undgå at røre akryloverfladen direkte.
- Placer bunden af glaspetriskålen inde i et større glas petriskål (figur 5D). Hæld 1 ml chloroform i bunden af petriskålen. Placer hurtigt låget med akrylpladerne fastgjort til indersiden.
- Tilsæt straks destilleret vand til bunden af den større petriskål op til niveauet for petriskålens låg. Akrylen udsættes for chloroform i 1 minut (figur 5E).
BEMÆRK: Overvej, at en længere eksponeringstid for chloroform vil angribe akryloverfladen, og 5 μm-begrænsningen smelter, ændrer dens højde eller forsvinder helt. - Vip petriskålen for at bryde den skabte vandforsegling. Fjern straks akrylen fra chloroformen ved at afdække petriskålen. Pas på ikke at spilde vandet.
FORSIGTIG: Gør denne proces i røghætten og brug handsker, da chloroform er meget giftigt.
- Limning ved presning og opvarmning
- Skræl begge akrylplader fra det dobbeltsidede bånd.
- Juster begge akryl med de sider, der blev udsat for gasformig chloroform ansigt til ansigt, og danner en sandwich. Akrylen anbringes i pressen ved 18 kgf/cm2 og en temperatur på 90 °C (figur 5F,G).
BEMÆRK: Det anbefales at placere akryl i længderetningen og ændre dens justering efter 2 minutter for en bedre tætning. Hvis forseglingen efter denne tid er utilstrækkelig, skal du placere den tilbage i pressen i intervaller på højst 1 min. Brug stereoskopet til at kontrollere kanalernes status og begrænsning. Overvej at i tilfælde af overskridelse af pressetiden er der risiko for at fjerne begrænsningen.
- Slange vedhæftet fil
- Skær 2-3 cm længder af slangen. Lav et helt lige snit. Fastgør hver slange til enhedens huller med øjeblikkeligt tørrende flydende klæbemiddel (figur 6A). Undgå, at klæbemidlet kommer ind i chippen.
Figur 5: Enhedens tætningsproces . (A) Hver af akrylpladerne anbringes i en genlukkelig pose med destilleret vand og nedsænkes i ultralydsbadet. (B) Billedet til venstre viser kanalerne lige efter fremstilling, og billedet til højre viser den samme enhed efter vask med IPA og ultralydsbadet, som fjerner alle urenheder og akrylrester fra mikrokanalen. Kanterne af begrænsningen, der afbryder den centrale kanal på 200 μm, observeres, hvilket bekræfter den vellykkede fræsningsproces. Skalastænger = 500 μm. (C) Begge akryl tørres og klæbes til glasplatformen på låget. (D) Bunden af petriskålen placeres inde i en anden skål med større diameter. (E) Ved lukning af petriskålen forhindrer vandforseglingen gasformig chloroform i at slippe ud. (F) Beskrivelse af håndtagets elementer med en vægt på 5 kg. (G) Billede af det åbne håndtag, der med rødt viser det område, hvor akrylen er placeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Forberedelse af udstyr
- Fyld kanalerne med destilleret vand ved hjælp af en sprøjte. Sørg for, at der ikke er lækager eller modstand mod strømning. Nedsænk enheden i et ultralydbad i 10 minutter for at fjerne resterende akryl, klæbemiddel eller uønsket materiale inde i kanalerne.
- Tøm vandet inde i enhedens kanaler. Brug en sprøjte til at indføre en blokerende opløsning fremstillet med 5% (w/v) bovin serumalbumin (BSA) fortyndet i 1x Tris-buffered saltvand (TBS) og tidligere filtreret gennem et 0,2 μm polyethersulfon (PES) sprøjtefilter.
- Forbered en suspension af jernmikropartikler med en diameter på 7,5 μm i 5% BSA.
BEMÆRK: Mikropartiklerne er tidligere funktionaliseret med et silica-polyethylenglycol (PEG) lag, der giver resistens over for proteinabsorption4. - Chippen og mikropartikelsuspensionen inkuberes med blokeringsopløsningen i mindst 1 time ved stuetemperatur. Hvis det er muligt, tillades blokering natten over ved 4 °C.
4. Dannelse af mikropartikelfælder
- Indsæt mikropartiklerne i chippen med en sprøjtenål gennem sidekanaludløbsslangen. Placer chippen lodret og lad mikropartiklerne strømme under tyngdekraften gennem sidekanalen. Drej chippen 180° i to trin på 90°, og lad mikropartiklerne ramme og komprimere ved 5 μm-begrænsningen.
- Fjern overskydende mikropartikler ved tyngdekraften, der roterer 45 ° mod sidekanalen.
- Hold enheden oprejst for at undgå at fortryde mikropartikelfælden. Se figur 6B for et resumé af mikropartikelfældedannelsesprocessen.
5. Immunoassay
- Nanopartikel forberedelse
- Tag 2 μL af suspensionen af 100 nm nanopartikler, der tidligere var konjugeret med lysozym (antigenmodel). Tilsæt det til et 1,5 ml mikrocentrifugerør med 100 μL blokerende opløsning. Inkuberes natten over ved 4 °C.
- Tilsæt 150 μL vaskebuffer (1x TBS, 0,05% Tween 20).
- Mikrocentrifugerøret på 1,5 ml anbringes i en magnetisk separator. Opbevares i 15 minutter for at tillade adskillelse af nanopartiklerne (supplerende figur S4).
BEMÆRK: Minimumsvolumenet for den magnetiske separator er 200 μL. Undgå at bruge et mindre volumen. - Fjern væsken fra røret med en mikropipette. Undgå kontakt med rørets væg, hvor nanopartikelpelleten blev dannet.
- Tilsæt 250 μL frisk vaskebuffer. Hold røret under omrøring i 15 min.
- Gentag trin 5.1.3.-5.1.5. 2x mere, ryster kun i 5 min.
- Tilsæt den ønskede koncentration af primært anti-lysozymantistof (se materialetabellen). Juster til et slutvolumen på 100 μL i antistoffortyndingsmiddel (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- Inkuberes i 15 minutter ved 37 °C. Bliv ved med at ryste i yderligere 15 minutter ved stuetemperatur.
- Vasketrinnene 5.1.2.-5.1.6 gentages.
- Tilsæt 100 μL antistoffortyndingsmiddel. Tilsæt peberrodsperoxidasekoblet sekundært antistof (HRP-AbII) (se materialetabellen) ved en fortynding på 1:500.
- Vasketrinnene 5.1.2.-5.1.6 gentages.
- Hold nanopartiklerne i et endeligt volumen på 50 μL antistoffortyndingsmiddel.
6. Eksperimentel montering
- Fyld de to 100 μL glassprøjter med vand, tilslut en 6,5 cm lang slange til hver sprøjte, indsæt en metalstift i enden af slangen, og læg begge sprøjter på den computerstyrede sprøjtepumpe.
- Forsegl alle slanger på akrylenheden med varme.
- Skær indløbsslangen og hold kun et par millimeter. Fyld dispenseringsnålen med vaskebuffer, og sæt den i den afskårne slange. Lad opløsningen dryppe, før nålen tilsluttes enheden for at forhindre luftadgang til enheden.
- Skær udløbsslangen fra sidekanalen. Tilslut til sprøjtepumpen. Udfør derefter den samme procedure for hovedkanaludløbsslangen.
BEMÆRK: Det er nøglen til at udføre trin 6.3.-6.4. i denne rækkefølge for at undgå udpakning af mikropartikelfælden. Hvis det er muligt, skal du kontrollere fældens tilstand under disse trin ved hjælp af et forstørrelsesglas. - Placer et glasglas på mikroskoptrinnet. Fastgør magneten til diaset med dobbeltsidet tape, og læg et lille stykke tape på hver side for at fastgøre chipkanterne til glasset.
- Indstil en strømningshastighed på 50 μL/t gennem fanerne Flowhastighed og Enheder i sprøjtepumpestyringen. Vælg tilbagetrækningstilstand , og klik på Start-knappen for at aktivere vaskebufferens flow.
- Gå forsigtigt hen til enheden mod glideren med magneten vandret, så det område af chippen, der indeholder fælden, kommer i kontakt med magneten.
- Sæt enhedens kanter på glasset med dobbeltsidet tape for at forhindre bevægelse. Undgå at blokere den optiske vej til mikroskopi (figur 6C).
Figur 6: Endelig enhedskonfiguration . (A) Akrylanordning med slangerne fastgjort til de tilsvarende indgange og udgange. Skalaen viser enhedens dimensioner i centimeter. (B) Protokol for dannelsen af mikropartikelfælden. Mikropartikler strømmer gennem kanalen ved tyngdekraften, når enheden placeres lodret. Mikropartikler koncentreres ved 5 μm begrænsningen. Overskydende mikropartikler fjernes let ved at dreje chippen gennem sidekanalen. Chippen holdes lodret for at bevare fælden før immunassay. C) Mikrofluidisk anordning monteret på et glasglas indeholdende magneten på scenen i det omvendte fluorescensmikroskop. Dispenseringsnålen, gennem hvilken reagenserne tilsættes, observeres, såvel som udløbsslangerne, der forbinder til en sprøjtepumpe. Klik her for at se en større version af denne figur.
7. Immundetektion
- Hold vaskebufferen flydende i 10 minutter ved 50 μL/t for at fjerne overskydende BSA.
- Fjern den resterende vaskebuffer fra doseringsnålen med en mikropipette. Der tilsættes 50 μL nanopartikelsuspension.
- Suspenderingen af nanopartikler strømmes i 7 minutter ved en strømningshastighed på 100 μL/t. Derefter ændres strømningshastigheden til 50 μL/t og flowet i yderligere 15 minutter.
- Skift dispenseringsnålen. Vaskebufferen hældes i 10 minutter ved 50 μL/t. Forbered det fluorogene substrat i henhold til producentens specifikationer under vasketrinnet.
- Fjern den resterende vaskebuffer fra doseringsnålen med en mikropipette. Tilsæt 100 μL af det fluorogene substrat (se materialetabellen). Det fluorogene substrat flydes i 6 minutter ved 50 μL/t.
- Indstil måleparametrene for strømningshastighed (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h og 10 μL/h ) og tidsparametre (6 min) i de tilsvarende faner Flow Rate og Indstil timer i grænsefladen, der styrer sprøjtepumpen. Sørg for at vælge Udtrækstilstand for hver af de målinger, der skal udføres.
- Indstil en ekstra flowhastighedsfane til 50 μL/t, og indstil timeren til 3 minutter for vasketrinnet.
- Tænd fluorescensen af mikroskopet 15 s, før substratet ved 50 μL / h stopper. Start billedoptagelsen med softwaren til mikroskopkameraet 10 s, før substratet stopper med en eksponeringstid på 1.000 millisekunder. Udfør billedbehandling i 6 minutter ved 1 ramme/s (FPS).
- Klik på Start-knappen for den ønskede strømningshastighedsparameter umiddelbart efter, at substratvaskens strømningshastighed ved 50 μL/t stopper. Klik på knappen Start for vaskeflowet (50 μL/h) umiddelbart efter, at det valgte måleflow stopper.
- Stop billedoptagelsen, og sluk for mikroskopets fluorescens for at undgå fotoblegning af substratet.
- Gentag trin 7.8.-7.10. for hver anvendt målestrømningshastighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det var muligt at etablere en meget reproducerbar fabrikationsprotokol, der forbedrer opløsningen af den konventionelle mikrofræsningsteknik. Ved hjælp af denne protokol opnås fremstilling af en kanal så lille som 5 μm i højden, der fungerer som en forskudt begrænsning i en 200 μm høj kanal. Det enkle design af den forskudte begrænsning fanger jernmikropartikler med en diameter på 7,5 μm, som, når de komprimeres i mikrokanalen, tillader oprettelse af en magnetisk fælde, når en ekstern magnet nærmer sig enheden. Denne enhed gør det muligt at udføre immunoassays ved hjælp af nanopartikler konjugeret med analysanden af interesse som immunologisk støtte. I dette arbejde blev ikke-konkurrencedygtige indirekte immunassays med enzymmærket antistofbaseret påvisning udført. Modelantigenet (Ag) var lysozymprotein konjugeret til nanopartikler (NP'er) med en diameter på 100 nm. Kanin anti-lysozym IgG blev anvendt som det primære antistof (AbI), og påvisning blev udført ved anvendelse af kanin peberrodsperoxidasekonjugeret sekundært antistof (HRP-AbII).
Detektion blev udført ved at korrelere ændringen i fluorescenssignalintensitet opnået efter interaktionen mellem HRP-AbII og et fluorogent substrat ved passage gennem fælden med indesluttede nanopartikler. For at udføre målingerne blev der bestemt et område før og et område efter fælden. Figur 7A-D viser stigningen i fluorescensintensitet for forskellige koncentrationer af anti-lysozym AbI: 0 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml og 1.000 ng/ml for en given fluorogen substratstrømningshastighed (3 μL/h). Dette viser, at ændringen i substratfluorescens er direkte proportional med koncentrationen af AbI.
Figur 7: Fluorescensmåleområder. Fluorescensmålingerne er vist for forskellige koncentrationer af primært anti-lysozymantistof: (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml, (C) 100 ng/ml og (D) 1.000 ng/ml. Blå cirkler viser området for fluorescensmåling før og efter fælden dannet af 5 μm højdebegrænsningen, hvor substratet reagerer med det HRP-konjugerede sekundære antistof. Alle billeder svarer til et flow på 3 μL/t. Forkortelse: HRP = peberrodsperoxidase. Klik her for at se en større version af denne figur.
For en given AbI-koncentration er det opnåede fluorescensniveau imidlertid en funktion af den strømningshastighed, der anvendes til det fluorogene substrat. Således er omdannelseskapaciteten af dette substrat af HRP-enzymet omvendt proportional med strømningshastigheden. Forskellige substratstrømningshastigheder på 1 μL / h, 3 μL / h, 5 μL / h og 10 μL / h blev evalueret. For hvert forsøg blev kurverne svarende til forskellen i fluorescens givet af substratet før og efter passage gennem magnetfælden opnået. Figur 8A-C viser kurverne for en koncentration på 100 ng/ml for tre forskellige strømningshastigheder: (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h og (C) 1 μL/h. Afhængigt af den anvendte strømningshastighed varierer substratets konverteringskapacitet ved det HRP-konjugerede sekundære antistof anbragt i magnetfælden. Den grønne kurve repræsenterer substratets fluorescensintensitet efter omdannelse af HRP placeret i fælden. Det kan ses, at det maksimale niveau af fluorescens opnået henfalder ved højere fluxer. Den røde kurve repræsenterer basalfluorescensen, før substratet når fælden. Målingen af substratfluorescens i dette område af fælden forbliver konstant, og dens værdi afhænger af graden af ikke-specifikke interaktioner, hvis der ikke er nogen effektiv blokering af kanaloverfladen. Vi beregnede forskellen mellem begge kurver, repræsenteret af den blå kurve.
Figur 8: Fluorescenskurver. Grafer opnået ved en koncentration på 100 ng/ml primært antistof og strømningshastigheder på (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h og (C) 1 μL/h. De tre farvede kurver repræsenterer fluorescensen målt før fælden (rød kurve) og efter fælden (grøn kurve) og forskellen mellem de to (blå kurve) over tid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9A-C integrerer fluorescensforskelskurverne målt før og efter immunreaktion for de forskellige strømme for AbI-koncentrationer på (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml og (C) 1.000 ng/ml. Målingen for en strømningshastighed på 0 μL/h indikerer måling af immunreaktion under statiske forhold, hvor diffusion styrer. For en koncentration på 1.000 ng/ml mættes fluorescensen for alle de evaluerede strømme. Det forskudte fluorescensmønster ved de forskellige strømme skyldes imidlertid diffusion af substratet, som reagerer med en så høj konverteringsfrekvens, at det overvinder de mindre strømme. Således er der en tilbagevenden af denne fluorescens til fældens opstrømszone.
Figur 9: Fluorescensforskelsforhold. Opsummerede kurver for fluorescensforskellene (efter-før) for de forskellige fluxer, der anvendes ved (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml og (C) 1.000 ng/ml. Klik her for at se en større version af denne figur.
Målinger opnået med denne enhed gør det muligt at generere en standardkalibreringskurve for immunoassays udført med lysozym som modelantigen. Figur 10 viser kalibreringskurven opnået ud fra de maksimale værdier af forskellene mellem fluorescensen før og efter immunreaktionen udført i magnetfælden. Denne protokol tillader påvisning af det primære anti-lysozymantistof med koncentrationer i størrelsesordenen nanogram pr. milliliter ved anvendelse af strømme mellem 1 μL / h og 10 μL / h. Den høje variabilitet og høje fluorescensniveauer ved 1 μL / h tyder på, at immunkompleksets reaktivitet er sådan, at denne hastighed ikke favoriserer strømmen af det reagerende substrat og har tendens til at akkumulere lige efter fælden, ud over det faktum, at enhedens modstand reducerer enhedens opløsning for denne strømningshastighed.
Figur 10: Kalibreringskurve. Grafen viser den maksimale værdi af forskellene i fluorescensintensitet af kurverne opnået med hensyn til koncentrationen af primært antistof anvendt (AB1) for hver strømningshastighed. I/Isad svarer til forholdet mellem fluorescensværdien opnået for hver fluorescensmåling (I), normaliseret med hensyn til den maksimale fluorescensværdi, der blev nået ved mætning (jegsad). Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for de tre eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Piezoelektrisk platform controller interface. Det venstre billede viser grænsefladen, der styrer z-aksens forskydning af den piezoelektriske platform. Begrænsningen skabes ved at hæve platformen ved anvendelse af spænding til tre piezoelektriske aktuatorer. Det højre billede viser grænsefladen til den software, der styrer mikrofræsemaskinen, hvor det er muligt at observere de præcise koordinater i x- og y-akserne, hvor begrænsningen bearbejdes med en hastighed på 11.000 o / min. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Enhedens design. Designet af enheden oprettet ved hjælp af designsoftwaren ses til venstre. Designet består af to tilsluttede kanaler, hvoraf den ene er hovedkanalen, der indeholder 5 μm højdebegrænsningen, og den anden er sidekanalen til affaldsudløbet. Kanalerne er mikrofræset med en 200 μm pindfræserbit. Panelet til højre viser fabrikationsparametrene. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Mikrofræsningsparametre for indløbs- og udløbshuller. (A) 1,2 mm diameter og 0,65 mm dybdehuller (halvdelen af akryltykkelsen) er mikrofræset på den bearbejdede overflade. Panelet til højre viser forskydningshastigheden, rotationen og dybdeparametrene for pindfræserbiten. (B) huller med en diameter på 1,5 mm og en dybde på 0,7 mm mikrofræses på den modsatte side, der forbinder hullerne. Panelet til højre viser fabrikationsparametrene. Begge kasser er mikrofræset med en 800 μm pindfræserbit. (C) Reagensindløbshuller (højre) og udløb (venstre) vises efter bearbejdning af begge flader. Dimensionerne på den større diameter halvdel gør det muligt at koble slangen, mens barrieren skabt af den mindre diameter halvdel forhindrer slangen i at blokere indløbene. Vægtstænger = 1 mm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S4: Nanopartikelseparation. Ved hjælp af en kommerciel magnetisk separator kan 100 nm nanopartikler let koncentreres for at udføre vasketrinnene under immunoassayet. Pelleten dannet efter 15 min observeres i den røde cirkel. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 1: Kode til akryloverfladeslibning. Den genererede kode vises med instruktioner til slibning af 25 mm x 9 mm akryloverfladen langs x- og y-akserne. Den sidste linje i koden placerer borekronen lige ved koordinaten, hvor begrænsningen skal bearbejdes. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende designfil 1: Design af mikrokanal- og reagensindløbs- og udløbshuller. Designet indeholder to lag af forskellige farvede strukturer (sorte kanaler og røde huller), der er bearbejdet på det tidligere jordede akrylflade. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende designfil 2: Design af hullerne på den modsatte side. Designet består af huller med større diameter til det modsatte ansigt, der kommunikerer med de foregående og tjener til at fastgøre slangerne. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En akrylmikrofluidisk enhed til immunassays ved anvendelse af nanopartikler som immunstøtte blev fremstillet ved hjælp af en mikrofræsningsteknik. Metoden til direkte fremstilling på underlaget har den fordel, at man undgår brugen af en masterform og den tid og de omkostninger, dette indebærer. Det er dog begrænset til hurtig prototyping og fremstilling af enheder med høj volumen.
Her brugte vi en tidligere rapporteret tilbehørsplatform til fræsemaskinen12. Platformen blev fremstillet af 3D-udskrivning for at skabe kanaler med variabel dybde med en lodret opløsning, der er bedre end 10 μm opløsningen fra konventionelle mikrofræsemaskiner. Vi opnåede fræsning af kanaler på op til 5 μm høje, der danner en forskudt begrænsning i den 200 μm mikrofluidiske kanal.
Der kræves kun to pindfræsebits på 200 μm og 800 μm diameter til fremstilling af den mikrofluidiske enhed uden behov for manuelt at skifte bits. Den anvendte fræsemaskinemodel udfører automatisk udveksling af bits, hvilket hjælper med tidsoptimering. Derudover tillader "Z0 sensing" -tilstanden bestemmelsen af oprindelsen automatisk i z-aksen med høj præcision ved at kontakte sensoren og stiften, der er inkluderet i fræsemaskinen.
Designet af denne enhed er enkel og består kun af hovedkanalen afbrudt af en 5 μm forskudt begrænsning og en tilbehørskanal, der fungerer som en udrensning og indløb til mikropartikler. Imidlertid kræves den høje præcision af sådanne strukturer for begrænsningen til at fange jernmikropartikler med en diameter på 7,5 μm. En større begrænsning tillader mikropartikler at passere igennem uden tilbageholdelse, hvilket forhindrer deres indfangning og dannelsen af mikropartikelfælden. Omvendt øger en mindre begrænsning i høj grad kanalens strømningsmodstand og får reagenserne til at komme ud gennem sidekanalen i stedet for at passere gennem det porøse mikropartikelmedium. Brug af mikropartikler med en større diameter til at danne den magnetiske fælde ville give mulighed for at lave en større begrænsning. For eksempel har partikler med en diameter på 40 μm brug for en ~ 30 μm forskudt begrænsning. I så fald er det ikke nødvendigt at bruge den piezoelektriske platform, og fremstillingsprotokollen er forenklet. Imidlertid ville et porøst medium sammensat af større mikropartikler fange nanopartikler forskelligt og ville påvirke immunassayets ydeevne; Det er dog ikke klart, om det ville være på godt og ondt. Der arbejdes på at studere disse funktioner for at optimere enheden7.
For at opnå den krævede nøjagtighed blev overfladeslibning udført for at fjerne et 30 μm lag af akryloverfladen ved at flytte 200 μm pindfræserbit gennem hele akryloverfladen ved 14.500 o / min. Denne proces gør det muligt at opnå en ny oprindelse ved z-aksen langs hele overfladen for større nøjagtighed i højden. Det er afgørende altid at justere akrylen i samme position, så oprindelseskoordinaterne på x- og y-akserne (tidligere indstillet) falder sammen med et af akrylens hjørner. Ligeledes skal man sørge for, at akrylen sidder perfekt på bunden; Ellers slides overfladen muligvis ikke korrekt, hvilket forårsager problemer i følgende monteringstrin.
Når programmet har afsluttet overfladeslibeprocessen, bringer det automatisk pindfræserbitten til en bestemt koordinat, hvor den 5 μm begrænsning, der danner fælden, vil blive bearbejdet. Det er afgørende at forhindre, at pindfræserbitten løftes af overfladen, når den når denne koordinat. Det anbefales at identificere, om mikrofræsemaskinen har en mulighed, der forhindrer pindfræserbitten i at løsne sig fra overfladen, når slibeprocessen er afsluttet. Ellers vil det være nødvendigt manuelt at flytte fræseren til denne koordinat, hvilket kan resultere i placeringsnøjagtighedsfejl.
For at bearbejde den forskudte begrænsning i akryl er det nødvendigt at overdimensionere med 1,5 μm. I 5 μm højde blev den piezoelektriske platform hævet til 6,5 μm, fordi mikrokanalen har tendens til at flade lidt ud i processen med at forsegle kanalerne. Derudover er den endelige længde af begrænsningen i enheden kun 50 μm; det er dog bearbejdet længere for at sikre, at det kommunikerer med begge ender af hovedkanalen, når det bearbejdes bagefter. I et trin fremstilles de 200 μm dybe kanaler ved hjælp af endemøllebitten på 200 μm diameter og en rotationshastighed på 11.000 o / min. Således tager bearbejdning af de 200 μm brede kanaler i akryl kun få sekunder.
Det næste trin i fremstillingen af enheden er at bearbejde hullerne, der forbinder kanalerne udefra. Disse huller bruges til at placere slangerne, der gør det muligt for enheden let at blive tilsluttet sprøjtepumpen, der kører den. Et af de problemer, der opstår her, er placeringen af slangerne. En optimal afstand er afgørende for at tillade strømmen af reagenser og undgå at skabe en tætning med ansigtet af den ubearbejdede akryl. For at overvinde denne ulempe bearbejdes hullerne i to trin for at skabe en grænse, hvor slangerne ikke overstiger den ønskede dybde.
Med 800 μm pindfræserbit blev mønsteret af huller fræset på den samme tidligere mikrofræsede overflade. Huller bearbejdes i enden af hver kanal med en diameter på 1,2 mm og en dybde på 0,65 mm, hvilket er halvdelen af akrylens tykkelse. Derudover bearbejdes to huller i rektanglets kontralaterale hjørner, som gør det muligt at justere akrylen med forsiden nedad på platformen med søjler. Det er vigtigt at bruge en skraber eller fræser til at fjerne akryl fra den piezoelektriske platform for at undgå at bryde den. På den modsatte side af akryl er hullernes diameter 1,5 mm (større end den foregående halvdel), hvilket er lig med diameteren på slangen, der skal fastgøres. Dybden er 0,7 mm og skal være lidt større end halvdelen af det forreste fladehul for at sikre, at begge de bearbejdede huller kommunikerer med hinanden. Barrieren dannet af hullet med mindre diameter forhindrer slangen i at nå bunden og blokere indløbet. Denne implementering i protokollen forbedrer i høj grad placeringen af væskeindløbs- og udløbsslangerne til chippen.
Et vigtigt trin i enhedsfremstilling er tætning. Det er nødvendigt at forsegle ansigtet, der indeholder de bearbejdede kanaler med et ubearbejdet akryldæksel med samme dimensioner. Forsegling af arkene med en metode, der ikke nærmer sig glasovergangstemperaturen for akryl, giver mulighed for at opnå deformationsfrie kanaler. Gennem den anvendte bindingsmetode opløser en tynd film af opløsningsmiddel mellem de to PMMA-ark en tynd film fra PMMA-arkets overflade, fordamper derefter og tilslutter til sidst PMMA-arkenes monomerer igen ved en bestemt driftstemperatur.
Den bredt beskrevne metode til eksponering for chloroform damp blev brugt til at forsegle denne akrylanordning. Som tidligere rapporteret i litteraturen giver chloroform høj bindingsstyrke; Men da chloroform angriber akryl meget aggressivt, bør akryl aldrig komme i direkte kontakt med flydende chloroform, kun med gasformig chloroform. Det er vigtigt at opretholde en optimal afstand mellem den fordampende chloroform og akrylen. Vi skabte et simpelt system ved hjælp af en glas petriskål, hvor akryl blev klæbet til låget. En platform bestående af ni dias forbundet og fastgjort til låget på petriskålen blev brugt, hvorpå akrylerne blev klæbet med dobbeltsidet tape for at regulere afstanden. Selvom den gasformige chloroformproces er meget følsom over for ændringer i omgivelsestemperaturen, kan temperaturen på petriskålene styres ved at placere dem i en polystyrenkasse. Vandforseglingen forhindrer chloroformen i at fordampe for hurtigt.
I modsætning hertil er der andre rapporterede sammenføjningsmetoder, der er hurtigere og ikke kræver specielt udstyr; nogle er dog kun egnede til sammenføjning af to akrylplader uden bearbejdning. Ligeledes er det vanskeligt at kontrollere bindingskraften, da opløsningsmidlet skal hældes direkte mellem begge akrylplader18 med stor risiko for smeltestrukturer af små dimensioner, såsom den mikrofræsede 5 μm-begrænsning.
Ved hjælp af protokollen beskrevet her blev homogene tætninger opnået med en hjemmelavet presse, hvormed tætningstrykket og temperaturen blev styret. Til konstruktionen af denne presse skaber både en ramme af aluminium og et hængsel en håndtag, der forstærker den mekaniske kraft, der kommer fra en vægt på 5 kg til en faktor på 9: 1. Varmeelementerne overfører deres varme til 2 cm tykke aluminiumsplader, der er i kontakt med akrylstykkerne.
Når akryllagene er forseglet, er det sidste trin i fremstillingsprocessen at forbinde de eksterne slanger til de tilsvarende indløb og udløb på enheden. Det flydende klæbemiddel påføres eksternt, når slangerne er inde i hullerne. Hvis slangens diameter er mindre end hullerne, kan det flydende klæbemiddel komme ind i enheden og tilstoppe kanalerne.
Direkte fremstillingsmetoder på substratet, såsom mikrofræsning, har nogle ulemper, såsom ruhed af den bearbejdede overflade og strukturer med dårligt afgrænsede kanter9. På trods af ruheden af kanalernes bearbejdede overflade er der ikke behov for yderligere behandling af denne enhed. Et vigtigt punkt at bemærke om denne bindingsprotokol er, at chloroform gør det muligt at reducere ruheden af de fræsede mikrokanaler ved at polere overfladerne udsat for opløsningsmidlet. Polering af overfladen er så god, at selv den optiske kvalitet forbedres19.
Når enheden er fremstillet, skal den være forberedt til at blive brugt i et immunoassay. Ultralydvask af enheden er af stor betydning for at fjerne uønsket akrylaffald, der kan tilstoppe kanalerne og forstyrre immunoassayet.
Derudover skal der lægges særlig vægt på den korrekte blokering af kanalerne for at undgå uspecifikke interaktioner og høje baggrundsstøjsignaler. Blokering med 5% BSA har vist sig at reducere støj fra ikke-specifik binding af antistoffer i kanalerne, og 1 time inkubation er tilstrækkelig. Jernmikropartiklerne er belagt med et silica-PEG-lag for at forhindre uspecifik binding i dem. Desuden blokeres mikropartiklerne med BSA (på samme tid som kanalerne), inden fælden dannes i enheden. Inkubation natten over ved 4 °C er bedre, hvilket betyder, at der kræves 1 dag til fremstilling og inkubation af enheden før immunoassayet. Reduktionen af ruheden ved hjælp af chloroformen og blokeringen af overfladerne for at reducere ikke-specifikke interaktioner har vist sig at fungere usædvanligt godt, hvilket gør det muligt for denne platform at opnå en detektionsgrænse, der kan sammenlignes med standard ELISA i et modelimmunoassay4.
Dannelsen af mikropartikelfælden i mikrokanalbegrænsningen er en manuel proces. Selvom der ikke er nogen præcis kontrol over antallet af mikropartikler, der kommer ind, stoler vi på et skøn over længden af de komprimerede partikler. Det er muligt at gøre fælden større eller fjerne overskuddet let. De kasserede partikler akkumuleres i sidekanalen og behøver ikke fjernes fra chippen. Det er afgørende at forhindre mikropartikler i at strømme ind i hovedkanalen, da de kan interagere med nanopartikler opstrøms for fælden og ændre immunassaymålingerne.
Som et proof-of-concept implementerede vi immundetektion af et kompleks dannet af lysozymprotein konjugeret til nanopartikler med en diameter på 100 nm ved inkubation af det specifikke primære antistof og det tilsvarende HRP-mærkede sekundære antistof. Immunokomplekset dannes uden for enheden. Det er dog muligt at udføre hele immunoanalysen inde i enheden. Nanopartiklernes magnetiske egenskaber muliggør nem manipulation med en højtydende neodym permanent magnetseparator. Man skal blot holde reaktionsmikrorøret i 15 minutter for at lade nanopartiklerne tiltrækkes af magneten til mikrorørvæggen, hvilket letter immunassayvasktrinnene uden for enheden.
Højdepunktet ved denne enhed er, at den er enkel, hurtig (samlet analysetid på 40 min 4 sammenlignet med4-6 timer for ELISA) og billig (sammenlignelig med prisen på en lateral flowtest). Alle disse funktioner gør denne enhedsprofil til en god kandidat til udvikling af POCT. Derudover kan enheden kvantitativt detektere analysandkoncentrationer svarende til guldstandarden ELISA4, hvilket er yderst værdifuldt for epidemiologiske undersøgelser og beslutningstagning inden for folkesundhed. Normalt har mikrofluidiske systemer til immunassays gode detektionsgrænser, men lange analysetider, eller de har korte analysetider, men suboptimale detektionsgrænser4. Ved at kombinere magnetiske nanopartikler som immunstøtte og fluorogene enzymer til detektion har denne platform en kort analysetid og en god detektionsgrænse (i tidligere arbejde fandt vi en detektionsgrænse på 8 pg / ml ved hjælp af biotin som et antigen, hvilket kan sammenlignes med en standard ELISA4). Endelig har denne teknologi en vigtig fordel i forhold til laterale flowtest: muligheden for at give kvantitative og ikke kun kvalitative resultater ("ja" eller "nej"). I modsætning til de fleste andre mikrofluidiske systemer udviklet i laboratorier, hvor sjældne materialer anvendes, er dette system lavet af akryl (PMMA), en billig termoplast, der er yderst kompatibel med masseproduktion af medicinsk diagnostisk udstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Conacyt, Mexico under tilskud 312231 af "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación" og af AMEXCID og det mexicanske udenrigsministerium (SRE) under tilskud "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO takker Conacyt Mexico for deres ph.d.-stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R.
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
