Summary
Mikroakışkanlar, tanısal testlerin geliştirilmesi için güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, pahalı ekipman ve malzemelerin yanı sıra zahmetli imalat ve taşıma teknikleri de sıklıkla gereklidir. Burada, manyetik mikro ve nanopartikül bazlı immünotahliller için akrilik bir mikroakışkan cihazın üretim protokolünü düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir ortamda detaylandırıyoruz.
Abstract
Mikroakışkan sistemler immünoassay tekniklerini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, birçok mikrofabrikasyon tekniği uzmanlaşmış, pahalı veya karmaşık ekipman gerektirir, bu da imalatın maliyetli olmasını ve düşük kaynak ortamlarında benimsenecek bakım noktası testlerinin (POCT) en önemli ön koşullarından biri olan seri üretimle uyumsuz olmasını sağlar. Bu çalışma, bilgisayarlı sayısal kontrol (CNC) mikrofrezeleme tekniğini kullanarak nanopartikül konjuge enzimatik immünoassay testi için bir akrilik (polimetilmetakrilat, PMMA) cihazının üretim sürecini açıklamaktadır. Mikroakışkan cihazın işleyişi, 100 nm manyetik nanopartiküllere konjuge edilmiş bir model antijen olarak lizozim kullanarak ticari bir antikoru tespit etmek için bir immünoassay yapılarak gösterilir. Bu cihaz, harici bir mıknatıs yerleştirerek manyetik bir tuzak oluşturan manyetik mikropartikülleri yakalamak için kullanılan, yalnızca 5 μm yüksekliğinde fiziksel kademeli bir kısıtlamayı bütünleştirir. Bu şekilde, konjuge nanopartiküllerin immün desteği üzerindeki manyetik kuvvet, onları yakalamak ve akış sürüklenmesine direnmek için yeterlidir. Bu mikroakışkan cihaz, immünoassay performansı için hassasiyet kaybı olmadan düşük maliyetli seri üretim için özellikle uygundur.
Introduction
Son yıllarda, mikroakışkanlar immünoassay tekniklerinde önemli bir rol oynamıştır1. Minyatürleştirme teknolojisi, geleneksel immünotahlillere kıyasla daha az numune ve reaktif tüketimi, daha kısa inkübasyon süreleri, verimli çözelti değişimi ve daha yüksek entegrasyonve otomasyon 2 gibi birçok olağanüstü avantaja sahiptir.
Ayrıca, immünotahlillerdeki mikroakışkan sistemler, immünodestek olarak manyetik nanopartiküllerle birlikte, inkübasyon sürelerini önemli ölçüde azaltır ve artan yüzey-hacim oranı nedeniyle yüksek algılama hassasiyeti elde eder3. Parçacıkların Brownian hareketi, antijen-antikor kompleksi 4,5'in oluşumu sırasında reaksiyon kinetiğini geliştirir. Dahası, nanopartiküllerin manyetik özellikleri, farklı mikroakışkan cihaz konfigürasyonlarına entegre edilmek üzere çok yönlülük sağlar, bu da onları minyatür çip üstü biyosensing sistemlerinde sinyal ve molekül yakalama için ideal bir aday haline getirir5. Bununla birlikte, manyetik kuvvetler, yüksek yüzey-hacim oranı6 nedeniyle nanometre ölçeğinde sürükleme kuvvetlerinden önemli ölçüde daha zayıftır. Bu nedenle, yıkama ve algılama gibi önemli immünoassay adımları için nanopartiküllerin yakalanması zor olabilir ve geleneksel bir mıknatıs yetersizdir4.
Nanopartikülleri manipüle etmenin etkili bir yolu, mikroakışkan bir yapıda paketlenmiş demir mikropartikülleri tarafından oluşturulan mikroakışkan manyetik bir tuzağın kullanılmasıdır3. Bu nedenle, harici bir mıknatıs yaklaştığında, manyetik ve akı kuvvetleri arasında mıknatıslanmış gözenekli ortam içinde karmaşık bir etkileşim yaratılır. Nanopartiküllere etki eden manyetik kuvvet, onları yakalamak ve akış sürüklenmesine direnmek için yeterince güçlüdür 3,4,7. Bu yaklaşım, mikropartikülleri tutan mikrometrik yapılar oluşturmak için birkaç mikrometre düzeyinde çözünürlükler elde eden mikrofabrikasyon teknikleri gerektirir.
Mevcut mikrofabrikasyon teknikleri, yapıların birkaç mikrondan yüzlerce nanometreye kadar yüksek çözünürlüklü imalatına izin verir8. Bununla birlikte, bu tekniklerin çoğu uzmanlaşmış, pahalı veya karmaşık ekipman gerektirir. Başlıca zorluklardan biri, pahalı ve zaman alıcı 8,9 olan kalıp üretimi için temiz bir oda gereksinimidir. Son zamanlarda, mikroakışkan mühendisleri, azaltılmış maliyetler, daha hızlı geri dönüş süreleri, daha ucuz malzemeler ve aletler ve artan işlevsellik gibi çeşitli avantajlarla çeşitli alternatif imalat yöntemleri geliştirerek bu dezavantajı aşmışlardır8. Bu şekilde, yeni mikrofabrikasyon tekniklerinin geliştirilmesi, 10 μm8'e kadar düşük çözünürlüklere ulaşan düşük maliyetli, temiz oda dışı yöntemler getirdi. Desenleme, pahalı bir kalıplama deseni oluşturmadan doğrudan bir substrat üzerinde kullanılabilir, böylece zaman alıcı bir işlemden kaçınılır. Doğrudan imalat yöntemleri arasında CNC frezeleme, lazer ablasyon ve doğrudan litografi8 bulunur. Tüm bu yöntemler, sertliklerine bakılmaksızın çok çeşitli malzemelerde yüksek en boy oranına sahip kanallar üretmek için uygundur9, mikroakışkan cihazlarda yeni ve avantajlı geometriler, fiziksel davranışlar ve niteliklersağlar 8.
CNC mikro frezeleme, bir alt tabakadan dökme malzemeyi çıkaran kesici aletler kullanarak mikro ölçekli yapılar oluşturur ve mikroakışkan cihazlar için etkili bir imalat yöntemidir10,11. Mikrofrezeleme tekniği, mikroakışkan uygulamalarda doğrudan çalışma yüzeyinde mikro kanallar ve özellikler oluşturmak için yararlı olabilir ve önemli bir avantaj sunar: bir iş parçası kısa sürede (30 dakikadan az) üretilebilir ve tasarımdan prototip12'ye geri dönüş süresini önemli ölçüde azaltır. Ek olarak, farklı malzemelerden, boyutlardan ve şekillerden kesme aksesuarlarının geniş kullanılabilirliği, CNC freze makinelerini birçok düşük maliyetli tek kullanımlık malzeme türünde farklı özelliklerin üretilmesine izin veren uygun bir araç haline getirir13.
Mikrofrezelemede yaygın olarak kullanılan tüm malzemeler arasında, termoplastikler birçok olumlu özellikleri ve biyolojik uygulamalarla uyumluluğu nedeniyle lider bir seçim olmaya devam etmektedir10,14. Termoplastikler, düşük maliyetli, tek kullanımlık analitik sistemler geliştirmek için önemli avantajları nedeniyle mikroakışkan sistemler için çekici bir substrattır9. Ek olarak, bu malzemeler yüksek hacimli üretim süreçlerine oldukça uygundur, bu da onları ticarileştirme ve seri üretim için uygun hale getirir. Bu nedenlerden dolayı, PMMA gibi termoplastikler, mikroakışkanların ilk yıllarından beri güvenilir ve sağlam malzemeler olarak kabul edilmiştir10. Termoplastiklerde solvent yapıştırma15, ısı yapıştırma16 ve ultraviyole (UV) / ozon yüzey işleme yapıştırma17 gibi kapalı kanallar üretmek için farklı protokoller tanımlanmıştır.
Çoğu durumda, geleneksel mikro freze makineleri ile elde edilen konumlandırma çözünürlüğü, 10 μm'den küçük yapılar gerektiren bazı mikroakışkan uygulamalar için yeterli değildir. Üst düzey mikro frezeleme yeterli çözünürlüğe sahiptir. Ne yazık ki, yüksek fiyatlar nedeniyle, kullanımı bir avuç kullanıcıyla sınırlıdır12. Daha önce, araştırma grubumuz, geleneksel freze makinelerinin çözünürlüğünün üstesinden gelerek, 10 μm'den daha az işleme yapılarına izin veren düşük maliyetli bir takımın imalatını ve manipülasyonunu bildirmiştir12. Fikstür, üç piezoelektrik aktüatör içeren, basit elektroniklerle 3D baskı ile üretilen bir platformdur. Yüzey, piezoelektrik elemanlar aynı anda hareket ettiğinde kaldırılmasını sağlayan menteşe şeklindeki eklemler içerir. Z ekseni yer değiştirmesi, 500 nm çözünürlük ve ±1,5 μm12 hassasiyetle kontrol edilebilir.
Bu yazıda, bir mikrofrezeleme tekniği ile bir akrilik cihazın (PMMA) üretim sürecinin adımları sunulmaktadır. Talaş tasarımı, 200 μm genişliğinde ve 200 μm yüksekliğinde bir ana kanaldan ve reaktiflerin akışını temizlemek için aynı boyutlara sahip bir yan kanaldan oluşur. Merkezi bölgede, kanal, harici bir mıknatıs yerleştirerek nanopartiküller için manyetik bir tuzak oluşturan manyetik mikropartikülleri yakalamak için bu grup12 tarafından yapılan 3D baskılı piezoelektrik platform ile imal edilen sadece 5 μm yüksekliğinde fiziksel bir kısıtlama ile kesintiye uğrar. Mikroakışkan cihazın çalışmalarını, 100 nm manyetik nanopartiküllere konjuge edilmiş bir model antijen olarak lizozim kullanarak ticari bir antikoru tespit etmek için bir immünoassay yaparak gösteriyoruz. Bu cihaz, onu benzersiz kılan farklı özellikleri bir araya getirir4: manyetik nanopartiküllerin bağışıklık desteği olarak kullanılması, toplam test süresini saatlerden dakikalara düşürür; Tespit için florojenik bir enzim kullanmak, standart enzime bağlı immünosorbent tahlilleriyle (ELISA'lar) karşılaştırılabilir tespit sınırlarına izin verir; ve bir termoplastiğin bir imalat malzemesi olarak kullanılması, önceki mikroakışkan nanopartiküllerin manyetik tuzakları3 için geçerli olmayan seri üretimle uyumlu hale getirir ve POCT'yi geliştirmek için mükemmel bir aday haline getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrofrezeleme
- Yüzey taşlama
- Mikrofreze makinesini ve piezoelektrik kontrolörü açın. İlgili kontrol yazılımlarını başlatın12.
- Gerekli parmak freze uçlarını seçin (200 μm ve 800 μm çaplar). Bunları freze makinesinin uygun bölmesine yerleştirin (Şekil 1).
- 1,3 mm kalınlığındaki PMMA'nın 9 mm x 25 mm dikdörtgenlerini 800 μm parmak freze ucu ile kesin. Bu dikdörtgenlerden birini piezoelektrik platforma çift taraflı yapışkan bantla dikkatlice takın (Şekil 2).
NOT: Akrilik dikdörtgeni her zaman aynı konuma yerleştirdiğinizden emin olun, böylece köşelerden biri işleme için x ve y eksenlerindeki başlangıç koordinatlarıyla çakışacaktır. - Z-sensörünü bağlayın ve PMMA dikdörtgeninin yüzeyine yerleştirin. Algılama pimini seçin ve sensör yüzeyinin üzerinde hareket ettirin. Sensöre temas etmeden pimi manuel olarak indirin. Z0 algılama modunu etkinleştirin (Şekil 3).
- 200 μm parmak freze ucunu seçin ve x, y orijinine taşıyın. z sensörünü çıkarın. Akrilik yüzeye temas etmeden ucu dikkatlice indirin.
- 200 μm parmak freze ucunu 14.500 dev/dak'da döndürün. Yavaşça z eksenindeki orijin koordinatına indirin (z = 0). Z eksenini kaynağın 30 μm altına sıfırlayın. Bu koordinatı yeni z kaynağı olarak ayarlayın.
NOT: Dönmüyorsa ucu asla alçaltmayın. Aksi takdirde, kırılma riski vardır. - Cut panelini etkinleştirmek için mikro freze makinesi yazılımındaki Kes düğmesine tıklayın. Ekle düğmesine tıklayın ve akrilik yüzeyin taşlanması için önceden oluşturulmuş bir kod içeren .txt dosyasını (Ek Kodlama Dosyası 1) seçin. İşlemi başlatmak için Çıktı düğmesine tıklayın.
- Parmak freze ucunu, kısıtlamanın işleneceği koordinata getirin. Duraklat düğmesine tıklayarak bu koordinata ulaşıldığında parmak freze ucunun zemin yüzeyinden kalkmasını önleyin. Aksi takdirde, parmak freze ucunu bu koordinata manuel olarak yeniden konumlandırın (Şekil 4A).
- 5 μm kısıtlamasının frezelenmesi
- Parmak freze ucunun dönme hızını 11.000 rpm'ye ayarlayın. Piezoelektrik platformun arayüzü ile platformu 6,5 μm yükseltin (Ek Şekil S1). Freze ucunu y ekseni boyunca 500 μm hareket ettirin. Piezoelektrik platformu, kontrol arayüzü ile z eksenindeki başlangıç değerine geri döndürün.
- Mikro kanalların frezelenmesi
- Tasarım yazılımından önceden oluşturulmuş tasarım dosyasını açın (Ek Tasarım Dosyası 1). Print (Yazdır ) düğmesine tıklayın. Özellikler menüsüne erişin ve işlenecek tasarımı içeren katmana karşılık gelen renk penceresine tıklayın. Takım panelindeki imalat parametrelerini Ek Şekil S2'de belirtildiği gibi ayarlayın.
- Araçlar açılır menüsündeki Hiçbiri seçeneğini belirleyerek istenmeyen katmanları devre dışı bırakın.
- Deliklerin frezelenmesi
- 800 μm parmak freze ucuna geçin. İlgili renk penceresine tıklayarak 1,2 mm çapındaki deliklerin tasarım katmanını etkinleştirin.
- Adım 1.3.2.'yi tekrarlayın, ancak bu durumda, delikler için Ek Şekil S3A'da açıklandığı gibi ilgili imalat parametrelerini ayarlayın.
NOT: İşlenmiş deliklerin derinliği akrilik kalınlığın yarısıdır. - Dikdörtgenin karşıt köşelerinde, akriliğin yeni bir platformda ters çevrilmiş bir şekilde hizalanmasına iki ek delik açın (Şekil 4B). Piezoelektrik platformdan akrilik dikdörtgeni çıkarın. Akriliği çevirin ve işlenmiş sütunlarla adaptörün üzerine çift taraflı yapışkan bantla bantlayın (Şekil 4C, D).
- Tasarım yazılımından karşı yüz için deliklerin tasarımını içeren dosyayı açın (Ek Tasarım Dosyası 2). İlgili üretim parametrelerini Ek Şekil S3B'de açıklandığı gibi ayarlayın. Reaktif giriş ve çıkış deliklerinin kalan yarısını 1,5 mm çapında ve 0,7 mm derinlikte frezeleyin (Ek Şekil S3C).
Şekil 1: Freze ucu yerleşimi . (A) 200 μm ve 800 μm parmak freze uçları yerleştirilir ve bir vida vasıtasıyla çelik desteğe sabitlenir. (B) Her parmak freze ucu, otomatik seçim için mikro freze makinesinin özel bölmesine yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Piezoelektrik platform. Platform 3D baskı ile üretilmiştir ve üç piezoelektrik aktüatör tarafından kontrol edilen z ekseninde ince bir yer değiştirmeye izin veren menteşelerle birleştirilmiş iki altıgen tabandan oluşur. PMMA dikdörtgeninin takılı olduğu ve koordinatların hizalama köşesinin ayarlanmasına izin veren bir akrilik adaptör de gözlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Z ekseni kalibrasyonu. Z ekseni kalibrasyonunun adımları detaylandırılmıştır. (A) Z-sensörü, mikro freze makinesine takılan bir kablo içerir. (B) Sensör doğrudan işlenecek yüzeye yerleştirilir. (C) Algılama pimi, parmak freze uçlarının yanındaki özel bir bölmeye yerleştirilmiş metal bir çubuktan oluşur. (D) Her iki aksesuar da temas ettiğinde, mikro freze makinesi z eksenindeki menşe koordinatını otomatik olarak hesaplar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Düzeltilmiş akrilik yüzey. (A) 200 μm çaplı parmak freze ucu, akrilik dikdörtgenin tüm yüzeyini süpürerek yaklaşık 30 μm yüksekliğinde bir tabakayı temizler. (B) Resim, daha önce düzeltilmiş akriliğin yüzünde öğütülmüş farklı yapıları göstermektedir. Reaktif giriş ve çıkışı için kanallar ve delikler gözlenir. 5 μm kısıtlaması çıplak gözle görülemez. (C) Hizalama delikleri olan mikro frezelenmiş yüzey ve zıt köşelerde hizalama sütunları bulunan adaptör. (D) Akrilik, adaptör üzerinde, hizalama deliklerinin sığdığı sütunlarla baş aşağı hizalanır. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Kanal sızdırmazlığı
- Akrilik temizlik
- Akrilik dikdörtgeni sütun adaptörü platformundan çıkarın. Başka bir işlenmemiş akrilik dikdörtgen alın. Her iki akrilik tabakayı izopropil alkol (IPA) ile yıkayın ve damıtılmış suyla durulayın. Eldiven giyin ve IPA ile temastan kaçının.
- Akriliği 10 dakika boyunca ultrasonik bir banyoya daldırın (Şekil 5A, B).
- Gazlı kloroform maruziyeti
- Her iki akrilik tabakayı da mükemmel şekilde kurulayın. Çift taraflı bantla cam Petri çanak kapağının içine bantlayın. İşlenmiş kanalın kenarını açıkta bıraktığınızdan emin olun (Şekil 5C). Eldiven giyin ve akrilik yüzeye doğrudan dokunmaktan kaçının.
- Cam Petri kabının tabanını daha büyük bir cam Petri kabının içine yerleştirin (Şekil 5D). Petri kabının tabanına 1 mL kloroform dökün. Kapağı, iç tarafa tutturulmuş akrilik levhalarla hızlı bir şekilde yerleştirin.
- Hemen daha büyük Petri kabının tabanına, Petri kabı kapağının seviyesine kadar damıtılmış su ekleyin. Akriliğin kloroform gaza 1 dakika maruz kalmasına izin verin (Şekil 5E).
NOT: Kloroforma daha uzun süre maruz kalma süresinin akrilik yüzeye saldıracağını ve 5 μm kısıtlamasının eriyeceğini, yüksekliğini değiştireceğini veya tamamen kaybolacağını düşünün. - Oluşturulan su contasını kırmak için Petri kabını eğin. Petri kabını ortaya çıkararak akriliği kloroformdan derhal çıkarın. Suyu dökmemeye dikkat edin.
DİKKAT: Bu işlemi duman davlumbazında yapın ve kloroform oldukça toksik olduğundan eldiven kullanın.
- Presleme ve ısıtma ile yapıştırma
- Her iki akrilik plakayı da çift taraflı banttan soyun.
- Her iki akriliği de gaz halindeki kloroforma maruz kalan taraflarla yüz yüze hizalayın ve bir sandviç oluşturun. Akrilikleri prese 18 kgf/cm2 ve 90 °C sıcaklıkta yerleştirin (Şekil 5F,G).
NOT: Akriliğin uzunlamasına hizalanmış olarak yerleştirilmesi ve daha iyi bir sızdırmazlık için 2 dakika sonra hizalamasının değiştirilmesi önerilir. Bu süreden sonra conta yetersizse, 1 dakikadan fazla olmayan aralıklarla tekrar prese yerleştirin. Stereoskobu kullanarak kanalların durumunu ve kısıtlamayı kontrol edin. Presleme süresinin aşılması durumunda, kısıtlamanın ortadan kaldırılması riski olduğunu düşünün.
- Hortum bağlantısı
- 2-3 cm uzunluğunda hortum kesin. Tamamen düz bir kesim yapın. Her hortumu anında kuruyan sıvı yapıştırıcı ile cihazın deliklerine takın (Şekil 6A). Yapıştırıcının çipin içine girmesini önleyin.
Şekil 5: Cihazın sızdırmazlık işlemi . (A) Akrilik levhaların her biri, damıtılmış su ile yeniden kapatılabilir bir torbaya yerleştirilir ve ultrasonik banyoya daldırılır. (B) Soldaki görüntü, imalattan hemen sonra kanalları gösterir ve sağdaki görüntü, IPA ve ultrasonik banyo ile yıkandıktan sonra aynı cihazı gösterir, tüm safsızlıkları ve akrilik kalıntıları mikrokanaldan uzaklaştırır. 200 μm'lik merkezi kanalı kesen kısıtlamanın kenarları gözlenir ve bu da başarılı frezeleme işlemini doğrular. Ölçek çubukları = 500 μm. (C) Her iki akrilik de kurutulur ve kapaktaki cam platforma yapıştırılır. (D) Petri kabının tabanı daha büyük çaplı başka bir kabın içine yerleştirilir. (E) Petri kabını kapatırken, su contası gaz halindeki kloroformun kaçmasını önler. (F) 5 kg ağırlığındaki kol elemanlarının tanımı. (G) Akriliğin yerleştirildiği alanı kırmızı renkle gösteren açık kolun görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Cihaz hazırlama
- Bir şırınga kullanarak kanalları damıtılmış suyla doldurun. Sızıntı olmadığından veya akışa karşı direnç olmadığından emin olun. Kanalların içinde kalan akrilik, yapışkan veya istenmeyen malzemeleri çıkarmak için cihazı 10 dakika boyunca ultrasonik bir banyoya daldırın.
- Cihaz kanallarının içindeki suyu boşaltın. 1x Tris tamponlu salin (TBS) içinde seyreltilmiş ve daha önce 0,2 μm polietersülfon (PES) şırınga filtresinden süzülmüş% 5 (w / v) sığır serum albümini (BSA) ile hazırlanan bir blokaj çözeltisi sunmak için bir şırınga kullanın.
- % 5 BSA'da 7.5 μm çapında demir mikropartiküllerinin bir süspansiyonunu hazırlayın.
NOT: Mikropartiküller daha önce protein emilimine direnç kazandıran bir silika-polietilen glikol (PEG) tabakası ile işlevselleştirilmiştir4. - Çipi ve mikropartikül süspansiyonunu blokaj çözeltisi ile oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca inkübe edin. Mümkünse, gece boyunca 4 ° C'de tıkanmaya izin verin.
4. Mikropartikül tuzağı oluşumu
- Mikropartikülleri, yan kanal çıkış hortumundan bir şırınga iğnesi ile çipin içine yerleştirin. Çipi dikey olarak yerleştirin ve mikropartiküllerin yan kanaldan yerçekimi etkisi altında akmasına izin verin. Çipi 90°'lik iki adımda 180° döndürün ve mikropartiküllerin 5 μm kısıtlamada hedeflemesine ve sıkıştırmasına izin verin.
- Yerçekimi yan kanala doğru 45 ° dönerek fazla mikropartikülleri uzaklaştırın.
- Mikropartikül tuzağının geri alınmasını önlemek için cihazı dik tutun. Mikropartikül tuzağı oluşum sürecinin bir özeti için Şekil 6B'ye bakınız.
5. İmmünoassay
- Nanopartikül hazırlama
- Daha önce lizozim (antijen modeli) ile konjuge edilmiş 100 nm nanopartiküllerin süspansiyonunun 2 μL'sini alın. 100 μL blokaj çözeltisi ile 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 150 μL yıkama tamponu ekleyin (1x TBS, %0,05 Ara 20).
- 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Nanopartiküllerin ayrılmasına izin vermek için 15 dakika bekletin (Ek Şekil S4).
NOT: Manyetik ayırıcı için minimum hacim 200 μL'dir. - Sıvıyı tüpten bir mikropipetle çıkarın. Nanopartikül peletinin oluştuğu tüpün duvarı ile temastan kaçının.
- 250 μL taze yıkama tamponu ekleyin. Tüpü 15 dakika boyunca ajitasyon altında tutun.
- 5.1.3.-5.1.5 arasındaki adımları yineleyin. 2x daha fazla, sadece 5 dakika sallanıyor.
- İstenilen konsantrasyonda primer antilizozim antikoru ekleyin ( bakınız Malzeme Tablosu). Antikor seyrelticide 100 μL'lik bir son hacme ayarlayın (1x TBS,% 1 BSA,% 0.05 Ara 20).
- 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında 15 dakika daha sallanmaya devam edin.
- 5.1.2.-5.1.6 yıkama adımlarını tekrarlayın.
- 100 μL antikor seyreltici ekleyin. Yaban turpu peroksidaz ile eşleşmiş sekonder antikoru (HRP-AbII) ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1:500 seyreltmede ekleyin.
- 5.1.2.-5.1.6 yıkama adımlarını tekrarlayın.
- Nanopartikülleri 50 μL antikor seyrelticisinin son hacminde tutun.
6. Deneysel montaj
- İki adet 100 μL cam şırıngayı suyla doldurun, her bir şırıngaya 6,5 cm uzunluğunda bir hortum bağlayın, hortumun ucuna metal bir pim yerleştirin ve her iki şırıngayı da bilgisayar kontrollü şırınga pompasına yerleştirin.
- Akrilik cihazın tüm hortumlarını ısı ile kapatın.
- Giriş hortumunu kesin ve sadece birkaç milimetre tutun. Dağıtım iğnesini yıkama tamponu ile doldurun ve kesilmiş hortuma yerleştirin. Cihaza hava erişimini önlemek için iğneyi cihaza bağlamadan önce çözeltinin damlamasına izin verin.
- Çıkış hortumunu yanal kanaldan kesin. Şırınga pompasına bağlayın. Ardından, ana kanal çıkış hortumu için aynı prosedürü uygulayın.
NOT: 6.3.-6.4 adımlarını gerçekleştirmek çok önemlidir. mikropartikül tuzağının ambalajından çıkmasını önlemek için. Mümkünse, bu adımlar sırasında tuzağın durumunu bir büyüteç yardımıyla doğrulayın. - Mikroskop aşamasına bir cam slayt yerleştirin. Mıknatısı çift taraflı bantla slayda takın ve talaş kenarlarını cama sabitlemek için her iki tarafa da küçük bir bant parçası yerleştirin.
- Şırınga pompası kontrolöründeki Akış Hızı ve Birimler sekmeleri aracılığıyla 50 μL/s'lik bir akış hızı ayarlayın. Para çekme modunu seçin ve yıkama tamponunun akışını etkinleştirmek için Başlat düğmesine tıklayın.
- Dikkatlice, cihazı mıknatısla slayta doğru yatay bir şekilde yaklaştırın, böylece tuzağı içeren çipin alanı mıknatısla temas eder.
- Hareketi önlemek için cihazın kenarlarını çift taraflı bantla cama yapıştırın. Mikroskopi için optik yolu engellemekten kaçının (Şekil 6C).
Şekil 6: Son cihaz konfigürasyonu . (A) İlgili giriş ve çıkışlara bağlı hortumlarla akrilik cihaz. Ölçek, cihazın boyutlarını santimetre cinsinden gösterir. (B) Mikroparçacık tuzağının oluşumu için protokol. Mikropartiküller, cihaz dikey bir konuma yerleştirildiğinde yerçekimi ile kanaldan akar. Mikropartiküller 5 μm kısıtlamasında yoğunlaşır. Fazla mikropartiküller, çip yan kanaldan döndürülerek kolayca çıkarılır. İmmünoassay öncesi tuzağı korumak için çip dikey tutulur. (C) Mıknatısı içeren cam bir slayt üzerine, ters floresan mikroskobun sahnesine monte edilmiş mikroakışkan cihaz. Reaktiflerin eklendiği dağıtım iğnesinin yanı sıra bir şırınga pompasına bağlanan çıkış hortumları da gözlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
7. İmmün tespit
- Fazla BSA'yı gidermek için yıkama tamponunu 50 μL/s'de 10 dakika boyunca akmaya devam ettirin.
- Kalan yıkama tamponunu dağıtım iğnesinden bir mikropipetle çıkarın. Nanopartikül süspansiyonunun 50 μL'sini ekleyin.
- Nanopartiküllerin süspansiyonunu 7 dakika boyunca 100 μL / s akış hızında akıtın. Daha sonra, akış hızını 50 μL / s olarak değiştirin ve 15 dakika daha deyin.
- Dağıtım iğnesini değiştirin. Yıkama tamponunu 50 μL/s'de 10 dakika boyunca akıtın. Florojenik substratı, yıkama adımı sırasında üreticinin spesifikasyonlarına göre hazırlayın.
- Kalan yıkama tamponunu dağıtım iğnesinden bir mikropipetle çıkarın. Florojenik substrattan 100 μL ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Florojenik substratı 50 μL/s'de 6 dakika boyunca akıtın.
- Şırınga pompasını kontrol eden arayüzün ilgili Akış Hızı ve Zamanlayıcı Ayar sekmelerinde akış hızı (1 μL/s, 3 μL/h, 5 μL/h ve 10 μL/h) ve zaman (6 dakika) ölçüm parametrelerini ayarlayın. Gerçekleştirilecek ölçümlerin her biri için Geri çekme modunu seçtiğinizden emin olun.
- Yıkama adımı için ek bir Akış Hızı sekmesini 50 μL/s'ye ayarlayın ve Zamanlayıcıyı 3 dakikaya ayarlayın.
- Substrat 50 μL/s'de durmadan 15 s önce mikroskopun floresansını açın. Substrat 1.000 milisaniyelik bir pozlama süresiyle durmadan 10 s önce mikroskop kamerasının yazılımıyla görüntü yakalamaya başlayın. 1 kare/sn'de (FPS) 6 dakika boyunca görüntüleme gerçekleştirin.
- 50 μL/s'de substrat yıkama akış hızı durduktan hemen sonra istenen akış hızı parametresinin Başlat düğmesine tıklayın. Seçilen ölçüm akışı durduktan hemen sonra yıkama akışının Başlat düğmesine ( 50 μL/h) tıklayın.
- Görüntü yakalamayı durdurun ve substratın fotobeyazlamasını önlemek için mikroskopun floresansını kapatın.
- 7.8.-7.10 arasındaki adımları yineleyin. kullanılan her ölçüm akış hızı için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geleneksel mikrofrezeleme tekniğinin çözünürlüğünü artıran yüksek oranda tekrarlanabilir bir imalat protokolü oluşturmak mümkündü. Bu protokolü kullanarak, 200 μm yüksekliğindeki bir kanalda kademeli bir kısıtlama olarak çalışan 5 μm yüksekliğinde bir kanalın üretimi sağlanır. Kademeli kısıtlamanın basit tasarımı, mikrokanalda sıkıştırıldığında, harici bir mıknatıs cihaza yaklaştığında manyetik bir tuzak oluşturulmasına izin veren 7,5 μm çapındaki demir mikropartiküllerini yakalar. Bu cihaz, immünolojik destek olarak ilgilenilen analit ile konjuge edilmiş nanopartiküller kullanılarak immünotahlillerin yapılmasına izin verir. Bu çalışmada, enzim etiketli antikor bazlı tespiti ile rekabetçi olmayan dolaylı immünotahliller yapılmıştır. Model antijen (Ag), 100 nm çapında nanopartiküllere (NP'ler) konjuge edilmiş lizozim proteiniydi. Primer antikor (AbI) olarak tavşan antilizomi IgG kullanıldı ve tavşan yaban turpu peroksidaz konjuge sekonder antikoru (HRP-AbII) kullanılarak tespit yapıldı.
Tespit, HRP-AbII'nin tuzaktan sıkışmış nanopartiküllerle geçişi üzerine florojenik bir substratla etkileşiminden sonra elde edilen floresan sinyal yoğunluğundaki değişimin ilişkilendirilmesiyle gerçekleştirildi. Ölçümleri gerçekleştirmek için, tuzaktan önceki bir bölge ve tuzaktan sonraki bir bölge belirlendi. Şekil 7A-D, farklı anti-lizozim AbI konsantrasyonları için floresan yoğunluğundaki artışı göstermektedir: belirli bir florojenik substrat akış hızı (3 μL / h) için 0 ng / mL, 10 ng / mL, 100 ng / mL ve 1.000 ng / mL. Bu, substrat floresansındaki değişimin, kullanılan AbI konsantrasyonu ile doğru orantılı olduğunu göstermektedir.
Şekil 7: Floresan ölçüm alanları. Kullanılan primer antilizozim antikorunun farklı konsantrasyonları için floresan ölçümleri gösterilmiştir: (A) 0 ng / mL, (B) 10 ng / mL, (C) 100 ng / mL ve (D) 1.000 ng / mL. Mavi daireler, substratın HRP konjuge sekonjuge sekonder antikor ile reaksiyona girdiği 5 μm yükseklik kısıtlaması tarafından oluşturulan tuzaktan önce ve sonra floresan ölçüm alanını gösterir. Tüm görüntüler 3 μL/s'lik bir akışa karşılık gelir. Kısaltma: HRP = yaban turpu peroksidaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bununla birlikte, belirli bir AbI konsantrasyonu için, elde edilen floresan seviyesi, florojenik substrat için kullanılan akış hızının bir fonksiyonudur. Bu nedenle, bu substratın HRP enzimi tarafından dönüşüm kapasitesi, akış hızı ile ters orantılıdır. 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h ve 10 μL/h farklı substrat akış hızları değerlendirildi. Her deney için, manyetik tuzaktan geçmeden önce ve geçtikten sonra substrat tarafından verilen floresan farkına karşılık gelen eğriler elde edildi. Şekil 8A-C, üç farklı akış hızı için 100 ng / mL'lik bir konsantrasyon için elde edilen eğrileri göstermektedir: (A) 10 μL / s, (B) 3 μL / s ve (C) 1 μL / s. Kullanılan akış hızına bağlı olarak, substratın manyetik tuzağa yerleştirilen HRP konjuge sekonder antikor tarafından dönüşüm kapasitesi değişir. Yeşil eğri, tuzakta bulunan HRP tarafından dönüştürüldükten sonra substratın floresan yoğunluğunu temsil eder. Daha yüksek akışlarda, maksimum floresan seviyesinin bozunma elde ettiği görülebilir. Kırmızı eğri, substrat tuzağa ulaşmadan önce bazal floresanı temsil eder. Tuzağın bu alanındaki substrat floresansının ölçümü sabit kalır ve kanal yüzeyinin verimli bir şekilde bloke edilmesi durumunda değeri, spesifik olmayan etkileşimlerin derecesine bağlıdır. Mavi eğri ile temsil edilen her iki eğri arasındaki farkı hesapladık.
Şekil 8: Floresan eğrileri. 100 ng/mL primer antikor konsantrasyonunda ve (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h ve (C) 1 μL/h akış hızlarında elde edilen grafikler. Üç renkli eğri, tuzaktan önce (kırmızı eğri) ve tuzaktan sonra (yeşil eğri) ölçülen floresanı ve zaman içinde ikisi arasındaki farkı (mavi eğri) temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9A-C, (A) 0 ng / mL, (B) 10 ng / mL ve (C) 1.000 ng / mL'lik AbI konsantrasyonları için farklı akışlar için immünoreaksiyondan önce ve sonra ölçülen floresan farkı eğrilerini bütünleştirir. 0 μL/s akış hızı ölçümü, difüzyonun hüküm sürdüğü statik koşullar altında immünoreaksiyonun ölçümünü gösterir. 1.000 ng / mL'lik bir konsantrasyon için, floresan değerlendirilen tüm akışlar için doyurulur. Bununla birlikte, farklı akışlardaki kademeli floresan paterni, daha küçük akışların üstesinden gelecek kadar yüksek bir dönüşüm oranıyla reaksiyona giren substratın difüzyonundan kaynaklanmaktadır. Böylece, bu floresanın tuzağın yukarı akış bölgesine geri dönüşü vardır.
Şekil 9: Floresan fark oranları. (A) 0 ng / mL, (B) 10 ng / mL ve (C) 1.000 ng / mL'de kullanılan farklı akılar için floresan farklılıklarının (sonra-önce) özetlenmiş eğrileri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu cihazla elde edilen ölçümler, bir model antijen olarak lizozim ile yapılan immünotahliller için standart bir kalibrasyon eğrisi oluşturmayı mümkün kılar. Şekil 10 , manyetik tuzakta gerçekleştirilen immünoreaksiyondan önce ve sonra floresan arasındaki farkların maksimum değerlerinden elde edilen kalibrasyon eğrisini göstermektedir. Bu protokol, 1 μL / s ile 10 μL / s arasındaki akışları kullanarak mililitre başına nanogram sırasına göre konsantrasyonlara sahip birincil anti-lizozim antikorunun tespit edilmesini sağlar. 1 μL / s'deki yüksek değişkenlik ve yüksek floresan seviyeleri, immünokompleksin reaktivitesinin, bu hızın reaksiyona giren substratın akışını desteklemeyeceği ve tuzaktan hemen sonra birikme eğiliminde olduğu şekilde olduğunu düşündürmektedir.
Şekil 10: Kalibrasyon eğrisi. Grafik, her akış hızı için kullanılan primer antikorun (AB1) konsantrasyonuna göre elde edilen eğrilerin floresan yoğunluğundaki farklılıkların maksimum değerini göstermektedir. I/Ioturdu , her bir floresan ölçümü (I) için elde edilen floresan değerinin oranına karşılık gelir, doygunluk üzerine ulaşılan maksimum floresan değerine göre normalleştirilir (Isat). Hata çubukları, üç deneyin standart sapmasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Piezoelektrik platform denetleyici arayüzü. Soldaki resim, piezoelektrik platformun z ekseni yer değiştirmesini kontrol eden arayüzü göstermektedir. Kısıtlama, üç piezoelektrik aktüatöre voltaj uygulanarak platformun yükseltilmesiyle oluşturulur. Doğru görüntü, kısıtlamanın 11.000 rpm hızında işlendiği x ve y eksenlerindeki hassas koordinatları gözlemlemenin mümkün olduğu mikrofreze makinesini kontrol eden yazılımın arayüzünü göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: Cihazın tasarımı. Tasarım yazılımı kullanılarak oluşturulan cihazın tasarımı solda görülmektedir. Tasarım, biri 5 μm yükseklik kısıtlamasını içeren ana kanal ve diğeri atık çıkışı için yan kanal olmak üzere birbirine bağlı iki kanaldan oluşur. Kanallar 200 μm parmak freze ucu ile mikro frezelenmiştir. Sağdaki panel imalat parametrelerini gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S3: Giriş ve çıkış deliklerinin mikrofrezeleme parametreleri. (A) 1,2 mm çapında ve 0,65 mm derinlikte delikler (akrilik kalınlığın yarısı) işlenmiş yüzey üzerinde mikro frezelenir. Sağdaki panel, parmak freze ucunun deplasman hızını, dönüşünü ve derinlik parametrelerini gösterir. (B) 1,5 mm çapında ve 0,7 mm derinlikte delikler, delikleri birbirine bağlayan karşı yüze mikro frezelenmiştir. Sağdaki panel imalat parametrelerini gösterir. Her iki kasa da 800 μm parmak freze ucu ile mikro frezelenmiştir. (C) Reaktif giriş (sağ) ve çıkış (sol) delikleri, her iki yüzün işlenmesinden sonra gösterilir. Daha büyük çaplı yarının boyutları hortumun bağlanmasına izin verirken, daha küçük çaplı yarının oluşturduğu bariyer hortumun girişleri tıkamasını önler. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S4: Nanopartikül ayrımı. Ticari bir manyetik ayırıcı kullanarak, immünotahlil sırasında yıkama adımlarını gerçekleştirmek için 100 nm nanopartiküller kolayca konsantre edilebilir. 15 dakika sonra oluşan pelet kırmızı dairede gözlenir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 1: Akrilik yüzey taşlama kodu. Oluşturulan kod, 25 mm x 9 mm akrilik yüzeyin x ve y eksenleri boyunca taşlanması için talimatlarla birlikte gösterilir. Kodun son satırı, matkap ucunu kısıtlamanın işleneceği koordinata doğru konumlandırır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tasarım Dosyası 1: Mikrokanal ve reaktif giriş ve çıkış deliklerinin tasarımı. Tasarım, daha önce öğütülmüş akrilik yüzünde işlenen iki farklı renkli yapı katmanı (siyah kanallar ve kırmızı delikler) içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tasarım Dosyası 2: Karşı taraftaki deliklerin tasarımı. Tasarım, öncekilerle iletişim kuran ve hortumları sabitlemeye yarayan karşı yüz için daha büyük çaplı deliklerden oluşur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İmmüno-destek olarak nanopartikülleri kullanan immünotahliller için akrilik bir mikroakışkan cihaz, bir mikrofrezeleme tekniği kullanılarak üretildi. Substrat üzerinde doğrudan üretim yöntemi, bir ana kalıbın kullanımından ve bunun ima ettiği zaman ve maliyetlerden kaçınma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, hızlı prototipleme ve yüksek hacimli cihaz üretimi ile sınırlıdır.
Burada, freze makinesi12 için daha önce bildirilen bir aksesuar piezoelektrik platform kullandık. Platform, geleneksel mikro freze makinelerinin 10 μm çözünürlüğünden daha iyi dikey çözünürlüğe sahip değişken derinlikli kanallar oluşturmak için 3D baskı ile üretildi. 200 μm mikroakışkan kanalda kademeli bir kısıtlama oluşturan 5 μm yüksekliğe kadar kanalların frezelenmesini sağladık.
Mikroakışkan cihazın imalatı için, uçları manuel olarak değiştirmeye gerek kalmadan sadece 200 μm ve 800 μm çapında iki parmak freze ucu gereklidir. Kullanılan freze makinesi modeli, zaman optimizasyonuna yardımcı olan uçların değişimini otomatik olarak gerçekleştirir. Ek olarak, "Z0 algılama" modu, freze makinesinde bulunan sensör ve pim ile temas ederek z-ekseninde menşeinin otomatik olarak yüksek hassasiyetle belirlenmesini sağlar.
Bu cihazın tasarımı basittir, sadece 5 μm kademeli bir kısıtlama ile kesilen ana kanaldan ve mikropartiküller için bir temizleme ve giriş görevi gören bir aksesuar kanalından oluşur. Bununla birlikte, bu tür yapıların yüksek hassasiyeti, 7.5 μm çapındaki demir mikropartiküllerini yakalama kısıtlaması için gereklidir. Daha büyük bir kısıtlama, mikropartiküllerin tutulmadan geçmesine izin verir, bu da yakalanmalarını ve mikropartikül tuzağının oluşumunu önler. Tersine, daha küçük bir kısıtlama, kanalın akış direncini büyük ölçüde arttırır ve reaktiflerin gözenekli mikropartikül ortamından geçmek yerine yan kanaldan çıkmasına neden olur. Manyetik tuzağı oluşturmak için daha büyük çaplı mikropartiküllerin kullanılması, daha büyük bir kısıtlama yapılmasına izin verecektir. Örneğin, 40 μm çapındaki parçacıklar ~ 30 μm kademeli bir kısıtlamaya ihtiyaç duyar. Bu durumda, piezoelektrik platformun kullanılması gerekli değildir ve imalat protokolü basitleştirilmiştir. Bununla birlikte, daha büyük mikropartiküllerden oluşan gözenekli bir ortam, nanopartikülleri farklı şekilde yakalayacak ve immünoassay performansını etkileyecektir; ancak, daha iyi mi yoksa daha kötüsü için mi olacağı belli değil. Cihazı optimize etmek için bu özellikleri incelemek için çalışmalar devam ediyor7.
Gerekli doğruluğu elde etmek için, 200 μm parmak freze ucunu tüm akrilik yüzey boyunca 14.500 rpm'de hareket ettirerek akrilik yüzeyin 30 μm'lik bir tabakasını çıkarmak için yüzey taşlama gerçekleştirildi. Bu işlem, yükseklikte daha fazla doğruluk için tüm yüzey boyunca z ekseninde yeni bir menşe elde edilmesini sağlar. Akriliği her zaman aynı konumda hizalamak çok önemlidir, böylece x ve y eksenlerindeki (önceden ayarlanmış) orijin koordinatları akriliğin köşelerinden biriyle çakışacaktır. Aynı şekilde, akriliğin tabana mükemmel bir şekilde oturduğundan emin olunmalıdır; aksi takdirde, yüzey düzgün bir şekilde aşınmayabilir ve aşağıdaki montaj adımlarında sorunlara neden olabilir.
Program yüzey taşlama işlemini tamamladıktan sonra, parmak freze ucunu otomatik olarak tuzağı oluşturan 5 μm kısıtlamasının işleneceği belirli bir koordinata getirir. Freze ucunun bu koordinata ulaştığında yüzeyden kalkmasını önlemek çok önemlidir. Mikro freze makinesinin, taşlama işlemi bittikten sonra parmak freze ucunun yüzeyden ayrılmasını önleyen bir seçeneğe sahip olup olmadığının belirlenmesi önerilir. Aksi takdirde, kesiciyi manuel olarak bu koordinata yeniden konumlandırmak gerekecektir, bu da konum doğruluğu hatalarına neden olabilir.
Akrilikteki kademeli kısıtlamayı işlemek için, 1,5 μm kadar büyük boy olması gerekir. 5 μm yükseklik için, piezoelektrik platform 6.5 μm'ye yükseltildi, çünkü mikrokanal kanalları sızdırmazlık sürecinde biraz düzleşme eğilimindedir. Ek olarak, cihazdaki kısıtlamanın son uzunluğu sadece 50 μm'dir; ancak, daha sonra işlendiğinde ana kanalın her iki ucuyla iletişim kurmasını sağlamak için daha uzun süre işlenir. Tek adımda, 200 μm derinliğindeki kanallar, 200 μm çaplı parmak freze ucu ve 11.000 rpm dönme hızı kullanılarak üretilir. Bu nedenle, 200 μm genişliğindeki kanalların akrilik olarak işlenmesi sadece birkaç saniye sürer.
Cihazın imalatındaki bir sonraki adım, kanalları dışarıya bağlayan delikleri işlemektir. Bu delikler, cihazın onu çalıştıran şırınga pompasına kolayca bağlanmasını sağlayan hortumları yerleştirmek için kullanılır. Burada karşılaşılan sorunlardan biri de hortumların yerleştirilmesidir. Reaktiflerin akışına izin vermek ve işlenmemiş akriliğin yüzüyle bir conta oluşturmaktan kaçınmak için optimum bir mesafe kritik öneme sahiptir. Bu dezavantajın üstesinden gelmek için, hortumların istenen derinliği aşmadığı bir sınır oluşturmak için delikler iki adımda işlenir.
800 μm parmak freze ucu ile, deliklerin deseni daha önce mikrofrezelenmiş aynı yüzey üzerinde frezelendi. Delikler, her kanalın ucuna, akriliğin kalınlığının yarısı olan 1,2 mm çapında ve 0,65 mm derinlikte işlenir. Ek olarak, dikdörtgenin karşıt köşelerinde, akriliğin platform üzerinde sütunlarla yüzüstü hizalanmasını sağlayan iki delik işlenir. Akriliği piezoelektrik platformdan çıkarmak için kırılmasını önlemek için bir kazıyıcı veya kesici kullanmak önemlidir. Akriliğin karşı tarafında, deliklerin çapı 1,5 mm'dir (önceki yarıdan daha büyük), bu da sabitlenecek hortumun çapına eşittir. Derinlik 0,7 mm'dir ve işlenmiş deliklerin her ikisinin de birbiriyle iletişim kurmasını sağlamak için ön yüz deliğinin yarısından biraz daha büyük olmalıdır. Daha küçük çaplı deliğin oluşturduğu bariyer, hortumun tabana ulaşmasını ve girişi tıkamasını engeller. Protokoldeki bu uygulama, sıvı giriş ve çıkış hortumlarının çipe yerleştirilmesini büyük ölçüde iyileştirir.
Cihaz üretiminde önemli bir adım sızdırmazlıktır. İşlenmiş kanalları içeren yüzün, aynı boyutlarda işlenmemiş bir akrilik kapakla kapatılması gerekir. Levhaların akriliğin cam geçiş sıcaklığına yaklaşmayan bir yöntemle kapatılması, deformasyonsuz kanalların elde edilmesini sağlar. Kullanılan yapıştırma yöntemi sayesinde, iki PMMA levhası arasındaki ince bir çözücü filmi, PMMA levhasının yüzeyinden ince bir filmi çözer, daha sonra buharlaşır ve son olarak PMMA tabakalarının monomerlerini belirli bir çalışma sıcaklığında yeniden bağlar.
Bu akrilik cihazı kapatmak için yaygın olarak tanımlanan kloroform buharına maruz kalma yöntemi kullanılmıştır. Literatürde daha önce bildirildiği gibi, kloroform yüksek bağ mukavemeti sağlar; Bununla birlikte, kloroform akriliğe çok agresif bir şekilde saldırdığından, akrilik asla sıvı kloroform ile doğrudan temas etmemelidir, sadece gaz halindeki kloroform ile. Buharlaşan kloroform ve akrilik arasında optimum bir mesafenin korunması esastır. Akriliğin kapağa yapıştırıldığı bir cam Petri kabı kullanarak basit bir sistem oluşturduk. Petri kabının kapağına birleştirilmiş ve tutturulmuş dokuz slayttan oluşan bir platform kullanıldı, bu platformda mesafeyi düzenlemek için akrilikler çift taraflı bantla yapıştırıldı. Gazlı kloroform işlemi ortam sıcaklığındaki değişikliklere karşı çok hassas olmasına rağmen, Petri bulaşıklarının sıcaklığı bir polistiren kutunun içine yerleştirilerek kontrol edilebilir. Su contası, kloroformun çok hızlı buharlaşmasını önler.
Buna karşılık, daha hızlı olan ve özel ekipman gerektirmeyen başka bildirilen birleştirme yöntemleri de vardır; Bununla birlikte, bazıları sadece iki akrilik levhayı işlemeden birleştirmek için uygundur. Benzer şekilde, bağlayıcı kuvveti kontrol etmek zordur, çünkü çözücü doğrudan her iki akrilik levha18 arasına dökülmelidir, mikromilled 5 μm kısıtlaması gibi küçük boyutlardaki yapıları eritme riski yüksektir.
Burada açıklanan protokol kullanılarak, sızdırmazlık basıncının ve sıcaklığının kontrol edildiği ev yapımı bir pres ile homojen contalar elde edildi. Bu presin yapımı için, hem alüminyum bir çerçeve hem de bir menteşe, 5 kg'lık bir ağırlıktan gelen mekanik kuvveti 9: 1 faktörüne yükselten bir kol oluşturur. Isıtma elemanları ısılarını akrilik parçalarla temas eden 2 cm kalınlığındaki alüminyum plakalara aktarır.
Akrilik tabakalar kapatıldıktan sonra, imalat sürecindeki son adım, harici hortumları cihazın ilgili giriş ve çıkışlarına bağlamaktır. Sıvı yapıştırıcı, hortumlar deliklerin içine girdikten sonra harici olarak uygulanır. Hortumun çapı deliklerden daha küçükse, sıvı yapıştırıcı cihaza girerek kanalları tıkayabilir.
Mikrofrezeleme gibi substrat üzerindeki doğrudan imalat yöntemleri, işlenmiş yüzeyin pürüzlülüğü ve zayıf sınırlandırılmış kenarlara sahip yapılar gibi bazı dezavantajlara sahiptir9. Kanalların işlenmiş yüzeyinin pürüzlülüğüne rağmen, bu cihaz için ek bir işlem gerekmez. Bu yapıştırma protokolü hakkında dikkat edilmesi gereken önemli bir nokta, kloroformun, çözücüye maruz kalan yüzeyleri parlatarak öğütülmüş mikro kanalların pürüzlülüğünü azaltmaya izin vermesidir. Yüzeyin parlatılması o kadar iyi ki, optik kalite bile iyileştirildi19.
Cihaz imal edildiğinde, bir immünotahlilde kullanılmak üzere hazırlanmalıdır. Cihazın ultrasonik yıkanması, kanalları tıkayabilecek ve immünoassay'a müdahale edebilecek istenmeyen akrilik kalıntıları gidermek için büyük önem taşımaktadır.
Ek olarak, spesifik olmayan etkileşimlerden ve yüksek arka plan gürültü sinyallerinden kaçınmak için kanalların doğru tıkanmasına özel dikkat gösterilmelidir. % 5 BSA ile blokajın, kanallardaki antikorların spesifik olmayan bağlanmasının gürültüsünü azalttığı gösterilmiştir ve 1 saatlik inkübasyon yeterlidir. Demir mikropartikülleri, içlerinde spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için bir silika-PEG tabakası ile kaplanır. Ayrıca, mikropartiküller cihazda tuzak oluşturmadan önce BSA (kanallarla aynı anda) ile bloke edilir. 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon daha iyidir, yani immünotahlilden önce cihazın üretimi ve inkübasyonu için 1 gün gereklidir. Kloroform tarafından pürüzlülüğün azaltılması ve spesifik olmayan etkileşimleri azaltmak için yüzeylerin tıkanmasının son derece iyi çalıştığı gösterilmiştir, bu da bu platformun bir model immünoassay4'teki standart ELISA ile karşılaştırılabilir bir algılama sınırına ulaşmasını sağlamıştır.
Mikrokanal kısıtlamasında mikropartikül tuzağının oluşumu manuel bir işlemdir. Giren mikropartiküllerin sayısının kesin bir kontrolü olmamasına rağmen, sıkıştırılmış parçacıkların uzunluğunun bir tahminine güveniyoruz. Tuzağı büyütmek veya fazlalığı kolayca çıkarmak mümkündür. Atılan parçacıklar yan kanalda birikir ve çipten çıkarılmasına gerek yoktur. Mikropartiküllerin ana kanala akmasını önlemek çok önemlidir, çünkü tuzağın yukarı yönündeki nanopartiküllerle etkileşime girebilir ve immünoassay ölçümlerini değiştirebilirler.
Bir kavram kanıtı olarak, spesifik birincil antikorun ve buna karşılık gelen HRP etiketli ikincil antikorun inkübasyonu ile 100 nm çapında nanopartiküllere konjuge edilmiş lizozim proteini tarafından oluşturulan bir kompleksin immün tespitini uyguladık. İmmünokompleks cihazın dışında oluşur. Bununla birlikte, tüm immünoassay'ı cihazın içinde gerçekleştirmek mümkündür. Nanopartiküllerin manyetik özellikleri, yüksek performanslı bir neodimyum kalıcı mıknatıslı ayırıcı ile kolay manipülasyona izin verir. Nanopartiküllerin mıknatıs tarafından mikrotüp duvarına çekilmesine izin vermek için reaksiyon mikrotüpünü 15 dakika boyunca tutmalısınız, bu da immünoassay yıkama adımlarını cihazın dışına çıkarır.
Bu cihazın en önemli özelliği, basit, hızlı (ELISA için 4-6 saate kıyasla40 dakika 4 toplam tahlil süresi) ve ucuz (yanal akış testinin fiyatıyla karşılaştırılabilir) olmasıdır. Tüm bu özellikler, bu cihaz profilini POCT'nin geliştirilmesi için iyi bir aday haline getirir. Ek olarak, cihaz, epidemiyolojik çalışmalar ve halk sağlığında karar verme için son derece değerli olan altın standart ELISA4'e benzer analit konsantrasyonlarını nicel olarak tespit edebilir. Genellikle, immünotahliller için mikroakışkan sistemler iyi tespit sınırlarına sahiptir, ancak uzun tahlil sürelerine sahiptir veya kısa tahlil sürelerine sahiptir, ancak optimal olmayan tespit limitlerine sahiptirler4. Manyetik nanopartikülleri bağışıklık desteği ve tespit için florojenik enzimler olarak birleştirerek, bu platform kısa bir tahlil süresine ve iyi bir tespit sınırına sahiptir (önceki çalışmalarda, standart bir ELISA4 ile karşılaştırılabilir bir antijen olarak biyotin kullanarak 8 pg / mL'lik bir tespit sınırı bulduk). Son olarak, bu teknolojinin yanal akış testlerine göre önemli bir avantajı vardır: sadece nitel sonuçlar değil, nicel sonuçlar verme olasılığı ("evet" veya "hayır"). Nadir malzemelerin kullanıldığı laboratuvarlarda geliştirilen diğer birçok mikroakışkan sistemin aksine, bu sistem tıbbi teşhis cihazlarının seri üretimi ile oldukça uyumlu olan düşük maliyetli bir termoplastik olan akrilikten (PMMA) yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Conacyt, Meksika tarafından "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación" hibe 312231 ve AMEXCID ve Meksika Dış İlişkiler Bakanlığı (SRE) tarafından "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2" hibesi altında desteklenmiştir. JAHO, doktora bursu için Conacyt Mexico'ya teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R.
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
