Summary
Microfluidics er et kraftig verktøy for utvikling av diagnostiske tester. Imidlertid er det ofte nødvendig med dyrt utstyr og materialer, samt arbeidskrevende fabrikasjons- og håndteringsteknikker. Her beskriver vi fabrikasjonsprotokollen til en akrylmikrofluidisk enhet for magnetiske mikro- og nanopartikkelbaserte immunoassays i en rimelig og brukervennlig innstilling.
Abstract
Mikrofluidiske systemer har sterkt forbedret immunoassay teknikker. Imidlertid krever mange mikrofabrikasjonsteknikker spesialisert, dyrt eller komplisert utstyr, noe som gjør fabrikasjon kostbar og uforenlig med masseproduksjon, noe som er en av de viktigste forutsetningene for pasientnære tester (POCT) som skal tas i bruk i lavressursinnstillinger. Dette arbeidet beskriver fabrikasjonsprosessen av en akryl (polymetylmetakrylat, PMMA) enhet for nanopartikkel-konjugert enzymatisk immunoassay testing ved hjelp av datamaskinen numerisk kontroll (CNC) mikrofresing teknikk. Funksjonen til den mikrofluidiske enheten er vist ved å utføre en immunoassay for å oppdage et kommersielt antistoff ved bruk av lysozym som et modellantigen konjugert til 100 nm magnetiske nanopartikler. Denne enheten integrerer en fysisk forskjøvet begrensning på bare 5 μm i høyden, som brukes til å fange magnetiske mikropartikler som utgjør en magnetisk felle ved å plassere en ekstern magnet. På denne måten er den magnetiske kraften på immunstøtten til konjugerte nanopartikler nok til å fange dem og motstå strømningsdrag. Denne mikrofluidiske enheten er spesielt egnet for billig masseproduksjon uten tap av presisjon for immunoassay-ytelse.
Introduction
De siste årene har mikrofluidikk spilt en viktig rolle i immunoassayteknikker1. Miniatyriseringsteknologi har mange enestående fordeler sammenlignet med tradisjonelle immunoassays, for eksempel redusert prøve- og reagensforbruk, kortere inkubasjonstider, effektiv løsningsutveksling og høyere integrasjon og automatisering2.
Videre reduserer mikrofluidiske systemer i immunoassays, i forbindelse med magnetiske nanopartikler som immunstøtte, inkubasjonstiden betydelig, og oppnår høy deteksjonsfølsomhet på grunn av økt overflate-til-volum-forhold3. Brownsk bevegelse av partiklene forbedrer reaksjonskinetikken under dannelsen av antigen-antistoffkomplekset 4,5. Videre gir de magnetiske egenskapene til nanopartikler allsidigheten til å bli integrert i forskjellige mikrofluidiske enhetskonfigurasjoner, noe som gjør dem til en ideell kandidat for signalering og molekylfangst i miniatyriserte biosensingssystemer5. Imidlertid er magnetiske krefter betydelig svakere enn dragkrefter på nanometerskalaen på grunn av det høye forholdet mellom overflate og volum6. Derfor kan fangst av nanopartikler for viktige immunoassay-trinn som vasking og deteksjon være utfordrende, og en konvensjonell magnet er utilstrekkelig4.
En effektiv måte å manipulere nanopartiklene på er bruken av en mikrofluidisk magnetisk felle dannet av jernmikropartikler, som er pakket i en mikrofluidisk struktur3. Derfor, når en ekstern magnet nærmer seg, opprettes en kompleks interaksjon innenfor det magnetiserte porøse mediet mellom magnetiske og flukskrefter. Den magnetiske kraften som virker på nanopartiklene er sterk nok til å fange dem og motstå strømningsdrag 3,4,7. Denne tilnærmingen krever mikrofabrikasjonsteknikker som oppnår oppløsninger i størrelsesorden noen få mikrometer for å generere mikrometriske strukturer som beholder mikropartiklene.
Nåværende mikrofabrikasjonsteknikker tillater høyoppløselig fabrikasjon av strukturer fra noen få mikron til hundrevis av nanometer8. Imidlertid krever mange av disse teknikkene spesialisert, dyrt eller komplisert utstyr. En av de største vanskelighetene er kravet om et renrom for muggfabrikasjon, som fortsatt er kostbart og tidkrevende 8,9. Nylig har mikrofluidiske ingeniører overvunnet denne ulempen ved å utvikle en rekke alternative fabrikasjonsmetoder, med ulike fordeler som reduserte kostnader, raskere behandlingstid, billigere materialer og verktøy og økt funksjonalitet8. På denne måten førte utviklingen av nye mikrofabrikasjonsteknikker til lavkost, ikke-renromsmetoder som oppnår oppløsninger så lave som 10 μm8. Mønster kan brukes direkte på et underlag uten å generere et dyrt støpemønster, og dermed unngå en tidkrevende prosess. Direkte fabrikasjonsmetoder inkluderer CNC-fresing, laserablasjon og direkte litografi8. Alle disse metodene er egnet for å produsere kanaler med høyt aspektforhold i et bredt spekter av materialer, uavhengig av hardhet9, noe som muliggjør nye og fordelaktige geometrier, fysisk oppførsel og kvaliteter i mikrofluidiske enheter8.
CNC-mikrofresing skaper mikroskalastrukturer ved hjelp av skjæreverktøy som fjerner bulkmateriale fra et substrat og er en effektiv fabrikasjonsmetode for mikrofluidiske enheter10,11. Mikrofreseteknikken kan være nyttig i mikrofluidiske applikasjoner for å lage mikrokanaler og funksjoner direkte på arbeidsflaten, noe som gir en viktig fordel: et arbeidsstykke kan fremstilles på kort tid (mindre enn 30 minutter), noe som reduserer behandlingstiden fra design til prototype12 betydelig. I tillegg gjør den brede tilgjengeligheten av skjæretilbehør av forskjellige materialer, størrelser og former CNC-fresemaskiner til et egnet verktøy som har gjort det mulig å produsere forskjellige funksjoner i mange typer rimelige engangsmaterialer13.
Blant alle materialene som vanligvis brukes i mikrofresing, er termoplast fortsatt et ledende valg på grunn av deres mange gunstige egenskaper og kompatibilitet med biologiske applikasjoner10,14. Termoplast er et attraktivt substrat for mikrofluidiske systemer på grunn av deres betydelige fordeler for å utvikle rimelige, engangsanalytiske systemer9. I tillegg er disse materialene svært mottagelige for produksjonsprosesser med høyt volum, noe som gjør dem egnet for kommersialisering og masseproduksjon. Av disse grunner har termoplast som PMMA blitt ansett som pålitelige og robuste materialer siden de tidlige årene av mikrofluidikk10. Ulike protokoller er beskrevet for å fremstille lukkede kanaler i termoplast, for eksempel løsningsmiddelbinding15, varmebinding 16 og ultrafiolett (UV) / ozon overflatebehandlingsbinding17.
I mange tilfeller er posisjoneringsoppløsningen oppnådd med konvensjonelle mikrofresemaskiner ikke tilstrekkelig for noen mikrofluidiske applikasjoner som krever strukturer mindre enn 10 μm. High-end mikromilling har nok oppløsning. Dessverre, på grunn av høye priser, er bruken begrenset til en håndfull brukere12. Tidligere rapporterte vår forskningsgruppe fabrikasjon og manipulering av et billig verktøy som tillater maskineringsstrukturer på mindre enn 10 μm, overvinne oppløsningen til konvensjonelle fresemaskiner12. Armaturen er en plattform produsert av 3D-utskrift med enkel elektronikk, som inneholder tre piezoelektriske aktuatorer. Overflaten inneholder hengselformede ledd som gjør at den kan løftes når de piezoelektriske elementene virker samtidig. Z-akseforskyvning kan styres med en oppløsning på 500 nm og en nøyaktighet på ± 1,5 μm12.
Denne artikkelen presenterer trinnene i produksjonsprosessen til en akrylenhet (PMMA) gjennom en mikrofreseteknikk. Brikkedesignet består av en hovedkanal 200 μm bred og 200 μm høy og en sidekanal med samme dimensjoner for å rense strømmen av reagensene. I det sentrale området blir kanalen avbrutt av en fysisk begrensning på bare 5 μm i høyden, produsert med den 3D-printede piezoelektriske plattformen laget av denne gruppen12, for å fange magnetiske mikropartikler som utgjør en magnetisk felle for nanopartikler ved å plassere en ekstern magnet. Vi viser driften av den mikrofluidiske enheten ved å utføre en immunoassay for å oppdage et kommersielt antistoff ved bruk av lysozym som et modellantigen konjugert til 100 nm magnetiske nanopartikler. Denne enheten kombinerer forskjellige funksjoner som gjør den unik4: bruk av magnetiske nanopartikler som immunstøtte reduserer den totale testtiden fra timer til minutter; bruk av et fluorogent enzym for deteksjon muliggjør deteksjonsgrenser som er sammenlignbare med standard enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISAer); og bruken av en termoplast som fabrikasjonsmateriale gjør den kompatibel med masseproduksjon, noe som ikke var tilfelle for tidligere mikrofluidiske nanopartiklers magnetiske feller3, og gjør det til en utmerket kandidat til å utvikle POCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikromilling
- Overflatesliping
- Slå på mikrofresemaskinen og den piezoelektriske kontrolleren. Start deres respektive kontrollprogramvare12.
- Velg de nødvendige endemøllebitene (200 μm og 800 μm diametre). Plasser dem i riktig rom på fresemaskinen (figur 1).
- Skjær 9 mm x 25 mm rektangler med 1,3 mm tykk PMMA med 800 μm endemøllebit. Fest en av disse rektanglene forsiktig med dobbeltsidig tape til den piezoelektriske plattformen (figur 2).
MERK: Pass på at akrylrektangelet alltid plasseres i samme posisjon slik at et av hjørnene sammenfaller med opprinnelseskoordinatene på x- og y-aksene for maskinering. - Koble til og plasser z-sensoren på overflaten av PMMA-rektangelet. Velg deteksjonspinnen og flytt den over sensoroverflaten. Senk pinnen manuelt uten å kontakte sensoren. Aktiver Z0-sensormodus (figur 3).
- Velg 200 μm endemøllebit og flytt den til x, y opprinnelse. Fjern z-sensoren. Senk biten forsiktig uten å komme i kontakt med akryloverflaten.
- Spinn 200 μm endemøllebiten ved 14.500 o / min. Senk den sakte til opprinnelseskoordinaten på z-aksen (z = 0). Tilbakestill z-aksen 30 μm under origo. Angi denne koordinaten som den nye z-opprinnelsen.
MERK: Senk aldri biten hvis den ikke roterer. Ellers risikerer det å bryte. - Klikk på Kutt-knappen i mikrofresemaskinprogramvaren for å aktivere kuttpanelet . Klikk på Legg til-knappen og velg den .txt filen (Supplemental Coding File 1) med en tidligere opprettet kode for sliping av akryloverflaten. Klikk på Output-knappen for å starte prosessen.
- Ta endemøllebiten til koordinaten der begrensningen skal maskineres. Forhindre at endemøllebiten løftes av bakken når denne koordinaten er nådd ved å klikke på Pause-knappen . Ellers kan du manuelt flytte endemøllebiten til denne koordinaten (figur 4A).
- Fresing av 5 μm begrensning
- Sett rotasjonshastigheten til endemøllebiten til 11 000 o / min. Hev plattformen 6,5 μm med grensesnittet til den piezoelektriske plattformen (tilleggsfigur S1). Flytt endemøllebiten langs y-aksen med 500 μm. Returner den piezoelektriske plattformen til den opprinnelige verdien på z-aksen med kontrollgrensesnittet.
- Fresing av mikrokanaler
- Åpne den tidligere opprettede designfilen fra designprogramvaren (Supplemental Design File 1). Klikk på Skriv ut-knappen . Gå til Egenskaper-menyen og klikk på fargevinduet som tilsvarer laget som inneholder designet som skal maskineres. Angi fabrikasjonsparametrene i verktøypanelet som angitt i tilleggsfigur S2.
- Deaktiver uønskede lag ved å velge alternativet Ingen i rullegardinmenyen Verktøy .
- Fresing av hull
- Bytt til 800 μm endemøllebit. Aktiver designlaget til hullene med en diameter på 1,2 mm ved å klikke på det tilsvarende fargevinduet.
- Gjenta trinn 1.3.2., men i dette tilfellet, angi de tilsvarende fabrikasjonsparametrene som beskrevet i tilleggsfigur S3A for hullene.
MERK: Dybden på de maskinerte hullene er halvparten av akryltykkelsen. - Maskin ytterligere to hull på kontralaterale hjørner av rektangelet til justeringen av akrylen på en omvendt måte på en ny plattform (figur 4B). Skrell av akrylrektangelet fra den piezoelektriske plattformen. Vend akrylen og teip den med dobbeltsidig tape over adapteren med de maskinerte søylene (figur 4C, D).
- Åpne filen med utformingen av hullene for motsatt side fra designprogramvaren (Supplemental Design File 2). Angi de tilsvarende fabrikasjonsparametrene som beskrevet i tilleggsfigur S3B. Fres den resterende halvdelen av reagensinnløps- og utløpshullene med en diameter på 1,5 mm og en dybde på 0,7 mm (tilleggsfigur S3C).
Figur 1: Plassering av endemøllebit . (A) Endemøllebitene på 200 μm og 800 μm plasseres og festes gjennom en skrue på stålstøtten. (B) Hver endemøllebit plasseres i det spesifikke rommet på mikrofresemaskinen for automatisk valg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Piezoelektrisk plattform. Plattformen er fabrikkert ved 3D-utskrift og består av to sekskantede baser forbundet med hengsler som tillater en fin forskyvning i z-aksen styrt av tre piezoelektriske aktuatorer. En akryladapter observeres også, som PMMA-rektangelet er festet på, og som gjør det mulig å sette justeringshjørnet på koordinatene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kalibrering av Z-akse. Trinnene i z-aksekalibreringen er detaljerte. (A) Z-sensoren inkluderer en kabel som plugges inn i mikrofresemaskinen. (B) Sensoren plasseres direkte på overflaten som skal bearbeides. (C) Deteksjonspinnen består av en metallstang plassert i et spesialrom ved siden av endemøllebiter. (D) Når begge tilbehørene kommer i kontakt, beregner mikrofresemaskinen automatisk opprinnelseskoordinaten på z-aksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Utbedret akryloverflate . (A) Endemøllebiten på 200 μm diameter feier over hele overflaten av akrylrektangelet og fjerner et lag som er ca. 30 μm høyt. (B) Bildet viser de forskjellige strukturene som er malt på forsiden av den tidligere utbedrede akrylen. Kanaler og hull for reagensinntak og utløp observeres. Begrensningen på 5 μm kan ikke sees med det blotte øye. (C) Mikromalt overflate med justeringshull og adapter med justeringsstolper i motsatte hjørner. (D) Akrylen er justert opp ned på adapteren med søyler, som justeringshullene passer inn i. Skala bar = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Kanal tetning
- Akryl rengjøring
- Fjern akrylrektangelet fra søyleadapterplattformen. Ta et annet unmachined akryl rektangel. Vask begge akrylplatene med isopropylalkohol (IPA) og skyll med destillert vann. Bruk hansker og unngå kontakt med IPA.
- Senk akrylen i et ultralydbad i 10 minutter (figur 5A, B).
- Eksponering for kloroform i gassform
- Tørk begge akrylplatene perfekt. Teip dem til innsiden av et petriskållokk i glass med dobbeltsidig tape. Pass på at du plasserer den synlige siden av den maskinerte kanalen (figur 5C). Bruk hansker og unngå å berøre akryloverflaten direkte.
- Plasser bunnen av petriskålen i glass i en større petriskål i glass (figur 5D). Hell 1 ml kloroform i bunnen av petriskålen. Legg lokket raskt med akrylplatene festet til innsiden.
- Tilsett umiddelbart destillert vann til bunnen av den større petriskålen opp til nivået på petriskållokket. Tillat eksponering av akrylen for kloroformgass i 1 minutt (figur 5E).
MERK: Tenk på at en lengre eksponeringstid for kloroform vil angripe akryloverflaten, og begrensningen på 5 μm vil smelte, endre høyden eller forsvinne helt. - Vipp petriskålen for å bryte vanntetningen som er opprettet. Fjern akrylen umiddelbart fra kloroformen ved å avdekke petriskålen. Vær forsiktig så du ikke søler vannet.
FORSIKTIG: Gjør denne prosessen i avtrekkshetten og bruk hansker siden kloroform er svært giftig.
- Liming ved å trykke og varme opp
- Skrell begge akrylplatene fra dobbeltsidig tape.
- Juster begge akrylene med sidene som ble utsatt for gassformig kloroform ansikt til ansikt, og danner en sandwich. Plasser akrylen i pressen ved 18 kgf/cm2 og en temperatur på 90 °C (figur 5F,G).
MERK: Det anbefales å plassere akrylen langsgående justert og endre justeringen etter 2 minutter for en bedre tetning. Hvis forseglingen etter denne tiden ikke er tilstrekkelig, plasser den tilbake i pressen i intervaller på ikke mer enn 1 min. Bruk stereoskopet, kontroller statusen til kanalene og begrensningen. Tenk på at i tilfelle overskridelse av pressetiden, er det fare for å eliminere begrensningen.
- Slange vedlegg
- Skjær 2-3 cm lengder av slangen. Lag et helt rett kutt. Fest hver slange til hullene på enheten med øyeblikkelig tørking av flytende lim (figur 6A). Forhindre at limet kommer inn i brikken.
Figur 5: Tetningsprosessen til enheten. (A) Hver av akrylarkene er plassert i en gjenlukkbar pose med destillert vann og nedsenket i ultralydbadet. (B) Bildet til venstre viser kanalene like etter fabrikasjon, og bildet til høyre viser den samme enheten etter vask med IPA og ultralydbadet, som fjerner alle urenheter og akrylrester fra mikrokanalen. Kantene på begrensningen som avbryter den sentrale kanalen på 200 μm observeres, noe som bekrefter den vellykkede freseprosessen. Vektstenger = 500 μm. (C) Begge akrylene tørkes og festes til glassplattformen på lokket. (D) Basen av petriskålen er plassert inne i en annen tallerken med større diameter. (E) Når du lukker petriskålen, forhindrer vanntetningen gassformig kloroform i å rømme. (F) Beskrivelse av elementene i spaken med en vekt på 5 kg. (G) Bilde av den åpne spaken, som viser i rødt området der akrylen er plassert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Forberedelse av enhet
- Fyll kanalene med destillert vann med en sprøyte. Forsikre deg om at det ikke er lekkasjer eller motstand mot strømning. Senk enheten i et ultralydbad i 10 minutter for å fjerne gjenværende akryl, lim eller uønsket materiale inne i kanalene.
- Tøm vannet inne i enhetskanalene. Bruk en sprøyte for å introdusere en blokkeringsløsning tilberedt med 5 % (w/v) bovint serumalbumin (BSA) fortynnet i 1x Tris-bufret saltvann (TBS) og tidligere filtrert gjennom et 0,2 μm polyetersulfon (PES) sprøytefilter.
- Forbered en suspensjon av jernmikropartikler med diameter på 7,5 μm i 5% BSA.
MERK: Mikropartiklene er tidligere funksjonalisert med et silika-polyetylenglykol (PEG) lag som gir motstand mot proteinabsorpsjon4. - Inkuber brikken og mikropartikkelsuspensjonen med blokkeringsløsningen i minst 1 time ved romtemperatur. Hvis mulig, la blokkering over natten ved 4 °C.
4. Dannelse av mikropartikkelfelle
- Sett mikropartiklene inn i brikken med en sprøytekanyle gjennom sidekanalens utløpsslange. Plasser brikken vertikalt og la mikropartiklene strømme under tyngdekraften gjennom sidekanalen. Roter brikken 180 ° i to trinn på 90 ° og la mikropartiklene målrette og komprimere ved 5 μm begrensningen.
- Fjern overflødige mikropartikler ved at tyngdekraften roterer 45° mot sidekanalen.
- Hold enheten oppreist for å unngå å angre mikropartikkelfellen. Se figur 6B for et sammendrag av dannelsesprosessen for mikropartikkelfeller.
5. Immunoassay
- Nanopartikkel forberedelse
- Ta 2 μL av suspensjonen av 100 nm nanopartikler som tidligere er konjugert med lysozym (antigenmodell). Legg det til et 1,5 ml mikrosentrifugerør med 100 μL blokkeringsløsning. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Tilsett 150 μL vaskebuffer (1x TBS, 0,05 % mellom 20).
- Plasser 1,5 ml mikrosentrifugerøret i en magnetisk separator. Oppbevares i 15 minutter for å tillate separasjon av nanopartiklene (supplerende figur S4).
MERK: Minimumsvolumet for magnetseparatoren er 200 μL. Unngå å bruke et mindre volum. - Fjern væsken fra røret med en mikropipette. Unngå kontakt med rørveggen der nanopartikkelpelleten ble dannet.
- Tilsett 250 μL fersk vaskebuffer. Hold røret under omrøring i 15 min.
- Gjenta trinn 5.1.3.-5.1.5. 2x mer, risting bare i 5 min.
- Tilsett ønsket konsentrasjon av primært anti-lysozymantistoff (se materialtabellen). Juster til et endelig volum på 100 μL i antistofffortynningsmiddel (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- Inkuber i 15 minutter ved 37 °C. Fortsett å riste i ytterligere 15 minutter ved romtemperatur.
- Gjenta vasketrinnene 5.1.2.-5.1.6.
- Tilsett 100 μL antistofffortynningsmiddel. Tilsett pepperrotperoksidasekoblet sekundært antistoff (HRP-AbII) (se materialtabellen) ved en fortynning på 1:500.
- Gjenta vasketrinnene 5.1.2.-5.1.6.
- Hold nanopartiklene i et sluttvolum på 50 μL antistofffortynningsmiddel.
6. Eksperimentell montering
- Fyll de to 100 μL glasssprøytene med vann, koble en 6,5 cm lang slange til hver sprøyte, sett en metallpinne inn i enden av slangen og legg begge sprøytene på den datastyrte sprøytepumpen.
- Forsegl alle slanger på akrylenheten med varme.
- Klipp innløpsslangen og hold bare noen få millimeter. Fyll dispensernålen med vaskebuffer og sett den inn i kuttslangen. La oppløsningen dryppe før du kobler kanylen til enheten for å forhindre lufttilgang til enheten.
- Klipp utløpsslangen fra sidekanalen. Koble til sprøytepumpen. Deretter gjør du samme prosedyre for hovedkanalens utløpsslange.
MERK: Det er viktig å utføre trinn 6.3.-6.4. for å unngå å pakke ut mikropartikkelfellen. Hvis mulig, kontroller tilstanden til fellen under disse trinnene ved hjelp av et forstørrelsesglass. - Plasser et glassglass på mikroskopstadiet. Fest magneten til lysbildet med dobbeltsidig tape og legg et lite stykke tape på hver side for å feste sponkantene til glasset.
- Still inn en strømningshastighet på 50 μL/t gjennom fanene Flow Rate og Units i sprøytepumpekontrolleren. Velg uttaksmodus og klikk på Start-knappen for å aktivere strømmen av vaskebufferen.
- Tilnærm enheten forsiktig mot lysbildet med magneten på en horisontal måte slik at området på brikken som inneholder fellen kontakter magneten.
- Fest kantene på enheten til glasset med dobbeltsidig tape for å forhindre bevegelse. Unngå å hindre den optiske banen for mikroskopi (figur 6C).
Figur 6: Endelig enhetskonfigurasjon . (A) Akrylanordning med slangene festet til tilsvarende innganger og utganger. Skalaen viser dimensjonene til enheten i centimeter. B) Protokoll for dannelse av mikropartikkelfellen. Mikropartikler strømmer gjennom kanalen etter tyngdekraften når enheten er plassert i vertikal stilling. Mikropartikler er konsentrert ved 5 μm begrensning. Overskytende mikropartikler fjernes enkelt ved å rotere brikken gjennom sidekanalen. Brikken holdes vertikal for å bevare fellen før immunoassay. (C) Mikrofluidisk anordning montert på et glassglass som inneholder magneten, på scenen av det inverterte fluorescensmikroskopet. Dispensernålen gjennom hvilken reagensene tilsettes, observeres, samt utløpsslangene som kobles til en sprøytepumpe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. Immundeteksjon
- Hold vaskebufferen flytende i 10 minutter ved 50 μL / t for å fjerne overflødig BSA.
- Fjern den gjenværende vaskebufferen fra dispenseringsnålen med en mikropipette. Tilsett 50 μL av nanopartikkelsuspensjonen.
- Flyt suspensjonen av nanopartikler i 7 minutter ved en strømningshastighet på 100 μL / t. Deretter endrer du strømningshastigheten til 50 μL / t og strømmer i ytterligere 15 minutter.
- Bytt kanyle. Gjennomfør vaskebufferen i 10 minutter ved 50 μL/t. Forbered det fluorogene substratet i henhold til produsentens spesifikasjoner under vasketrinnet.
- Fjern den gjenværende vaskebufferen fra dispenseringsnålen med en mikropipette. Tilsett 100 μL av det fluorogene substratet (se materialtabellen). Flyt det fluorogene substratet i 6 minutter ved 50 μL / t.
- Still inn måleparametrene for strømningshastighet (1 μL/t, 3 μL/t, 5 μL/t og 10 μL/t ) og tid (6 min) i de tilsvarende kategoriene Flow Rate og Set Timer i grensesnittet som styrer sprøytepumpen. Sørg for å velge Uttaksmodus for hver av målingene som skal utføres.
- Sett en ekstra strømningsfrekvens-fane til 50 μL/t og Still inn tidtakeren på 3 minutter for vasketrinnet.
- Slå på fluorescensen til mikroskopet 15 s før substratet ved 50 μL / t stopper. Start bildeopptaket med programvaren til mikroskopkameraet 10 s før underlaget stopper med en eksponeringstid på 1000 millisekunder. Utfør bildebehandling i 6 minutter ved 1 bilde/s (FPS).
- Klikk på Start-knappen for ønsket strømningshastighetsparameter umiddelbart etter at underlagets vaskestrømningshastighet ved 50 μL / t stopper. Klikk på Start-knappen for vaskestrømmen (50 μL/t) umiddelbart etter at den valgte målestrømmen stopper.
- Stopp bildeopptaket og slå av fluorescensen til mikroskopet for å unngå fotobleking av substratet.
- Gjenta trinn 7.8.-7.10. for hver målestrømningshastighet som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det var mulig å etablere en svært reproduserbar fabrikasjonsprotokoll som forbedrer oppløsningen av den konvensjonelle mikrofreseteknikken. Ved hjelp av denne protokollen oppnås fabrikasjon av en kanal så liten som 5 μm i høyden som fungerer som en forskjøvet begrensning i en 200 μm høy kanal. Den enkle utformingen av den forskjøvne begrensningen fanger jernmikropartikler på 7,5 μm diameter som, når de komprimeres i mikrokanalen, tillater dannelsen av en magnetisk felle når en ekstern magnet nærmer seg enheten. Denne enheten gjør det mulig å utføre immunoassays ved hjelp av nanopartikler konjugert med analytten av interesse som immunologisk støtte. I dette arbeidet ble det utført ikke-konkurrerende indirekte immunoassays med enzymmerket antistoffbasert deteksjon. Modellantigenet (Ag) var lysozymprotein konjugert til nanopartikler (NP) med 100 nm diameter. Kaninanti-lysozym IgG ble brukt som primært antistoff (AbI) og påvisning ble utført ved bruk av kaninpepperrotperoksidasekonjugert sekundært antistoff (HRP-AbII).
Deteksjon ble utført ved å korrelere endringen i fluorescenssignalintensitet oppnådd etter samspillet mellom HRP-AbII og et fluorogent substrat ved passasje gjennom fellen med innfangede nanopartikler. For å utføre målingene ble en region før og en region etter fellen bestemt. Figur 7A-D viser økningen i fluorescensintensitet for forskjellige konsentrasjoner av anti-lysozym AbI: 0 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml og 1000 ng / ml for en gitt fluorogen substratstrømningshastighet (3 μL / t). Dette viser at endringen i substratfluorescens er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av AbI som brukes.
Figur 7: Måleområder for fluorescens. Fluorescensmålingene er vist for forskjellige konsentrasjoner av primært anti-lysozymantistoff brukt: (A) 0 ng / ml, (B) 10 ng / ml, (C) 100 ng / ml og (D) 1000 ng / ml. Blå sirkler viser området for fluorescensmåling før og etter fellen dannet av 5 μm høydebegrensning, hvor substratet reagerer med det HRP-konjugerte sekundære antistoffet. Alle bilder tilsvarer en strømning på 3 μL / t. Forkortelse: HRP = pepperrotperoksidase. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For en gitt AbI-konsentrasjon er imidlertid nivået av fluorescens oppnådd en funksjon av strømningshastigheten som brukes til det fluorogene substratet. Dermed er omformingskapasiteten til dette substratet av HRP-enzymet omvendt proporsjonal med strømningshastigheten. Ulike substratstrømningshastigheter på 1 μL/t, 3 μL/t, 5 μL/t og 10 μL/t ble evaluert. For hvert eksperiment ble kurvene som tilsvarer forskjellen i fluorescens gitt av substratet før og etter passering gjennom magnetfellen oppnådd. Figur 8A-C viser kurvene oppnådd for en konsentrasjon på 100 ng / ml for tre forskjellige strømningshastigheter: (A) 10 μL / t, (B) 3 μL / h og (C) 1 μL / t. Avhengig av strømningshastigheten som brukes, varierer omformingskapasiteten til substratet av det HRP-konjugerte sekundære antistoffet plassert i magnetfellen. Den grønne kurven representerer fluorescensintensiteten til substratet etter konvertering av HRP som ligger i fellen. Det kan ses at ved høyere flukser oppnås det maksimale nivået av fluorescens. Den røde kurven representerer basal fluorescens før substratet når fellen. Måling av substratfluorescens i dette området av fellen forblir konstant, og verdien avhenger av graden av ikke-spesifikke interaksjoner dersom det ikke er effektiv blokkering av kanaloverflaten. Vi beregnet forskjellen mellom begge kurvene, representert ved den blå kurven.
Figur 8: Fluorescenskurver. Grafer oppnådd ved en konsentrasjon på 100 ng / ml av primært antistoff og strømningshastigheter på (A) 10 μL / t, (B) 3 μL / t og (C) 1 μL / t. De tre fargede kurvene representerer fluorescensen som måles før overlappingen (rød kurve) og etter overlappingen (grønn kurve) og forskjellen mellom de to (blå kurve) over tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9A-C integrerer fluorescensdifferansekurvene målt før og etter immunreaksjon for de forskjellige strømmene for AbI-konsentrasjoner på (A) 0 ng / ml, (B) 10 ng / ml og (C) 1000 ng / ml. Målingen for en strømningshastighet på 0 μL/t indikerer måling av immunreaksjon under statiske forhold der diffusjon styrer. For en konsentrasjon på 1000 ng/ml mEr fluorescensen mettet for alle strømmene som evalueres. Imidlertid skyldes det forskjøvne mønsteret av fluorescens ved de forskjellige strømmene diffusjon av substratet, som reagerer med en så høy konverteringsfrekvens at den overvinner de mindre strømmene. Dermed er det en retur av denne fluorescensen til oppstrømssonen i fellen.
Figur 9: Fluorescensforskjellsforhold. Oppsummerte kurver av fluorescensforskjellene (etter-før) for de forskjellige fluksene som brukes ved (A) 0 ng / ml, (B) 10 ng / ml og (C) 1000 ng / ml. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Målinger oppnådd med denne enheten gjør det mulig å generere en standard kalibreringskurve for immunoassays utført med lysozym som modellantigen. Figur 10 viser kalibreringskurven oppnådd fra maksimumsverdiene for forskjellene mellom fluorescensen før og etter immunreaksjonen utført i magnetfellen. Denne protokollen tillater påvisning av det primære anti-lysozymantistoffet med konsentrasjoner i størrelsesorden nanogram per milliliter ved bruk av strømmer mellom 1 μL / t og 10 μL / t. Den høye variabiliteten og høye fluorescensnivåene ved 1 μL / t antyder at reaktiviteten til immunkomplekset er slik at denne hastigheten ikke favoriserer strømmen av det reagerende substratet og har en tendens til å akkumulere like etter fellen, i tillegg til at motstanden til enheten reduserer oppløsningen til enheten for denne strømningshastigheten.
Figur 10: Kalibreringskurve. Grafen viser den maksimale verdien av forskjellene i fluorescensintensitet av kurvene oppnådd med hensyn til konsentrasjonen av primært antistoff som brukes (AB1) for hver strømningshastighet. I/Isatt tilsvarer forholdet mellom fluorescensverdien oppnådd for hver fluorescensmåling (I), normalisert med hensyn til den maksimale fluorescensverdien som oppnås ved metning (Ilør). Feilfelt representerer standardavviket for de tre eksperimentene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur S1: Piezoelektrisk plattformkontrollergrensesnitt. Det venstre bildet viser grensesnittet som styrer z-akseforskyvningen av den piezoelektriske plattformen. Begrensningen skapes ved å heve plattformen gjennom påføring av spenning til tre piezoelektriske aktuatorer. Det høyre bildet viser grensesnittet til programvaren som styrer mikrofresemaskinen, der det er mulig å observere de nøyaktige koordinatene i x- og y-aksene der begrensningen maskineres med en hastighet på 11 000 o / min. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Design av enheten. Utformingen av enheten som er opprettet ved hjelp av designprogramvaren, ses til venstre. Designet består av to tilkoblede kanaler, den ene er hovedkanalen som inneholder høydebegrensningen på 5 μm og den andre er sidekanalen for avfallsutløpet. Kanalene er mikromalt med en 200 μm endemøllebit. Panelet til høyre viser fabrikasjonsparametrene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Mikrofreseparametere for innløps- og utløpshull. (A) 1,2 mm diameter og 0,65 mm dybdehull (halvparten av akryltykkelsen) mikrofreses på den maskinerte overflaten. Panelet til høyre viser forskyvningshastighet, rotasjon og dybdeparametere for endemøllebiten. (B) 1,5 mm diameter og 0,7 mm dybdehull mikrofreses på motsatt side som forbinder hullene. Panelet til høyre viser fabrikasjonsparametrene. Begge tilfellene er mikromillet med en 800 μm endemøllebit. (C) Reagenshull (høyre) og utløp (venstre) vises etter bearbeiding av begge sider. Dimensjonene til den større diameterhalvdelen gjør at slangen kan kobles sammen, mens barrieren skapt av den mindre diameterhalvdelen forhindrer slangen i å blokkere innløpene. Vektstenger = 1 mm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S4: Nanopartikkelseparasjon. Ved hjelp av en kommersiell magnetisk separator kan 100 nm nanopartikler enkelt konsentreres for å utføre vasketrinnene under immunoassay. Pelleten dannet etter 15 min observeres i den røde sirkelen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggskodingsfil 1: Kode for sliping av akryloverflate. Den genererte koden vises med instruksjoner for sliping av akryloverflaten på 25 mm x 9 mm langs x- og y-aksene. Den siste linjen i koden plasserer borekronen rett ved koordinaten der begrensningen skal maskineres. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende designfil 1: Design av mikrokanal- og reagensinnløps- og utløpshullene. Designet inneholder to lag med forskjellige fargede strukturer (svarte kanaler og røde hull) som er maskinert på den tidligere bakken akrylflaten. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende designfil 2: Design av hullene på motsatt side. Designet består av hull med større diameter for motsatt ansikt som kommuniserer med de forrige og tjener til å fikse slangene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En akryl mikrofluidisk enhet for immunoassays ved bruk av nanopartikler som immunosupport ble produsert ved hjelp av en mikrofreseteknikk. Metoden for direkte produksjon på underlaget har fordelen av å unngå bruk av en hovedform og tid og kostnader som dette innebærer. Det er imidlertid begrenset til rask prototyping og produksjon av enheter med høyt volum.
Her brukte vi en tidligere rapportert tilbehør piezoelektrisk plattform for fresemaskinen12. Plattformen ble produsert av 3D-utskrift for å skape kanaler med variabel dybde med en vertikal oppløsning bedre enn 10 μm oppløsning av konvensjonelle mikrofresemaskiner. Vi oppnådde fresing av kanaler på opptil 5 μm høye som danner en forskjøvet begrensning i den mikrofluidiske kanalen på 200 μm.
Bare to endemøllebiter på 200 μm og 800 μm diameter er nødvendig for fabrikasjon av mikrofluidisk enhet, uten behov for manuelt å bytte biter. Fresemaskinmodellen som brukes utfører utveksling av biter automatisk, noe som hjelper til med tidsoptimalisering. I tillegg tillater "Z0 sensing" -modus bestemmelse av opprinnelsen automatisk i z-aksen med høy presisjon ved å kontakte sensoren og pinnen som følger med i fresemaskinen.
Utformingen av denne enheten er enkel, og består bare av hovedkanalen avbrutt av en 5 μm forskjøvet begrensning og en tilbehørskanal som fungerer som rensing og innløp for mikropartikler. Imidlertid er den høye presisjonen til slike strukturer nødvendig for begrensningen for å fange jernmikropartikler på 7, 5 μm i diameter. En større begrensning tillater mikropartikler å passere gjennom uten retensjon, noe som forhindrer fangst og dannelse av mikropartikkelfellen. Omvendt øker en mindre begrensning kanalens strømningsmotstand sterkt og får reagensene til å gå ut gjennom sidekanalen i stedet for å passere gjennom det porøse mikropartikkelmediet. Bruk av mikropartikler med større diameter for å danne magnetfellen vil tillate en større begrensning. For eksempel trenger partikler med en diameter på 40 μm en ~ 30 μm forskjøvet begrensning. I så fall er det ikke nødvendig å bruke den piezoelektriske plattformen, og fabrikasjonsprotokollen er forenklet. Imidlertid vil et porøst medium sammensatt av større mikropartikler fange nanopartikler annerledes og vil påvirke ytelsen til immunoassay; Det er imidlertid ikke klart om det ville være på godt og vondt. Det arbeides med å studere disse funksjonene for å optimalisere enheten7.
For å oppnå den nødvendige nøyaktigheten ble overflatesliping utført for å fjerne et 30 μm lag av akryloverflaten ved å flytte 200 μm endemøllebit gjennom hele akryloverflaten ved 14 500 o / min. Denne prosessen gjør det mulig å oppnå en ny opprinnelse på z-aksen langs hele overflaten for større nøyaktighet i høyden. Det er avgjørende å alltid justere akrylen i samme posisjon slik at opprinnelseskoordinatene på x- og y-aksene (tidligere satt) sammenfaller med et av akrylens hjørner. På samme måte bør man sørge for at akrylen sitter perfekt på basen; Ellers kan det hende at overflaten ikke slites ordentlig, noe som forårsaker problemer i de følgende monteringstrinnene.
Når programmet har fullført overflateslipingsprosessen, bringer det automatisk endemøllebiten til en bestemt koordinat der begrensningen på 5 μm som danner fellen vil bli maskinert. Det er viktig å forhindre at endemøllebiten løftes av overflaten når den når denne koordinaten. Det anbefales å identifisere om mikrofresemaskinen har et alternativ som forhindrer at endemøllebiten løsner fra overflaten når slipeprosessen er ferdig. Ellers vil det være nødvendig å manuelt flytte kutteren til denne koordinaten, noe som kan føre til feil på plasseringsnøyaktigheten.
For å maskinere den forskjøvne begrensningen i akrylen, er det nødvendig å oversize med 1,5 μm. For 5 μm høyde ble den piezoelektriske plattformen hevet til 6,5 μm fordi mikrokanalen har en tendens til å flate litt i ferd med å forsegle kanalene. I tillegg er den endelige lengden på begrensningen i enheten bare 50 μm; Den maskineres imidlertid lenger for å sikre at den kommuniserer med begge ender av hovedkanalen når den maskineres etterpå. I ett trinn fremstilles de 200 μm dype kanalene ved hjelp av endemøllebiten på 200 μm og en rotasjonshastighet på 11 000 o / min. Dermed tar maskinering av de 200 μm brede kanalene i akryl bare noen få sekunder.
Det neste trinnet i fabrikasjonen av enheten er å maskinere hullene som forbinder kanalene til utsiden. Disse hullene brukes til å plassere slangene som gjør at enheten enkelt kan kobles til sprøytepumpen som kjører den. Et av problemene som oppstår her er plasseringen av slangene. En optimal avstand er avgjørende for å tillate strømmen av reagenser og unngå å skape en tetning med ansiktet til den ikke-maskinerte akrylen. For å overvinne denne ulempen maskineres hullene i to trinn for å skape en grense der slangene ikke overskrider ønsket dybde.
Med endemøllebiten på 800 μm ble mønsteret av hull frest på samme tidligere mikrofreste ansikt. Hull maskineres i enden av hver kanal med en diameter på 1,2 mm og en dybde på 0,65 mm, som er halvparten av akrylens tykkelse. I tillegg maskineres to hull i rektanglets kontralaterale hjørner, noe som gjør at akrylen kan justeres med forsiden ned på plattformen med søyler. Det er viktig å bruke en skrape eller kutter for å fjerne akrylen fra den piezoelektriske plattformen for å unngå å bryte den. På motsatt side av akrylen er diameteren på hullene 1,5 mm (større enn forrige halvdel), som er lik diameteren på slangen som skal festes. Dybden er 0,7 mm og bør være litt større enn halvparten av det fremre hullet for å sikre at begge de maskinerte hullene kommuniserer med hverandre. Barrieren dannet av hullet med mindre diameter forhindrer slangen i å nå bunnen og blokkere innløpet. Denne implementeringen i protokollen forbedrer plasseringen av væskeinnløps- og utløpsslangene til brikken.
Et viktig skritt i enhetsproduksjon er tetting. Det er nødvendig å forsegle ansiktet som inneholder de maskinerte kanalene med et ikke-maskinert akryldeksel med samme dimensjoner. Tetting av arkene med en metode som ikke nærmer seg glassovergangstemperaturen til akryl, gjør det mulig å oppnå deformasjonsfrie kanaler. Gjennom bindingsmetoden som brukes, løser en tynn film av løsningsmiddel mellom de to PMMA-arkene en tynn film fra overflaten av PMMA-arket, fordampes deretter, og til slutt kobles monomerene til PMMA-arkene til en bestemt driftstemperatur.
Den allment beskrevne metoden for kloroform dampeksponering ble brukt til å forsegle denne akrylinnretningen. Som tidligere rapportert i litteraturen, gir kloroform høy bindingsstyrke; Men da kloroform angriper akryl veldig aggressivt, bør akryl aldri komme i direkte kontakt med flytende kloroform, bare med gassformig kloroform. Det er viktig å opprettholde en optimal avstand mellom fordampende kloroform og akryl. Vi opprettet et enkelt system ved hjelp av et glass petriskål, der akrylen ble festet til lokket. En plattform bestående av ni lysbilder sammenføyd og festet til lokket på petriskålen ble brukt, hvor akrylene ble festet med dobbeltsidig tape for å regulere avstanden. Selv om den gassformige kloroformprosessen er svært følsom for endringer i omgivelsestemperatur, kan temperaturen på petriskålene kontrolleres ved å plassere dem i en polystyrenboks. Vanntetningen forhindrer at kloroformen fordamper for raskt.
I motsetning til dette er det andre rapporterte sammenføyningsmetoder som er raskere og ikke krever spesialutstyr; Noen er imidlertid bare egnet for sammenføyning av to akrylplater uten bearbeiding. På samme måte er det vanskelig å kontrollere bindingskraften siden løsningsmidlet må helles direkte mellom begge akrylplater18, med stor risiko for smeltestrukturer av små dimensjoner som mikromilled 5 μm begrensning.
Ved hjelp av protokollen beskrevet her ble homogene tetninger oppnådd med en hjemmelaget presse, med hvilken tetningstrykket og temperaturen ble kontrollert. For konstruksjonen av denne pressen skaper både et rammeverk av aluminium og et hengsel en spak som forsterker den mekaniske kraften som kommer fra en vekt på 5 kg til en faktor på 9: 1. Varmeelementene overfører varmen til 2 cm tykke aluminiumsplater som er i kontakt med akrylbitene.
Når akryllagene er forseglet, er det siste trinnet i fabrikasjonsprosessen å koble de eksterne slangene til de tilsvarende innløpene og uttakene til enheten. Det flytende limet påføres eksternt når slangene er inne i hullene. Hvis slangens diameter er mindre enn hullene, kan det flytende limet komme inn i enheten og tette kanalene.
Direkte fabrikasjonsmetoder på underlaget, for eksempel mikrofresing, har noen ulemper, for eksempel ruhet på den maskinerte overflaten og strukturer med dårlig avgrensede kanter9. Til tross for ruheten på den maskinerte overflaten av kanalene, er det ikke nødvendig med ytterligere behandling for denne enheten. Et viktig poeng å merke seg om denne bindingsprotokollen er at kloroform gjør det mulig å redusere ruheten til de freste mikrokanalene ved å polere overflatene som er utsatt for løsningsmidlet. Poleringen av overflaten er så god at selv den optiske kvaliteten er forbedret19.
Når enheten er produsert, må den være forberedt på å brukes i en immunoassay. Ultralydvask av enheten er av stor betydning for å fjerne uønskede akrylrester som kan tette kanalene og forstyrre immunoassayen.
I tillegg må spesiell oppmerksomhet rettes mot riktig blokkering av kanalene for å unngå uspesifikke interaksjoner og høye bakgrunnsstøysignaler. Blokkering med 5% BSA har vist seg å redusere støyen fra ikke-spesifikk binding av antistoffer i kanalene, og 1 time inkubasjon er tilstrekkelig. Jernmikropartiklene er belagt med et silika-PEG-lag for å forhindre ikke-spesifikk binding i dem. Videre blokkeres mikropartiklene med BSA (samtidig med kanalene) før de danner fellen i enheten. Inkubasjon over natten ved 4 °C er bedre, noe som betyr at 1 dag er nødvendig for fremstilling og inkubering av enheten før immunoassayen. Reduksjonen av ruheten ved kloroformen og blokkering av overflatene for å redusere ikke-spesifikke interaksjoner har vist seg å fungere eksepsjonelt bra, slik at denne plattformen kan oppnå en deteksjonsgrense som kan sammenlignes med standard ELISA i en modell immunoassay4.
Dannelsen av mikropartikkelfellen i mikrokanalbegrensningen er en manuell prosess. Selv om det ikke er noen presis kontroll av antall mikropartikler som kommer inn, er vi avhengige av et estimat av lengden på de komprimerte partiklene. Det er mulig å gjøre fellen større eller fjerne overflødig lett. De kasserte partiklene akkumuleres i sidekanalen og trenger ikke å fjernes fra brikken. Det er avgjørende å forhindre at mikropartikler strømmer inn i hovedkanalen, da de kan samhandle med nanopartikler oppstrøms fellen og modifisere immunoassaymålingene.
Som et proof-of-concept implementerte vi immunodeteksjon av et kompleks dannet av lysozymprotein konjugert til 100 nm diameter nanopartikler ved inkubering av det spesifikke primære antistoffet og det tilsvarende HRP-merkede sekundære antistoffet. Immunokomplekset dannes utenfor enheten. Det er imidlertid mulig å utføre hele immunoassay inne i enheten. De magnetiske egenskapene til nanopartiklene tillater enkel manipulering med en høyytelses neodym permanentmagnetseparator. Man må ganske enkelt holde reaksjonsmikrorøret i 15 minutter for å la nanopartiklene bli tiltrukket av magneten til mikrorørveggen, noe som letter immunoassay-vasketrinnene utenfor enheten.
Høydepunktet på denne enheten er at den er enkel, rask (total analysetid på 40 min 4 sammenlignet med4-6 timer for ELISA), og billig (sammenlignbar med prisen på en lateral strømningstest). Alle disse funksjonene gjør denne enhetsprofilen til en god kandidat for utviklingen av POCT. I tillegg kan enheten kvantitativt oppdage analyttkonsentrasjoner som ligner gullstandarden ELISA4, noe som er ekstremt verdifullt for epidemiologiske studier og beslutningstaking i folkehelsen. Vanligvis har mikrofluidiske systemer for immunoassays gode deteksjonsgrenser, men lange analysetider, eller de har korte analysetider, men suboptimale grenser for deteksjon4. Ved å kombinere magnetiske nanopartikler som immunstøtte og fluorogene enzymer for deteksjon, har denne plattformen kort analysetid og en god deteksjonsgrense (i tidligere arbeid fant vi en deteksjonsgrense på 8 pg / ml ved bruk av biotin som antigen, som er sammenlignbar med en standard ELISA4). Til slutt har denne teknologien en viktig fordel i forhold til laterale strømningstester: muligheten for å gi kvantitative og ikke bare kvalitative resultater ("ja" eller "nei"). I motsetning til de fleste andre mikrofluidiske systemer utviklet i laboratorier der sjeldne materialer brukes, er dette systemet laget av akryl (PMMA), en billig termoplast som er svært kompatibel med masseproduksjon av medisinsk diagnostisk utstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Conacyt, Mexico under bevilgning 312231 av "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación", og av AMEXCID og meksikanske Foreign Relations Ministry (SRE) under tilskudd "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO takker Conacyt Mexico for deres PhD-stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R.
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
