Summary
미세 유체 공학은 진단 테스트 개발을위한 강력한 도구입니다. 그러나 값비싼 장비와 재료, 힘든 제조 및 취급 기술이 필요한 경우가 많습니다. 여기에서는 저비용 및 사용이 간편한 환경에서 자성 마이크로 및 나노 입자 기반 면역 분석을위한 아크릴 미세 유체 장치의 제조 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
미세 유체 시스템은 면역 분석 기술을 크게 향상 시켰습니다. 그러나 많은 미세 가공 기술에는 전문적이고 비싸거나 복잡한 장비가 필요하므로 제조 비용이 많이 들고 대량 생산과 양립 할 수 없으며, 이는 자원이 부족한 환경에서 현장 진료 테스트 (POCT)를 채택하기위한 가장 중요한 전제 조건 중 하나입니다. 이 작업은 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 마이크로 밀링 기술을 사용하여 나노 입자 접합 효소 면역 분석 테스트를위한 아크릴 (폴리 메틸 메타 크릴 레이트, PMMA) 장치의 제조 공정을 설명합니다. 미세유체 장치의 기능은 100 nm 자성 나노입자에 접합된 모델 항원으로서 라이소자임을 사용하여 상용 항체를 검출하기 위한 면역검정을 수행함으로써 나타난다. 이 장치는 높이가 5μm에 불과한 물리적 엇갈린 제한을 통합하여 외부 자석을 배치하여 자기 트랩을 구성하는 자성 미세 입자를 포착하는 데 사용됩니다. 이러한 방식으로, 공액 나노 입자의 면역 지지체에 대한 자기력은이를 포착하고 유동 항력에 저항하기에 충분합니다. 이 미세유체 장치는 면역분석 성능을 위한 정밀도의 손실 없이 저비용 대량 생산에 특히 적합합니다.
Introduction
최근 몇 년 동안 미세 유체 공학은 면역 분석 기술1에서 중요한 역할을했습니다. 소형화 기술은 기존 면역분석법에 비해 시료 및 시약 소비 감소, 배양 시간 단축, 효율적인 용액 교환, 높은 통합및 자동화 2와 같은 많은 뛰어난 이점을 가지고 있습니다.
또한, 면역 분석의 미세 유체 시스템은 면역 지원체로서 자성 나노 입자와 결합하여 배양 시간을 상당히 단축시켜 증가 된 표면 대 부피 비율로 인해 높은 검출 감도를 달성합니다3. 입자의 브라운 운동은 항원-항체 복합체 4,5의 형성 동안 반응 동력학을 향상시킵니다. 또한, 나노입자의 자기적 특성은 다양한 미세유체 장치 구성에 통합될 수 있는 다기능성을 제공하여 소형화된 온칩 바이오감지 시스템5에서 신호 전달 및 분자 포획에 이상적인 후보가 됩니다. 그러나, 자기력은 높은 표면 대 부피 비율6로 인해 나노 미터 규모의 항력보다 현저히 약하다. 따라서 세척 및 검출과 같은 중요한 면역 분석 단계를 위해 나노 입자를 포획하는 것은 어려울 수 있으며 기존의 자석으로는 충분하지 않습니다4.
나노입자를 조작하는 효율적인 방법은 미세유체 구조(3)로 포장되어 있는 철 미세입자에 의해 형성된 미세유체 자기 트랩을 사용하는 것이다. 따라서 외부 자석이 접근하면 자화된 다공성 매질 내에서 자기력과 자속력 사이에 복잡한 상호 작용이 생성됩니다. 나노 입자에 작용하는 자기력은이를 포착하고 유동 항력 3,4,7에 저항 할만큼 충분히 강합니다. 이 접근법은 마이크로 입자를 유지하는 마이크로 메트릭 구조를 생성하기 위해 몇 마이크로 미터 정도의 해상도를 달성하는 미세 가공 기술이 필요합니다.
현재의 미세가공 기술은 수 미크론에서 수백 나노미터까지의 구조물의 고해상도 제조를 가능하게 한다(8). 그러나 이러한 기술 중 상당수는 전문적이고 비싸거나 복잡한 장비가 필요합니다. 주요 어려움 중 하나는 금형 제작을위한 클린 룸에 대한 요구 사항으로, 비용과 시간이 많이 소요됩니다 8,9. 최근에, 미세유체 공학자들은 비용 절감, 더 빠른 처리 시간, 더 저렴한 재료 및 도구,향상된 기능성 8과 같은 다양한 이점을 갖는 다양한 대체 제조 방법을 개발함으로써 이러한 단점을 극복하고 있다. 이러한 방식으로 새로운 미세 가공 기술의 개발은 10 μm8의 낮은 분해능을 달성하는 저비용의 비 클린 룸 방법을 가져 왔습니다. 패터닝은 값비싼 성형 패턴을 생성하지 않고 기판 상에 직접 사용할 수 있으므로 시간이 많이 소요되는 공정을 피할 수 있습니다. 직접 제조 방법에는 CNC 밀링, 레이저 제거 및 직접 리소그래피8이 포함됩니다. 이러한 모든 방법은 경도9에 관계없이 광범위한 재료에서 높은 종횡비 채널을 생성하는 데적합하며, 미세유체 장치8에서 새롭고 유리한 형상, 물리적 거동 및 품질을 가능하게 합니다.
CNC 마이크로 밀링은 기판에서 벌크 재료를 제거하는 절삭 공구를 사용하여 마이크로 스케일 구조를 생성하며 미세 유체 장치(10,11)를위한 효과적인 제조 방법입니다. 마이크로밀링 기술은 미세 유체 응용 분야에서 작업 표면에 직접 마이크로 채널과 피처를 생성하는 데 유용할 수 있으며, 주요 이점을 제공합니다: 짧은 시간(30분 미만)에 공작물을 제작할 수 있어 설계에서 프로토타입12까지의 처리 시간을 크게 단축할 수 있습니다. 또한 다양한 재료, 크기 및 모양의 절단 액세서리를 광범위하게 사용할 수 있기 때문에 CNC 밀링 머신은 다양한 유형의 저비용 일회용 재료에서 다양한 기능을 제작할 수 있는 적합한 도구입니다13.
마이크로 밀링에 일반적으로 사용되는 모든 재료 중에서 열가소성 수지는 많은 유리한 특성과 생물학적 응용 분야와의 호환성10,14로 인해 선도적 인 선택으로 남아 있습니다. 열가소성 수지는 저비용의 일회용분석 시스템 9 개발에 상당한 이점이 있기 때문에 미세 유체 시스템에 매력적인 기질입니다. 또한 이러한 재료는 대량 제조 공정에 매우 적합하여 상업화 및 대량 생산에 적합합니다. 이러한 이유로 PMMA와 같은 열가소성 수지는 미세 유체 공학10의 초기부터 신뢰할 수 있고 견고한 재료로 간주되었습니다. 열가소성 수지에서 폐쇄 채널을 제조하기 위한 상이한 프로토콜이 설명되었으며, 예컨대 용매 접합(15), 열 접합(16) 및 자외선(UV)/오존 표면 처리 접합(17)이 있다.
많은 경우, 기존의 마이크로 밀링 머신으로 달성 된 위치 결정 분해능은 10 μm보다 작은 구조가 필요한 일부 미세 유체 응용 분야에는 충분하지 않습니다. 고급 마이크로 밀링은 충분한 분해능을 가지고 있습니다. 불행히도, 높은 가격으로 인해, 그 사용은 소수의 사용자로 제한됩니다12. 이전에 우리 연구 그룹은 10μm 미만의 가공 구조를 허용하는 저비용 공구의 제조 및 조작을 보고하여 기존 밀링 머신의 분해능을 극복했습니다12. 고정 장치는 3 개의 압전 액추에이터를 포함하는 간단한 전자 장치로 3D 인쇄로 제조 된 플랫폼입니다. 표면에는 압전 요소가 동시에 작용할 때 들어 올릴 수있는 힌지 모양의 조인트가 있습니다. Z축 변위는 500nm의 분해능과 ±1.5μm의 정확도로 제어할 수 있습니다12.
이 논문은 마이크로 밀링 기술을 통한 아크릴 장치 (PMMA)의 제조 공정 단계를 제시합니다. 칩 설계는 폭 200μm, 높이 200μm의 메인 채널과 시약의 흐름을 퍼지하기 위한 동일한 치수의 측면 채널로 구성됩니다. 중앙 영역에서, 채널은 외부 자석을 배치하여 나노 입자의 자기 트랩을 구성하는 자성 미세 입자를 포착하기 위해이 그룹(12)에 의해 만들어진 3D 인쇄 압전 플랫폼으로 제작 된 높이가 5μm에 불과한 물리적 제한에 의해 중단됩니다. 우리는 100 nm 자성 나노 입자에 접합 된 모델 항원으로 라이소자임을 사용하여 상용 항체를 검출하기위한 면역 분석법을 수행하여 미세 유체 장치의 작동을 보여줍니다. 이 장치는 독특한4 : 면역 지원으로 자성 나노 입자를 사용하면 총 테스트 시간이 몇 시간에서 몇 분으로 단축됩니다. 검출을 위해 형광 생성 효소를 사용하면 표준 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)과 비교할 수있는 검출 한계가 허용됩니다. 그리고 열가소성 수지를 제조 재료로 사용하면 이전 미세 유체 나노 입자의 자기 트랩3에는 없었던 대량 생산과 호환되며 POCT를 개발할 수있는 훌륭한 후보가됩니다.
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Protocol
1. 마이크로 밀링
- 표면 연삭
- 마이크로 밀링 머신과 압전 컨트롤러를 켭니다. 각각의 제어 소프트웨어를 시작하십시오12.
- 필요한 엔드밀 비트(직경 200μm 및 800μm)를 선택합니다. 밀링 머신의 적절한 구획에 배치합니다(그림 1).
- 800μm 엔드밀 비트로 1.3mm 두께의 PMMA의 9mm x 25mm 직사각형을 절단합니다. 양면 접착 테이프를 사용하여 이러한 직사각형 중 하나를 압전 플랫폼에 조심스럽게 부착합니다(그림 2).
참고: 모서리 중 하나가 가공을 위해 x축 및 y축의 원점 좌표와 일치하도록 항상 아크릴 직사각형을 같은 위치에 배치해야 합니다. - z-센서를 연결하여 PMMA 사각형의 표면에 놓습니다. 감지 핀을 선택하고 센서 표면 위로 이동합니다. 센서에 접촉하지 않고 수동으로 핀을 내립니다. Z0 감지 모드를 활성화합니다(그림 3).
- 200μm 엔드밀 비트를 선택하고 x, y 원점으로 이동합니다. z-센서를 제거합니다. 아크릴 표면에 닿지 않도록 비트를 조심스럽게 내립니다.
- 200μm 엔드밀 비트를 14,500rpm으로 회전시킵니다. z축의 원점 좌표(z = 0)까지 천천히 내립니다. 원점에서 30μm 아래로 z축을 재설정합니다. 이 좌표를 새 z-원점으로 설정합니다.
참고: 비트가 회전하지 않는 경우 비트를 내리지 마십시오. 그렇지 않으면 파손될 위험이 있습니다. - 마이크로 밀링 머신 소프트웨어에서 절단 버튼을 클릭하여 절단 패널을 활성화합니다. 추가 버튼을 클릭하고 아크릴 표면 연삭을 위해 이전에 생성 된 코드가있는 .txt 파일 (보충 코딩 파일 1)을 선택하십시오. 출력 버튼을 클릭하여 프로세스를 시작하십시오.
- 엔드밀 비트를 제한이 머시닝될 좌표로 가져옵니다. 이 좌표에 도달하면 일시 중지 버튼을 클릭하여 엔드밀 비트가 지표면에서 들어 올려지지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 엔드밀 비트를 이 좌표로 수동으로 재배치합니다(그림 4A).
- 밀링 제한 5 μm
- 엔드밀 비트의 회전 속도를 11,000rpm으로 설정합니다. 압전 플랫폼의 인터페이스로 플랫폼을 6.5μm 올립니다(보충 그림 S1). 엔드밀 비트를 y축을 따라 500μm 이동합니다. 압전 플랫폼을 제어 인터페이스를 사용하여 z축의 초기 값으로 되돌립니다.
- 마이크로 채널의 밀링
- 설계 소프트웨어에서 이전에 작성한 설계 파일(보충 설계 파일 1)을 엽니다. 인쇄 버튼을 클릭합니다. 속성(Properties) 메뉴에 액세스하고 머시닝할 디자인이 포함된 레이어에 해당하는 색상 창을 클릭합니다. 보충 그림 S2에 지정된 대로 도구 패널에서 제작 매개변수를 설정합니다.
- 도구 풀다운 메뉴에서 없음(None 옵션)을 선택하여 원하지 않는 레이어를 비활성화합니다.
- 구멍 밀링
- 800μm 엔드밀 비트로 전환합니다. 해당 색상 창을 클릭하여 직경 1.2mm 구멍의 디자인 레이어를 활성화합니다.
- 1.3.2단계를 반복하되 이 경우 구멍에 대한 보충 그림 S3A 에 설명된 대로 해당 제작 매개변수를 설정합니다.
알림: 가공 된 구멍의 깊이는 아크릴 두께의 절반입니다. - 직사각형의 반대쪽 모서리에 있는 두 개의 추가 구멍을 새 플랫폼에서 거꾸로 아크릴 정렬에 맞게 가공합니다(그림 4B). 압전 플랫폼에서 아크릴 직사각형을 떼어냅니다. 아크릴을 뒤집고 가공된 기둥이 있는 어댑터 위에 양면 접착 테이프로 테이프로 붙입니다(그림 4C, D).
- 설계 소프트웨어에서 반대면에 대한 구멍 설계가 포함된 파일을 엽니다(보충 설계 파일 2). 보충 그림 S3B에 설명된 대로 해당 제작 파라미터를 설정합니다. 시약 입구 및 출구 구멍의 나머지 절반을 직경 1.5mm, 깊이 0.7mm로 밀링합니다(보충 그림 S3C).
그림 1: 엔드밀 비트 배치. (A) 200 μm 및 800 μm 엔드 밀 비트를 배치하고 나사를 통해 강철 지지대에 고정합니다. (B) 각 엔드 밀 비트는 자동 선택을 위해 마이크로 밀링 머신의 특정 구획에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 압전 플랫폼. 이 플랫폼은 3D 프린팅으로 제작되며 3 개의 압전 액추에이터로 제어되는 z 축에서 미세한 변위를 허용하는 힌지로 연결된 2 개의 육각형베이스로 구성됩니다. PMMA 사각형이 부착되고 좌표의 정렬 모서리를 설정할 수있는 아크릴 어댑터도 관찰됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Z축 보정. z축 보정 단계가 자세히 설명되어 있습니다. (A) z-센서에는 마이크로 밀링 머신에 연결되는 케이블이 포함되어 있습니다. (B) 센서는 가공 할 표면에 직접 배치됩니다. (C) 감지 핀은 엔드 밀 비트 옆의 특수 구획에 배치 된 금속 막대로 구성됩니다. (D) 두 액세서리가 접촉하면 마이크로 밀링 머신이 z 축의 원점 좌표를 자동으로 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 정류 된 아크릴 표면. (A) 직경 200μm의 엔드 밀 비트는 아크릴 직사각형의 전체 표면을 스윕하여 약 30μm 높이의 층을 제거합니다. (B) 이미지는 이전에 정류 된 아크릴의면에 밀링 된 다양한 구조를 보여줍니다. 시약 입구 및 출구를위한 채널과 구멍이 관찰됩니다. 5 μm 제한은 육안으로 볼 수 없습니다. (C) 정렬 구멍이 있는 미세 밀링 표면과 반대쪽 모서리에 정렬 기둥이 있는 어댑터. (D) 아크릴은 정렬 구멍이 맞는 기둥이있는 어댑터에 거꾸로 정렬됩니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 채널 씰링
- 아크릴 청소
- 기둥 어댑터 플랫폼에서 아크릴 사각형을 제거합니다. 가공되지 않은 다른 아크릴 직사각형을 가져 가십시오. 두 아크릴 시트를 이소프로필 알코올(IPA)로 씻고 증류수로 헹굽니다. 장갑을 착용하고 IPA와의 접촉을 피하십시오.
- 아크릴을 초음파 수조에 10 분 동안 담그십시오 (그림 5A, B).
- 기체 클로로포름 노출
- 두 아크릴 시트를 완벽하게 말리십시오. 양면 테이프로 유리 페트리 접시 뚜껑 안쪽에 테이프로 붙입니다. 가공된 채널의 측면을 노출된 곳에 배치해야 합니다(그림 5C). 장갑을 착용하고 아크릴 표면을 직접 만지지 마십시오.
- 유리 페트리 접시의 바닥을 더 큰 유리 페트리 접시 안에 넣습니다(그림 5D). 클로로포름 1mL를 페트리 접시의 바닥에 붓습니다. 안쪽에 부착 된 아크릴 시트로 뚜껑을 빠르게 놓습니다.
- 즉시 더 큰 페트리 접시의 바닥에 증류수를 페트리 접시 뚜껑 높이까지 추가합니다. 아크릴을 클로로포름 가스에 1분 동안 노출시킵니다(그림 5E).
알림: 클로로포름에 더 오래 노출되면 아크릴 표면이 공격되고 5μm 제한이 녹아 높이가 수정되거나 완전히 사라집니다. - 페트리 접시를 기울여 생성 된 물개를 깨뜨립니다. 페트리 접시를 열어 클로로포름에서 아크릴을 즉시 제거하십시오. 물을 흘리지 않도록주의하십시오.
주의 : 클로로포름은 독성이 높으므로 흄 후드에서이 과정을 수행하고 장갑을 사용하십시오.
- 압착 및 가열에 의한 접착
- 양면 테이프에서 두 아크릴 판을 모두 떼어냅니다.
- 두 아크릴을 기체 클로로포름에 노출 된면과 마주보고 정렬하여 샌드위치를 만듭니다. 아크릴을 18kgf/cm2 및 90°C의 온도에서 프레스에 놓습니다(그림 5F,G).
알림: 더 나은 밀봉을 위해 아크릴을 세로로 정렬하고 2분 후에 정렬을 변경하는 것이 좋습니다. 이 시간이 지난 후 씰이 충분하지 않으면 1 분 이상 프레스에 다시 넣으십시오. 스테레오스코프를 사용하여 채널 및 제한 상태를 확인합니다. 압착 시간을 초과하는 경우 제한을 제거 할 위험이 있음을 고려하십시오.
- 호스 부착
- 2-3cm 길이의 호스를 자릅니다. 완전히 똑바로 자르십시오. 순간 건조 액체 접착제로 각 호스를 장치의 구멍에 연결합니다(그림 6A). 접착제가 칩 내부로 들어가는 것을 방지하십시오.
그림 5 : 장치의 밀봉 공정. (A) 각 아크릴 시트를 증류수로 재 밀봉 가능한 백에 넣고 초음파 욕조에 담근다. (B) 왼쪽 이미지는 제작 직후의 채널을 보여주고 오른쪽 이미지는 IPA 및 초음파 수조로 세척 한 후 동일한 장치를 보여줍니다. 마이크로 채널에서 모든 불순물과 아크릴 잔류 물을 제거합니다. 200μm의 중앙 채널을 방해하는 제한의 가장자리가 관찰되어 성공적인 밀링 공정을 확인합니다. 스케일 바 = 500 μm. (C) 두 아크릴을 모두 건조시키고 뚜껑의 유리 플랫폼에 부착합니다. (D) 페트리 접시의 바닥은 더 큰 직경의 다른 접시 안에 놓입니다. (E) 페트리 접시를 닫을 때 워터 씰은 기체 클로로포름이 빠져 나가는 것을 방지합니다. (F) 무게가 5kg 인 레버 요소에 대한 설명. (G) 아크릴이 놓인 영역을 빨간색으로 보여주는 열린 레버의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 장치 준비
- 주사기를 사용하여 채널을 증류수로 채 웁니다. 누출이나 흐름 저항이 없는지 확인하십시오. 장치를 초음파 수조에 10분 동안 담그면 채널 내부에 남아 있는 아크릴, 접착제 또는 원치 않는 물질이 제거됩니다.
- 장치 채널 내부의 물을 비우십시오. 주사기를 사용하여 1x 트리스 완충 식염수(TBS)에 희석한 5%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)으로 제조한 차단 용액을 도입하고 이전에 0.2μm 폴리에테르설폰(PES) 주사기 필터로 여과합니다.
- 5% BSA에서 직경 7.5μm의 철 미세입자의 현탁액을 준비한다.
참고: 미립자는 이전에단백질 흡수에 대한 내성을 부여하는 실리카-폴리에틸렌 글리콜(PEG) 층으로 기능화되었습니다4. - 칩과 마이크로입자 현탁액을 블로킹 용액과 함께 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다. 가능하면 4 ° C에서 밤새 차단하십시오.
4. 미립자 트랩 형성
- 측면 채널 출구 호스를 통해 주사기 바늘로 미립자를 칩에 삽입합니다. 칩을 수직으로 놓고 미세 입자가 측면 채널을 통해 중력의 영향으로 흐르도록합니다. 칩을 90°의 두 단계로 180° 회전하고 미세 입자가 5μm 제한에서 표적화되고 압축되도록 합니다.
- 측면 채널을 향해 45° 회전하는 중력에 의해 과도한 미세 입자를 제거합니다.
- 미립자 트랩이 풀리지 않도록 장치를 똑바로 세우십시오. 미립자 트랩 형성 공정의 요약은 도 6B 를 참조한다.
5. 면역 측정법
- 나노 입자 준비
- 이전에 리소자임(항원 모델)과 접합된 100nm 나노입자의 현탁액 2μL를 취합니다. 100μL의 블로킹 용액이 담긴 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 4°C에서 밤새 배양한다.
- 150 μL의 세척 완충액(1x TBS, 0.05% 트윈 20)을 추가합니다.
- 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 자기 분리기에 넣습니다. 나노입자가 분리될 수 있도록 15분 동안 보관합니다(보충 그림 S4).
알림: 자기 분리기의 최소 부피는 200μL입니다. 더 작은 볼륨을 사용하지 마십시오. - 마이크로 피펫으로 튜브에서 액체를 제거하십시오. 나노 입자 펠릿이 형성된 튜브의 벽과의 접촉을 피하십시오.
- 250 μL의 신선한 세척 완충액을 첨가하십시오. 튜브를 15분 동안 교반 상태로 유지하십시오.
- 5.1.3.-5.1.5단계를 반복합니다. 2 배 더, 5 분 동안 만 흔들어.
- 원하는 농도의 1차 항-리소자임 항체를 추가합니다( 재료 표 참조). 항체 희석제(1x TBS, 1% BSA, 0.05% 트윈 20)에서 최종 부피 100μL로 조정합니다.
- 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 실온에서 15분 더 흔들어 주십시오.
- 세척 단계 5.1.2.-5.1.6을 반복합니다.
- 항체 희석제 100μL를 추가합니다. 양 고추 냉이 퍼 옥시다제 결합 2 차 항체 (HRP-AbII) ( 재료 표 참조)를 1 : 500의 희석으로 첨가하십시오.
- 세척 단계 5.1.2.-5.1.6을 반복합니다.
- 나노입자를 항체 희석제의 최종 부피 50 μL로 유지한다.
6. 실험적 장착
- 두 개의 100μL 유리 주사기에 물을 채우고 각 주사기에 6.5cm 길이의 호스를 연결하고 호스 끝에 금속 핀을 삽입한 다음 두 주사기를 컴퓨터 제어 주사기 펌프에 놓습니다.
- 아크릴 장치의 모든 호스를 열로 밀봉하십시오.
- 입구 호스를 자르고 몇 밀리미터 만 유지하십시오. 분배 바늘에 세척 버퍼를 채우고 절단 된 호스에 삽입하십시오. 바늘을 장치에 연결하기 전에 용액이 떨어지도록 하여 장치에 대한 공기 접근을 방지하십시오.
- 측면 채널에서 배출 호스를 자릅니다. 주사기 펌프에 연결합니다. 다음으로 메인 채널 출구 호스에 대해 동일한 절차를 수행하십시오.
참고: 6.3.-6.4단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 순서는 미립자 트랩의 포장을 풀지 않기 위해서입니다. 가능하면 돋보기를 사용하여이 단계에서 트랩의 상태를 확인하십시오. - 현미경 스테이지에 유리 슬라이드를 놓습니다. 양면 테이프로 자석을 슬라이드에 부착하고 양쪽에 작은 테이프 조각을 놓아 칩 가장자리를 유리에 고정합니다.
- 주사기 펌프 컨트롤러의 유량 및 단위 탭을 통해 50μL/h의 유량을 설정합니다. 인출 모드를 선택하고 시작 버튼을 클릭하여 세척 버퍼의 흐름을 활성화합니다.
- 트랩이 들어있는 칩의 영역이 자석에 닿도록 자석이있는 슬라이드쪽으로 장치를 수평으로 조심스럽게 접근하십시오.
- 움직임을 방지하기 위해 양면 테이프로 장치의 가장자리를 유리에 붙입니다. 현미경 검사를 위한 광학 경로를 방해하지 마십시오(그림 6C).
그림 6: 최종 장치 구성 . (A) 해당 입력 및 출력에 호스가 부착 된 아크릴 장치. 눈금은 장치의 크기를 센티미터 단위로 표시합니다. (b) 미세입자 트랩의 형성을 위한 프로토콜. 미립자는 장치가 수직 위치에 놓일 때 중력에 의해 채널을 통해 흐릅니다. 미립자는 5 μm 제한에서 농축된다. 과량의 미립자는 측면 채널을 통해 칩을 회전시킴으로써 쉽게 제거된다. 칩은 면역 분석 전에 트랩을 보존하기 위해 수직으로 유지됩니다. (c) 상기 자석을 포함하는 유리 슬라이드 상에 장착된, 도립형광현미경의 스테이지 상에 장착된 미세유체소자. 시약이 첨가되는 분배 바늘과 주사기 펌프에 연결되는 출구 호스가 관찰됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
7. 면역 검출
- 과도한 BSA를 제거하기 위해 50μL/h로 10분 동안 세척 버퍼를 계속 흐르게 합니다.
- 마이크로피펫으로 분배 바늘에서 남은 세척 버퍼를 제거합니다. 50 μL의 나노입자 현탁액을 첨가한다.
- 나노입자의 현탁액을 100μL/h의 유속으로 7분 동안 흘려준다. 그런 다음 유속을 50μL/h로 변경하고 15분 더 흘립니다.
- 분배 바늘을 교체하십시오. 세척 버퍼를 50μL/h로 10분 동안 흘립니다. 세척 단계 동안 제조업체의 사양에 따라 형광 생성 기판을 준비하십시오.
- 마이크로피펫으로 분배 바늘에서 남은 세척 버퍼를 제거합니다. 100 μL의 플루오로 생성 기질을 첨가하십시오 ( 재료 표 참조). 플루오로제닉 기질을 50μL/h에서 6분 동안 흘립니다.
- 시린지 펌프를 제어하는 인터페이스의 해당 유량 및 타이머 설정 탭에서 유량(1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h 및 10 μL/h) 및 시간(6분) 측정 파라미터를 설정합니다. 수행할 각 측정에 대해 인출 모드를 선택해야 합니다.
- 세척 단계에 대해 추가 유량 탭을 50μL/h로 설정하고 타이머 를 3분 으로 설정합니다.
- 50μL/h에서 기판이 멈추기 15초 전에 현미경의 형광을 켭니다. 기판이 1,000밀리초의 노출 시간으로 멈추기 10초 전에 현미경 카메라의 소프트웨어로 이미지 캡처를 시작합니다. 1프레임/초(FPS)로 6분 동안 이미징을 수행합니다.
- 50μL/h에서 기판 세척 유량이 멈춘 직후 원하는 유량 파라미터의 시작 버튼을 클릭합니다. 선택한 측정 흐름이 중지된 직후 세척 흐름의 시작 버튼(50 μL/h)을 클릭합니다.
- 이미지 캡처를 중지하고 현미경의 형광을 꺼서 기판의 광퇴색을 방지합니다.
- 7.8.-7.10단계를 반복합니다. 사용 된 각 측정 유량에 대해.
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Representative Results
기존 마이크로 밀링 기술의 분해능을 향상시키는 재현성이 높은 제조 프로토콜을 수립 할 수있었습니다. 이 프로토콜을 사용하면 200μm 높은 채널에서 엇갈린 제한으로 작동하는 높이 5μm만큼 작은 채널을 제작할 수 있습니다. 엇갈린 제한의 단순한 설계는 7.5μm 직경의 철 미세 입자를 포착하여 마이크로 채널에서 압축될 때 외부 자석이 장치에 접근할 때 자기 트랩을 생성할 수 있습니다. 이 장치를 사용하면 관심 분석물과 면역학적 지지체로 접합된 나노입자를 사용하여 면역분석을 수행할 수 있습니다. 이 연구에서는 효소 표지 항체 기반 검출을 통한 비경쟁적 간접 면역 분석법을 수행했습니다. 모델 항원(Ag)은 직경 100 nm의 나노입자(NPs)에 접합된 라이소자임 단백질이었다. 토끼 항-리소자임 IgG를 1차 항체(AbI)로 사용하였고, 검출은 토끼 양 고추냉이 퍼옥시다아제-접합 2차 항체(HRP-AbII)를 사용하여 수행하였다.
검출은 트랩을 통과할 때 HRP-AbII와 플루오로제닉 기질의 상호작용 후에 얻어진 형광 신호 강도의 변화를 포획된 나노입자와 상관시킴으로써 수행하였다. 측정을 수행하기 위해, 트랩 전의 영역과 트랩 후의 영역을 결정하였다. 그림 7A-D는 주어진 형광 기질 유량 (3 μL / h)에 대해 항 리소자임 AbI의 다양한 농도에 대한 형광 강도의 증가를 보여줍니다 : 0 ng / mL, 10 ng / mL, 100 ng / mL 및 1,000 ng / mL. 이는 기질 형광의 변화가 사용된 AbI의 농도에 정비례한다는 것을 보여준다.
그림 7: 형광 측정 영역. 형광 측정은 사용된 1차 항-리소자임 항체의 다양한 농도에 대해 표시됩니다: (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL, (C) 100 ng/mL 및 (D) 1,000 ng/mL. 파란색 원은 기질이 HRP- 접합 된 2 차 항체와 반응하는 5 μm 높이 제한에 의해 형성된 트랩 전후의 형광 측정 영역을 보여줍니다. 모든 이미지는 3μL/h의 유량에 해당합니다. 약어 : HRP = 양 고추 냉이 과산화 효소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그러나, 주어진 AbI 농도에 대해, 수득된 형광의 수준은 플루오로제닉 기질에 사용된 유속의 함수이다. 따라서, HRP 효소에 의한이 기질의 전환 능력은 유속에 반비례한다. 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h 및 10 μL/h의 다양한 기질 유속이 평가되었습니다. 각 실험에 대해, 자기 트랩을 통과하기 전과 후에 기판에 의해 주어진 형광의 차이에 해당하는 곡선이 얻어졌다. 그림 8A-C는 (A) 10 μL / h, (B) 3 μL / h 및 (C) 1 μL / h의 세 가지 유속에 대해 100 ng / mL의 농도에 대해 얻은 곡선을 보여줍니다. 사용되는 유속에 따라, 자기 트랩에 배치된 HRP-접합된 2차 항체에 의한 기질의 전환 용량이 변한다. 녹색 곡선은 트랩에 위치한 HRP에 의한 전환 후 기질의 형광 강도를 나타낸다. 더 높은 플럭스에서, 수득된 형광의 최대 수준이 붕괴되는 것을 볼 수 있다. 빨간색 곡선은 기질이 트랩에 도달하기 전의 기저 형광을 나타냅니다. 트랩의이 영역에서 기질 형광의 측정은 일정하게 유지되며, 그 값은 채널 표면의 효율적인 차단이없는 경우 비특이적 상호 작용의 정도에 따라 달라집니다. 파란색 곡선으로 표시되는 두 곡선의 차이를 계산했습니다.
그림 8: 형광 곡선. 1차 항체 100ng/mL의 농도와 (A) 10μL/h, (B) 3μL/h 및 (C) 1μL/h의 유속에서 얻은 그래프. 3개의 컬러 곡선은 트랩 전(적색 곡선)과 트랩 후(녹색 곡선)와 시간에 따른 두 가지 사이의 차이(청색 곡선)를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9A-C는 (A) 0 ng / mL, (B) 10 ng / mL 및 (C) 1,000 ng / mL의 AbI 농도에 대한 다양한 흐름에 대한 면역 반응 전후에 측정 된 형광 차이 곡선을 통합합니다. 0 μL/h의 유속에 대한 측정은 확산이 지배하는 정적 조건에서의 면역 반응 측정을 나타냅니다. 1,000ng/mL 농도의 경우 평가된 모든 흐름에 대해 형광이 포화됩니다. 그러나, 상이한 흐름에서의 형광의 엇갈린 패턴은 기판의 확산에 기인하며, 이는 더 작은 흐름을 극복하는 높은 전환율과 반응한다. 따라서이 형광이 트랩의 상류 영역으로 되돌아옵니다.
그림 9: 형광 차이 비율. (A) 0 ng / mL, (B) 10 ng / mL 및 (C) 1,000 ng / mL에서 사용 된 다양한 플럭스에 대한 형광 차이 (전후)의 요약 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 장치로 얻은 측정은 모델 항원으로서 리소자임으로 수행 된 면역 분석에 대한 표준 검량 곡선을 생성하는 것을 가능하게한다. 도 10 은 마그네틱 트랩에서 수행된 면역반응 전후의 형광 차이의 최대값으로부터 얻어진 검량선을 나타낸다. 이 프로토콜을 사용하면 1μL/h에서 10μL/h 사이의 흐름을 사용하여 밀리리터당 나노그램 정도의 농도로 1차 항-리소자임 항체를 검출할 수 있습니다. 1 μL/h에서의 높은 가변성 및 높은 형광 수준은 면역복합체의 반응성이 이 속도가 반응 기질의 흐름을 선호하지 않고 트랩 직후에 축적되는 경향이 있음을 시사하며, 장치의 저항이 이 유속에 대한 장치의 분해능을 감소시킨다는 사실을 시사합니다.
그림 10: 검량선. 그래프는 각 유속에 대해 사용된 1차 항체 (AB1)의 농도에 대하여 얻어진 곡선의 형광 강도 차이의 최대값을 나타낸다. I/Isat 는 각 형광 측정(I)에 대해 얻어진 형광 값의 비율에 해당하며, 포화 시 도달한 최대 형광 값(Isat)에 대해 정규화됩니다. 오차 막대는 세 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 압전 플랫폼 컨트롤러 인터페이스. 왼쪽 이미지는 압전 플랫폼의 z축 변위를 제어하는 인터페이스를 보여줍니다. 제한은 3 개의 압전 액추에이터에 전압을 적용하여 플랫폼을 올림으로써 생성됩니다. 오른쪽 이미지는 마이크로 밀링 머신을 제어하는 소프트웨어의 인터페이스를 보여 주며, 여기서 제한이 11,000rpm의 속도로 가공되는 x 및 y 축의 정확한 좌표를 관찰 할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 장치의 설계. 디자인 소프트웨어를 사용하여 만든 장치의 디자인이 왼쪽에 표시됩니다. 설계는 연결된 두 개의 채널로 구성되며, 하나는 5μm 높이 제한을 포함하는 메인 채널이고 다른 하나는 폐기물 배출구의 측면 채널입니다. 채널은 200μm 엔드밀 비트로 마이크로밀링됩니다. 오른쪽 패널에는 제작 매개변수가 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S3: 입구 및 출구 구멍의 마이크로밀링 매개변수. (A) 직경 1.2mm와 깊이 구멍 0.65mm(아크릴 두께의 절반)를 가공된 면에 미세 밀링합니다. 오른쪽 패널에는 엔드밀 비트의 변위 속도, 회전 및 깊이 매개변수가 표시됩니다. (B) 직경 1.5mm, 깊이 0.7mm의 구멍은 구멍을 연결하는 반대면에 미세 밀링됩니다. 오른쪽 패널에는 제작 매개변수가 표시됩니다. 두 케이스 모두 800μm 엔드밀 비트로 마이크로밀링됩니다. (C) 시약 입구 (오른쪽)와 출구 (왼쪽) 구멍은 양면 가공 후 표시됩니다. 직경이 큰 절반의 치수는 호스를 결합 할 수있게 해주는 반면, 작은 직경의 절반에 의해 생성 된 장벽은 호스가 입구를 막는 것을 방지합니다. 스케일 바 = 1mm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S4 : 나노 입자 분리. 상용 자기 분리기를 사용하여, 100 nm 나노입자는 면역검정 동안 세척 단계를 수행하기 위해 용이하게 농축될 수 있다. 15분 후에 형성된 펠릿이 빨간색 원에서 관찰됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1: 아크릴 표면 연삭을 위한 코드. 생성된 코드는 x축 및 y축을 따라 25mm x 9mm 아크릴 표면을 연삭하기 위한 지침과 함께 표시됩니다. 코드의 마지막 줄은 구속조건이 머시닝될 좌표에 드릴 비트를 바로 배치합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 설계 파일 1: 마이크로채널 및 시약 입구 및 출구 구멍 설계. 이 디자인에는 이전에 연마 된 아크릴면에서 가공 된 서로 다른 색상 구조 (검은 색 채널 및 빨간색 구멍)의 두 레이어가 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 설계 파일 2: 반대쪽의 구멍 설계. 디자인은 반대면에 대해 더 큰 직경의 구멍으로 구성되어 이전 구멍과 통신하고 호스를 고정하는 역할을합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
나노입자를 면역지지체로서 사용하는 면역분석용 아크릴 미세유체 장치를 마이크로밀링 기술을 사용하여 제작하였다. 기판 상에 직접 제조하는 방법은 마스터 몰드의 사용과 이것이 의미하는 시간 및 비용을 피할 수 있는 장점이 있다. 그러나 신속한 프로토 타이핑 및 대량 장치 제조로 제한됩니다.
여기에서, 우리는 밀링 머신(12)에 대해 이전에보고 된 액세서리 압전 플랫폼을 사용했다. 이 플랫폼은 기존 마이크로 밀링 머신의 10μm 분해능보다 더 나은 수직 분해능으로 가변 깊이 채널을 생성하기 위해 3D 프린팅으로 제작되었습니다. 우리는 200 μm 미세 유체 채널에서 엇갈린 제한을 형성하는 최대 5 μm 높이의 채널 밀링을 달성했습니다.
200 μm 및 800 μm 직경의 두 개의 엔드 밀 비트만 미세 유체 장치의 제조에 필요하며 비트를 수동으로 변경할 필요가 없습니다. 사용된 밀링 머신 모델은 비트 교환을 자동으로 수행하므로 시간 최적화에 도움이 됩니다. 또한 "Z0 감지" 모드를 사용하면 밀링 머신에 포함된 센서와 핀을 접촉하여 z축에서 높은 정밀도로 원점을 자동으로 결정할 수 있습니다.
이 장치의 설계는 간단하며 5μm 엇갈린 제한에 의해 중단된 주 채널과 미립자의 퍼지 및 입구 역할을 하는 액세서리 채널로만 구성됩니다. 그러나, 이러한 구조의 높은 정밀도는 직경 7.5 μm의 철 미립자를 포획하는 데 한계가 요구된다. 더 큰 제한은 미립자가 머무름 없이 통과할 수 있도록 하여 미립자 트랩의 포획 및 형성을 방지합니다. 반대로, 더 작은 제한은 채널의 유동 저항을 크게 증가시키고 시약이 다공성 미립자 매질을 통과하는 대신 측면 채널을 통해 빠져나가게 합니다. 자기 트랩을 형성하기 위해 더 큰 직경의 미립자를 사용하면 더 큰 제한을 만들 수 있습니다. 예를 들어, 직경이 40μm 인 입자는 ~ 30μm 엇갈린 제한이 필요합니다. 이 경우 압전 플랫폼을 사용할 필요가 없으며 제조 프로토콜이 단순화됩니다. 그러나 더 큰 미세 입자로 구성된 다공성 배지는 나노 입자를 다르게 포획하고 면역 분석의 성능에 영향을 미칩니다. 그러나 그것이 더 좋든 나쁘 든 명확하지 않습니다. 장치를 최적화하기 위해 이러한 기능을 연구하는 작업이 진행 중입니다7.
요구되는 정확도를 달성하기 위해, 표면 연삭을 수행하여 200μm 엔드밀 비트를 14,500rpm으로 전체 아크릴 표면을 통해 이동시킴으로써 아크릴 표면의 30μm 층을 제거하였다. 이 프로세스를 통해 높이의 정확도를 높이기 위해 전체 표면을 따라 z 축에서 새로운 원점을 얻을 수 있습니다. x 축과 y 축 (이전에 설정)의 원점 좌표가 아크릴의 모서리 중 하나와 일치하도록 아크릴을 항상 같은 위치에 정렬하는 것이 중요합니다. 마찬가지로 아크릴이베이스에 완벽하게 장착되어 있는지 확인해야합니다. 그렇지 않으면 표면이 제대로 마모되지 않아 다음 조립 단계에서 문제가 발생할 수 있습니다.
프로그램이 표면 연삭 공정을 완료하면 트랩을 형성하는 5μm 제약 조건이 가공될 특정 좌표로 엔드밀 비트를 자동으로 가져옵니다. 엔드밀 비트가 이 좌표에 도달하면 표면에서 들어 올려지지 않도록 하는 것이 중요합니다. 마이크로 밀링 머신에 연삭 공정이 완료되면 엔드 밀 비트가 표면에서 분리되는 것을 방지하는 옵션이 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 커터를 이 좌표로 수동으로 재배치해야 하므로 위치 정확도 오류가 발생할 수 있습니다.
아크릴의 엇갈린 제한을 가공하려면 1.5 μm 크기를 초과해야합니다. 5μm 높이의 경우, 압전 플랫폼은 채널을 밀봉하는 과정에서 마이크로 채널이 약간 평평 해지는 경향이 있기 때문에 6.5μm로 상승했습니다. 또한 장치의 제한 최종 길이는 50μm에 불과합니다. 그러나 나중에 가공될 때 메인 채널의 양쪽 끝과 통신하도록 더 오래 가공됩니다. 한 단계에서 200μm 깊이의 채널은 200μm 직경의 엔드 밀 비트와 11,000rpm의 회전 속도를 사용하여 제작됩니다. 따라서 아크릴에서 200μm 너비의 채널을 가공하는 데 몇 초 밖에 걸리지 않습니다.
장치 제작의 다음 단계는 채널을 외부와 연결하는 구멍을 가공하는 것입니다. 이 구멍은 장치를 작동하는 주사기 펌프에 장치를 쉽게 연결할 수 있도록 호스를 배치하는 데 사용됩니다. 여기서 발생하는 문제 중 하나는 호스의 배치입니다. 최적의 거리는 시약의 흐름을 허용하고 가공되지 않은 아크릴의 면과 씰이 생성되지 않도록 하는 데 중요합니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 구멍을 두 단계로 가공하여 호스가 원하는 깊이를 초과하지 않는 경계를 만듭니다.
800μm 엔드 밀 비트를 사용하여 구멍 패턴이 이전에 마이크로 밀링 된 동일한 면에 밀링되었습니다. 구멍은 직경 1.2mm, 깊이 0.65mm로 아크릴 두께의 절반 인 각 채널의 끝으로 가공됩니다. 또한 직사각형의 반대쪽 모서리에 두 개의 구멍이 가공되어 아크릴이 기둥으로 플랫폼에서 아래를 향하도록 정렬 할 수 있습니다. 압전 플랫폼에서 아크릴을 제거하기 위해 스크레이퍼 또는 커터를 사용하여 아크릴이 파손되지 않도록하는 것이 중요합니다. 아크릴의 반대쪽에서 구멍의 직경은 1.5mm (이전 절반보다 큼)이며 고정 할 호스의 직경과 같습니다. 깊이는 0.7mm이며 가공된 두 구멍이 서로 통신하도록 전면 구멍의 절반보다 약간 커야 합니다. 더 작은 직경의 구멍에 의해 형성된 장벽은 호스가 바닥에 도달하여 입구를 막는 것을 방지합니다. 프로토콜의 이러한 구현은 유체 입구 및 출구 호스를 칩에 배치하는 것을 크게 향상시킵니다.
장치 제조의 핵심 단계는 밀봉입니다. 가공 된 채널이 들어있는면을 동일한 치수의 가공되지 않은 아크릴 커버로 밀봉해야합니다. 아크릴의 유리 전이 온도에 접근하지 않는 방법으로 시트를 밀봉하면 변형없는 채널을 얻을 수 있습니다. 사용 된 접합 방법을 통해 두 PMMA 시트 사이의 용매 박막은 PMMA 시트 표면에서 박막을 용해시킨 다음 증발하고 마지막으로 특정 작동 온도에서 PMMA 시트의 단량체를 다시 연결합니다.
널리 기술된 클로로포름 증기 노출 방법이 이 아크릴 장치를 밀봉하는 데 사용되었습니다. 이전에 문헌에서보고 된 바와 같이, 클로로포름은 높은 결합 강도를 제공한다; 그러나 클로로포름은 아크릴을 매우 공격적으로 공격하기 때문에 아크릴은 액체 클로로포름과 직접 접촉해서는 안되며 기체 클로로포름과만 접촉해야합니다. 증발하는 클로로포름과 아크릴 사이의 최적 거리를 유지하는 것이 필수적입니다. 우리는 아크릴이 뚜껑에 부착 된 유리 페트리 접시를 사용하여 간단한 시스템을 만들었습니다. 페트리 접시의 뚜껑에 결합되고 부착 된 9 개의 슬라이드로 구성된 플랫폼이 사용되었으며, 아크릴은 거리를 조절하기 위해 양면 테이프로 접착되었습니다. 기체 클로로포름 공정은 주변 온도의 변화에 매우 민감하지만 페트리 접시의 온도는 폴리스티렌 상자 안에 넣어 제어할 수 있습니다. 워터 씰은 클로로포름이 너무 빨리 증발하는 것을 방지합니다.
대조적으로, 더 빠르고 특별한 장비가 필요하지 않은 다른 보고된 접합 방법이 있습니다. 그러나 일부는 가공하지 않고 두 개의 아크릴 시트를 결합하는 데만 적합합니다. 마찬가지로, 용매가 양 아크릴 시트(18) 사이에 직접 부어져야 하기 때문에, 마이크로밀링된 5 μm 제한과 같은 작은 치수의 구조가 용융될 위험이 높기 때문에 결합력을 제어하기가 어렵다.
여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 밀봉 압력과 온도를 제어하는 수제 프레스로 균일 한 밀봉을 달성했습니다. 이 프레스의 구성을 위해 알루미늄 프레임워크와 힌지는 모두 5kg의 무게에서 9:1의 계수로 오는 기계적 힘을 증폭하는 레버를 만듭니다. 발열체는 아크릴 조각과 접촉하는 2cm 두께의 알루미늄 판으로 열을 전달합니다.
아크릴 층이 밀봉되면 제조 공정의 마지막 단계는 외부 호스를 장치의 해당 입구 및 출구에 연결하는 것입니다. 액체 접착제는 호스가 구멍 안에 있으면 외부에 적용됩니다. 호스의 직경이 구멍보다 작 으면 액체 접착제가 장치에 들어가 채널을 막을 수 있습니다.
마이크로 밀링과 같은 기판 상의 직접 제조 방법은 가공 된 표면의 거칠기 및 가장자리가 잘 구분되지 않은 구조와 같은 몇 가지 단점을 갖는다9. 채널의 가공 된 표면의 거칠기에도 불구하고이 장치에는 추가 처리가 필요하지 않습니다. 이 결합 프로토콜에 대해 주목해야 할 중요한 점은 클로로포름이 용매에 노출 된 표면을 연마하여 밀링 된 마이크로 채널의 거칠기를 감소시킬 수 있다는 것입니다. 표면의 연마가 너무 좋아서 광학 품질도 향상됩니다19.
장치가 제작 된 경우 면역 분석에 사용할 수 있도록 준비해야합니다. 장치의 초음파 세척은 채널을 막히고 면역 측정법을 방해 할 수있는 원치 않는 아크릴 파편을 제거하는 데 매우 중요합니다.
또한 비특이적 상호 작용과 높은 배경 소음 신호를 피하기 위해 채널의 올바른 차단에 특별한주의를 기울여야합니다. 5% BSA로 차단하면 채널에서 항체의 비특이적 결합 노이즈가 감소하는 것으로 나타났으며 1시간의 배양으로 충분합니다. 철 미립자는 실리카-PEG 층으로 코팅되어 비특이적 결합을 방지합니다. 또한 미립자는 장치에 트랩을 형성하기 전에 BSA (채널과 동시에)로 차단됩니다. 4°C에서 하룻밤 배양하는 것이 더 좋으며, 이는 면역검정 전에 장치의 제조 및 배양에 1일이 필요하다는 것을 의미합니다. 클로로포름에 의한 거칠기의 감소와 비특이적 상호 작용을 줄이기 위한 표면의 막힘은 예외적으로 잘 작동하는 것으로 나타났으며, 이를 통해 이 플랫폼은 모델 면역분석법4에서 표준 ELISA에 필적하는 검출 한계를 달성할 수 있습니다.
마이크로채널 제한에서 마이크로입자 트랩의 형성은 수동 공정이다. 들어가는 미립자의 수를 정밀하게 제어할 수는 없지만, 우리는 압축된 입자의 길이 추정치에 의존합니다. 트랩을 더 크게 만들거나 초과분을 쉽게 제거 할 수 있습니다. 폐기 된 입자는 측면 채널에 축적되어 칩에서 제거 할 필요가 없습니다. 미립자가 트랩 상류의 나노입자와 상호작용하여 면역분석 측정을 수정할 수 있으므로 미립자가 주 채널로 유입되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.
개념 증명으로, 우리는 특정 1차 항체와 해당 HRP 표지된 2차 항체의 배양에 의해 직경 100nm 나노입자에 접합된 리소자임 단백질에 의해 형성된 복합체의 면역검출을 구현했습니다. 면역 복합체는 장치 외부에서 형성됩니다. 그러나, 장치 내부에서 전체 면역 검정을 수행하는 것이 가능하다. 나노 입자의 자기 적 특성은 고성능 네오디뮴 영구 자석 분리기로 쉽게 조작 할 수 있습니다. 나노 입자가 자석에 의해 마이크로 튜브 벽으로 끌어 당겨 장치 외부의 면역 분석 세척 단계를 용이하게하기 위해 반응 마이크로 튜브를 15 분 동안 유지해야합니다.
이 장치의 하이라이트는 간단하고 빠르며 (ELISA의 경우 4-4 시간에 비해 총 분석 시간 4 분4 분) 저렴하다는 것입니다 (측면 흐름 테스트 가격과 비슷). 이러한 모든 기능을 통해 이 장치 프로필은 POCT 개발에 적합한 후보가 됩니다. 또한이 장치는 금 표준 ELISA4와 유사한 분석 물 농도를 정량적으로 검출 할 수있어 공중 보건의 역학 연구 및 의사 결정에 매우 유용합니다. 보통, 면역분석용 미세유체 시스템은 검출 한계는 양호하지만 분석 시간이 길거나, 분석 시간은 짧지만 최적이 아닌 검출 한계를 갖는다4. 자성 나노 입자를 면역 지원체로 결합하고 검출을위한 형광 생성 효소를 결합함으로써이 플랫폼은 분석 시간이 짧고 검출 한계가 좋습니다 (이전 연구에서 비오틴을 항원으로 사용하여 8 pg / mL의 검출 한계를 발견했으며 이는 표준 ELISA4와 유사합니다). 마지막으로,이 기술은 측면 흐름 테스트에 비해 중요한 이점이 있습니다 : 질적 결과뿐만 아니라 정량적 결과를 제공 할 수있는 가능성 ( "예"또는 "아니오"). 희귀 물질을 사용하는 실험실에서 개발된 대부분의 다른 미세유체 시스템과 달리 이 시스템은 의료 진단 장치의 대량 생산과 매우 호환되는 저비용 열가소성 수지인 아크릴(PMMA)로 만들어집니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación"의 보조금 312231 따라 멕시코 Conacyt와 AMEXCID 및 멕시코 외교부 (SRE)가 "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2"보조금으로 지원했습니다. JAHO는 박사 학위 장학금에 대해 Conacyt Mexico에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
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