Summary
Microfluïdica is een krachtig hulpmiddel voor de ontwikkeling van diagnostische tests. Dure apparatuur en materialen, evenals bewerkelijke fabricage- en handlingtechnieken, zijn echter vaak vereist. Hier beschrijven we het fabricageprotocol van een acryl microfluïdisch apparaat voor magnetische micro- en nanodeeltjesgebaseerde immunoassays in een goedkope en eenvoudig te gebruiken omgeving.
Abstract
Microfluïdische systemen hebben de immunoassaytechnieken sterk verbeterd. Veel microfabricagetechnieken vereisen echter gespecialiseerde, dure of gecompliceerde apparatuur, waardoor fabricage duur en incompatibel is met massaproductie, wat een van de belangrijkste voorwaarden is voor point-of-care-tests (POCT) om te worden toegepast in omgevingen met weinig middelen. Dit werk beschrijft het fabricageproces van een acryl (polymethylmethacrylaat, PMMA) apparaat voor nanodeeltjes-geconjugeerde enzymatische immunoassay testen met behulp van de computer numerieke controle (CNC) micromilling techniek. De werking van het microfluïdische apparaat wordt aangetoond door een immunoassay uit te voeren om een commercieel antilichaam te detecteren met behulp van lysozym als een modelantigeen geconjugeerd aan 100 nm magnetische nanodeeltjes. Dit apparaat integreert een fysieke gespreide beperking van slechts 5 μm in hoogte, gebruikt om magnetische microdeeltjes die deel uitmaken van een magnetische val te vangen door een externe magneet te plaatsen. Op deze manier is de magnetische kracht op de immunosupport van geconjugeerde nanodeeltjes voldoende om ze te vangen en weerstand te bieden aan de stromingsweerstand. Dit microfluïdische apparaat is bijzonder geschikt voor goedkope massaproductie zonder het verlies van precisie voor immunoassay-prestaties.
Introduction
De afgelopen jaren heeft microfluïdica een belangrijke rol gespeeld bij immunoassaytechnieken1. Miniaturisatietechnologie heeft veel uitstekende voordelen in vergelijking met traditionele immunoassays, zoals een lager monster- en reagensverbruik, kortere incubatietijden, efficiënte uitwisseling van oplossingen en hogere integratie en automatisering2.
Bovendien verminderen microfluïdische systemen in immunoassays, in combinatie met magnetische nanodeeltjes als immunosupport, de incubatietijden aanzienlijk, waardoor een hoge detectiegevoeligheid wordt bereikt vanwege de verhoogde oppervlakte-volumeverhouding3. Brownse beweging van de deeltjes verbetert de reactiekinetiek tijdens de vorming van het antigeen-antilichaamcomplex 4,5. Bovendien bieden de magnetische eigenschappen van nanodeeltjes de veelzijdigheid om te worden geïntegreerd in verschillende microfluïdische apparaatconfiguraties, waardoor ze een ideale kandidaat zijn voor signalering en molecuulvangst in geminiaturiseerde on-chip biosensingsystemen5. Magnetische krachten zijn echter aanzienlijk zwakker dan luchtweerstandskrachten op nanometerschaal vanwege de hoge oppervlakte-volumeverhouding6. Daarom kan het vastleggen van nanodeeltjes voor cruciale immunoassay-stappen zoals wassen en detecteren een uitdaging zijn, en een conventionele magneet is onvoldoende4.
Een efficiënte manier om de nanodeeltjes te manipuleren is het gebruik van een microfluïdische magnetische val gevormd door ijzeren microdeeltjes, die zijn verpakt in een microfluïdische structuur3. Daarom, wanneer een externe magneet nadert, wordt een complexe interactie gecreëerd binnen het gemagnetiseerde poreuze medium tussen de magnetische en fluxkrachten. De magnetische kracht die op de nanodeeltjes inwerkt, is sterk genoeg om ze op te vangen en weerstand te bieden aande stromingsweerstand 3,4,7. Deze aanpak vereist microfabricagetechnieken die resoluties bereiken in de orde van enkele micrometers om micrometrische structuren te genereren die de microdeeltjes vasthouden.
De huidige microfabricagetechnieken maken het mogelijk om structuren met hoge resolutie te fabriceren van enkele microns tot honderden nanometers8. Veel van deze technieken vereisen echter gespecialiseerde, dure of gecompliceerde apparatuur. Een van de grootste problemen is de vereiste voor een cleanroom voor matrijsfabricage, die duur en tijdrovend blijft 8,9. Onlangs hebben microfluïdische ingenieurs dit nadeel overwonnen door een verscheidenheid aan alternatieve fabricagemethoden te ontwikkelen, met verschillende voordelen zoals lagere kosten, snellere doorlooptijden, goedkopere materialen en gereedschappen en verhoogde functionaliteit8. Op deze manier bracht de ontwikkeling van nieuwe microfabricagetechnieken goedkope, niet-cleanroommethoden met resoluties zo laag als 10 μm8. Patroonvorming kan direct op een substraat worden gebruikt zonder een duur gietpatroon te genereren, waardoor een tijdrovend proces wordt vermeden. Directe fabricagemethoden omvatten CNC-frezen, laserablatie en directe lithografie8. Al deze methoden zijn geschikt voor het produceren van kanalen met een hoge beeldverhouding in een breed scala aan materialen, ongeacht hun hardheid9, waardoor nieuwe en voordelige geometrieën, fysiek gedrag en kwaliteiten in microfluïdische apparatenmogelijk worden 8.
CNC-microfrezen creëren microschaalstructuren met behulp van snijgereedschappen die bulkmateriaal uit een substraat verwijderen en is een effectieve fabricagemethode voor microfluïdische apparaten10,11. De micromolentechniek kan nuttig zijn in microfluïdische toepassingen om microkanalen en functies direct op het werkoppervlak te creëren, wat een belangrijk voordeel biedt: een werkstuk kan in korte tijd (minder dan 30 minuten) worden vervaardigd, waardoor de doorlooptijd van ontwerp tot prototype12 aanzienlijk wordt verkort. Bovendien maakt de brede beschikbaarheid van snijaccessoires van verschillende materialen, maten en vormen CNC-freesmachines een geschikt hulpmiddel dat de fabricage van verschillende functies in vele soorten goedkope wegwerpmaterialen mogelijk heeft gemaakt13.
Van alle materialen die vaak worden gebruikt in micromolens, blijven thermoplasten een toonaangevende keuze vanwege hun vele gunstige eigenschappen en compatibiliteit met biologische toepassingen 10,14. Thermoplasten zijn een aantrekkelijk substraat voor microfluïdische systemen vanwege hun aanzienlijke voordelen voor de ontwikkeling van goedkope, wegwerpanalysesystemen9. Bovendien zijn deze materialen zeer geschikt voor productieprocessen met een hoog volume, waardoor ze geschikt zijn voor commercialisering en massaproductie. Om deze redenen worden thermoplasten zoals PMMA sinds de beginjaren van microfluïdica als betrouwbare en robuuste materialen beschouwd10. Er zijn verschillende protocollen beschreven om gesloten kanalen in thermoplasten te fabriceren, zoals solventbinding15, warmtebinding16 en ultraviolette (UV) / ozonoppervlakbehandelingsbinding17.
In veel gevallen is de positioneringsresolutie die wordt bereikt met conventionele micromolenmachines niet voldoende voor sommige microfluïdische toepassingen die structuren kleiner dan 10 μm vereisen. High-end micromilling heeft voldoende resolutie. Helaas is het gebruik ervan vanwege de hoge prijzen beperkt tot een handvol gebruikers12. Eerder rapporteerde onze onderzoeksgroep de fabricage en manipulatie van een goedkoop gereedschap dat bewerkingsstructuren van minder dan 10 μm mogelijk maakt, waardoor de resolutie van conventionele freesmachineswordt overwonnen 12. Het armatuur is een platform vervaardigd door 3D-printen met eenvoudige elektronica, met drie piëzo-elektrische actuatoren. Het oppervlak bevat scharniervormige verbindingen die het mogelijk maken om te worden opgetild wanneer de piëzo-elektrische elementen tegelijkertijd werken. Z-as verplaatsing kan worden geregeld met een resolutie van 500 nm en een nauwkeurigheid van ±1,5 μm12.
Dit artikel presenteert de stappen van het productieproces van een acrylapparaat (PMMA) door middel van een micromolentechniek. Het chipontwerp bestaat uit een hoofdkanaal van 200 μm breed en 200 μm hoog en een zijkanaal met dezelfde afmetingen om de stroom van de reagentia te zuiveren. In het centrale gebied wordt het kanaal onderbroken door een fysieke beperking van slechts 5 μm hoog, vervaardigd met het 3D-geprinte piëzo-elektrische platform gemaakt door deze groep12, om magnetische microdeeltjes te vangen die een magnetische val vormen voor nanodeeltjes door een externe magneet te plaatsen. We tonen de werking van het microfluïdische apparaat door een immunoassay uit te voeren om een commercieel antilichaam te detecteren met behulp van lysozym als een modelantigeen geconjugeerd aan 100 nm magnetische nanodeeltjes. Dit apparaat combineert verschillende functies die het uniek maken4: het gebruik van magnetische nanodeeltjes als immuunondersteuning vermindert de totale testtijd van uren tot minuten; het gebruik van een fluorogeen enzym voor detectie zorgt voor detectielimieten die vergelijkbaar zijn met die van standaard enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's); en het gebruik van een thermoplast als fabricagemateriaal maakt het compatibel met massaproductie, wat niet het geval was voor eerdere magnetische vallen van microfluïdische nanodeeltjes3, en maakt het een uitstekende kandidaat om POCT te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Micromolens
- Oppervlakte slijpen
- Schakel de micromolenmachine en de piëzo-elektrische controller in. Start hun respectievelijke besturingssoftware12.
- Selecteer de vereiste eindmolenbits (diameters van 200 μm en 800 μm). Plaats ze in het daarvoor bestemde compartiment van de freesmachine (figuur 1).
- Knip 9 mm x 25 mm rechthoeken van 1,3 mm dik PMMA met de 800 μm eindfreesbit. Bevestig een van deze rechthoeken voorzichtig met dubbelzijdig plakband aan het piëzo-elektrische platform (figuur 2).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de acrylrechthoek altijd op dezelfde positie plaatst, zodat een van de hoeken samenvalt met de oorsprongscoördinaten op de x- en y-as voor bewerking. - Sluit de z-sensor aan en plaats deze op het oppervlak van de PMMA-rechthoek. Selecteer de detectiepen en beweeg deze over het sensoroppervlak. Laat de pin handmatig zakken zonder contact te maken met de sensor. Activeer de Z0-detectiemodus (figuur 3).
- Selecteer de eindfreesbit van 200 μm en verplaats deze naar de x, y-oorsprong. Verwijder de z-sensor. Laat het bit voorzichtig zakken zonder in contact te komen met het acryloppervlak.
- Draai de 200 μm eindfreesbit op 14.500 tpm. Laat het langzaam zakken naar de oorsprongscoördinaat op de z-as (z = 0). Reset de z-as 30 μm onder de oorsprong. Stel deze coördinaat in als de nieuwe z-origin.
OPMERKING: Verlaag het bit nooit als het niet draait. Anders dreigt het te breken. - Klik op de knop Knippen in de software van de micromolenmachine om het snijpaneel te activeren. Klik op de knop Toevoegen en selecteer het .txt bestand (Supplemental Coding File 1) met een eerder gemaakte code voor het slijpen van het acryloppervlak. Klik op de knop Uitvoer om het proces te starten.
- Breng het eindfrebit naar de coördinaat waar de beperking wordt bewerkt. Voorkom dat de eindfreesbit van het grondoppervlak wordt getild zodra deze coördinaat is bereikt door op de knop Pauze te klikken. Verplaats anders de eindfrebit handmatig naar deze coördinaat (figuur 4A).
- Frezen van de 5 μm beperking
- Stel de rotatiesnelheid van de eindfrees in op 11.000 tpm. Verhoog het platform 6,5 μm met de interface van het piëzo-elektrische platform (aanvullende figuur S1). Beweeg de eindfreesbit langs de y-as met 500 μm. Breng het piëzo-elektrische platform terug naar de beginwaarde op de z-as met de besturingsinterface.
- Frezen van microkanalen
- Open het eerder gemaakte ontwerpbestand vanuit de ontwerpsoftware (Supplemental Design File 1). Klik op de knop Afdrukken . Open het menu Eigenschappen en klik op het kleurenvenster dat overeenkomt met de laag met het te bewerken ontwerp. Stel de fabricageparameters in het deelvenster Gereedschap in zoals opgegeven in Aanvullende afbeelding S2.
- Activeer ongewenste lagen door de optie Geen te selecteren in het vervolgkeuzemenu Extra .
- Frezen van gaten
- Schakel over naar de 800 μm eindmolenbit. Activeer de ontwerplaag van de gaten met een diameter van 1,2 mm door op het bijbehorende kleurenvenster te klikken.
- Herhaal stap 1.3.2., maar stel in dit geval de overeenkomstige fabricageparameters in zoals beschreven in aanvullende figuur S3A voor de gaten.
OPMERKING: De diepte van de bewerkte gaten is de helft van de acryldikte. - Werk twee extra gaten op contralaterale hoeken van de rechthoek om de acryl omgekeerd uit te lijnen op een nieuw platform (figuur 4B). Verwijder de acrylrechthoek van het piëzo-elektrische platform. Draai het acrylaat om en plak het met dubbelzijdig plakband over de adapter met de bewerkte pilaren (figuur 4C, D).
- Open het bestand met het ontwerp van de gaten voor het tegenovergestelde vlak van de ontwerpsoftware (Supplemental Design File 2). Stel de bijbehorende fabricageparameters in zoals beschreven in aanvullende figuur S3B. Frees de resterende helft van de reagensinlaat- en uitlaatgaten met een diameter van 1,5 mm en een diepte van 0,7 mm (aanvullende figuur S3C).
Figuur 1: Plaatsing van de eindfrebit. (A) De eindfrebits van 200 μm en 800 μm worden door een schroef op de stalen steun geplaatst en bevestigd. (B) Elke eindfreesbit wordt in het specifieke compartiment van de micromolenmachine geplaatst voor automatische selectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Piëzo-elektrisch platform. Het platform is vervaardigd door 3D-printen en bestaat uit twee zeshoekige bases verbonden door scharnieren die een fijne verplaatsing in de z-as mogelijk maken, bestuurd door drie piëzo-elektrische actuatoren. Er wordt ook een acryladapter waargenomen, waarop de PMMA-rechthoek is bevestigd en die het mogelijk maakt om de uitlijningshoek van de coördinaten in te stellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Z-as kalibratie. De stappen van de z-askalibratie zijn gedetailleerd. (A) De z-sensor bevat een kabel die op de micromolenmachine wordt aangesloten. (B) De sensor wordt direct op het te bewerken oppervlak geplaatst. (C) De detectiepen bestaat uit een metalen staaf die in een speciaal compartiment naast de eindfresbits is geplaatst. (D) Wanneer beide accessoires in contact komen, berekent de micromolenmachine automatisch de oorsprongscoördinaat op de z-as. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gerectificeerd acryloppervlak. (A) De eindfreesbit met een diameter van 200 μm veegt het gehele oppervlak van de acrylrechthoek en verwijdert een laag van ongeveer 30 μm hoog. (B) De afbeelding toont de verschillende structuren die op de voorkant van het eerder gerectificeerde acryl zijn gefreesd. Kanalen en gaten voor reagensinlaat en -uitlaat worden waargenomen. De beperking van 5 μm is niet met het blote oog te zien. (C) Micromilled oppervlak met uitlijningsgaten en adapter met uitlijningsstijlen op tegenovergestelde hoeken. (D) Het acrylaat wordt ondersteboven op de adapter uitgelijnd met pilaren, waarin de uitlijningsgaten passen. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
2. Kanaalafdichting
- Acryl reiniging
- Verwijder de rechthoek acryl van het platform van de pijleradapter. Neem nog een onbewerkte acrylrechthoek. Was beide acrylplaten met isopropylalcohol (IPA) en spoel af met gedestilleerd water. Draag handschoenen en vermijd contact met IPA.
- Dompel het acryl onder in een ultrasoon bad gedurende 10 minuten (figuur 5A, B).
- Blootstelling aan gasvormig chloroform
- Droog beide acrylplaten perfect. Plak ze aan de binnenkant van een glazen petrischaaldeksel met dubbelzijdige tape. Zorg ervoor dat u de zijkant van het bewerkte kanaal bloot legt (figuur 5C). Draag handschoenen en raak het acryloppervlak niet direct aan.
- Plaats de basis van de glazen petrischaal in een grotere glazen petrischaal (figuur 5D). Giet 1 ml chloroform in de basis van de petrischaal. Plaats het deksel snel met de acrylplaten bevestigd aan de binnenkant.
- Voeg onmiddellijk gedestilleerd water toe aan de basis van de grotere petrischaal tot het niveau van het petrischaaldeksel. Laat het acrylaat gedurende 1 minuut aan chloroformgas ontsnappen (figuur 5E).
OPMERKING: Houd er rekening mee dat een langere blootstellingstijd aan chloroform het acryloppervlak zal aanvallen en dat de beperking van 5 μm zal smelten, de hoogte ervan zal wijzigen of volledig zal verdwijnen. - Kantel de petrischaal om de ontstane waterafdichting te verbreken. Verwijder het acrylaat onmiddellijk uit de chloroform door de petrischaal bloot te leggen. Pas op dat je het water niet morst.
LET OP: Doe dit proces in de zuurkast en gebruik handschoenen omdat chloroform zeer giftig is.
- Verlijmen door persen en verwarmen
- Pel beide acrylplaten van de dubbelzijdige tape.
- Lijn beide acrylverf uit met de zijden die werden blootgesteld aan gasvormig chloroform van aangezicht tot aangezicht, waardoor een sandwich wordt gevormd. Plaats de acrylverf in de pers op 18 kgf/cm2 en een temperatuur van 90 °C (figuur 5F,G).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het acryl in de lengterichting uitgelijnd te plaatsen en de uitlijning na 2 minuten te wijzigen voor een betere afdichting. Als de afdichting na deze tijd onvoldoende is, plaats deze dan terug in de pers voor intervallen van niet meer dan 1 min. Controleer met behulp van de stereoscoop de status van de kanalen en de beperking. Bedenk dat, in geval van overschrijding van de perstijd, er een risico bestaat op het elimineren van de beperking.
- Slangbevestiging
- Snijd 2-3 cm lengtes van de slang. Maak een volledig rechte snede. Bevestig elke slang aan de gaten van het apparaat met directdrogende vloeibare lijm (figuur 6A). Voorkom dat de lijm in de chip komt.
Figuur 5: Afdichtingsproces van het apparaat. (A) Elk van de acrylplaten wordt in een hersluitbare zak met gedestilleerd water geplaatst en ondergedompeld in het ultrasone bad. (B) De afbeelding aan de linkerkant toont de kanalen net na de fabricage, en de afbeelding aan de rechterkant toont hetzelfde apparaat na het wassen met IPA en het ultrasone bad, die alle onzuiverheden en acrylresten uit het microkanaal verwijdert. De randen van de beperking die het centrale kanaal van 200 μm onderbreekt, worden waargenomen, wat het succesvolle freesproces bevestigt. Schaalstaven = 500 μm. (C) Beide acrylverf wordt gedroogd en op het glazen platform op het deksel geplakt. (D) De basis van de petrischaal wordt in een andere schaal met een grotere diameter geplaatst. (E) Bij het sluiten van de petrischaal voorkomt de waterafdichting dat gasvormig chloroform ontsnapt. (F) Beschrijving van de elementen van de hendel met een gewicht van 5 kg. (G) Afbeelding van de open hendel, die in rood het gebied toont waar het acrylaat is geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Voorbereiding van het apparaat
- Vul de kanalen met gedestilleerd water met behulp van een spuit. Zorg ervoor dat er geen lekken of weerstand tegen stroming zijn. Dompel het apparaat gedurende 10 minuten onder in een ultrasoon bad om achtergebleven acryl, lijm of ongewenst materiaal in de kanalen te verwijderen.
- Leeg het water in de kanalen van het apparaat. Gebruik een spuit om een blokkerende oplossing te introduceren die is bereid met 5% (w /v) runderserumalbumine (BSA) verdund in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en eerder gefilterd door een 0,2 μm polyethersulfon (PES) spuitfilter.
- Bereid een suspensie van ijzeren microdeeltjes met een diameter van 7,5 μm in 5% BSA.
OPMERKING: De microdeeltjes zijn eerder gefunctionaliseerd met een silica-polyethyleenglycol (PEG) laag die weerstand biedt tegen eiwitabsorptie4. - Incubeer de chip en de microdeeltjessuspensie met de blokkerende oplossing gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur. Laat indien mogelijk een nacht blokkeren bij 4 °C.
4. Vorming van microdeeltjesval
- Steek de microdeeltjes in de chip met een spuitnaald door de uitlaatslang aan de zijkant. Plaats de chip verticaal en laat de microdeeltjes onder invloed van de zwaartekracht door het zijkanaal stromen. Draai de chip 180° in twee stappen van 90° en laat de microdeeltjes richten en compacteren op de 5 μm beperking.
- Verwijder overtollige microdeeltjes door de zwaartekracht 45° naar het zijkanaal te draaien.
- Houd het apparaat rechtop om te voorkomen dat de microdeeltjesval ongedaan wordt gemaakt. Zie figuur 6B voor een samenvatting van het vormingsproces van de microdeeltjesval.
5. Immunoassay
- Nanodeeltjes voorbereiding
- Neem 2 μL van de suspensie van 100 nm nanodeeltjes die eerder zijn geconjugeerd met lysozym (antigeenmodel). Voeg het toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 100 μL blokkeringsoplossing. Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Voeg 150 μL wasbuffer toe (1x TBS, 0,05% Tween 20).
- Plaats de microcentrifugebuis van 1,5 ml in een magnetische afscheider. Gedurende 15 minuten bewaren om de nanodeeltjes te scheiden (aanvullende figuur S4).
OPMERKING: Het minimumvolume voor de magnetische separator is 200 μL. Vermijd het gebruik van een kleiner volume. - Verwijder de vloeistof uit de buis met een micropipette. Vermijd contact met de wand van de buis waar de nanodeeltjeskorrel is gevormd.
- Voeg 250 μL verse wasbuffer toe. Houd de buis 15 min onder roeren.
- Herhaal stap 5.1.3.-5.1.5. 2x meer, slechts 5 minuten schudden.
- Voeg de gewenste concentratie van primair anti-lysozymantilichaam toe (zie de materiaaltabel). Stel in op een eindvolume van 100 μL antilichaamverdunningsmiddel (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- Incubeer gedurende 15 min bij 37 °C. Blijf nog eens 15 minuten schudden bij kamertemperatuur.
- Herhaal de wasstappen 5.1.2.-5.1.6.
- Voeg 100 μL antilichaamverdunningsmiddel toe. Voeg het mierikswortelperoxidase-gekoppeld secundair antilichaam (HRP-AbII) (zie de tabel met materialen) toe bij een verdunning van 1:500.
- Herhaal de wasstappen 5.1.2.-5.1.6.
- Bewaar de nanodeeltjes in een eindvolume van 50 μL antilichaamverdunningsmiddel.
6. Experimentele montage
- Vul de twee glazen spuiten van 100 μL met water, sluit een 6,5 cm lange slang aan op elke spuit, steek een metalen pin in het uiteinde van de slang en plaats beide spuiten op de computergestuurde spuitpomp.
- Sluit alle slangen van het acrylapparaat af met warmte.
- Snijd de inlaatslang door en bewaar slechts enkele millimeters. Vul de doseernaald met wasbuffer en steek deze in de gesneden slang. Laat de oplossing druppelen voordat u de naald op het apparaat aansluit om luchttoegang tot het apparaat te voorkomen.
- Knip de uitlaatslang uit het zijkanaal. Sluit aan op de spuitpomp. Voer vervolgens dezelfde procedure uit voor de uitlaatslang van het hoofdkanaal.
OPMERKING: Het is belangrijk om stappen 6.3.-6.4 uit te voeren. in deze volgorde om te voorkomen dat de microdeeltjesval wordt uitgepakt. Controleer indien mogelijk de status van de val tijdens deze stappen met behulp van een vergrootglas. - Plaats een glasglaasje op het microscooppodium. Bevestig de magneet aan de dia met dubbelzijdige tape en plaats een klein stukje tape aan elke kant om de spaanranden aan het glas te bevestigen.
- Stel een debiet in van 50 μL/h via de tabbladen Debiet en Eenheden in de pompregelaar van de spuit. Selecteer de opnamemodus en klik op de knop Start om de stroom van de wasbuffer te activeren.
- Benader het apparaat voorzichtig naar de dia met de magneet op een horizontale manier, zodat het gebied van de chip met de val contact maakt met de magneet.
- Plak de randen van het apparaat met dubbelzijdige tape op het glas om beweging te voorkomen. Vermijd het belemmeren van het optische pad voor microscopie (figuur 6C).
Figuur 6: Definitieve configuratie van het apparaat. (A) Acrylapparaat met de slangen aangesloten op de overeenkomstige in- en uitgangen. De schaal toont de afmetingen van het apparaat in centimeters. B) Protocol voor de vorming van de houder van microdeeltjes. Microdeeltjes stromen door de zwaartekracht door het kanaal wanneer het apparaat in een verticale positie wordt geplaatst. Microdeeltjes worden geconcentreerd bij de 5 μm-beperking. Overtollige microdeeltjes kunnen eenvoudig worden verwijderd door de chip door het zijkanaal te draaien. De chip wordt verticaal gehouden om de val te behouden voor immunoassay. (C) Microfluïdisch apparaat gemonteerd op een glazen dia met de magneet, op het podium van de omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De doseernaald waardoor de reagentia worden toegevoegd, wordt geobserveerd, evenals de uitlaatslangen die op een spuitpomp worden aangesloten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Immunodetectie
- Laat de wasbuffer gedurende 10 minuten stromen bij 50 μL/h om overtollige BSA te verwijderen.
- Verwijder de resterende wasbuffer van de doseernaald met een micropipette. Voeg 50 μL van de suspensie van het nanodeeltje toe.
- Laat de suspensie van nanodeeltjes gedurende 7 minuten stromen met een stroomsnelheid van 100 μL/h. Wijzig vervolgens het debiet in 50 μL/h en debiet gedurende nog eens 15 minuten.
- Vervang de doseernaald. Laat de wasbuffer gedurende 10 min vloeien bij 50 μL/h. Bereid het fluorogene substraat volgens de specificaties van de fabrikant tijdens de wasstap.
- Verwijder de resterende wasbuffer van de doseernaald met een micropipette. Voeg 100 μL van het fluorogene substraat toe (zie de materiaaltabel). Laat het fluorogene substraat gedurende 6 minuten bij 50 μL/h stromen.
- Stel de meetparameters debiet (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h en 10 μL/h) en tijd (6 min) in op de overeenkomstige tabbladen Debiet en Timer instellen van de interface die de spuitpomp besturen. Zorg ervoor dat u de opnamemodus selecteert voor elk van de uit te voeren metingen.
- Stel een extra tabblad Debiet in op 50 μL/h en Stel Timer in op 3 min voor de wasstap.
- Schakel de fluorescentie van de microscoop 15 s voordat het substraat bij 50 μL/h stopt. Start de opname met de foto met de software van de microscoopcamera 10 s voordat het substraat stopt met een belichtingstijd van 1.000 milliseconden. Voer gedurende 6 minuten beeld uit bij 1 frame/s (FPS).
- Klik op de knop Start van de gewenste debietparameter onmiddellijk nadat het substraatwasdebiet bij 50 μL/h stopt. Klik op de knop Start van de wasstroom (50 μL/h) onmiddellijk nadat de geselecteerde meetstroom stopt.
- Stop de opname van het beeld en schakel de fluorescentie van de microscoop uit om fotobleaching van het substraat te voorkomen.
- Herhaal stap 7.8.-7.10. voor elk gebruikt meetdebiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het was mogelijk om een zeer reproduceerbaar fabricageprotocol op te stellen dat de resolutie van de conventionele micromolentechniek verbetert. Met behulp van dit protocol wordt de fabricage bereikt van een kanaal zo klein als 5 μm hoog dat werkt als een gespreide beperking in een 200 μm hoog kanaal. Het eenvoudige ontwerp van de verspringende beperking vangt ijzeren microdeeltjes op met een diameter van 7,5 μm die, wanneer ze in het microkanaal worden samengeperst, de creatie van een magnetische val mogelijk maken wanneer een externe magneet het apparaat nadert. Met dit apparaat kunnen immunoassays worden uitgevoerd met behulp van nanodeeltjes die zijn geconjugeerd met de analyt van belang als immunologische ondersteuning. In dit werk werden niet-competitieve indirecte immunoassays met enzym-gelabelde antilichaam-gebaseerde detectie uitgevoerd. Het modelantigeen (Ag) was lysozymeiwit geconjugeerd aan nanodeeltjes (NP's) met een diameter van 100 nm. Konijnenanti-lysozym IgG werd gebruikt als het primaire antilichaam (AbI) en detectie werd uitgevoerd met behulp van konijn mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (HRP-AbII).
Detectie werd uitgevoerd door de verandering in fluorescentiesignaalintensiteit te correleren die werd verkregen na de interactie van de HRP-AbII met een fluorogeen substraat bij passage door de val met ingesloten nanodeeltjes. Om de metingen uit te voeren, werden een gebied voor en een gebied na de val bepaald. Figuur 7A-D toont de toename van de fluorescentie-intensiteit voor verschillende concentraties anti-lysozym AbI: 0 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml en 1.000 ng/ml voor een bepaald fluorogeen substraatdebiet (3 μL/h). Hieruit blijkt dat de verandering in substraatfluorescentie recht evenredig is met de gebruikte concentratie AbI.
Figuur 7: Fluorescentiemeetgebieden. De fluorescentiemetingen worden weergegeven voor verschillende concentraties van het gebruikte primaire anti-lysozymantilichaam: (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml, (C) 100 ng/ml en (D) 1.000 ng/ml. Blauwe cirkels tonen het gebied van fluorescentiemeting voor en na de val gevormd door de 5 μm hoogtebeperking, waar het substraat reageert met het HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam. Alle beelden komen overeen met een stroom van 3 μL/h. Afkorting: HRP = mierikswortelperoxidase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Voor een bepaalde AbI-concentratie is het verkregen fluorescentieniveau echter een functie van de stroomsnelheid die wordt gebruikt voor het fluorogene substraat. De omzettingscapaciteit van dit substraat door het HRP-enzym is dus omgekeerd evenredig met het debiet. Verschillende substraatdebieten van 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h en 10 μL/h werden geëvalueerd. Voor elk experiment werden de curven verkregen die overeenkomen met het verschil in fluorescentie dat door het substraat wordt gegeven voor en na het passeren van de magnetische val. Figuur 8A-C toont de curven die zijn verkregen voor een concentratie van 100 ng/ml voor drie verschillende stroomsnelheden: (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h en (C) 1 μL/h. Afhankelijk van het gebruikte debiet varieert de conversiecapaciteit van het substraat door het HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam dat in de magnetische val is geplaatst. De groene curve vertegenwoordigt de fluorescentie-intensiteit van het substraat na conversie door de HRP in de val. Het is te zien dat, bij hogere fluxen, het maximale niveau van verkregen fluorescentie vervalt. De rode curve vertegenwoordigt de basale fluorescentie voordat het substraat de val bereikt. De meting van substraatfluorescentie in dit gebied van de val blijft constant en de waarde ervan hangt af van de mate van niet-specifieke interacties als er geen efficiënte blokkering van het kanaaloppervlak is. We berekenden het verschil tussen beide curven, weergegeven door de blauwe curve.
Figuur 8: Fluorescentiecurven. Grafieken verkregen bij een concentratie van 100 ng/ml primair antilichaam en stroomsnelheden van (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h en (C) 1 μL/h. De drie gekleurde curven vertegenwoordigen de fluorescentie gemeten vóór de val (rode curve) en na de val (groene curve) en het verschil tussen de twee (blauwe curve) in de loop van de tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9A-C integreert de fluorescentieverschilcurven gemeten voor en na immunoreactie voor de verschillende stromen voor AbI-concentraties van (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml en (C) 1.000 ng/ml. De meting voor een stroomsnelheid van 0 μL/h geeft de meting van immunoreactie aan onder statische omstandigheden waar diffusie regeert. Voor een concentratie van 1.000 ng/ml verzadigt de fluorescentie voor alle geëvalueerde stromen. Het gespreide patroon van fluorescentie bij de verschillende stromen is echter te wijten aan diffusie van het substraat, dat reageert met zo'n hoge conversiesnelheid dat het de kleinere stromen overwint. Er is dus een terugkeer van deze fluorescentie naar de stroomopwaartse zone van de val.
Figuur 9: Fluorescentieverschilverhoudingen. Samengevatte curven van de fluorescentieverschillen (na−voor) voor de verschillende fluxen die worden gebruikt bij (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml en (C) 1.000 ng/ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Metingen verkregen met dit apparaat maken het mogelijk om een standaard kalibratiecurve te genereren voor immunoassays uitgevoerd met lysozym als modelantigeen. Figuur 10 toont de kalibratiecurve die is verkregen uit de maximale waarden van de verschillen tussen de fluorescentie voor en na de immunoreactie die in de magnetische val is uitgevoerd. Dit protocol maakt de detectie mogelijk van het primaire anti-lysozymantilichaam met concentraties in de orde van nanogram per milliliter met behulp van stromen tussen 1 μL / h en 10 μL / h. De hoge variabiliteit en hoge fluorescentieniveaus bij 1 μL / h suggereren dat de reactiviteit van het immunocomplex zodanig is dat deze snelheid de stroom van het reagerende substraat niet bevordert en de neiging heeft zich net na de val op te hopen, naast het feit dat de weerstand van het apparaat de resolutie van het apparaat voor dit stroomtempo vermindert.
Figuur 10: Kalibratiecurve. De grafiek toont de maximale waarde van de verschillen in fluorescentie-intensiteit van de verkregen curven met betrekking tot de concentratie van het gebruikte primaire antilichaam (AB1) voor elke stroomsnelheid. I/Isat komt overeen met de verhouding van de fluorescentiewaarde verkregen voor elke fluorescentiemeting (I), genormaliseerd ten opzichte van de maximale fluorescentiewaarde bereikt bij verzadiging (Isat). Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de drie experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Piëzo-elektrische platformcontrollerinterface. De linkerafbeelding toont de interface die de z-asverplaatsing van het piëzo-elektrische platform regelt. De beperking wordt gecreëerd door het platform te verhogen door de toepassing van spanning op drie piëzo-elektrische actuatoren. De rechter afbeelding toont de interface van de software die de micromolenmachine bestuurt, waar het mogelijk is om de precieze coördinaten in de x- en y-as waar te nemen waar de beperking wordt bewerkt met een snelheid van 11.000 tpm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Ontwerp van het apparaat. Het ontwerp van het apparaat dat met behulp van de ontwerpsoftware is gemaakt, is links te zien. Het ontwerp bestaat uit twee aangesloten kanalen, één is het hoofdkanaal dat de 5 μm hoogtebeperking bevat en het andere is het zijkanaal voor de afvoer. De kanalen zijn gemicromilled met een 200 μm eindmolenbit. Het paneel aan de rechterkant toont de fabricageparameters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Micromolenparameters van inlaat- en uitlaatgaten. (A) Gaten met een diameter van 1,2 mm en een diepte van 0,65 mm (de helft van de acryldikte) worden op het bewerkte oppervlak gemicromilleerd. Het paneel aan de rechterkant toont de verplaatsingssnelheid, rotatie en diepteparameters van de eindfreesbit. (B) Gaten met een diameter van 1,5 mm en een diepte van 0,7 mm worden gemicromilleerd aan de tegenoverliggende zijde die de gaten met elkaar verbinden. Het paneel aan de rechterkant toont de fabricageparameters. Beide koffers zijn gemicromilled met een 800 μm eindfreesbit. (C) Reagensinlaat (rechts) en uitlaatgaten (links) worden getoond na het bewerken van beide vlakken. De afmetingen van de helft met een grotere diameter maken het mogelijk om de slang te koppelen, terwijl de barrière die wordt gecreëerd door de helft met een kleinere diameter voorkomt dat de slang de inlaten blokkeert. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: Scheiding van nanodeeltjes. Met behulp van een commerciële magnetische separator kunnen 100 nm nanodeeltjes gemakkelijk worden geconcentreerd om de wasstappen tijdens de immunoassay uit te voeren. De pellet gevormd na 15 minuten wordt waargenomen in de rode cirkel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Supplemental Coding File 1: Code voor acryl oppervlakte slijpen. De gegenereerde code wordt weergegeven met instructies voor het slijpen van het acryloppervlak van 25 mm x 9 mm langs de x- en y-as. De laatste regel van de code plaatst de boor precies op de coördinaat waar de beperking zal worden bewerkt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend ontwerpbestand 1: Ontwerp van de inlaat- en uitlaatgaten van het microkanaal en het reagens. Het ontwerp bevat twee lagen van verschillende gekleurde structuren (zwarte kanalen en rode gaten) die op het eerder geslepen acrylvlak zijn bewerkt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Supplemental Design File 2: Ontwerp van de gaten aan de andere kant. Het ontwerp bestaat uit gaten met een grotere diameter voor het tegenovergestelde vlak die communiceren met de vorige en dienen om de slangen te bevestigen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een acryl microfluïdisch apparaat voor immunoassays met behulp van nanodeeltjes als immunosupport werd gefabriceerd met behulp van een micromilling-techniek. De methode van directe productie op het substraat heeft het voordeel dat het gebruik van een hoofdmatrijs en de tijd en kosten die dit met zich meebrengt, wordt vermeden. Het is echter beperkt tot rapid prototyping en de productie van grote hoeveelheden apparaten.
Hier gebruikten we een eerder gemeld accessoire piëzo-elektrisch platform voor de freesmachine12. Het platform werd vervaardigd door 3D-printen om kanalen met variabele diepte te creëren met een verticale resolutie die beter is dan de resolutie van 10 μm van conventionele micromolenmachines. We bereikten het frezen van kanalen tot 5 μm hoog die een gespreide beperking vormen in het microfluïdische kanaal van 200 μm.
Voor de fabricage van het microfluïdische apparaat zijn slechts twee eindmolenbits van 200 μm en 800 μm diameter nodig, zonder dat er handmatig bits hoeven te worden vervangen. Het gebruikte freesmachinemodel voert de uitwisseling van bits automatisch uit, wat helpt bij tijdoptimalisatie. Bovendien maakt de "Z0 sensing"-modus het mogelijk om de oorsprong automatisch in de z-as met hoge precisie te bepalen door contact te maken met de sensor en de pin die in de freesmachine is opgenomen.
Het ontwerp van dit apparaat is eenvoudig en bestaat alleen uit het hoofdkanaal onderbroken door een verspringende beperking van 5 μm en een accessoirekanaal dat dient als een spoeling en inlaat voor microdeeltjes. De hoge precisie van dergelijke structuren is echter vereist voor de beperking om ijzeren microdeeltjes met een diameter van 7,5 μm te vangen. Een grotere beperking laat microdeeltjes door zonder retentie, wat hun vangst en de vorming van de microdeeltjesval voorkomt. Omgekeerd verhoogt een kleinere beperking de stromingsweerstand van het kanaal aanzienlijk en zorgt ervoor dat de reagentia via het zijkanaal naar buiten gaan in plaats van door het poreuze microdeeltjesmedium te gaan. Het gebruik van microdeeltjes met een grotere diameter om de magnetische val te vormen, zou het mogelijk maken om een grotere beperking te maken. Deeltjes met een diameter van 40 μm hebben bijvoorbeeld een verspringende beperking van ~30 μm nodig. In dat geval is het niet nodig om het piëzo-elektrische platform te gebruiken en wordt het fabricageprotocol vereenvoudigd. Een poreus medium dat bestaat uit grotere microdeeltjes zou nanodeeltjes echter anders vangen en de prestaties van de immunoassay beïnvloeden; het is echter niet duidelijk of het ten goede of ten kwade zou zijn. Er wordt gewerkt aan het bestuderen van deze functies om het apparaat te optimaliseren7.
Om de vereiste nauwkeurigheid te bereiken, werd oppervlakteslijpen uitgevoerd om een laag van 30 μm van het acryloppervlak te verwijderen door de 200 μm eindfreesbit bij 14.500 tpm door het gehele acryloppervlak te verplaatsen. Dit proces maakt het mogelijk om een nieuwe oorsprong te verkrijgen op de z-as langs het hele oppervlak voor een grotere nauwkeurigheid in hoogte. Het is cruciaal om het acryl altijd in dezelfde positie uit te lijnen, zodat de oorsprongscoördinaten op de x- en y-as (eerder ingesteld) samenvallen met een van de hoeken van het acrylaat. Evenzo moet men ervoor zorgen dat het acryl perfect op de basis zit; anders kan het oppervlak niet goed slijten, wat problemen veroorzaakt in de volgende montagestappen.
Zodra het programma het oppervlakteslijpproces heeft voltooid, brengt het automatisch de eindfreesbit naar een specifieke coördinaat waar de beperking van 5 μm die de val vormt, wordt bewerkt. Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat het eindfrebit van het oppervlak opstijgt zodra het deze coördinaat bereikt. Het wordt aanbevolen om te bepalen of de micromolenmachine een optie heeft die voorkomt dat de eindfreesbit loskomt van het oppervlak zodra het maalproces is voltooid. Anders is het nodig om de snijder handmatig naar deze coördinaat te verplaatsen, wat kan leiden tot locatienauwkeurigheidsfouten.
Om de verspringende beperking in het acryl te bewerken, is het noodzakelijk om 1,5 μm te overdimensioneren. Gedurende een hoogte van 5 μm werd het piëzo-elektrische platform verhoogd tot 6,5 μm omdat het microkanaal de neiging heeft om een beetje af te vlakken tijdens het afdichten van de kanalen. Bovendien is de uiteindelijke lengte van de beperking in het apparaat slechts 50 μm; het wordt echter langer bewerkt om ervoor te zorgen dat het met beide uiteinden van het hoofdkanaal communiceert wanneer het daarna wordt bewerkt. In één stap worden de 200 μm diepe kanalen vervaardigd met behulp van de 200 μm diameter eindfreesbit en een rotatiesnelheid van 11.000 tpm. Het bewerken van de 200 μm brede kanalen in acryl duurt dus slechts enkele seconden.
De volgende stap in de fabricage van het apparaat is het bewerken van de gaten die de kanalen met de buitenkant verbinden. Deze gaten worden gebruikt om de slangen te plaatsen waarmee het apparaat gemakkelijk kan worden aangesloten op de spuitpomp die het laat draaien. Een van de problemen die zich hier voordoen, is de plaatsing van de slangen. Een optimale afstand is van cruciaal belang om de stroom van reagentia mogelijk te maken en te voorkomen dat een afdichting ontstaat met het gezicht van het onbewerkte acrylaat. Om dit nadeel te overwinnen, worden de gaten in twee stappen bewerkt om een grens te creëren waar de slangen de gewenste diepte niet overschrijden.
Met de 800 μm eindfrees werd het patroon van gaten op hetzelfde voorheen micromilled oppervlak gefreesd. Gaten worden in het uiteinde van elk kanaal bewerkt met een diameter van 1,2 mm en een diepte van 0,65 mm, wat de helft is van de dikte van het acryl. Bovendien zijn twee gaten bewerkt in de contralaterale hoeken van de rechthoek, waardoor het acryl met de voorkant naar beneden op het platform met pilaren kan worden uitgelijnd. Het is belangrijk om een schraper of snijder te gebruiken om het acryl van het piëzo-elektrische platform te verwijderen om te voorkomen dat het breekt. Aan de andere kant van het acryl is de diameter van de gaten 1,5 mm (groter dan de vorige helft), wat gelijk is aan de diameter van de te bevestigen slang. De diepte is 0,7 mm en moet iets groter zijn dan de helft van het gat aan de voorkant om ervoor te zorgen dat beide bewerkte gaten met elkaar communiceren. De barrière gevormd door het gat met een kleinere diameter voorkomt dat de slang de bodem bereikt en de inlaat blokkeert. Deze implementatie in het protocol verbetert de plaatsing van de vloeistofinlaat- en uitlaatslangen naar de chip aanzienlijk.
Een belangrijke stap in de productie van apparaten is afdichting. Het is noodzakelijk om het gezicht dat de bewerkte kanalen bevat af te dichten met een niet-bewerkte acrylafdekking met dezelfde afmetingen. Het afdichten van de platen met een methode die de glasovergangstemperatuur van acryl niet benadert, zorgt voor het verkrijgen van vervormingsvrije kanalen. Door de gebruikte verlijmingsmethode lost een dunne film oplosmiddel tussen de twee PMMA-platen een dunne film van het oppervlak van de PMMA-plaat op, verdampt vervolgens en verbindt ten slotte de monomeren van de PMMA-platen opnieuw bij een specifieke bedrijfstemperatuur.
De algemeen beschreven methode van blootstelling aan chloroformdamp werd gebruikt om dit acrylapparaat af te dichten. Zoals eerder gemeld in de literatuur, biedt chloroform een hoge bindingssterkte; omdat chloroform acryl echter zeer agressief aanvalt, mag acryl nooit in direct contact komen met vloeibaar chloroform, alleen met gasvormig chloroform. Het is essentieel om een optimale afstand te bewaren tussen de verdampende chloroform en het acrylaat. We creëerden een eenvoudig systeem met behulp van een glazen petrischaal, waarin het acryl aan het deksel werd geplakt. Er werd gebruik gemaakt van een platform bestaande uit negen dia's die aan het deksel van de petrischaal waren bevestigd, waarop de acrylverf met dubbelzijdige tape werd geplakt om de afstand te regelen. Hoewel het gasvormige chloroformproces zeer gevoelig is voor veranderingen in de omgevingstemperatuur, kan de temperatuur van de petrischalen worden geregeld door ze in een polystyreendoos te plaatsen. De waterafdichting voorkomt dat de chloroform te snel verdampt.
Daarentegen zijn er andere gerapporteerde verbindingsmethoden die sneller zijn en geen speciale apparatuur vereisen; sommige zijn echter alleen geschikt voor het verbinden van twee acrylplaten zonder bewerking. Evenzo is het moeilijk om de bindingskracht te regelen, omdat het oplosmiddel rechtstreeks tussen beide acrylplaten moet worden gegoten18, met een hoog risico op smeltstructuren van kleine afmetingen zoals de micromolt 5 μm-beperking.
Met behulp van het hier beschreven protocol werden homogene afdichtingen bereikt met een zelfgemaakte pers, waarmee de afdichtingsdruk en temperatuur werden geregeld. Voor de constructie van deze pers creëren zowel een raamwerk van aluminium als een scharnier een hendel die de mechanische kracht versterkt die afkomstig is van een gewicht van 5 kg tot een factor 9: 1. De verwarmingselementen brengen hun warmte over op 2 cm dikke aluminium platen die in contact staan met de acrylstukken.
Zodra de acryllagen zijn afgedicht, is de laatste stap in het fabricageproces het aansluiten van de externe slangen op de overeenkomstige in- en uitgangen van het apparaat. De vloeibare lijm wordt extern aangebracht zodra de slangen zich in de gaten bevinden. Als de diameter van de slang kleiner is dan de gaten, kan de vloeibare lijm in het apparaat komen, waardoor de kanalen verstopt raken.
Directe fabricagemethoden op het substraat, zoals microfrezen, hebben enkele nadelen, zoals ruwheid van het bewerkte oppervlak en structuren met slecht afgebakende randen9. Ondanks de ruwheid van het bewerkte oppervlak van de kanalen, is er geen extra behandeling nodig voor dit apparaat. Een belangrijk punt om op te merken over dit bindingsprotocol is dat chloroform het mogelijk maakt om de ruwheid van de gemalen microkanalen te verminderen door de oppervlakken die aan het oplosmiddel worden blootgesteld te polijsten. Het polijsten van het oppervlak is zo goed dat zelfs de optische kwaliteit is verbeterd19.
Wanneer het apparaat is vervaardigd, moet het worden voorbereid om te worden gebruikt in een immunoassay. Ultrasoon wassen van het apparaat is van groot belang om ongewenst acrylafval te verwijderen dat de kanalen kan verstoppen en de immunoassay kan verstoren.
Bovendien moet speciale aandacht worden besteed aan de juiste blokkering van de kanalen om niet-specifieke interacties en hoge achtergrondruissignalen te voorkomen. Van blokkering met 5% BSA is aangetoond dat het de ruis van niet-specifieke binding van antilichamen in de kanalen vermindert, en 1 uur incubatie is voldoende. De ijzeren microdeeltjes zijn gecoat met een silica-PEG-laag om niet-specifieke binding erin te voorkomen. Bovendien worden de microdeeltjes geblokkeerd met BSA (tegelijkertijd met de kanalen) voordat ze de val in het apparaat vormen. Nachtelijke incubatie bij 4 °C is beter, wat betekent dat 1 dag nodig is voor de fabricage en incubatie van het apparaat vóór de immunoassay. De vermindering van de ruwheid door de chloroform en de verstopping van de oppervlakken om niet-specifieke interacties te verminderen, hebben aangetoond dat ze uitzonderlijk goed werken, waardoor dit platform een detectielimiet kan bereiken die vergelijkbaar is met standaard ELISA in een modelimmunoassay4.
De vorming van de microdeeltjesval in de microkanaalbeperking is een handmatig proces. Hoewel er geen precieze controle is over het aantal microdeeltjes dat binnenkomt, vertrouwen we op een schatting van de lengte van de verdichte deeltjes. Het is mogelijk om de val groter te maken of het teveel gemakkelijk te verwijderen. De afgedankte deeltjes hopen zich op in het zijkanaal en hoeven niet van de chip te worden verwijderd. Het is cruciaal om te voorkomen dat microdeeltjes in het hoofdkanaal stromen, omdat ze kunnen interageren met nanodeeltjes stroomopwaarts van de val en de immunoassay-metingen kunnen wijzigen.
Als proof-of-concept implementeerden we immunodetectie van een complex gevormd door lysozymeiwit geconjugeerd tot nanodeeltjes met een diameter van 100 nm door incubatie van het specifieke primaire antilichaam en het overeenkomstige HRP-gelabelde secundaire antilichaam. Het immunocomplex wordt buiten het apparaat gevormd. Het is echter mogelijk om de volledige immunoassay in het apparaat uit te voeren. De magnetische eigenschappen van de nanodeeltjes maken eenvoudige manipulatie mogelijk met een hoogwaardige neodymium permanente magneetscheider. Men moet de reactiemicrobuis gewoon 15 minuten bewaren om de nanodeeltjes door de magneet naar de microbuiswand te laten trekken, wat de immunoassay-wasstappen buiten het apparaat vergemakkelijkt.
Het hoogtepunt van dit apparaat is dat het eenvoudig, snel (totale testtijd van 40 min4 vergeleken met 4-6 h voor ELISA) en goedkoop is (vergelijkbaar met de prijs van een laterale flowtest). Al deze functies maken dit apparaatprofiel een goede kandidaat voor de ontwikkeling van POCT. Bovendien kan het apparaat analytconcentraties kwantitatief detecteren die vergelijkbaar zijn met de gouden standaard ELISA4, die uiterst waardevol is voor epidemiologische studies en besluitvorming in de volksgezondheid. Meestal hebben microfluïdische systemen voor immunoassays goede detectiegrenzen maar lange testtijden, of ze hebben korte testtijden maar suboptimale detectielimieten4. Door magnetische nanodeeltjes te combineren als immuunondersteuning en fluorogene enzymen voor detectie, heeft dit platform een korte testtijd en een goede detectielimiet (in eerder werk vonden we een detectiegrens van 8 pg / ml met biotine als antigeen, wat vergelijkbaar is met een standaard ELISA4). Ten slotte heeft deze technologie een belangrijk voordeel ten opzichte van laterale flowtests: de mogelijkheid om kwantitatieve en niet alleen kwalitatieve resultaten te geven ("ja" of "nee"). In tegenstelling tot de meeste andere microfluïdische systemen die zijn ontwikkeld in laboratoria waarin zeldzame materialen worden gebruikt, is dit systeem gemaakt van acryl (PMMA), een goedkope thermoplast die zeer compatibel is met de massaproductie van medische diagnostische hulpmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Conacyt, Mexico onder subsidie 312231 van de "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación", en door AMEXCID en het Mexicaanse ministerie van Buitenlandse Betrekkingen (SRE) onder subsidie "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO bedankt Conacyt Mexico voor hun PhD-beurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R.
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
