Summary
La microfluidique est un outil puissant pour le développement de tests diagnostiques. Cependant, des équipements et des matériaux coûteux, ainsi que des techniques de fabrication et de manutention laborieuses, sont souvent nécessaires. Ici, nous détaillons le protocole de fabrication d’un dispositif microfluidique acrylique pour les immunoessais magnétiques à base de micro et nanoparticules dans un environnement peu coûteux et simple d’utilisation.
Abstract
Les systèmes microfluidiques ont grandement amélioré les techniques d’immunoessais. Cependant, de nombreuses techniques de microfabrication nécessitent un équipement spécialisé, coûteux ou compliqué, ce qui rend la fabrication coûteuse et incompatible avec la production de masse, ce qui est l’une des conditions préalables les plus importantes pour que les tests au point de service (DPS) soient adoptés dans les milieux à faibles ressources. Ce travail décrit le procédé de fabrication d’un dispositif acrylique (polyméthacrylate de méthyle, PMMA) pour les tests immunologiques enzymatiques conjugués aux nanoparticules à l’aide de la technique de microbroyage à commande numérique par ordinateur (CNC). Le fonctionnement du dispositif microfluidique est démontré en effectuant un dosage immunologique pour détecter un anticorps commercial utilisant le lysozyme comme antigène modèle conjugué à des nanoparticules magnétiques de 100 nm. Ce dispositif intègre une restriction physique échelonnée de seulement 5 μm de hauteur, utilisée pour capturer les microparticules magnétiques qui composent un piège magnétique en plaçant un aimant externe. De cette façon, la force magnétique sur l’immunosupport des nanoparticules conjuguées est suffisante pour les capturer et résister à la traînée d’écoulement. Ce dispositif microfluidique est particulièrement adapté à la production de masse à faible coût sans perte de précision pour les performances des immunoessais.
Introduction
Ces dernières années, la microfluidique a joué un rôle important dans les techniques d’immunoessais1. La technologie de miniaturisation présente de nombreux avantages exceptionnels par rapport aux immunoessais traditionnels, tels qu’une consommation réduite d’échantillons et de réactifs, des temps d’incubation plus courts, un échange de solution efficace et une intégration et une automatisation accrues2.
De plus, les systèmes microfluidiques dans les essais immunologiques, associés à des nanoparticules magnétiques comme immunosupport, réduisent considérablement les temps d’incubation, atteignant une sensibilité de détection élevée en raison de l’augmentation du rapport surface/volume3. Le mouvement brownien des particules améliore la cinétique de réaction lors de la formation du complexe antigène-anticorps 4,5. De plus, les propriétés magnétiques des nanoparticules offrent la polyvalence nécessaire pour être intégrées dans différentes configurations de dispositifs microfluidiques, ce qui en fait un candidat idéal pour la signalisation et la capture de molécules dans les systèmes de biodétection miniaturiséssur puce 5. Cependant, les forces magnétiques sont significativement plus faibles que les forces de traînée à l’échelle nanométrique en raison du rapport surface/volume élevé6. Par conséquent, la capture de nanoparticules pour des étapes cruciales d’immunodosage telles que le lavage et la détection peut être difficile, et un aimant conventionnel est insuffisant4.
Un moyen efficace de manipuler les nanoparticules est l’utilisation d’un piège magnétique microfluidique formé de microparticules de fer, qui sont emballées dans une structure microfluidique3. Par conséquent, lorsqu’un aimant externe s’approche, une interaction complexe est créée dans le milieu poreux magnétisé entre les forces magnétiques et de flux. La force magnétique agissant sur les nanoparticules est suffisamment forte pour les capturer et résister à la traînée d’écoulement 3,4,7. Cette approche nécessite des techniques de microfabrication qui atteignent des résolutions de l’ordre de quelques micromètres pour générer des structures micrométriques qui retiennent les microparticules.
Les techniques actuelles de microfabrication permettent la fabrication à haute résolution de structures allant de quelques microns à des centaines de nanomètres8. Cependant, bon nombre de ces techniques nécessitent un équipement spécialisé, coûteux ou compliqué. L’une des principales difficultés est la nécessité d’une salle blanche pour la fabrication des moules, qui reste coûteuse et chronophage 8,9. Récemment, les ingénieurs en microfluidique ont surmonté cet inconvénient en développant une variété de méthodes de fabrication alternatives, avec divers avantages tels que des coûts réduits, des délais d’exécution plus rapides, des matériaux et des outils moins chers et des fonctionnalités accrues8. De cette façon, le développement de nouvelles techniques de microfabrication a apporté des méthodes peu coûteuses, non salles blanches, qui atteignent des résolutions aussi basses que 10 μm8. Le modelage peut être utilisé directement sur un substrat sans générer un motif de moulage coûteux, évitant ainsi un processus fastidieux. Les méthodes de fabrication directe comprennent le fraisage CNC, l’ablation laser et la lithographie directe8. Toutes ces méthodes sont adaptées à la production de canaux à rapport d’aspect élevé dans une large gamme de matériaux, quelle que soit leur dureté9, permettant des géométries, des comportements physiques et des qualités nouveaux et avantageux dans les dispositifs microfluidiques8.
Le microfraisage CNC crée des structures à l’échelle microscopique à l’aide d’outils de coupe qui éliminent le matériau en vrac d’un substrat et constitue une méthode de fabrication efficace pour les dispositifs microfluidiques10,11. La technique de microfraisage peut être utile dans les applications microfluidiques pour créer des microcanaux et des caractéristiques directement sur la surface de travail, offrant un avantage clé : une pièce peut être fabriquée en peu de temps (moins de 30 min), ce qui réduit considérablement le délai d’exécution entre la conception et le prototype12. En outre, la grande disponibilité d’accessoires de coupe de différents matériaux, tailles et formes fait des fraiseuses CNC un outil approprié qui a permis la fabrication de différentes caractéristiques dans de nombreux types de matériaux jetables à faible coût13.
Parmi tous les matériaux couramment utilisés dans le microbroyage, les thermoplastiques restent un choix de premier plan en raison de leurs nombreuses propriétés favorables et de leur compatibilité avec les applications biologiques10,14. Les thermoplastiques sont un substrat attrayant pour les systèmes microfluidiques en raison de leurs avantages significatifs pour le développement de systèmes analytiques jetables à faible coût9. En outre, ces matériaux se prêtent très bien aux processus de fabrication à grand volume, ce qui les rend adaptés à la commercialisation et à la production de masse. Pour ces raisons, les thermoplastiques tels que le PMMA sont considérés comme des matériaux fiables et robustes depuis les premières années de la microfluidique10. Différents protocoles ont été décrits pour fabriquer des canaux fermés dans les thermoplastiques, tels que le collage par solvant15, le collage thermique 16 et le collage de surface ultraviolet (UV)/ozone17.
Dans de nombreux cas, la résolution de positionnement obtenue avec les microfraiseuses conventionnelles n’est pas suffisante pour certaines applications microfluidiques nécessitant des structures inférieures à 10 μm. Le microfraisage haut de gamme a une résolution suffisante. Malheureusement, en raison des prix élevés, son utilisation est limitée à une poignée d’utilisateurs12. Auparavant, notre groupe de recherche a rapporté la fabrication et la manipulation d’un outil à faible coût qui permet d’usiner des structures de moins de 10 μm, surmontant la résolution des fraiseuses conventionnelles12. Le luminaire est une plate-forme fabriquée par impression 3D avec une électronique simple, contenant trois actionneurs piézoélectriques. La surface contient des joints en forme de charnière qui permettent de la soulever lorsque les éléments piézoélectriques agissent simultanément. Le déplacement de l’axe Z peut être contrôlé avec une résolution de 500 nm et une précision de ±1,5 μm12.
Cet article présente les étapes du processus de fabrication d’un dispositif acrylique (PMMA) à travers une technique de microfraisage. La conception de la puce se compose d’un canal principal de 200 μm de large et 200 μm de haut et d’un canal latéral avec les mêmes dimensions pour purger le flux des réactifs. Dans la région centrale, le canal est interrompu par une restriction physique de seulement 5 μm de hauteur, fabriquée avec la plate-forme piézoélectrique imprimée en 3D réalisée par ce groupe12, pour capturer les microparticules magnétiques qui constituent un piège magnétique pour les nanoparticules en plaçant un aimant externe. Nous montrons le fonctionnement du dispositif microfluidique en effectuant un dosage immunologique pour détecter un anticorps commercial en utilisant le lysozyme comme antigène modèle conjugué à des nanoparticules magnétiques de 100 nm. Ce dispositif combine différentes caractéristiques qui le rendent unique4: l’utilisation de nanoparticules magnétiques comme support immunitaire réduit le temps total de test de quelques heures à quelques minutes; l’utilisation d’une enzyme fluorogénique pour la détection permet d’obtenir des limites de détection comparables à celles des tests immuno-enzymatiques standard (ELISA); et l’utilisation d’un thermoplastique comme matériau de fabrication le rend compatible avec la production de masse, ce qui n’était pas le cas pour les précédents pièges magnétiques de nanoparticules microfluidiques3, et en fait un excellent candidat pour développer le POCT.
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Protocol
1. Microfraisage
- Rectification de surface
- Allumez la microfraiseuse et le contrôleur piézoélectrique. Démarrez leur logiciel de contrôle respectif12.
- Sélectionnez les taillants d’extrémité requis (diamètres 200 μm et 800 μm). Placez-les dans le compartiment approprié de la fraiseuse (Figure 1).
- Découpez des rectangles de 9 mm x 25 mm en PMMA de 1,3 mm d’épaisseur avec le taillant d’extrémité de 800 μm. Fixez soigneusement l’un de ces rectangles à l’aide de ruban adhésif double face à la plate-forme piézoélectrique (Figure 2).
REMARQUE: Assurez-vous de toujours placer le rectangle acrylique dans la même position afin que l’un des coins coïncide avec les coordonnées d’origine sur les axes x et y pour l’usinage. - Connectez et placez le capteur z sur la surface du rectangle en PMMA. Sélectionnez la broche de détection et déplacez-la sur la surface du capteur. Abaissez la broche manuellement sans entrer en contact avec le capteur. Activez le mode de détection Z0 (Figure 3).
- Sélectionnez le taillant d’extrémité de 200 μm et déplacez-le vers l’origine x, y. Retirez le capteur z. Abaissez le taillant avec précaution sans entrer en contact avec la surface acrylique.
- Faites tourner le taillant d’extrémité de 200 μm à 14 500 tr/min. Abaissez-le lentement jusqu’à la coordonnée d’origine sur l’axe z (z = 0). Réinitialisez l’axe z à 30 μm au-dessous de l’origine. Définissez cette coordonnée comme nouvelle origine z.
REMARQUE: Ne baissez jamais le bit s’il ne tourne pas. Sinon, il risque de se briser. - Cliquez sur le bouton Couper dans le logiciel de la microfraiseuse pour activer le panneau Couper . Cliquez sur le bouton Ajouter et sélectionnez le fichier .txt (fichier de codage supplémentaire 1) avec un code créé précédemment pour le meulage de la surface acrylique. Cliquez sur le bouton Sortie pour démarrer le processus.
- Amenez le taillant d’extrémité du fraisage à la coordonnée où la restriction sera usinée. Empêchez le taillant d’extrémité de soulever la surface du sol une fois cette coordonnée atteinte en cliquant sur le bouton Pause . Sinon, repositionnez manuellement le taillant de fraisage d’extrémité sur cette coordonnée (Figure 4A).
- Fraisage de la restriction de 5 μm
- Réglez la vitesse de rotation du taillant d’extrémité du fraiseur à 11 000 tr/min. Élever la plate-forme de 6,5 μm avec l’interface de la plate-forme piézoélectrique (Figure supplémentaire S1). Déplacez le taillant d’extrémité le long de l’axe des y de 500 μm. Ramener la plate-forme piézoélectrique à sa valeur initiale sur l’axe z avec l’interface de contrôle.
- Fraisage des microcanaux
- Ouvrez le fichier de conception créé précédemment à partir du logiciel de conception (fichier de conception supplémentaire 1). Cliquez sur le bouton Imprimer . Accédez au menu Propriétés et cliquez sur la fenêtre de couleur correspondant au calque contenant le dessin à usiner. Définissez les paramètres de fabrication dans le panneau Outil comme indiqué dans la figure supplémentaire S2.
- Désactivez les calques indésirables en sélectionnant l’option Aucun dans le menu déroulant Outils .
- Fraisage des trous
- Passez au taillant de fraisage d’extrémité de 800 μm. Activez la couche de conception des trous de 1,2 mm de diamètre en cliquant sur la fenêtre de couleur correspondante.
- Répétez l’étape 1.3.2., mais dans ce cas, définissez les paramètres de fabrication correspondants comme décrit à la figure supplémentaire S3A pour les trous.
REMARQUE: La profondeur des trous usinés est la moitié de l’épaisseur acrylique. - Usinez deux trous supplémentaires sur les coins controlatéraux du rectangle pour aligner l’acrylique de manière inversée sur une nouvelle plate-forme (figure 4B). Décollez le rectangle en acrylique de la plate-forme piézoélectrique. Retournez l’acrylique et collez-le avec du ruban adhésif double face sur l’adaptateur avec les montants usinés (Figure 4C,D).
- Ouvrez le fichier avec la conception des trous pour la face opposée du logiciel de conception (fichier de conception supplémentaire 2). Définissez les paramètres de fabrication correspondants comme décrit à la figure supplémentaire S3B. Broyer la moitié restante des trous d’entrée et de sortie du réactif d’un diamètre de 1,5 mm et d’une profondeur de 0,7 mm (figure supplémentaire S3C).
Figure 1 : Emplacement du taillant d’extrémité du broyeur. (A) Les taillants d’extrémité de 200 μm et 800 μm sont placés et fixés à l’aide d’une vis au support en acier. (B) Chaque taillant d’extrémité est placé dans le compartiment spécifique de la microfraiseuse pour une sélection automatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Plateforme piézoélectrique. La plate-forme est fabriquée par impression 3D et se compose de deux bases hexagonales reliées par des charnières qui permettent un déplacement fin dans l’axe z contrôlé par trois actionneurs piézoélectriques. Un adaptateur acrylique est également observé, sur lequel est fixé le rectangle en PMMA, et qui permet de régler le coin d’alignement des coordonnées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Étalonnage de l’axe Z. Les étapes de l’étalonnage de l’axe z sont détaillées. (A) Le capteur z comprend un câble qui se branche sur la microfraiseuse. (B) Le capteur est placé directement sur la surface à usiner. (C) La goupille de détection est constituée d’une barre métallique placée dans un compartiment spécial à côté des taillants d’extrémité du broyeur. (D) Lorsque les deux accessoires entrent en contact, la microfraiseuse calcule automatiquement les coordonnées d’origine sur l’axe z. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Surface acrylique rectifiée. (A) Le taillant d’extrémité de train de 200 μm de diamètre balaie toute la surface du rectangle acrylique, enlevant une couche d’environ 30 μm de haut. (B) L’image montre les différentes structures fraisées sur la face de l’acrylique précédemment rectifié. Des canaux et des trous pour l’entrée et la sortie du réactif sont observés. La restriction de 5 μm ne peut pas être vue à l’œil nu. (C) Surface microfraisée avec trous d’alignement et adaptateur avec piliers d’alignement aux angles opposés. (D) L’acrylique est aligné à l’envers sur l’adaptateur avec des piliers, dans lesquels les trous d’alignement s’insèrent. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Étanchéité des canaux
- Nettoyage acrylique
- Retirez le rectangle en acrylique de la plate-forme de l’adaptateur de pilier. Prenez un autre rectangle acrylique non usiné. Lavez les deux feuilles d’acrylique avec de l’alcool isopropylique (IPA) et rincez à l’eau distillée. Portez des gants et évitez tout contact avec l’IPA.
- Plongez l’acrylique dans un bain à ultrasons pendant 10 min (Figure 5A,B).
- Exposition gazeuse au chloroforme
- Sécher parfaitement les deux feuilles d’acrylique. Collez-les à l’intérieur d’un couvercle en verre de la boîte de Petri avec du ruban adhésif double face. Veillez à exposer le côté du canal usiné (Figure 5C). Portez des gants et évitez de toucher directement la surface en acrylique.
- Placez la base de la boîte de Petri en verre à l’intérieur d’une boîte de Petri en verre plus grande (Figure 5D). Verser 1 mL de chloroforme à la base de la boîte de Pétri. Placez rapidement le couvercle avec les feuilles d’acrylique attachées à la face intérieure.
- Ajouter immédiatement de l’eau distillée à la base de la plus grande boîte de Petri jusqu’au niveau du couvercle de la boîte de Pétri. Laisser l’acrylique exposé au gaz chloroforme pendant 1 min (figure 5E).
REMARQUE : Considérez qu’un temps d’exposition plus long au chloroforme attaquera la surface de l’acrylique et que la restriction de 5 μm fondra, modifiera sa hauteur ou disparaîtra complètement. - Inclinez la boîte de Petri pour briser le joint d’eau créé. Retirez immédiatement l’acrylique du chloroforme en découvrant la boîte de Pétri. Veillez à ne pas renverser l’eau.
ATTENTION : Faites ce procédé dans la hotte et utilisez des gants puisque le chloroforme est très toxique.
- Collage par pressage et chauffage
- Décollez les deux plaques d’acrylique du ruban adhésif double face.
- Aligner les deux acryliques avec les côtés qui ont été exposés au chloroforme gazeux face à face, formant un sandwich. Placer les acryliques dans la presse à 18 kgf/cm2 et à une température de 90 °C (figure 5F,G).
NOTE: Il est recommandé de placer l’acrylique aligné longitudinalement et de changer son alignement après 2 min pour une meilleure étanchéité. Si, après ce temps, le joint est insuffisant, replacez-le dans la presse à des intervalles ne dépassant pas 1 min. À l’aide du stéréoscope, vérifiez l’état des canaux et la restriction. Considérez qu’en cas de dépassement du temps de pressage, il existe un risque d’élimination de la restriction.
- Fixation de tuyau
- Couper 2-3 cm longueurs de tuyau. Faites une coupe complètement droite. Fixez chaque tuyau aux trous de l’appareil à l’aide d’un adhésif liquide à séchage instantané (Figure 6A). Empêchez l’adhésif de pénétrer à l’intérieur de la puce.
Figure 5 : Processus d’étanchéité de l’appareil. (A) Chacune des feuilles d’acrylique est placée dans un sac refermable avec de l’eau distillée et immergée dans le bain à ultrasons. (B) L’image de gauche montre les canaux juste après la fabrication, et l’image de droite montre le même appareil après le lavage avec de l’IPA et le bain à ultrasons, qui élimine toutes les impuretés et les résidus acryliques du microcanal. Les bords de la restriction qui interrompt le canal central de 200 μm sont observés, ce qui confirme le succès du processus de fraisage. Barres d’échelle = 500 μm. (C) Les deux acryliques sont séchés et collés à la plate-forme en verre sur le couvercle. (D) La base de la boîte de Petri est placée à l’intérieur d’une autre boîte de plus grand diamètre. (E) Lors de la fermeture de la boîte de Pétri, le joint d’étanchéité empêche le chloroforme gazeux de s’échapper. F) Description des éléments du levier d’un poids de 5 kg. (G) Image du levier ouvert, montrant en rouge la zone où l’acrylique est placé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Préparation de l’appareil
- Remplissez les canaux avec de l’eau distillée à l’aide d’une seringue. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites ou de résistance à l’écoulement. Immergez l’appareil dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes pour éliminer tout acrylique, adhésif ou matériau indésirable restant à l’intérieur des canaux.
- Videz l’eau à l’intérieur des canaux de l’appareil. Utilisez une seringue pour introduire une solution bloquante préparée avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % (p/v) diluée dans 1x solution saline tamponnée Tris (TBS) et préalablement filtrée à travers un filtre de seringue en polyéthersulfone (PES) de 0,2 μm.
- Préparer une suspension de microparticules de fer de 7,5 μm de diamètre dans 5% BSA.
NOTE: Les microparticules sont préalablement fonctionnalisées avec une couche silice-polyéthylèneglycol (PEG) qui confère une résistance à l’absorption des protéines4. - Incuber la puce et la suspension de microparticules avec la solution de blocage pendant au moins 1 h à température ambiante. Si possible, laisser bloquer pendant la nuit à 4 °C.
4. Formation de pièges à microparticules
- Insérez les microparticules dans la puce à l’aide d’une aiguille de seringue à travers le tuyau de sortie du canal latéral. Placez la puce verticalement et laissez les microparticules s’écouler sous l’effet de la gravité à travers le canal latéral. Faites pivoter la puce de 180° en deux étapes de 90° et laissez les microparticules cibler et compacter à la restriction de 5 μm.
- Éliminer les microparticules en excès par gravité en tournant de 45° vers le canal latéral.
- Gardez l’appareil debout pour éviter de défaire le piège à microparticules. Voir la figure 6B pour un résumé du processus de formation des pièges à microparticules.
5. Dosage immunologique
- Préparation des nanoparticules
- Prélever 2 μL de la suspension de nanoparticules de 100 nm préalablement conjuguées avec du lysozyme (modèle antigénique). Ajoutez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL avec 100 μL de solution bloquante. Incuber pendant une nuit à 4 °C.
- Ajouter 150 μL de tampon de lavage (1x TBS, 0,05% Tween 20).
- Placez le tube microcentrifuge de 1,5 mL dans un séparateur magnétique. Conserver 15 min pour permettre la séparation des nanoparticules (Figure supplémentaire S4).
REMARQUE: Le volume minimum pour le séparateur magnétique est de 200 μL. Évitez d’utiliser un volume plus petit. - Retirez le liquide du tube à l’aide d’une micropipette. Évitez tout contact avec la paroi du tube où la pastille de nanoparticules a été formée.
- Ajouter 250 μL de tampon de lavage frais. Maintenir le tube sous agitation pendant 15 min.
- Répétez les étapes 5.1.3.-5.1.5. 2x de plus, en secouant seulement pendant 5 min.
- Ajouter la concentration désirée d’anticorps anti-lysozyme primaire (voir le tableau des matériaux). Ajuster à un volume final de 100 μL dans un diluant d’anticorps (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- Incuber pendant 15 min à 37 °C. Continuez à agiter pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante.
- Répétez les étapes de lavage 5.1.2.-5.1.6.
- Ajouter 100 μL de diluant d’anticorps. Ajouter l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort (HRP-AbII) (voir le tableau des matières) à une dilution de 1:500.
- Répétez les étapes de lavage 5.1.2.-5.1.6.
- Conserver les nanoparticules dans un volume final de 50 μL de diluant d’anticorps.
6. Montage expérimental
- Remplissez les deux seringues en verre de 100 μL avec de l’eau, connectez un tuyau de 6,5 cm de long à chaque seringue, insérez une goupille métallique à l’extrémité du tuyau et placez les deux seringues sur la pompe à seringue contrôlée par ordinateur.
- Scellez tous les tuyaux de l’appareil en acrylique avec de la chaleur.
- Coupez le tuyau d’entrée et ne gardez que quelques millimètres. Remplissez l’aiguille de distribution avec un tampon de lavage et insérez-la dans le tuyau coupé. Laissez la solution s’égoutter avant de connecter l’aiguille à l’appareil pour empêcher l’accès de l’air à l’appareil.
- Coupez le tuyau de sortie du canal latéral. Connectez-vous à la pompe à seringue. Ensuite, effectuez la même procédure pour le tuyau de sortie du canal principal.
Remarque : Il est essentiel d’effectuer les étapes 6.3.-6.4. dans cet ordre pour éviter de déballer le piège à microparticules. Si possible, vérifiez l’état du piège au cours de ces étapes à l’aide d’une loupe. - Placez une lame de verre sur la platine du microscope. Fixez l’aimant à la lame avec du ruban adhésif double face et placez un petit morceau de ruban adhésif de chaque côté pour fixer les bords de la puce au verre.
- Réglez un débit de 50 μL/h via les onglets Débit et Unités du contrôleur de la pompe à seringues. Sélectionnez le mode Retrait et cliquez sur le bouton Démarrer pour activer le flux du tampon de lavage.
- Approchez soigneusement l’appareil vers la glissière avec l’aimant de manière horizontale de sorte que la zone de la puce contenant le piège entre en contact avec l’aimant.
- Collez les bords de l’appareil au verre avec du ruban adhésif double face pour empêcher tout mouvement. Éviter d’obstruer le chemin optique pour la microscopie (Figure 6C).
Figure 6 : Configuration finale du dispositif. (A) Dispositif acrylique avec les tuyaux fixés aux entrées et sorties correspondantes. L’échelle montre les dimensions de l’appareil en centimètres. B) Protocole pour la formation du piège à microparticules. Les microparticules circulent dans le canal par gravité lorsque l’appareil est placé en position verticale. Les microparticules sont concentrées à la restriction de 5 μm. Les microparticules en excès sont facilement éliminées en faisant tourner la puce dans le canal latéral. La puce est maintenue verticale pour préserver le piège avant le dosage immunologique. (C) Dispositif microfluidique monté sur une lame de verre contenant l’aimant, sur la platine du microscope à fluorescence inversée. On observe l’aiguille de distribution à travers laquelle les réactifs sont ajoutés, ainsi que les tuyaux de sortie qui se connectent à une pompe à seringue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
7. Immunodétection
- Laissez le tampon de lavage couler pendant 10 minutes à 50 μL/h pour éliminer l’excès de BSA.
- Retirez le tampon de lavage restant de l’aiguille de distribution à l’aide d’une micropipette. Ajouter 50 μL de la suspension de nanoparticules.
- Écoulement de la suspension de nanoparticules pendant 7 min à un débit de 100 μL/h. Ensuite, modifiez le débit à 50 μL/h et le débit pendant encore 15 minutes.
- Changez l’aiguille de distribution. Écouler le tampon de lavage pendant 10 min à 50 μL/h. Préparer le substrat fluorogénique selon les spécifications du fabricant pendant l’étape de lavage.
- Retirez le tampon de lavage restant de l’aiguille de distribution à l’aide d’une micropipette. Ajouter 100 μL du substrat fluorogénique (voir le tableau des matériaux). Écoulement du substrat fluorogénique pendant 6 min à 50 μL/h.
- Réglez les paramètres de mesure du débit (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h et 10 μL/h ) et du temps (6 min) dans les onglets Débit et Réglage de la minuterie correspondants de l’interface qui contrôlent la pompe à seringue. Assurez-vous de sélectionner le mode de retrait pour chacune des mesures à effectuer.
- Réglez une languette de débit supplémentaire à 50 μL/h et réglez la minuterie à 3 min pour l’étape de lavage.
- Allumez la fluorescence du microscope 15 s avant l’arrêt du substrat à 50 μL/h. Démarrez la capture d’image avec le logiciel de la caméra de microscope 10 s avant que le substrat ne s’arrête avec un temps d’exposition de 1 000 millisecondes. Effectuez des images pendant 6 min à 1 image/s (FPS).
- Cliquez sur le bouton Démarrer du paramètre de débit souhaité immédiatement après l’arrêt du débit de lavage du substrat à 50 μL/h. Cliquez sur le bouton Démarrer du débit de lavage (50 μL/h) immédiatement après l’arrêt du débit de mesure sélectionné.
- Arrêtez la capture d’image et désactivez la fluorescence du microscope pour éviter le photoblanchiment du substrat.
- Répétez les étapes 7.8.-7.10. pour chaque débit de mesure utilisé.
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Representative Results
Il a été possible d’établir un protocole de fabrication hautement reproductible qui améliore la résolution de la technique de microfraisage conventionnelle. En utilisant ce protocole, la fabrication d’un canal aussi petit que 5 μm de hauteur qui fonctionne comme une restriction échelonnée dans un canal de 200 μm de haut est réalisée. La conception simple de la restriction décalée capture les microparticules de fer de 7,5 μm de diamètre qui, lorsqu’elles sont compactées dans le microcanal, permettent la création d’un piège magnétique lorsqu’un aimant externe s’approche de l’appareil. Ce dispositif permet de réaliser des immunoessais à l’aide de nanoparticules conjuguées à l’analyte d’intérêt comme support immunologique. Dans ce travail, des immunoessais indirects non compétitifs avec détection par anticorps marqués par des enzymes ont été réalisés. L’antigène modèle (Ag) était une protéine lysozyme conjuguée à des nanoparticules (NP) de 100 nm de diamètre. Les IgG anti-lysozyme de lapin ont été utilisées comme anticorps primaire (AbI) et la détection a été effectuée à l’aide d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort de lapin (HRP-AbII).
La détection a été réalisée en corrélant le changement d’intensité du signal de fluorescence obtenu après l’interaction du HRP-AbII avec un substrat fluorogénique lors du passage à travers le piège avec des nanoparticules piégées. Pour effectuer les mesures, une région avant et une région après le piège ont été déterminées. La figure 7A-D montre l’augmentation de l’intensité de fluorescence pour différentes concentrations d’AbI anti-lysozyme : 0 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL et 1 000 ng/mL pour un débit de substrat fluorogénique donné (3 μL/h). Cela montre que le changement de fluorescence du substrat est directement proportionnel à la concentration d’AbI utilisée.
Figure 7 : Zones de mesure de la fluorescence. Les mesures de fluorescence sont indiquées pour différentes concentrations d’anticorps anti-lysozyme primaire utilisés : (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL, (C) 100 ng/mL et (D) 1 000 ng/mL. Les cercles bleus montrent la zone de mesure de fluorescence avant et après le piège formé par la restriction de hauteur de 5 μm, où le substrat réagit avec l’anticorps secondaire conjugué HRP. Toutes les images correspondent à un débit de 3 μL/h. Abréviation : HRP = peroxydase de raifort. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Cependant, pour une concentration d’AbI donnée, le niveau de fluorescence obtenu est fonction du débit utilisé pour le substrat fluorogénique. Ainsi, la capacité de conversion de ce substrat par l’enzyme HRP est inversement proportionnelle au débit. Différents débits de substrat de 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h et 10 μL/h ont été évalués. Pour chaque expérience, on a obtenu les courbes correspondant à la différence de fluorescence donnée par le substrat avant et après le passage dans le piège magnétique. La figure 8A-C montre les courbes obtenues pour une concentration de 100 ng/mL pour trois débits différents : (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h et (C) 1 μL/h. Selon le débit utilisé, la capacité de conversion du substrat par l’anticorps secondaire conjugué HRP placé dans le piège magnétique varie. La courbe verte représente l’intensité de fluorescence du substrat après conversion par le HRP situé dans le piège. On peut voir que, à des flux plus élevés, le niveau maximal de fluorescence obtenu se désintègre. La courbe rouge représente la fluorescence basale avant que le substrat n’atteigne le piège. La mesure de la fluorescence du substrat dans cette zone du piège reste constante, et sa valeur dépend du degré d’interactions non spécifiques s’il n’y a pas de blocage efficace de la surface du canal. Nous avons calculé la différence entre les deux courbes, représentée par la courbe bleue.
Figure 8 : Courbes de fluorescence. Graphiques obtenus à une concentration de 100 ng/mL d’anticorps primaires et à des débits de (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h et (C) 1 μL/h. Les trois courbes colorées représentent la fluorescence mesurée avant le piège (courbe rouge) et après le piège (courbe verte) et la différence entre les deux (courbe bleue) au cours du temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La figure 9A-C intègre les courbes de différence de fluorescence mesurées avant et après immunoréaction pour les différents débits pour les concentrations d’AbI de (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL et (C) 1 000 ng/mL. La mesure pour un débit de 0 μL/h indique la mesure de l’immunoréaction dans des conditions statiques où la diffusion prévaut. Pour une concentration de 1 000 ng/mL, la fluorescence sature pour tous les débits évalués. Cependant, le schéma décalé de fluorescence aux différents écoulements est dû à la diffusion du substrat, qui réagit avec un taux de conversion si élevé qu’il surmonte les flux plus petits. Ainsi, il y a un retour de cette fluorescence dans la zone amont du piège.
Figure 9 : Rapports de différence de fluorescence. Courbes résumées des différences de fluorescence (après-avant) pour les différents flux utilisés à (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL et (C) 1 000 ng/mL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les mesures obtenues avec ce dispositif permettent de générer une courbe d’étalonnage standard pour les immunoessais réalisés avec le lysozyme comme antigène modèle. La figure 10 représente la courbe d’étalonnage obtenue à partir des valeurs maximales des différences entre la fluorescence avant et après l’immunoréaction réalisée dans le piège magnétique. Ce protocole permet la détection de l’anticorps anti-lysozyme primaire avec des concentrations de l’ordre du nanogramme par millilitre en utilisant des débits compris entre 1 μL/h et 10 μL/h. La grande variabilité et les niveaux de fluorescence élevés à 1 μL/h suggèrent que la réactivité de l’immunocomplexe est telle que ce taux ne favorise pas l’écoulement du substrat réactif et tend à s’accumuler juste après le piège, en plus du fait que la résistance du dispositif réduit la résolution du dispositif pour ce débit.
Figure 10 : Courbe d’étalonnage. Le graphique montre la valeur maximale des différences d’intensité de fluorescence des courbes obtenues par rapport à la concentration d’anticorps primaire utilisé (AB1) pour chaque débit. I/I sat correspond au rapport de la valeur de fluorescence obtenue pour chaque mesure de fluorescence (I), normalisée par rapport à la valeur de fluorescence maximale atteinte à la saturation (Isat). Les barres d’erreur représentent l’écart-type des trois expériences. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Interface de contrôleur de plate-forme piézoélectrique. L’image de gauche montre l’interface qui contrôle le déplacement de l’axe z de la plate-forme piézoélectrique. La restriction est créée en élevant la plate-forme par l’application de tension à trois actionneurs piézoélectriques. L’image de droite montre l’interface du logiciel qui contrôle la microfraiseuse, où il est possible d’observer les coordonnées précises dans les axes x et y où la restriction est usinée à une vitesse de 11 000 tr / min. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Conception de l’appareil. La conception de l’appareil créé à l’aide du logiciel de conception est visible à gauche. La conception se compose de deux canaux connectés, l’un étant le canal principal qui contient la restriction de hauteur de 5 μm et l’autre étant le canal latéral pour la sortie des déchets. Les canaux sont microfraisés avec un taillant d’extrémité de 200 μm. Le panneau de droite montre les paramètres de fabrication. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3 : Paramètres de microfraisage des trous d’entrée et de sortie. (A) Des trous de 1,2 mm de diamètre et 0,65 mm de profondeur (la moitié de l’épaisseur acrylique) sont microfraisés sur la face usinée. Le panneau de droite indique les paramètres de vitesse de déplacement, de rotation et de profondeur du taillant d’extrémité. (B) Des trous de 1,5 mm de diamètre et de 0,7 mm de profondeur sont microfraisés sur la face opposée reliant les trous. Le panneau de droite montre les paramètres de fabrication. Les deux boîtiers sont microbroyés avec un taillant d’extrémité de 800 μm. (C) Les trous d’entrée et de sortie du réactif (à gauche) sont indiqués après usinage des deux faces. Les dimensions de la moitié de plus grand diamètre permettent de coupler le tuyau, tandis que la barrière créée par la moitié de plus petit diamètre empêche le tuyau de bloquer les entrées. Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S4 : Séparation des nanoparticules. À l’aide d’un séparateur magnétique commercial, les nanoparticules de 100 nm peuvent être facilement concentrées pour effectuer les étapes de lavage pendant l’immunoessai. La pastille formée après 15 min est observée dans le cercle rouge. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 1 : Code pour le meulage de surface acrylique. Le code généré est montré avec des instructions pour meuler la surface acrylique de 25 mm x 9 mm le long des axes x et y. La dernière ligne du code positionne le foret directement à la coordonnée où la contrainte sera usinée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de conception supplémentaire 1 : Conception des trous d’entrée et de sortie du microcanal et du réactif. La conception contient deux couches de structures de couleurs différentes (canaux noirs et trous rouges) qui sont usinées sur la face acrylique préalablement broyée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier de conception supplémentaire 2 : Conception des trous du côté opposé. La conception se compose de trous de plus grand diamètre pour la face opposée qui communiquent avec les précédents et servent à fixer les tuyaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Un dispositif microfluidique acrylique pour des dosages immunologiques utilisant des nanoparticules comme immunosupport a été fabriqué à l’aide d’une technique de microbroyage. La méthode de fabrication directe sur le substrat a l’avantage d’éviter l’utilisation d’un moule maître et le temps et les coûts que cela implique. Cependant, il est limité au prototypage rapide et à la fabrication de dispositifs à haut volume.
Ici, nous avons utilisé une plate-forme piézoélectrique accessoire précédemment signalée pour la fraiseuse12. La plate-forme a été fabriquée par impression 3D pour créer des canaux de profondeur variable avec une résolution verticale supérieure à la résolution de 10 μm des microfraiseuses conventionnelles. Nous avons réalisé le broyage de canaux jusqu’à 5 μm de haut qui forment une restriction échelonnée dans le canal microfluidique de 200 μm.
Seuls deux embouts d’extrémité de 200 μm et 800 μm de diamètre sont nécessaires pour la fabrication du dispositif microfluidique, sans qu’il soit nécessaire de changer manuellement les embouts. Le modèle de fraiseuse utilisé effectue automatiquement l’échange de forfaits, ce qui contribue à l’optimisation du temps. De plus, le mode « Z0 sensing » permet de déterminer automatiquement l’origine dans l’axe z avec une grande précision en contactant le capteur et la broche incluse dans la fraiseuse.
La conception de cet appareil est simple, composée uniquement du canal principal interrompu par une restriction échelonnée de 5 μm et d’un canal accessoire qui sert de purge et d’entrée pour les microparticules. Cependant, la haute précision de telles structures est requise pour la restriction de piégeage de microparticules de fer de 7,5 μm de diamètre. Une restriction plus importante permet aux microparticules de passer sans rétention, ce qui empêche leur capture et la formation du piège à microparticules. Inversement, une restriction plus faible augmente considérablement la résistance à l’écoulement du canal et fait sortir les réactifs par le canal latéral au lieu de passer à travers le milieu poreux des microparticules. L’utilisation de microparticules d’un diamètre plus grand pour former le piège magnétique permettrait de faire une plus grande restriction. Par exemple, les particules d’un diamètre de 40 μm nécessitent une restriction échelonnée de ~30 μm. Dans ce cas, il n’est pas nécessaire d’utiliser la plate-forme piézoélectrique et le protocole de fabrication est simplifié. Cependant, un milieu poreux composé de microparticules plus grosses piégerait les nanoparticules différemment et aurait une incidence sur la performance de l’immunoessai; Cependant, il n’est pas clair si ce serait pour le meilleur ou pour le pire. Des travaux sont en cours pour étudier ces fonctionnalités afin d’optimiser l’appareil7.
Pour obtenir la précision requise, un meulage de surface a été effectué pour enlever une couche de 30 μm de la surface acrylique en déplaçant le taillant d’extrémité de 200 μm à travers toute la surface acrylique à 14 500 tr / min. Ce procédé permet d’obtenir une nouvelle origine sur l’axe z sur toute la surface pour une plus grande précision en hauteur. Il est crucial de toujours aligner l’acrylique dans la même position afin que les coordonnées d’origine sur les axes x et y (précédemment réglés) coïncident avec l’un des coins de l’acrylique. De même, il faut s’assurer que l’acrylique est parfaitement assis sur la base; Sinon, la surface risque de ne pas s’user correctement, ce qui entraînera des problèmes lors des étapes d’assemblage suivantes.
Une fois que le programme a terminé le processus de meulage de surface, il amène automatiquement le taillant de fraisage final à une coordonnée spécifique où la contrainte de 5 μm formant le piège sera usinée. Il est essentiel d’empêcher le taillant d’extrémité du broyeur de se soulever de la surface une fois qu’il atteint cette coordonnée. Il est recommandé d’identifier si la microfraiseuse dispose d’une option qui empêche le taillant de fraisage final de se détacher de la surface une fois le processus de meulage terminé. Sinon, il sera nécessaire de repositionner manuellement la fraise à cette coordonnée, ce qui peut entraîner des erreurs de précision de localisation.
Pour usiner la restriction décalée dans l’acrylique, il est nécessaire de surdimensionner de 1,5 μm. Pour une hauteur de 5 μm, la plate-forme piézoélectrique a été élevée à 6,5 μm car le microcanal a tendance à s’aplatir un peu en scellant les canaux. De plus, la longueur finale de la restriction dans l’appareil n’est que de 50 μm; Cependant, il est usiné plus longtemps pour s’assurer qu’il communique avec les deux extrémités du canal principal lorsqu’il est usiné par la suite. En une seule étape, les canaux de 200 μm de profondeur sont fabriqués à l’aide du taillant d’extrémité de 200 μm de diamètre et d’une vitesse de rotation de 11 000 tr/min. Ainsi, l’usinage des canaux de 200 μm de large en acrylique ne prend que quelques secondes.
L’étape suivante dans la fabrication de l’appareil consiste à usiner les trous qui relient les canaux à l’extérieur. Ces trous sont utilisés pour placer les tuyaux qui permettent à l’appareil d’être facilement connecté à la pompe à seringue qui le fait fonctionner. L’un des problèmes rencontrés ici est le placement des tuyaux. Une distance optimale est essentielle pour permettre l’écoulement des réactifs et éviter de créer un joint avec la face de l’acrylique non usiné. Pour surmonter cet inconvénient, les trous sont usinés en deux étapes pour créer une limite où les tuyaux ne dépassent pas la profondeur souhaitée.
Avec le taillant d’extrémité de 800 μm, le motif des trous a été fraisé sur la même face préalablement microfraisée. Des trous sont usinés à l’extrémité de chaque canal avec un diamètre de 1,2 mm et une profondeur de 0,65 mm, soit la moitié de l’épaisseur de l’acrylique. De plus, deux trous sont usinés dans les coins controlatéraux du rectangle, ce qui permet d’aligner l’acrylique face vers le bas sur la plate-forme avec des piliers. Il est important d’utiliser un grattoir ou un cutter pour retirer l’acrylique de la plateforme piézoélectrique afin d’éviter de la casser. Sur le côté opposé de l’acrylique, le diamètre des trous est de 1,5 mm (plus grand que la moitié précédente), ce qui est égal au diamètre du tuyau à fixer. La profondeur est de 0,7 mm et doit être légèrement supérieure à la moitié du trou de la face avant pour s’assurer que les deux trous usinés communiquent entre eux. La barrière formée par le trou de plus petit diamètre empêche le tuyau d’atteindre le fond et de bloquer l’entrée. Cette implémentation dans le protocole améliore considérablement le placement des tuyaux d’entrée et de sortie de fluide sur la puce.
Une étape clé dans la fabrication des appareils est l’étanchéité. Il est nécessaire de sceller la face qui contient les canaux usinés avec un couvercle en acrylique non usiné avec les mêmes dimensions. L’étanchéité des feuilles avec une méthode qui n’approche pas la température de transition vitreuse de l’acrylique permet d’obtenir des canaux sans déformation. Grâce à la méthode de collage utilisée, un film mince de solvant entre les deux feuilles de PMMA dissout un film mince de la surface de la feuille de PMMA, puis s’évapore et reconnecte enfin les monomères des feuilles de PMMA à une température de fonctionnement spécifique.
La méthode largement décrite d’exposition à la vapeur de chloroforme a été utilisée pour sceller ce dispositif acrylique. Comme indiqué précédemment dans la littérature, le chloroforme offre une force de liaison élevée; Cependant, comme le chloroforme attaque l’acrylique de manière très agressive, l’acrylique ne doit jamais entrer en contact direct avec le chloroforme liquide, mais seulement avec le chloroforme gazeux. Il est essentiel de maintenir une distance optimale entre le chloroforme qui s’évapore et l’acrylique. Nous avons créé un système simple utilisant une boîte de Petri en verre, dans laquelle l’acrylique était collé au couvercle. Une plate-forme composée de neuf glissières jointes et attachées au couvercle de la boîte de Petri a été utilisée, sur laquelle les acryliques ont été collés avec du ruban adhésif double face pour réguler la distance. Bien que le procédé de chloroforme gazeux soit très sensible aux changements de température ambiante, la température des boîtes de Petri peut être contrôlée en les plaçant dans une boîte en polystyrène. Le joint d’étanchéité empêche le chloroforme de s’évaporer trop rapidement.
En revanche, il existe d’autres méthodes d’assemblage signalées qui sont plus rapides et ne nécessitent pas d’équipement spécial; Cependant, certains ne conviennent que pour assembler deux feuilles d’acrylique sans usinage. De même, il est difficile de contrôler la force de collage puisque le solvant doit être versé directement entre les deux feuilles d’acrylique18, avec un risque élevé de fusion de structures de petites dimensions telles que la restriction microbroyée de 5 μm.
En utilisant le protocole décrit ici, des joints homogènes ont été obtenus avec une presse artisanale, avec laquelle la pression et la température d’étanchéité ont été contrôlées. Pour la construction de cette presse, un cadre en aluminium et une charnière créent un levier qui amplifie la force mécanique provenant d’un poids de 5 kg à un facteur de 9: 1. Les éléments chauffants transfèrent leur chaleur à des plaques d’aluminium de 2 cm d’épaisseur qui sont en contact avec les pièces acryliques.
Une fois les couches d’acrylique scellées, la dernière étape du processus de fabrication consiste à connecter les tuyaux externes aux entrées et sorties correspondantes de l’appareil. L’adhésif liquide est appliqué à l’extérieur une fois que les tuyaux sont à l’intérieur des trous. Si le diamètre du tuyau est plus petit que les trous, l’adhésif liquide peut pénétrer dans l’appareil, obstruant les canaux.
Les méthodes de fabrication directe sur le substrat, telles que le microfraisage, présentent certains inconvénients, tels que la rugosité de la surface usinée et les structures aux bords mal délimités9. Malgré la rugosité de la surface usinée des canaux, aucun traitement supplémentaire n’est nécessaire pour cet appareil. Un point important à noter à propos de ce protocole de liaison est que le chloroforme permet de diminuer la rugosité des microcanaux broyés en polissant les surfaces exposées au solvant. Le polissage de la surface est si bon que même la qualité optique est améliorée19.
Lorsque le dispositif a été fabriqué, il doit être préparé pour être utilisé dans un dosage immunologique. Le lavage par ultrasons de l’appareil est d’une grande importance pour éliminer tous les débris acryliques indésirables qui pourraient obstruer les canaux et interférer avec le dosage immunologique.
En outre, une attention particulière doit être accordée au blocage correct des canaux pour éviter les interactions non spécifiques et les signaux de bruit de fond élevés. Il a été démontré que le blocage avec 5% de BSA réduit le bruit de liaison non spécifique des anticorps dans les canaux, et 1 h d’incubation est suffisante. Les microparticules de fer sont recouvertes d’une couche de silice-PEG pour empêcher la liaison non spécifique en elles. De plus, les microparticules sont bloquées avec du BSA (en même temps que les canaux) avant de former le piège dans le dispositif. Une incubation nocturne à 4 °C est préférable, ce qui signifie qu’il faut 1 jour pour la fabrication et l’incubation du dispositif avant l’immunoessai. La réduction de la rugosité par le chloroforme et le blocage des surfaces pour réduire les interactions non spécifiques se sont avérés exceptionnellement efficaces, permettant à cette plateforme d’atteindre une limite de détection comparable à ELISA standard dans un essai immunologiquemodèle 4.
La formation du piège à microparticules dans la restriction des microcanaux est un processus manuel. Bien qu’il n’y ait pas de contrôle précis du nombre de microparticules entrantes, nous nous appuyons sur une estimation de la longueur des particules compactées. Il est possible d’agrandir le piège ou d’enlever l’excès facilement. Les particules rejetées s’accumulent dans le canal latéral et n’ont pas besoin d’être retirées de la puce. Il est crucial d’empêcher les microparticules de s’écouler dans le canal principal, car elles peuvent interagir avec les nanoparticules en amont du piège et modifier les mesures du dosage immunitaire.
Comme preuve de concept, nous avons mis en œuvre l’immunodétection d’un complexe formé par la protéine lysozyme conjuguée à des nanoparticules de 100 nm de diamètre par incubation de l’anticorps primaire spécifique et de l’anticorps secondaire marqué HRP correspondant. L’immunocomplexe est formé à l’extérieur du dispositif. Cependant, il est possible d’effectuer l’intégralité du dosage immunologique à l’intérieur du dispositif. Les propriétés magnétiques des nanoparticules permettent une manipulation facile avec un séparateur à aimants permanents en néodyme haute performance. Il suffit de conserver le microtube de réaction pendant 15 min pour permettre aux nanoparticules d’être attirées par l’aimant vers la paroi du microtube, ce qui facilite les étapes de lavage immunologique à l’extérieur du dispositif.
Le point fort de ce dispositif est qu’il est simple, rapide (temps total de dosage de 40 min 4 contre4-6 h pour ELISA), et bon marché (comparable au prix d’un test de flux latéral). Toutes ces caractéristiques font de ce profil d’appareil un bon candidat pour le développement de POCT. En outre, l’appareil peut détecter quantitativement des concentrations d’analytes similaires à l’étalon-or ELISA4, ce qui est extrêmement précieux pour les études épidémiologiques et la prise de décision en santé publique. Habituellement, les systèmes microfluidiques pour les immunoessais ont de bonnes limites de détection mais des temps d’essai longs, ou ils ont des temps d’essai courts mais des limites de détection sous-optimales4. En combinant des nanoparticules magnétiques comme support immunitaire et des enzymes fluorogéniques pour la détection, cette plateforme a un temps de dosage court et une bonne limite de détection (dans des travaux précédents, nous avons trouvé une limite de détection de 8 pg/mL en utilisant la biotine comme antigène, ce qui est comparable à un ELISA4 standard). Enfin, cette technologie présente un avantage important par rapport aux tests de flux latéraux : la possibilité de donner des résultats quantitatifs et pas seulement qualitatifs (« oui » ou « non »). Contrairement à la plupart des autres systèmes microfluidiques développés dans les laboratoires dans lesquels des matériaux rares sont utilisés, ce système est fabriqué en acrylique (PMMA), un thermoplastique à faible coût hautement compatible avec la production de masse d’appareils de diagnostic médical.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Conacyt, Mexique dans le cadre de la subvention 312231 du « Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación », et par l’AMEXCID et le Ministère mexicain des relations extérieures (SRE) sous la subvention « Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2 ». JAHO remercie Conacyt Mexico pour sa bourse de doctorat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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