Summary
La microfluídica es una poderosa herramienta para el desarrollo de pruebas diagnósticas. Sin embargo, a menudo se requieren equipos y materiales costosos, así como técnicas laboriosas de fabricación y manipulación. Aquí, detallamos el protocolo de fabricación de un dispositivo microfluídico acrílico para inmunoensayos magnéticos basados en micro y nanopartículas en un entorno de bajo costo y fácil de usar.
Abstract
Los sistemas microfluídicos han mejorado enormemente las técnicas de inmunoensayo. Sin embargo, muchas técnicas de microfabricación requieren equipos especializados, costosos o complicados, lo que hace que la fabricación sea costosa e incompatible con la producción en masa, que es una de las condiciones previas más importantes para que las pruebas en el punto de atención (POCT) se adopten en entornos de bajos recursos. Este trabajo describe el proceso de fabricación de un dispositivo de acrílico (polimetilmetacrilato, PMMA) para pruebas de inmunoensayo enzimático conjugado con nanopartículas utilizando la técnica de microfresado de control numérico computarizado (CNC). El funcionamiento del dispositivo microfluídico se demuestra mediante la realización de un inmunoensayo para detectar un anticuerpo comercial utilizando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo integra una restricción física escalonada de solo 5 μm de altura, utilizada para capturar micropartículas magnéticas que forman una trampa magnética colocando un imán externo. De esta manera, la fuerza magnética sobre el inmunosoporte de las nanopartículas conjugadas es suficiente para capturarlas y resistir el arrastre de flujo. Este dispositivo microfluídico es particularmente adecuado para la producción en masa de bajo costo sin pérdida de precisión para el rendimiento del inmunoensayo.
Introduction
En los últimos años, la microfluídica ha desempeñado un papel importante en las técnicas de inmunoensayo1. La tecnología de miniaturización tiene muchas ventajas sobresalientes en comparación con los inmunoensayos tradicionales, como la reducción del consumo de muestras y reactivos, tiempos de incubación más cortos, intercambio eficiente de soluciones y mayor integración y automatización2.
Además, los sistemas microfluídicos en inmunoensayos, en asociación con nanopartículas magnéticas como inmunosoporte, reducen considerablemente los tiempos de incubación, logrando una alta sensibilidad de detección debido al aumento de la relación superficie-volumen3. El movimiento browniano de las partículas mejora la cinética de reacción durante la formación del complejo antígeno-anticuerpo 4,5. Además, las propiedades magnéticas de las nanopartículas proporcionan la versatilidad para ser integradas en diferentes configuraciones de dispositivos microfluídicos, lo que las convierte en un candidato ideal para la señalización y captura de moléculas en sistemas de biodetección miniaturizados en chip5. Sin embargo, las fuerzas magnéticas son significativamente más débiles que las fuerzas de arrastre a escala nanométrica debido a la alta relación superficie-volumen6. Por lo tanto, la captura de nanopartículas para pasos cruciales de inmunoensayo, como el lavado y la detección, puede ser un desafío, y un imán convencional es insuficiente4.
Una forma eficiente de manipular las nanopartículas es el uso de una trampa magnética microfluídica formada por micropartículas de hierro, que se empaquetan en una estructura microfluídica3. Por lo tanto, cuando un imán externo se acerca, se crea una interacción compleja dentro del medio poroso magnetizado entre las fuerzas magnéticas y de flujo. La fuerza magnética que actúa sobre las nanopartículas es lo suficientemente fuerte como para capturarlas y resistir el arrastre de flujo 3,4,7. Este enfoque requiere técnicas de microfabricación que logren resoluciones del orden de unos pocos micrómetros para generar estructuras micrométricas que retengan las micropartículas.
Las técnicas actuales de microfabricación permiten la fabricación de alta resolución de estructuras desde unas pocas micras hasta cientos de nanómetros8. Sin embargo, muchas de estas técnicas requieren equipos especializados, costosos o complicados. Una de las principales dificultades es la necesidad de una sala limpia para la fabricación de moldes, que sigue siendo costosa y requiere mucho tiempo 8,9. Recientemente, los ingenieros microfluídicos han superado este inconveniente mediante el desarrollo de una variedad de métodos de fabricación alternativos, con varias ventajas, como costos reducidos, tiempos de respuesta más rápidos, materiales y herramientas más baratos y una mayor funcionalidad8. De esta manera, el desarrollo de nuevas técnicas de microfabricación trajo métodos de bajo costo, no de sala limpia, que logran resoluciones tan bajas como 10 μm8. El modelado se puede utilizar directamente sobre un sustrato sin generar un patrón de moldeo costoso, evitando así un proceso que consume mucho tiempo. Los métodos de fabricación directa incluyen fresado CNC, ablación láser y litografía directa8. Todos estos métodos son adecuados para producir canales de alta relación de aspecto en una amplia gama de materiales, independientemente de su dureza9, lo que permite geometrías, comportamientos físicos y cualidades nuevas y ventajosas en dispositivos microfluídicos8.
El microfresado CNC crea estructuras a microescala utilizando herramientas de corte que eliminan el material a granel de un sustrato y es un método de fabricación eficaz para dispositivos microfluídicos10,11. La técnica de microfresado puede ser útil en aplicaciones microfluídicas para crear microcanales y características directamente en la superficie de trabajo, ofreciendo una ventaja clave: una pieza de trabajo se puede fabricar en poco tiempo (menos de 30 min), reduciendo significativamente el tiempo de respuesta desde el diseño hasta el prototipo12. Además, la amplia disponibilidad de accesorios de corte de diferentes materiales, tamaños y formas hace de las fresadoras CNC una herramienta adecuada que ha permitido la fabricación de diferentes características en muchos tipos de materiales desechables de bajo costo13.
Entre todos los materiales comúnmente utilizados en micromolienda, los termoplásticos siguen siendo una opción líder debido a sus muchas propiedades favorables y compatibilidad con aplicaciones biológicas10,14. Los termoplásticos son un sustrato atractivo para los sistemas microfluídicos debido a sus importantes ventajas para el desarrollo de sistemas analíticos desechables de bajo costo9. Además, estos materiales son altamente susceptibles a procesos de fabricación de alto volumen, lo que los hace adecuados para la comercialización y la producción en masa. Por estas razones, los termoplásticos como el PMMA han sido considerados materiales confiables y robustos desde los primeros años de la microfluídica10. Se han descrito diferentes protocolos para fabricar canales cerrados en termoplásticos, como la unión con solventes15, la unión térmica 16 y la unión de tratamiento superficial ultravioleta (UV) / ozono17.
En muchos casos, la resolución de posicionamiento alcanzada con las microfresadoras convencionales no es suficiente para algunas aplicaciones microfluídicas que requieren estructuras menores de 10 μm. La micromolienda de gama alta tiene suficiente resolución. Desafortunadamente, debido a los altos precios, su uso está limitado a un puñado de usuarios12. Anteriormente, nuestro grupo de investigación informó de la fabricación y manipulación de una herramienta de bajo coste que permite mecanizar estructuras de menos de 10 μm, superando la resolución de las fresadoras convencionales12. El accesorio es una plataforma fabricada mediante impresión 3D con electrónica simple, que contiene tres actuadores piezoeléctricos. La superficie contiene juntas en forma de bisagra que permiten levantarla cuando los elementos piezoeléctricos actúan simultáneamente. El desplazamiento del eje Z se puede controlar con una resolución de 500 nm y una precisión de ±1,5 μm12.
Este artículo presenta los pasos del proceso de fabricación de un dispositivo acrílico (PMMA) a través de una técnica de microfresado. El diseño del chip consiste en un canal principal de 200 μm de ancho y 200 μm de alto y un canal lateral con las mismas dimensiones para purgar el flujo de los reactivos. En la región central, el canal está interrumpido por una restricción física de solo 5 μm de altura, fabricada con la plataforma piezoeléctrica impresa en 3D hecha por este grupo12, para capturar micropartículas magnéticas que forman una trampa magnética para nanopartículas colocando un imán externo. Mostramos el funcionamiento del dispositivo microfluídico realizando un inmunoensayo para detectar un anticuerpo comercial utilizando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo combina diferentes características que lo hacen único4: el uso de nanopartículas magnéticas como soporte inmunológico reduce el tiempo total de prueba de horas a minutos; el uso de una enzima fluorogénica para la detección permite límites de detección que son comparables a los de los ensayos estándar de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA); y el uso de un termoplástico como material de fabricación lo hace compatible con la producción en masa, lo que no fue el caso de las trampas magnéticas de nanopartículas microfluídicasanteriores 3, y lo convierte en un excelente candidato para desarrollar POCT.
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Protocol
1. Micromolienda
- Rectificado de superficies
- Encienda la microfresadora y el controlador piezoeléctrico. Inicie su respectivo software de control12.
- Seleccione las brocas de fresado final requeridas (diámetros de 200 μm y 800 μm). Colóquelos en el compartimento apropiado de la fresadora (Figura 1).
- Corte rectángulos de 9 mm x 25 mm de PMMA de 1,3 mm de espesor con la broca final de 800 μm. Fije uno de estos rectángulos cuidadosamente con cinta adhesiva de doble cara a la plataforma piezoeléctrica (Figura 2).
NOTA: Asegúrese de colocar siempre el rectángulo acrílico en la misma posición para que una de las esquinas coincida con las coordenadas de origen en los ejes x e y para el mecanizado. - Conecte y coloque el sensor z en la superficie del rectángulo de PMMA. Seleccione el pin de detección y muévalo sobre la superficie del sensor. Baje el pin manualmente sin entrar en contacto con el sensor. Active el modo de detección Z0 (Figura 3).
- Seleccione la broca de fresado final de 200 μm y muévala al origen x, y. Retire el sensor z. Baje la broca con cuidado sin entrar en contacto con la superficie acrílica.
- Gire la broca final de 200 μm a 14.500 rpm. Baje lentamente hasta la coordenada de origen en el eje z (z = 0). Restablezca el eje z 30 μm por debajo del origen. Establezca esta coordenada como el nuevo origen z.
NOTA: Nunca baje el bit si no está girando. De lo contrario, corre el riesgo de romperse. - Haga clic en el botón Cortar en el software de la microfresadora para activar el panel Cortar. Haga clic en el botón Agregar y seleccione el archivo .txt (Archivo de codificación suplementario 1) con un código creado previamente para la molienda de la superficie acrílica. Haga clic en el botón Salida para iniciar el proceso.
- Lleve la broca de extremo a la coordenada donde se mecanizará la restricción. Evite que la broca de extremo se levante de la superficie del suelo una vez que se alcanza esta coordenada haciendo clic en el botón Pausa . De lo contrario, vuelva a colocar manualmente la broca de extremo en esta coordenada (Figura 4A).
- Fresado de la restricción de 5 μm
- Ajuste la velocidad de rotación de la broca final a 11.000 rpm. Elevar la plataforma 6,5 μm con la interfaz de la plataforma piezoeléctrica (Figura suplementaria S1). Mueva la broca final a lo largo del eje y 500 μm. Devuelva la plataforma piezoeléctrica a su valor inicial en el eje z con la interfaz de control.
- Fresado de microcanales
- Abra el archivo de diseño creado anteriormente desde el software de diseño (Archivo de diseño complementario 1). Haga clic en el botón Imprimir . Acceda al menú Propiedades y haga clic en la ventana de color correspondiente a la capa que contiene el diseño a mecanizar. Defina los parámetros de fabricación en el panel Herramientas como se especifica en la figura suplementaria S2.
- Desactive las capas no deseadas seleccionando la opción Ninguna en el menú desplegable Herramientas .
- Fresado de agujeros
- Cambie a la broca de extremo de 800 μm. Active la capa de diseño de los orificios de 1,2 mm de diámetro haciendo clic en la ventana de color correspondiente.
- Repita el paso 1.3.2., pero en este caso, defina los parámetros de fabricación correspondientes como se describe en la figura suplementaria S3A para los orificios.
NOTA: La profundidad de los orificios mecanizados es la mitad del espesor acrílico. - Mecanizar dos orificios adicionales en las esquinas contralaterales del rectángulo para la alineación del acrílico de manera invertida en una nueva plataforma (Figura 4B). Despegue el rectángulo acrílico de la plataforma piezoeléctrica. Voltea el acrílico y pégalo con cinta adhesiva de doble cara sobre el adaptador con los pilares mecanizados (Figura 4C, D).
- Abra el archivo con el diseño de los orificios para la cara opuesta del software de diseño (Archivo de diseño complementario 2). Establezca los parámetros de fabricación correspondientes como se describe en la figura suplementaria S3B. Fresar la mitad restante de los orificios de entrada y salida del reactivo con un diámetro de 1,5 mm y una profundidad de 0,7 mm (Figura suplementaria S3C).
Figura 1: Colocación de la broca final. (A) Las brocas de la fresa final de 200 μm y 800 μm se colocan y fijan mediante un tornillo al soporte de acero. (B) Cada broca de extremo se coloca en el compartimento específico de la microfresadora para su selección automática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Plataforma piezoeléctrica. La plataforma está fabricada mediante impresión 3D y consta de dos bases hexagonales unidas por bisagras que permiten un desplazamiento fino en el eje z controlado por tres actuadores piezoeléctricos. También se observa un adaptador de acrílico, en el que se adjunta el rectángulo de PMMA, y que permite ajustar la esquina de alineación de las coordenadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Calibración del eje Z. Se detallan los pasos de la calibración del eje z. (A) El sensor z incluye un cable que se conecta a la microfresadora. (B) El sensor se coloca directamente sobre la superficie a mecanizar. (C) El pasador de detección consiste en una barra de metal colocada en un compartimento especial junto a las brocas de la fresadora final. (D) Cuando ambos accesorios entran en contacto, la microfresadora calcula automáticamente la coordenada de origen en el eje z. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Superficie acrílica rectificada . (A) La broca de extremo de 200 μm de diámetro barre toda la superficie del rectángulo acrílico, eliminando una capa de aproximadamente 30 μm de altura. (B) La imagen muestra las diferentes estructuras fresadas en la cara del acrílico previamente rectificado. Se observan canales y orificios para la entrada y salida del reactivo. La restricción de 5 μm no se puede ver a simple vista. (C) Superficie microfresada con orificios de alineación y adaptador con pilares de alineación en esquinas opuestas. (D) El acrílico está alineado boca abajo en el adaptador con pilares, en los que encajan los orificios de alineación. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Sellado del canal
- Limpieza acrílica
- Retire el rectángulo acrílico de la plataforma adaptadora del pilar. Tome otro rectángulo de acrílico sin mecanizar. Lave ambas láminas de acrílico con alcohol isopropílico (IPA) y enjuague con agua destilada. Use guantes y evite el contacto con IPA.
- Sumerja el acrílico en un baño ultrasónico durante 10 minutos (Figura 5A, B).
- Exposición al cloroformo gaseoso
- Secar ambas láminas de acrílico perfectamente. Pegue con cinta adhesiva al interior de una tapa de placa de Petri de vidrio con cinta adhesiva de doble cara. Asegúrese de colocar el lado del canal mecanizado expuesto (Figura 5C). Use guantes y evite tocar la superficie acrílica directamente.
- Coloque la base de la placa de Petri de vidrio dentro de una placa de Petri de vidrio más grande (Figura 5D). Vierta 1 ml de cloroformo en la base de la placa de Petri. Coloque rápidamente la tapa con las láminas de acrílico unidas al lado interior.
- Agregue inmediatamente agua destilada a la base de la placa de Petri más grande hasta el nivel de la tapa de la placa de Petri. Permitir la exposición del acrílico al gas cloroformo durante 1 min (Figura 5E).
NOTA: Tenga en cuenta que un tiempo de exposición más largo al cloroformo atacará la superficie acrílica, y la restricción de 5 μm se derretirá, modificando su altura, o desaparecerá por completo. - Incline la placa de Petri para romper el sello de agua creado. Retire inmediatamente el acrílico del cloroformo descubriendo la placa de Petri. Tenga cuidado de no derramar el agua.
PRECAUCIÓN: Haga este proceso en la campana extractora y use guantes ya que el cloroformo es altamente tóxico.
- Adhesión por prensado y calentamiento
- Despegue ambas placas de acrílico de la cinta de doble cara.
- Alinee ambos acrílicos con los lados que fueron expuestos al cloroformo gaseoso cara a cara, formando un sándwich. Colocar los acrílicos en la prensa a 18 kgf/cm2 y a una temperatura de 90 °C (Figura 5F,G).
NOTA: Se recomienda colocar el acrílico alineado longitudinalmente y cambiar su alineación después de 2 min para un mejor sellado. Si, después de este tiempo, el sello es insuficiente, vuelva a colocarlo en la prensa por intervalos de no más de 1 minuto. Usando el estereoscopio, verifique el estado de los canales y la restricción. Tenga en cuenta que, en caso de exceder el tiempo de prensado, existe el riesgo de eliminar la restricción.
- Accesorio de manguera
- Corte longitudes de manguera de 2-3 cm. Haz un corte completamente recto. Conecte cada manguera a los orificios del dispositivo con adhesivo líquido de secado instantáneo (Figura 6A). Evite que el adhesivo entre en el chip.
Figura 5: Proceso de sellado del dispositivo. (A) Cada una de las láminas de acrílico se coloca en una bolsa resellable con agua destilada y se sumerge en el baño ultrasónico. (B) La imagen de la izquierda muestra los canales justo después de la fabricación, y la imagen de la derecha muestra el mismo dispositivo después del lavado con IPA y el baño ultrasónico, que elimina todas las impurezas y residuos acrílicos del microcanal. Se observan los bordes de la restricción que interrumpe el canal central de 200 μm, lo que confirma el exitoso proceso de fresado. Barras de escala = 500 μm. (C) Ambos acrílicos se secan y se adhieren a la plataforma de vidrio en la tapa. (D) La base de la placa de Petri se coloca dentro de otra placa de mayor diámetro. (E) Al cerrar la placa de Petri, el sello de agua evita que el cloroformo gaseoso se escape. (F) Descripción de los elementos de la palanca con un peso de 5 kg. (G) Imagen de la palanca abierta, mostrando en rojo la zona donde se coloca el acrílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Preparación del dispositivo
- Llene los canales con agua destilada usando una jeringa. Asegúrese de que no haya fugas o resistencia al flujo. Sumerja el dispositivo en un baño ultrasónico durante 10 minutos para eliminar cualquier resto de acrílico, adhesivo o material no deseado dentro de los canales.
- Vacíe el agua dentro de los canales del dispositivo. Utilice una jeringa para introducir una solución bloqueante preparada con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% (p/v) diluida en solución salina tamponada con Tris (TBS) y previamente filtrada a través de un filtro de jeringa de polietersulfona (PES) de 0,2 μm.
- Preparar una suspensión de micropartículas de hierro de 7,5 μm de diámetro en BSA al 5%.
NOTA: Las micropartículas son previamente funcionalizadas con una capa de sílice-polietilenglicol (PEG) que confiere resistencia a la absorción de proteínas4. - Incubar el chip y la suspensión de micropartículas con la solución de bloqueo durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Si es posible, dejar bloquear durante la noche a 4 °C.
4. Formación de trampas de micropartículas
- Inserte las micropartículas en el chip con una aguja de jeringa a través de la manguera de salida del canal lateral. Coloque el chip verticalmente y permita que las micropartículas fluyan bajo el efecto de la gravedad a través del canal lateral. Gire el chip 180° en dos pasos de 90° y permita que las micropartículas se dirijan y compacten a la restricción de 5 μm.
- Elimine el exceso de micropartículas girando por gravedad 45° hacia el canal lateral.
- Mantenga el dispositivo en posición vertical para evitar deshacer la trampa de micropartículas. Consulte la Figura 6B para obtener un resumen del proceso de formación de trampas de micropartículas.
5. Inmunoensayo
- Preparación de nanopartículas
- Tomar 2 μL de la suspensión de nanopartículas de 100 nm previamente conjugadas con lisozima (modelo de antígeno). Añádalo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 100 μL de solución de bloqueo. Incubar durante la noche a 4 °C.
- Añadir 150 μL de tampón de lavado (1x TBS, 0,05% Tween 20).
- Coloque el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un separador magnético. Mantener durante 15 min para permitir la separación de las nanopartículas (Figura Suplementaria S4).
NOTA: El volumen mínimo para el separador magnético es de 200 μL. Evite usar un volumen más pequeño. - Retire el líquido del tubo con una micropipeta. Evite el contacto con la pared del tubo donde se formó el pellet de nanopartículas.
- Añadir 250 μL de tampón de lavado fresco. Mantenga el tubo bajo agitación durante 15 min.
- Repita los pasos 5.1.3.-5.1.5. 2 veces más, agitando solo durante 5 min.
- Agregue la concentración deseada de anticuerpo antilisozima primario (consulte la Tabla de materiales). Ajustar a un volumen final de 100 μL en diluyente de anticuerpos (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- Incubar durante 15 min a 37 °C. Siga agitando durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente.
- Repita los pasos de lavado 5.1.2.-5.1.6.
- Añadir 100 μL de diluyente de anticuerpos. Añadir el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP-AbII) (véase la Tabla de materiales) con una dilución de 1:500.
- Repita los pasos de lavado 5.1.2.-5.1.6.
- Mantener las nanopartículas en un volumen final de 50 μL de diluyente de anticuerpos.
6. Montaje experimental
- Llene las dos jeringas de vidrio de 100 μL con agua, conecte una manguera de 6,5 cm de largo a cada jeringa, inserte un alfiler de metal en el extremo de la manguera y coloque ambas jeringas en la bomba de jeringa controlada por computadora.
- Selle todas las mangueras del dispositivo acrílico con calor.
- Corte la manguera de entrada y manténgala solo unos pocos milímetros. Llene la aguja dispensadora con un tampón de lavado e insértela en la manguera de corte. Deje que la solución gotee antes de conectar la aguja al dispositivo para evitar el acceso de aire al dispositivo.
- Corte la manguera de salida del canal lateral. Conéctelo a la bomba de la jeringa. A continuación, realice el mismo procedimiento para la manguera de salida del canal principal.
NOTA: Es clave realizar los pasos 6.3.-6.4. en este orden para evitar desempaquetar la trampa de micropartículas. Si es posible, verifique el estado de la trampa durante estos pasos con la ayuda de una lupa. - Coloque un portaobjetos de vidrio en la plataforma del microscopio. Fije el imán a la diapositiva con cinta adhesiva de doble cara y coloque un pequeño trozo de cinta adhesiva en cada lado para fijar los bordes del chip al vidrio.
- Ajuste un caudal de 50 μL/h a través de las pestañas Caudal y Unidades del controlador de la bomba de jeringa. Seleccione el modo de retirada y haga clic en el botón Inicio para activar el flujo del búfer de lavado.
- Con cuidado, acerque el dispositivo hacia la diapositiva con el imán de manera horizontal para que el área del chip que contiene la trampa entre en contacto con el imán.
- Pegue los bordes del dispositivo al vidrio con cinta adhesiva de doble cara para evitar el movimiento. Evite obstruir la trayectoria óptica para la microscopía (Figura 6C).
Figura 6: Configuración final del dispositivo . (A) Dispositivo de acrílico con las mangueras conectadas a las entradas y salidas correspondientes. La escala muestra las dimensiones del dispositivo en centímetros. (B) Protocolo para la formación de la trampa de micropartículas. Las micropartículas fluyen a través del canal por gravedad cuando el dispositivo se coloca en posición vertical. Las micropartículas se concentran en la restricción de 5 μm. El exceso de micropartículas se elimina fácilmente girando el chip a través del canal lateral. El chip se mantiene vertical para preservar la trampa antes del inmunoensayo. (C) Dispositivo microfluídico montado en un portaobjetos de vidrio que contiene el imán, en la etapa del microscopio de fluorescencia invertida. Se observa la aguja dispensadora a través de la cual se agregan los reactivos, así como las mangueras de salida que se conectan a una bomba de jeringa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
7. Inmunodetección
- Mantenga el tampón de lavado fluyendo durante 10 min a 50 μL/h para eliminar el exceso de BSA.
- Retire el tampón de lavado restante de la aguja dispensadora con una micropipeta. Añadir 50 μL de la suspensión de nanopartículas.
- Hacer fluir la suspensión de nanopartículas durante 7 min a un caudal de 100 μL/h. Posteriormente, cambie el caudal a 50 μL / h y el flujo durante otros 15 minutos.
- Cambie la aguja dispensadora. Hacer fluir el tampón de lavado durante 10 min a 50 μL/h. Prepare el sustrato fluorogénico de acuerdo con las especificaciones del fabricante durante el paso de lavado.
- Retire el tampón de lavado restante de la aguja dispensadora con una micropipeta. Añadir 100 μL del sustrato fluorogénico (ver la Tabla de materiales). Hacer fluir el sustrato fluorogénico durante 6 min a 50 μL/h.
- Ajuste los parámetros de medición del caudal (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h y 10 μL/h ) y el tiempo (6 min) en las pestañas correspondientes Caudal y Ajustar temporizador de la interfaz que controlan la bomba de jeringa. Asegúrese de seleccionar el modo de retirada para cada una de las mediciones que se realizarán.
- Establezca una pestaña de caudal adicional a 50 μL/h y ajuste el temporizador a 3 min para el paso de lavado.
- Encienda la fluorescencia del microscopio 15 s antes de que el sustrato a 50 μL/h se detenga. Inicie la captura de imágenes con el software de la cámara del microscopio 10 s antes de que el sustrato se detenga con un tiempo de exposición de 1.000 milisegundos. Realice imágenes durante 6 minutos a 1 fotograma/s (FPS).
- Haga clic en el botón Inicio del parámetro de caudal deseado inmediatamente después de que se detenga el caudal de lavado del sustrato a 50 μL/h. Haga clic en el botón Inicio del flujo de lavado (50 μL/h) inmediatamente después de que se detenga el flujo de medición seleccionado.
- Detenga la captura de imágenes y apague la fluorescencia del microscopio para evitar el fotoblanqueo del sustrato.
- Repita los pasos 7.8.-7.10. para cada caudal de medición utilizado.
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Representative Results
Se logró establecer un protocolo de fabricación altamente reproducible que mejora la resolución de la técnica convencional de micromolienda. Usando este protocolo, se logra la fabricación de un canal tan pequeño como 5 μm de altura que opera como una restricción escalonada en un canal de 200 μm de altura. El diseño simple de la restricción escalonada captura micropartículas de hierro de 7,5 μm de diámetro que, cuando se compactan en el microcanal, permiten la creación de una trampa magnética cuando un imán externo se acerca al dispositivo. Este dispositivo permite realizar inmunoensayos utilizando nanopartículas conjugadas con el analito de interés como soporte inmunológico. En este trabajo, se realizaron inmunoensayos indirectos no competitivos con detección basada en anticuerpos marcados con enzimas. El antígeno modelo (Ag) fue la proteína lisozima conjugada a nanopartículas (NPs) de 100 nm de diámetro. Se utilizó la antilisozima de conejo IgG como anticuerpo primario (AbI) y la detección se realizó mediante el uso de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante de conejo (HRP-AbII).
La detección se realizó correlacionando el cambio en la intensidad de la señal de fluorescencia obtenida después de la interacción del HRP-AbII con un sustrato fluorogénico al pasar a través de la trampa con nanopartículas atrapadas. Para realizar las mediciones, se determinó una región antes y una región después de la trampa. La figura 7A-D muestra el aumento en la intensidad de fluorescencia para diferentes concentraciones de antilisozima AbI: 0 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL y 1.000 ng/mL para un caudal de sustrato fluorogénico dado (3 μL/h). Esto muestra que el cambio en la fluorescencia del sustrato es directamente proporcional a la concentración de AbI utilizada.
Figura 7: Áreas de medición de fluorescencia. Las mediciones de fluorescencia se muestran para diferentes concentraciones de anticuerpos antilisozima primarios utilizados: (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL, (C) 100 ng/mL, y (D) 1.000 ng/mL. Los círculos azules muestran el área de medición de fluorescencia antes y después de la trampa formada por la restricción de altura de 5 μm, donde el sustrato reacciona con el anticuerpo secundario conjugado con HRP. Todas las imágenes corresponden a un flujo de 3 μL/h. Abreviatura: HRP = peroxidasa de rábano picante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Sin embargo, para una concentración de AbI dada, el nivel de fluorescencia obtenido es una función del caudal utilizado para el sustrato fluorogénico. Por lo tanto, la capacidad de conversión de este sustrato por la enzima HRP es inversamente proporcional al caudal. Se evaluaron diferentes caudales de sustrato de 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h y 10 μL/h. Para cada experimento, se obtuvieron las curvas correspondientes a la diferencia de fluorescencia dada por el sustrato antes y después de pasar por la trampa magnética. La figura 8A-C muestra las curvas obtenidas para una concentración de 100 ng/mL para tres caudales diferentes: (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h y (C) 1 μL/h. Dependiendo del caudal utilizado, la capacidad de conversión del sustrato por el anticuerpo secundario conjugado HRP colocado en la trampa magnética varía. La curva verde representa la intensidad de fluorescencia del sustrato después de la conversión por el HRP ubicado en la trampa. Se puede observar que, a flujos más altos, el nivel máximo de fluorescencia obtenido decae. La curva roja representa la fluorescencia basal antes de que el sustrato alcance la trampa. La medición de la fluorescencia del sustrato en esta área de la trampa permanece constante, y su valor depende del grado de interacciones no específicas si no hay un bloqueo eficiente de la superficie del canal. Calculamos la diferencia entre ambas curvas, representada por la curva azul.
Figura 8: Curvas de fluorescencia. Gráficos obtenidos a una concentración de 100 ng/mL de anticuerpos primarios y caudales de (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h y (C) 1 μL/h. Las tres curvas de color representan la fluorescencia medida antes de la trampa (curva roja) y después de la trampa (curva verde) y la diferencia entre las dos (curva azul) a lo largo del tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 9A-C integra las curvas de diferencia de fluorescencia medidas antes y después de la inmunorreacción para los diferentes flujos para concentraciones de AbI de (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL y (C) 1.000 ng/mL. La medición de un caudal de 0 μL/h indica la medición de la inmunorreacción en condiciones estáticas en las que rige la difusión. Para una concentración de 1.000 ng/mL, la fluorescencia se satura para todos los flujos evaluados. Sin embargo, el patrón escalonado de fluorescencia en los diferentes flujos se debe a la difusión del sustrato, que reacciona con una tasa de conversión tan alta que supera los flujos más pequeños. Por lo tanto, hay un retorno de esta fluorescencia a la zona aguas arriba de la trampa.
Figura 9: Diferencias de fluorescencia. Curvas resumidas de las diferencias de fluorescencia (después-antes) para los diferentes flujos utilizados en (A) 0 ng/mL, (B) 10 ng/mL y (C) 1.000 ng/mL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las mediciones obtenidas con este dispositivo permiten generar una curva de calibración estándar para inmunoensayos realizados con lisozima como antígeno modelo. La figura 10 muestra la curva de calibración obtenida a partir de los valores máximos de las diferencias entre la fluorescencia antes y después de la inmunorreacción realizada en la trampa magnética. Este protocolo permite la detección del anticuerpo antilisozima primario con concentraciones del orden de nanogramos por mililitro utilizando flujos entre 1 μL/h y 10 μL/h. La alta variabilidad y los altos niveles de fluorescencia a 1 μL/h sugieren que la reactividad del inmunocomplejo es tal que esta velocidad no favorece el flujo del sustrato que reacciona y tiende a acumularse justo después de la trampa, además de que la resistencia del dispositivo reduce la resolución del dispositivo para este caudal.
Figura 10: Curva de calibración. El gráfico muestra el valor máximo de las diferencias en la intensidad de fluorescencia de las curvas obtenidas con respecto a la concentración de anticuerpo primario utilizado (AB1) para cada caudal. I/Isat corresponde a la relación del valor de fluorescencia obtenido para cada medición de fluorescencia (I), normalizado con respecto al valor máximo de fluorescencia alcanzado en el momento de la saturación (Isat). Las barras de error representan la desviación estándar de los tres experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Interfaz de controlador de plataforma piezoeléctrica. La imagen de la izquierda muestra la interfaz que controla el desplazamiento del eje z de la plataforma piezoeléctrica. La restricción se crea elevando la plataforma mediante la aplicación de voltaje a tres actuadores piezoeléctricos. La imagen de la derecha muestra la interfaz del software que controla la microfresadora, donde es posible observar las coordenadas precisas en los ejes x e y donde se mecaniza la restricción a una velocidad de 11.000 rpm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Diseño del dispositivo. El diseño del dispositivo creado con el software de diseño se ve a la izquierda. El diseño consta de dos canales conectados, uno es el canal principal que contiene la restricción de altura de 5 μm y el otro es el canal lateral para la salida de residuos. Los canales se microfresan con una broca final de 200 μm. El panel de la derecha muestra los parámetros de fabricación. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Parámetros de microfresado de orificios de entrada y salida. (A) Los orificios de 1,2 mm de diámetro y 0,65 mm de profundidad (la mitad del grosor acrílico) se microfresan en la cara mecanizada. El panel de la derecha muestra la velocidad de desplazamiento, la rotación y los parámetros de profundidad de la broca final. (B) Los orificios de 1,5 mm de diámetro y 0,7 mm de profundidad se microfresan en la cara opuesta que conecta los orificios. El panel de la derecha muestra los parámetros de fabricación. Ambas cajas están microfresadas con una broca final de 800 μm. (C) Los orificios de entrada (derecha) y salida (izquierda) del reactivo se muestran después de mecanizar ambas caras. Las dimensiones de la mitad de diámetro más grande permiten que la manguera se acople, mientras que la barrera creada por la mitad de diámetro más pequeña evita que la manguera bloquee las entradas. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S4: Separación de nanopartículas. Usando un separador magnético comercial, las nanopartículas de 100 nm se pueden concentrar fácilmente para realizar los pasos de lavado durante el inmunoensayo. El pellet formado después de 15 min se observa en el círculo rojo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 1: Código para el rectificado de superficies acrílicas. El código generado se muestra con instrucciones para moler la superficie acrílica de 25 mm x 9 mm a lo largo de los ejes x e y. La última línea del código coloca la broca justo en la coordenada donde se mecanizará la restricción. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de diseño complementario 1: Diseño de los orificios de entrada y salida de microcanales y reactivos. El diseño contiene dos capas de estructuras de diferentes colores (canales negros y agujeros rojos) que se mecanizan en la cara de acrílico previamente molida. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de diseño suplementario 2: Diseño de los orificios en el lado opuesto. El diseño consiste en orificios de mayor diámetro para la cara opuesta que comunican con los anteriores y sirven para fijar las mangueras. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Se fabricó un dispositivo microfluídico acrílico para inmunoensayos utilizando nanopartículas como inmunosoporte utilizando una técnica de micromolienda. El método de fabricación directa sobre el sustrato tiene la ventaja de evitar el uso de un molde maestro y el tiempo y costes que ello implica. Sin embargo, se limita a la creación rápida de prototipos y la fabricación de dispositivos de alto volumen.
Aquí, utilizamos una plataforma piezoeléctrica accesoria previamente informada para la fresadora12. La plataforma se fabricó mediante impresión 3D para crear canales de profundidad variable con una resolución vertical mejor que la resolución de 10 μm de las microfresadoras convencionales. Logramos el fresado de canales de hasta 5 μm de altura que forman una restricción escalonada en el canal microfluídico de 200 μm.
Solo se requieren dos brocas de fresado de 200 μm y 800 μm de diámetro para la fabricación del dispositivo microfluídico, sin necesidad de cambiar manualmente las brocas. El modelo de fresadora utilizado realiza el intercambio de brocas automáticamente, lo que ayuda a optimizar el tiempo. Además, el modo "Z0 sensing" permite la determinación del origen automáticamente en el eje z con alta precisión al contactar el sensor y el pasador incluido en la fresadora.
El diseño de este dispositivo es simple, consistiendo solo en el canal principal interrumpido por una restricción escalonada de 5 μm y un canal accesorio que sirve como purga y entrada para micropartículas. Sin embargo, se requiere la alta precisión de tales estructuras para la restricción de atrapar micropartículas de hierro de 7,5 μm de diámetro. Una restricción mayor permite que las micropartículas pasen sin retención, lo que impide su captura y la formación de la trampa de micropartículas. Por el contrario, una restricción más pequeña aumenta en gran medida la resistencia al flujo del canal y hace que los reactivos salgan a través del canal lateral en lugar de pasar a través del medio de micropartículas porosas. El uso de micropartículas de un diámetro mayor para formar la trampa magnética permitiría hacer una restricción mayor. Por ejemplo, las partículas con un diámetro de 40 μm necesitan una restricción escalonada de ~30 μm. En ese caso, no es necesario utilizar la plataforma piezoeléctrica, y el protocolo de fabricación se simplifica. Sin embargo, un medio poroso compuesto de micropartículas más grandes atraparía las nanopartículas de manera diferente y afectaría el rendimiento del inmunoensayo; Sin embargo, no está claro si sería para bien o para mal. Se está trabajando para estudiar estas características para optimizar el dispositivo7.
Para lograr la precisión requerida, se realizó la molienda superficial para eliminar una capa de 30 μm de la superficie acrílica moviendo la broca final de 200 μm a través de toda la superficie acrílica a 14.500 rpm. Este proceso permite obtener un nuevo origen en el eje z a lo largo de toda la superficie para una mayor precisión en altura. Es crucial alinear siempre el acrílico en la misma posición para que las coordenadas de origen en los ejes x e y (previamente establecidas) coincidan con una de las esquinas del acrílico. Del mismo modo, uno debe asegurarse de que el acrílico esté perfectamente asentado en la base; De lo contrario, es posible que la superficie no se desgaste correctamente, causando problemas en los siguientes pasos de montaje.
Una vez que el programa completa el proceso de rectificado de superficies, lleva automáticamente la broca final a una coordenada específica donde se mecanizará la restricción de 5 μm que forma la trampa. Es fundamental evitar que la broca final se levante de la superficie una vez que alcanza esta coordenada. Se recomienda identificar si la microfresadora tiene una opción que evita que la broca final se desprenda de la superficie una vez finalizado el proceso de molienda. De lo contrario, será necesario reposicionar manualmente el cortador a esta coordenada, lo que puede dar lugar a errores de precisión de ubicación.
Para mecanizar la restricción escalonada en el acrílico, es necesario sobredimensionar 1,5 μm. Para una altura de 5 μm, la plataforma piezoeléctrica se elevó a 6,5 μm porque el microcanal tiende a aplanarse un poco en el proceso de sellado de los canales. Además, la longitud final de la restricción en el dispositivo es de solo 50 μm; Sin embargo, se mecaniza durante más tiempo para garantizar que se comunique con ambos extremos del canal principal cuando se mecaniza después. En un solo paso, los canales de profundidad de 200 μm se fabrican utilizando la broca final de 200 μm de diámetro y una velocidad de rotación de 11,000 rpm. Por lo tanto, el mecanizado de los canales de 200 μm de ancho en acrílico toma solo unos segundos.
El siguiente paso en la fabricación del dispositivo es mecanizar los orificios que conectan los canales con el exterior. Estos orificios se utilizan para colocar las mangueras que permiten que el dispositivo se conecte fácilmente a la bomba de jeringa que lo hace funcionar. Uno de los problemas encontrados aquí es la colocación de las mangueras. Una distancia óptima es crítica para permitir el flujo de reactivos y evitar crear un sello con la cara del acrílico sin mecanizar. Para superar este inconveniente, los orificios se mecanizan en dos pasos para crear un límite donde las mangueras no excedan la profundidad deseada.
Con la broca de molienda de extremo de 800 μm, el patrón de agujeros se fresó en la misma cara previamente microfresada. Los orificios se mecanizan en el extremo de cada canal con un diámetro de 1,2 mm y una profundidad de 0,65 mm, que es la mitad del grosor del acrílico. Además, se mecanizan dos orificios en las esquinas contralaterales del rectángulo, que permiten que el acrílico se alinee boca abajo en la plataforma con pilares. Es importante utilizar un raspador o cortador para retirar el acrílico de la plataforma piezoeléctrica para evitar romperlo. En el lado opuesto del acrílico, el diámetro de los orificios es de 1,5 mm (más grande que la mitad anterior), que es igual al diámetro de la manguera a fijar. La profundidad es de 0,7 mm y debe ser ligeramente superior a la mitad del orificio frontal para garantizar que ambos orificios mecanizados se comuniquen entre sí. La barrera formada por el orificio de menor diámetro impide que la manguera llegue al fondo y bloquee la entrada. Esta implementación en el protocolo mejora en gran medida la colocación de las mangueras de entrada y salida de fluido en el chip.
Un paso clave en la fabricación de dispositivos es el sellado. Es necesario sellar la cara que contiene los canales mecanizados con una cubierta de acrílico sin mecanizar con las mismas dimensiones. El sellado de las láminas con un método que no se acerca a la temperatura de transición vítrea del acrílico permite obtener canales libres de deformación. A través del método de unión utilizado, una película delgada de solvente entre las dos láminas de PMMA disuelve una película delgada de la superficie de la lámina de PMMA, luego se evapora y finalmente vuelve a conectar los monómeros de las láminas de PMMA a una temperatura de funcionamiento específica.
El método ampliamente descrito de exposición al vapor de cloroformo se utilizó para sellar este dispositivo acrílico. Como se informó anteriormente en la literatura, el cloroformo proporciona una alta fuerza de unión; Sin embargo, como el cloroformo ataca al acrílico muy agresivamente, el acrílico nunca debe entrar en contacto directo con el cloroformo líquido, solo con el cloroformo gaseoso. Es esencial mantener una distancia óptima entre el cloroformo evaporante y el acrílico. Creamos un sistema simple utilizando una placa de Petri de vidrio, en la que el acrílico se adhirió a la tapa. Se utilizó una plataforma compuesta por nueve diapositivas unidas y unidas a la tapa de la placa de Petri, sobre las cuales se adhirieron los acrílicos con cinta adhesiva de doble cara para regular la distancia. Aunque el proceso de cloroformo gaseoso es muy sensible a los cambios en la temperatura ambiente, la temperatura de las placas de Petri se puede controlar colocándolas dentro de una caja de poliestireno. El sello de agua evita que el cloroformo se evapore demasiado rápido.
En contraste, hay otros métodos de unión reportados que son más rápidos y no requieren equipo especial; Sin embargo, algunos solo son adecuados para unir dos láminas de acrílico sin mecanizar. Asimismo, es difícil controlar la fuerza de unión ya que el disolvente debe verterse directamente entre ambas láminas acrílicas18, con un alto riesgo de fusión de estructuras de pequeñas dimensiones como la restricción micromolida de 5 μm.
Utilizando el protocolo aquí descrito, se lograron sellos homogéneos con una prensa casera, con la que se controló la presión y la temperatura de sellado. Para la construcción de esta prensa, tanto un marco de aluminio como una bisagra crean una palanca que amplifica la fuerza mecánica proveniente de un peso de 5 kg a un factor de 9:1. Los elementos calefactores transfieren su calor a placas de aluminio de 2 cm de espesor que están en contacto con las piezas acrílicas.
Una vez que las capas de acrílico están selladas, el último paso en el proceso de fabricación es conectar las mangueras externas a las entradas y salidas correspondientes del dispositivo. El adhesivo líquido se aplica externamente una vez que las mangueras están dentro de los orificios. Si el diámetro de la manguera es menor que los orificios, el adhesivo líquido puede entrar en el dispositivo, obstruyendo los canales.
Los métodos de fabricación directa sobre el sustrato, como el microfresado, tienen algunas desventajas, como la rugosidad de la superficie mecanizada y las estructuras con bordes mal delimitados9. A pesar de la rugosidad de la superficie mecanizada de los canales, no es necesario ningún tratamiento adicional para este dispositivo. Un punto importante a tener en cuenta sobre este protocolo de unión es que el cloroformo permite disminuir la rugosidad de los microcanales fresados puliendo las superficies expuestas al solvente. El pulido de la superficie es tan bueno que incluso la calidad óptica se mejora19.
Cuando el dispositivo ha sido fabricado, debe estar preparado para ser utilizado en un inmunoensayo. El lavado ultrasónico del dispositivo es de gran importancia para eliminar cualquier residuo acrílico no deseado que pueda obstruir los canales e interferir con el inmunoensayo.
Además, se debe prestar especial atención al bloqueo correcto de los canales para evitar interacciones no específicas y señales de alto ruido de fondo. Se ha demostrado que el bloqueo con BSA al 5% reduce el ruido de la unión no específica de anticuerpos en los canales, y 1 h de incubación es suficiente. Las micropartículas de hierro están recubiertas con una capa de sílice-PEG para evitar la unión no específica en ellas. Además, las micropartículas se bloquean con BSA (al mismo tiempo que los canales) antes de formar la trampa en el dispositivo. La incubación nocturna a 4 °C es mejor, lo que significa que se requiere 1 día para la fabricación e incubación del dispositivo antes del inmunoensayo. La reducción de la rugosidad por el cloroformo y el bloqueo de las superficies para reducir las interacciones no específicas han demostrado funcionar excepcionalmente bien, lo que permite que esta plataforma alcance un límite de detección comparable al ELISA estándar en un inmunoensayo modelo4.
La formación de la trampa de micropartículas en la restricción de microcanales es un proceso manual. Aunque no existe un control preciso del número de micropartículas que entran, nos basamos en una estimación de la longitud de las partículas compactadas. Es posible hacer la trampa más grande o eliminar el exceso fácilmente. Las partículas desechadas se acumulan en el canal lateral y no es necesario retirarlas del chip. Es crucial evitar que las micropartículas fluyan hacia el canal principal, ya que pueden interactuar con las nanopartículas aguas arriba de la trampa y modificar las mediciones del inmunoensayo.
Como prueba de concepto, implementamos la inmunodetección de un complejo formado por la proteína lisozima conjugada con nanopartículas de 100 nm de diámetro mediante la incubación del anticuerpo primario específico y el correspondiente anticuerpo secundario marcado con HRP. El inmunocomplejo se forma fuera del dispositivo. Sin embargo, es posible realizar todo el inmunoensayo dentro del dispositivo. Las propiedades magnéticas de las nanopartículas permiten una fácil manipulación con un separador de imán permanente de neodimio de alto rendimiento. Simplemente se debe mantener el microtubo de reacción durante 15 minutos para permitir que las nanopartículas sean atraídas por el imán a la pared del microtubo, lo que facilita los pasos de lavado del inmunoensayo fuera del dispositivo.
Lo más destacado de este dispositivo es que es simple, rápido (tiempo total de ensayo de 40 min 4 en comparación con4-6 h para ELISA) y barato (comparable al precio de una prueba de flujo lateral). Todas estas características hacen de este perfil de dispositivo un buen candidato para el desarrollo de POCT. Además, el dispositivo puede detectar cuantitativamente concentraciones de analitos similares al estándar de oro ELISA4, que es extremadamente valioso para estudios epidemiológicos y toma de decisiones en salud pública. Por lo general, los sistemas microfluídicos para inmunoensayos tienen buenos límites de detección pero tiempos de ensayo largos, o tienen tiempos de ensayo cortos pero límites de detección subóptimos4. Al combinar nanopartículas magnéticas como soporte inmune y enzimas fluorogénicas para la detección, esta plataforma tiene un tiempo de ensayo corto y un buen límite de detección (en trabajos anteriores, encontramos un límite de detección de 8 pg / ml utilizando biotina como antígeno, que es comparable con un ELISA4 estándar). Finalmente, esta tecnología tiene una ventaja importante sobre las pruebas de flujo lateral: la posibilidad de dar resultados cuantitativos y no solo cualitativos ("sí" o "no"). A diferencia de la mayoría de los otros sistemas microfluídicos desarrollados en laboratorios en los que se utilizan materiales raros, este sistema está hecho de acrílico (PMMA), un termoplástico de bajo costo que es altamente compatible con la producción en masa de dispositivos de diagnóstico médico.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Conacyt, México bajo la subvención 312231 del Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación, y por la AMEXCID y la Secretaría de Relaciones Exteriores de México (SRE) bajo la subvención "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO agradece a Conacyt México por su beca de doctorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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