Здесь мы представляем протокол для создания ксенотрансплантатов ортотопической гепатоцеллюлярной карциномы с перевязкой печеночной артерии и без нее и выполняем неинвазивную позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) гипоксии опухоли с использованием [18 F] фторизонидазола ([18 F]FMISO) и [18 F] фтордезоксиглюкозы ([18F]FDG).
Доклинические экспериментальные модели гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), которые повторяют заболевание человека, представляют собой важный инструмент для изучения онкогенеза и оценки новых терапевтических подходов. Неинвазивная визуализация всего тела с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) дает критическое представление о характеристиках тканей in vivo на молекулярном уровне в режиме реального времени. Мы представляем здесь протокол создания ортотопического ксенотрансплантата ГЦК с перевязкой печеночной артерии (HAL) и без нее, чтобы вызвать гипоксию опухоли и оценить их опухолевый метаболизм in vivo с использованием [18 F] фторизонидазола ([18 F]FMISO) и [18 F] фтордезоксиглюкозы ([18F] FDG) ПЭТ/магнитно-резонансной (МРТ) томографии. Гипоксию опухоли можно было легко визуализировать с помощью маркера гипоксии [18 F]FMISO, и было обнаружено, что поглощение [18 F] FMISO было выше у мышей с ГЦК, перенесших HAL, чем в группе без HAL, тогда как [18F]FDG не мог различить гипоксию опухоли между двумя группами. Опухоли HAL также показали более высокий уровень экспрессии индуцируемого гипоксией фактора (HIF)-1α в ответ на гипоксию. Количественная оценка опухолей HAL показала 2,3-кратное увеличение поглощения [18F] FMISO на основе стандартизированного подхода поглощения стоимости (SUV).
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является шестым наиболее диагностируемым раком и третьей по распространенности причиной смерти от рака во всем мире: в 2020 году было зарегистрировано более 900 000 новых случаев и 800 000 смертей1. Основным фактором риска является цирроз печени, который возникает в результате вирусных инфекций (вирусов гепатита В и С), злоупотребления алкоголем, диабета и неалкогольного стеатогепатита2. Лечение ГЦК довольно сложное, и существует несколько вариантов лечения, включая хирургическую резекцию, термическую или химическую абляцию, трансплантацию, трансартериальную химиоэмболизацию, лучевую терапию и химиотерапию, в зависимости от стадии заболевания 2,3. ГЦК представляет собой рефрактерную к химиотерапии опухоль с рецидивом заболевания у 70% пациентов после лечебной терапии2.
Несмотря на высокую степень гетерогенности опухоли, ГЦК связан с двумя общими исходами: (i) ГЦК очень гипоксичен и (ii) гипоксия опухоли связана с большей агрессивностью опухоли и неэффективностью лечения. Неконтролируемая пролиферация клеток ГЦК приводит к высокой скорости потребления кислорода, которая предшествует васкуляризации, создавая тем самым гипоксическое микроокружение. Низкий внутриопухолевый уровень кислорода вызывает ряд биологических реакций, которые влияют на агрессивность опухоли и реакцию на лечение. Индуцируемые гипоксией факторы (HIF) часто признаются важными транскрипционными регуляторами в ответ на гипоксию 2,3. Следовательно, способность обнаруживать гипоксию имеет решающее значение для визуализации опухолевых тканей и выявления труднодоступных участков, которые требуют инвазивных процедур. Это также помогает лучше понять молекулярные изменения, которые приводят к агрессивности опухоли, и улучшить результаты лечения пациентов.
Молекулярная визуализация с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) обычно используется для диагностики и определения стадии многих видов рака, включая ГЦК. В частности, комбинированное использование ПЭТ-визуализации с двумя индикаторами с участием [18 F] фтордезоксиглюкозы ([18F] ФДГ) и [11C] ацетата может значительно повысить общую чувствительность при диагностике ГЦК 4,5. С другой стороны, визуализация гипоксии может быть достигнута с помощью широко используемого гипоксического маркера [18 F] фторизонидазола ([18F]FMISO). В клинической практике неинвазивная оценка гипоксии важна для дифференциации различных типов опухолей и областей для планирования лучевой терапии6.
Доклиническая визуализация стала незаменимым инструментом для неинвазивной и продольной оценки моделей мышей для различных заболеваний. Надежная и воспроизводимая модель ГЦК представляет собой важную платформу для доклинических и трансляционных исследований патофизиологии ГЦК человека и оценки новых методов лечения. Вместе с ПЭТ-визуализацией поведение in vivo может быть выяснено, чтобы обеспечить важную информацию на молекулярном уровне для любого заданного момента времени. Здесь мы описываем протокол генерации ортотопических ксенотрансплантатов ГЦК для перевязки печеночной артерии (HAL) и анализа их опухолевого метаболизма in vivo с использованием [18 F]FMISO и [18F]FDG PET/MR. Включение HAL делает подходящую модель трансгенных или химически индуцированных ксенотрансплантатов мышей ГЦК для изучения гипоксии опухоли in vivo, поскольку HAL может эффективно блокировать артериальное кровоснабжение, вызывая внутриопухолевую гипоксию 7,8. Кроме того, в отличие от иммуногистохимического окрашивания ex vivo с использованием пимонидазола, изменения метаболизма опухоли в результате гипоксии могут быть легко визуализированы и точно количественно количественно неинвазивно с помощью ПЭТ-визуализации, что позволяет проводить продольную оценку ответа на лечение или измерять возникновение резистентности 3,7,8 . Наш метод, показанный здесь, позволяет создать надежную гипоксическую модель ГЦК вместе с неинвазивным мониторингом гипоксии опухоли с использованием ПЭТ/МРТ для изучения биологии ГЦК in vivo.
В этом исследовании мы описали процедуры выполнения HAL на ортотопических ксенотрансплантатах печени ГЦК с использованием подкожных опухолей, а также методы неинвазивного мониторинга гипоксии опухоли в ортотопических ксенотрансплантатах с использованием [18 F]FMISO и [18F]FDG PET/MR.</su…
The authors have nothing to disclose.
Мы выражаем признательность Гонконгскому трастовому фонду по борьбе с раком, Фонду совместных исследований Совета по исследовательским грантам Гонконга (CRF C7018-14E) в проведении экспериментов по визуализации мелких животных. Мы также благодарим Центр молекулярной визуализации и медицинских циклотронов (MIMCC) при Университете Гонконга за предоставление [18 F]FMISO и [18F]FDG.
0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |