Summary
Hier presenteren we een protocol om orthotopische hepatocellulaire carcinoom xenografts met en zonder ligatie van de leverslagader te creëren en niet-invasieve positronemissietomografie (PET) beeldvorming van tumorhypoxie uit te voeren met behulp van [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) en [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG).
Abstract
Preklinische experimentele modellen van hepatocellulair carcinoom (HCC) die menselijke ziekten samenvatten, vormen een belangrijk hulpmiddel om tumorigenese te bestuderen en nieuwe therapeutische benaderingen te evalueren. Niet-invasieve beeldvorming van het hele lichaam met behulp van positronemissietomografie (PET) biedt kritische inzichten in de in vivo kenmerken van weefsels op moleculair niveau in realtime. We presenteren hier een protocol voor orthotopische HCC xenograft creatie met en zonder hepatische arterie ligatie (HAL) om tumorhypoxie te induceren en de beoordeling van hun tumormetabolisme in vivo met behulp van [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) en [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG) PET / magnetische resonantie (MR) beeldvorming. Tumorhypoxie kon gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van de hypoxiemarker [18 F] FMISO, en het bleek dat de [18 F] FMISO-opname hoger was bij HCC-muizen die HAL ondergingen dan in de niet-HAL-groep, terwijl [18F] FDG geen tumorhypoxie tussen de twee groepen kon onderscheiden. HAL-tumoren vertoonden ook een hoger niveau van hypoxie-induceerbare factor (HIF)-1α-expressie als reactie op hypoxie. Kwantificering van HAL-tumoren toonde een 2,3-voudige toename in [18F] FMISO-opname op basis van de gestandaardiseerde waardeopname (SUV) -benadering.
Introduction
Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de zesde meest gediagnosticeerde kanker en de derde meest voorkomende doodsoorzaak van kanker wereldwijd, met meer dan 900.000 nieuwe gevallen en 800.000 sterfgevallen in 20201. De belangrijkste risicofactor is cirrose, die optreedt als gevolg van virale infecties (hepatitis B- en C-virussen), alcoholmisbruik, diabetes en niet-alcoholische steatohepatitis2. Het beheer van HCC is vrij complex en er zijn verschillende behandelingsopties beschikbaar, waaronder chirurgische resectie, thermische of chemische ablatie, transplantatie, transarteriële chemo-embolisatie, bestraling en chemotherapie, afhankelijk van de stadiëring van de ziekte 2,3. HCC is een chemotherapie-refractaire tumor met een recidief van de ziekte bij maximaal 70% van de patiënten na curatieve behandeling2.
Ondanks de hoge mate van tumorheterogeniteit is HCC geassocieerd met twee veel voorkomende uitkomsten: (i) HCC is zeer hypoxisch en (ii) tumorhypoxie is gekoppeld aan grotere tumoragressiviteit en behandelingsfalen. De ongecontroleerde proliferatie van HCC-cellen resulteert in een hoog zuurstofverbruik dat voorafgaat aan vascularisatie, waardoor een hypoxische micro-omgeving ontstaat. Lage intra-tumorale zuurstofniveaus veroorzaken vervolgens een reeks biologische reacties die de agressiviteit van de tumor en de behandelingsrespons beïnvloeden. Hypoxie-induceerbare factoren (HIF's) worden vaak erkend als de essentiële transcriptionele regulatoren in de respons op hypoxie 2,3. Daarom is het vermogen om hypoxie te detecteren cruciaal om neoplastische weefsels te visualiseren en de ontoegankelijke plaatsen te identificeren, die invasieve procedures vereisen. Het helpt ook om de moleculaire veranderingen die leiden tot tumoragressiviteit beter te begrijpen en de behandelingsresultaten van de patiënt te verbeteren.
Moleculaire beeldvorming met behulp van positronemissietomografie (PET) wordt vaak gebruikt bij de diagnose en stadiëring van veel kankers, waaronder HCC. Met name het gecombineerde gebruik van dual-tracer PET-beeldvorming met [18 F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) en [11C]Acetaat kan de algehele gevoeligheid bij HCC-diagnose aanzienlijk verhogen 4,5. Beeldvorming van hypoxie, aan de andere kant, kan worden bereikt met behulp van de veelgebruikte hypoxische marker [18 F] Fluoromisonidazol ([18F] FMISO). In de klinische praktijk is de niet-invasieve beoordeling van hypoxie belangrijk om onderscheid te maken tussen verschillende soorten tumoren en regio's voor radiotherapieplanning6.
Preklinische beeldvorming is een onmisbaar hulpmiddel geworden voor de niet-invasieve en longitudinale evaluatie van muismodellen voor verschillende ziekten. Een robuust en zeer reproduceerbaar HCC-model vormt een belangrijk platform voor preklinisch en translationeel onderzoek naar de pathofysiologie van menselijke HCC en de beoordeling van nieuwe therapieën. Samen met PET-beeldvorming kunnen in vivo gedragingen worden opgehelderd om belangrijke inzichten op moleculair niveau te bieden voor een bepaald tijdspunt. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van hepatische arterieligatie (HAL) orthotopische HCC-xenografts en analyse van hun in vivo tumormetabolisme met behulp van [18 F] FMISO en [18F] FDG PET / MR. De integratie van HAL maakt een geschikt model van transgene of chemisch geïnduceerde HCC-muizen xenografts om tumorhypoxie in vivo te bestuderen, omdat HAL de arteriële bloedtoevoer effectief kan blokkeren om intratumorale hypoxie te induceren 7,8. Bovendien kunnen, in tegenstelling tot ex vivo immunohistochemische kleuring met pimonidazol, veranderingen in het tumormetabolisme als gevolg van hypoxie gemakkelijk worden gevisualiseerd en nauwkeurig niet-invasief worden gekwantificeerd met behulp van PET-beeldvorming, waardoor longitudinale beoordeling van de behandelingsrespons of meting van het ontstaan van resistentie mogelijk is 3,7,8 . Onze hier getoonde methode maakt het mogelijk om een robuust hypoxisch HCC-model te maken, samen met niet-invasieve monitoring van tumorhypoxie met behulp van PET / MR-beeldvorming om HCC-biologie in vivo te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met het Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research (CULATR) in het Centre for Comparative Medicine Research (CCMR) aan de Universiteit van Hong Kong, een programma dat is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). De dieren die in de studie werden gebruikt, waren vrouwelijke BALB / cAnN-nu (Nude) muizen op de leeftijd van 6-8 weken, gewogen op 20 g ± 2 g. Voedsel en water werden ad libitum verstrekt.
1. Subcutane injectie van humane hepatocellulaire carcinoomcellijnen
OPMERKING: MHCC97 is een menselijke HCC-cellijn die wordt gebruikt om het subcutane HCC-xenograftmodel te genereren. MHCC97L-cellen worden verkregen van het Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai, de Volksrepubliek China9 en geauthenticeerd door short tandem repeat (STR) profilering.
- Kweek MHCC97L-cellen en onderhoud in kweekmedia aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline en streptomycine in een T-75-celkweekkolf bij 37 °C in een bevochtigde incubator geleverd met 5% CO2 (zie tabel met materialen). Vervang de kweekmedia om de 2 dagen en oogst de cellen bij 80%-90% samenvloeiing.
OPMERKING: Het begincelnummer is 1,5 x 10 6 cellen en de cellen worden gebruikt binnen6-8 passages. - Bewaar de kweekmedia en trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (trypsine-EDTA) bij 4 °C in het donker tot gebruik. Verwarm de kweekmedia voor gebruik voor op 37 °C en de trypsine-EDTA op kamertemperatuur. Raadpleeg de materiaaltabel voor alle reagentia en verbruiksartikelen die in deze sectie worden gebruikt.
- Verwijder de cultuurmedia. Spoel de cellaag af met 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS, zie materiaaltabel).
- Voeg 5 ml trypsine-EDTA toe aan de kweekkolf en incubeer de cellen bij 37 °C. Controleer de cellen onder een omgekeerde microscoop bij een vergroting van 20x (zie materiaaltabel) totdat de cellaag is gedispergeerd en volledig van de kolf is losgemaakt. Zorg ervoor dat de cellen niet langer dan 15 minuten in trypsine-EDTA blijven.
- Voeg 5 ml cultuurmedia toe aan de kweekfles. Zuig de cellen op door zachtjes te pipetteren. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis en draai gedurende 5 minuten op 1,107 x g (zie materiaaltabel).
- Verwijder het supernatant en resuspensie de celkorrel voorzichtig met 1 ml PBS. Pipetteer grondig om een eencellige suspensie te verkrijgen. Bepaal het celnummer met behulp van de geautomatiseerde celteller (zie tabel met materialen) en bereid de celsuspensie voor tot een concentratie van 5 x 106 cellen/ml in PBS.
- Zuig 200 μL celsuspensie op met een naald van 25 G in een spuit van 1 ml. Elke spuit bevat 1 x 106 MHCC97L cellen (in 200 μL). Bewaar de spuit op nat ijs.
- Verdoof de muis met een intraperitoneale (i.p.) injectie van een mengsel van ketamine (87,5 mg/kg) en xylazine (12,5 mg/kg). Zorg voor een goede anesthesie met behulp van de teen-knijpreflex. Zorg ervoor dat u oogglijmiddel op de muis aanbrengt om uitdroging en de mogelijke vorming van hoornvlieszweren te voorkomen. Plaats de muis in rugligging op een steriele pad (zie Materiaaltabel).
- Steriliseer het dorsale gebied nabij de onderste flank (linker- of rechterkant) van de muis met 70% ethanol (zie materiaaltabel). Til de huid op met een tang en steek de naald voorzichtig onder de huid in.
- Plaats de naald 4-5 mm langs het onderhuidse vlak van de prikplaats om te voorkomen dat de celsuspensie per ongeluk van de injectieplaats lekt bij het opzuigen van de naald. Zorg ervoor dat het inbrengen van de naald niet te diep onder de huid zit, wat per ongeluk orgaanschade kan veroorzaken.
- Laat de tang los en ontlaad voorzichtig en langzaam de inhoud van de spuit, waarbij u ervoor zorgt dat u de andere kant niet binnendringt. Trek de naald uit om te controleren op een zwelling op de injectie. Plaats de muis terug in de kooi bovenop een voorverwarmd verwarmingskussen om te helpen bij het herstel van de anesthesie en om de mobiliteit te herwinnen. Blijf de muis in de gaten houden totdat de muis volledig wakker is en de sternale lighouding handhaaft.
- Controleer de tumorgroei en het welzijn van de muis op een wekelijkse basis. Meet het tumorvolume (V) met behulp van een remklauw (zie Materiaaltabel). Bereken en registreer het tumorvolume met behulp van de volgende formule10:
V = (W 2× L)/2
waarbij W de breedte is en L de lengte van de tumor. - Controleer tussen 4-6 weken na injectie of een aanzienlijke grootte van de subcutane tumor, tussen 800-1000 mm3, is verkregen. Zorg ervoor dat de totale tumorbelasting niet groter is dan 10% van het lichaamsgewicht.
2. Orthotopische leverimplantatie en ligatie van de leverslagader
- Bereid de volgende chirurgische reagentia en gereedschappen voor in een gedesinfecteerde biologische veiligheidskast: 10 ml kweekmedia in een schaal, 10% povidon-jodiumoplossing, 70% ethanol, geautoclaveerde chirurgische instrumenten, d.w.z. scherpe scharen, veerschaar, tang (gebogen fijn en recht stomp), naaldhouder, scalpelblad, 6-0 en 5-0 nylon hechting, een verwarmingskussen.
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten en hanteer ze alleen op een steriele bank. Zorg voor de adequate en noodzakelijke pre-, intra- en postoperatieve zorg aan de muizen tijdens de chirurgische procedures (zie onderstaande stappen).
- Voor preoperatieve pijnverlichting, injecteer de muis met een subcutane injectie van buprenorfine (0,1 mg / kg) ten minste 30 minuten vóór het begin van de chirurgische ingreep. Voor postoperatieve zorg en behandeling, injecteer de muis met een subcutane injectie van buprenorfine (0,1 mg/kg) gedurende 3 dagen continu, eenmaal per 8-12 uur. Raadpleeg de materiaaltabel voor alle reagentia en verbruiksartikelen die in deze sectie worden gebruikt.
- Euthanaseer de subcutane tumordragende muis met een i.p. injectie van pentobarbital (330 mg/kg). Maak een incisie op de huid van de tumorplaats met behulp van een scalpelmes. Snijd het onderhuidse tumorblok weg en breng het onmiddellijk over naar de kweekmedia. Voer deze stap zo snel mogelijk uit.
- Knip het tumorblok in1 mm 3 kleine tumorblokjes met een scherpe chirurgische schaar. Bewaar alle tumorblokjes in de kweekmedia. Vermijd het gebruik van het kerngebied van het onderhuidse tumorblok.
- Verdoof de muis die de daaropvolgende orthotopische tumorimplantatieoperatie zal ondergaan met een i.p. injectie van een mengsel van ketamine (87,5 mg/kg) en xylazine (12,5 mg/kg). Zorg ervoor dat er ten minste 30 minuten zijn verstreken na het geven van de buprenorfine voordat u de muis verdooft. Zorg ervoor dat u oogglijmiddel op de muis aanbrengt om uitdroging en de mogelijke vorming van hoornvlieszweren te voorkomen.
- Plaats de muis in rugligging op een steriele pad die bovenop een voorverwarmd verwarmingskussen ligt. Controleer en registreer de fysiologische toestand van de muis elke 15 minuten tot het einde van de chirurgische ingreep.
- Strek de ledematen van de muis uit. Bevestig ze met tape om de blootstelling van de ventrale buik en thorax te maximaliseren. Steriliseer de gehele buikhuid van de muis met een 10% povidon-jodiumoplossing, gevolgd door 70% ethanol. Beoordeel de verdovingsdiepte van de muis door te controleren of er geen reactie is op teenknijpen - de terugtrekkingsreflex van het pedaal.
- Voer een laparotomie uit door een ongeveer 10 mm middellijnincisie te maken om toegang te krijgen tot het peritoneum met een scherpe schaar. Klem en trek het xiphoid-proces naar het hoofd met een tang en breng de subcostale retractors aan om het operatieveld te openen. Zorg ervoor dat er een goede incisie wordt gemaakt om een goed chirurgisch beeld van de operatieplaats mogelijk te maken.
- Trek de mediane en linkerlobben naar boven in met een nat gaasje. Beweeg de darmen buiten de buik naar de linkerkant van de muis en bedek ze met een nat gaasje. Voer de ligatie van de leverslagader (HAL) uit op de gemeenschappelijke leverslagader (CHA), die afkomstig is van de pancreaskop tot de wortel in de leverpedikel, onder een vergrootlamp voor geoptimaliseerde visualisatie.
- Trek de mediane en linkerlobben naar achteren / naar beneden in met een nat gaasstaafje om de linkerkwab bloot te leggen. Maak een incisie van ongeveer 2 mm lang en diep op het oppervlak van de linkerkwab met een steriel scalpelmesje.
OPMERKING: Het is ook mogelijk om de mediane kwab van de lever te gebruiken voor tumorimplantatie om onbedoelde tranen of scheuren door trauma aan naburige buikorganen te minimaliseren. - Breng onmiddellijk een tumorfragment in de leverincisie in met een steriele tang. Begraaf de tumor zodat deze veilig in de lever zit. Breng een hechting van acht met een 6-0 nylon hechting aan op de incisieplaats om een goede implantatie van tumorfragmenten in de lever en hemostase te garanderen. Voer deze operatie zo snel mogelijk uit om overmatig bloeden te voorkomen. Sluit na voltooiing de buikincisie met onderbroken 5-0 hechtingen.
- Plaats de muis terug in de kooi bovenop een voorverwarmd verwarmingskussen om te helpen bij het herstel van de anesthesie en om de rechtrichtreflex terug te krijgen. Blijf de fysiologische toestand van de muis elke 15 minuten controleren en registreren totdat de muis volledig wakker is en de sternale lighouding handhaaft.
- Herhaal de procedure totdat alle muizen orthotopische tumorimplantatie hebben ondergaan. Bied postoperatieve zorg aan alle muizen door hun fysiologische toestand dagelijks te controleren gedurende de volgende 3 dagen na de chirurgische ingreep. Geef buprenorfine (0,1 mg/kg) elke 8-12 uur.
3. Opzetten van PET/MR kalibraties en workflow
OPMERKING: Beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een preklinisch PET/MR 3T-systeem (zie materiaaltabel).
- Gebruik 5% isofluraan (1 L/min medisch O2) om de muis te verdoven in een inductiekamer. Plaats voor elke scan de verdoofde muis zorgvuldig op een beeldvormingsbed met continue verwarming; scan eerst met MR (scout view) als anatomische referentie voor statische [18 F]FMISO of [18F]FDG PET scans, gevolgd door anatomische referentie MR beeldvorming.
- Maak een sequentiële PET/MR-beeldvormingsworkflow in de software (zie Materiaaltabel) met een statische PET-scan, T1-gewogen (verzwakkingscorrectie) en T2-gewogen (anatomische referentie) MR-beeldvorming en PET-reconstructie 1 dag voor de geplande beeldvormingssessie.
- Om PET te verkrijgen, selecteert u 400-600 keV-niveaudiscriminatie, F-18-studieisotoop, 1-5 toevalsmodus en scans van 20 minuten.
- Om T1-gewogen MR voor het hele lichaam te verkrijgen, gebruikt u gradiënt echo-3D met TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, gezichtsveld (FOV) = 90 mm x 60 mm, aantal excitaties (NEX) = 3, 28 plakjes met een dikte van 0,9 mm en voxelgrootte = 0,375 mm 3 x 0,375 mm 3 x 0,9 mm 3.
- Om T2-gewogen MR voor het hele lichaam te verkrijgen, gebruikt u fast-spin echo 2D met TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 plakjes met een dikte van 0,9 mm, voxelgrootte = 0,265 mm 3 x 0,268 mm 3 x 0,9 mm3.
- Om PET te reconstrueren, selecteert u Tera-Tomo (TT3D) algoritme, iteraties = 8, subsets = 6, 1-3 toevalsmodus, en met verval, dode-tijd, willekeurige, verzwakkings- en spreidingscorrecties om afbeeldingen te maken met een totale voxelgrootte van 0,3 mm3.
- Voer vóór het begin van het experiment een PET-activiteitstest uit om de nauwkeurigheid van PET-kwantificering11 te controleren.
- Vul een spuit van 5 ml met 5-8 MBq [18F] FMISO verdund in water of zoutoplossing volgens de aanbeveling van de fabrikant. Gebruik een dosiskalibrator om de activiteit van de spuit te registreren (zie Tabel met materialen). Noteer het tijdstip van meting.
- Teken een volume van belang (VOI) op de gereconstrueerde afbeelding om de hele spuit te bedekken. Vergelijk de teruggewonnen activiteit uit de afbeelding met de waarde die wordt verkregen uit de dosiskalibrator. Ga verder met beeldvormingsstudies wanneer de herstelde activiteit nauwkeurig is binnen ±5%.
4. [18 F]FMISO en [18F]FDG injectie
- Verkrijg een klinische dosis van [18F]FMISO van de leverancier 30 minuten voor aanvang van de beeldvormingsstudies. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's), zoals een laboratoriumjas, handschoenen, een overbril, een filmbadge en ringdosimeters bij het hanteren van radioactieve materialen. Vervang regelmatig de handschoenen om kruisbesmetting van de radioactieve stoffen te voorkomen.
- Plaats de radioactieve voorraadoplossingen in de loden opslagcontainer achter een L-blok tafelbladschild. Doseer een aliquot van [18F]FMISO en verdun met gesteriliseerde zoutoplossing. Zorg ervoor dat de totale activiteitsconcentratie 18-20 MBq in 100 μL is.
- Zuig de [18F]FMISO op met een spuit van 1 ml met naald (zie materiaaltabel). Noteer de radioactiviteit en tijd die op de dosiskalibrator worden weergegeven.
- Noteer het gewicht van de muis vóór de injectie van de radiotracer. Gebruik 5% isofluraan (1 L/min medisch O2) om de muis te verdoven en injecteer vervolgens voorzichtig de bereide [18F]FMISO via de staartader. Noteer de injectietijd en residuactiviteit van de spuit om rekening te houden met de correctie van het bederf. Plaats de muis gedurende 180 minuten terug in de kooi om [18F]FMISO-opname mogelijk te maken voorafgaand aan de PET-scan. Laat de muis 1 dag herstellen na [18F]FMISO PET.
OPMERKING: Ondanks de zeer verschillende in vivo farmacokinetische profielen voor [18 F]FMISO en [18 F]FDG, zijn beide radiotracers radioactief gelabeld met F-18, een PET-radionuclide met een halfwaardetijd van 109,77min (< 2 uur). Omdat het PET-signaal afkomstig is van F-18, zal elke 2 uur de helft van de initieel geïnjecteerde radioactiviteit verloren gaan. In dit geval kan het restsignaal 24 uur na injectie niet meer worden gedetecteerd door de PET-scanner. Bovendien zal de 1 dag tussen zowel [18 F]FMISO (dag 1) als [18 F]FDG (dag 3) injecties volledig verval van [18 F]FMISO mogelijk maken wanneer [18 F]FDG PET wordt uitgevoerd, dus geen overlapping van [18 F]FMISO-signaal in de [18F]FDG PET-scan. - Herhaal stap 4.1.-4.4. voor de [18F]FDG-injectie op dag 3, met uitzondering van een totale activiteitsconcentratie van 6-8 MBq in 100 μL wordt geïnjecteerd met een opname van 60 minuten vóór het begin van de PET-scan.
- Bereken de geïnjecteerde [18 F]FMISO- of [18F]FDG-activiteit met behulp van de volgende formule 11:
Geïnjecteerde activiteit (MBq) = Activiteit in de spuit vóór injectie - Activiteit in de spuit na injectie
5. PET/MR-overname
- Zet de luchtverwarmer aan om het beeldvormingsbed van de muis te verwarmen vóór de geplande PET-scan. Gebruik 5% isofluraan (1 L/min medisch O2) om de muis te verdoven in een inductiekamer.
- Eenmaal goed verdoofd en gecontroleerd met behulp van de teen-knijpreactie, breng de muis voorzichtig en onmiddellijk over naar het verwarmingsbed en handhaaf de anesthesie op 2% -2,5% isofluraan. Plaats de muiskop op de bijtbalk en breng oogglijmiddel aan op beide ogen om uitdroging en de mogelijke vorming van hoornvlieszweren te voorkomen. Bedek het beeldvormende bed met een plastic laken om de omgevingstemperatuur van het bed te behouden.
- Bewaak en registreer de ademhalingsfrequentie en lichaamstemperatuur van de muis met behulp van respectievelijk het interne ademhalingskussen en de thermische sonde. Zorg ervoor dat de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C wordt gehouden, terwijl de ademhalingsfrequentie in het bereik van 40-50 ademhalingen per minuut (bpm) wordt gehouden door het isofluraanniveau aan te passen.
- Voer een verkennersweergave uit om de muispositie in de scanner te vinden. Pas de positie van het muisbed aan om het hele muislichaam te bedekken, met het rompgebied in het midden FOV van de MR.
- Als u een PET-scan wilt starten, selecteert u PET-acquisitie in het venster van de studielijst en kiest u vervolgens Scanbereik bij eerdere acquisitie om de vooraf bepaalde muisbedpositie in de scoutweergave te gebruiken. Klik op Prepare > OK om het muisbed automatisch van MR naar PET te verplaatsen en de aanschaf te starten.
- Selecteer onder de Radiofarmaceutische Editor de juiste radionuclide en voer vervolgens de details van de injectiedosis en de tijd voor en na [18 F]FMISO of [18F]FDG-injectie in, zoals gemeten in stap 4.3. en stap 4.4. Voer het gewicht van de muis in onder het menu Onderwerpinformatie.
- Ga verder met MR-acquisities na voltooiing van de PET-scan. Selecteer hiervoor Voorbereiden om de muis van PET naar MR te verplaatsen. Klik op OK om door te gaan.
- Zodra alle scans zijn voltooid, selecteert u Home om het beeldvormingsbed terug te zetten naar de standaardpositie.
- Schakel de anesthesie uit en spoel het beeldvormende bed door met medische O2. Controleer de terugtrekkingsreflex van het muispedaal. Breng de muis van het beeldvormingsbed terug naar een schone behuizingskooi die bovenop een verwarmingskussen is geplaatst om te helpen bij het herstel van de anesthesie en om de rechtrichtreflex terug te krijgen.
- Selecteer onder de Raw Scan de optie PET Acquisition om de verkregen ruwe PET-gegevens te laden voor PET-reconstructie . Selecteer MM voor gebruik als materiaalkaart. Ga verder met PET-reconstructie met behulp van de parameter zoals beschreven in stap 3.6.
- Houd u strikt aan de lokale en institutionele richtlijnen bij het omgaan met muizen na PET-beeldvormingsstudies. Behandel alle gebruikte verbruiksartikelen, bijvoorbeeld spuiten, naalden, handschoenen, doekjes en biologisch afval, bijvoorbeeld kooistrooisel en ontlasting, die in direct contact zijn geweest met de muis als radioactief afval, en behandel ze met zorg volgens de lokale voorschriften.
6. PET-beeldanalyse
- Open de beeldanalysesoftware (zie materiaaltabel) en selecteer DICOM-gegevens laden om de PET- en MR-afbeeldingen te openen.
- Sleep de bijbehorende PET- en MR-afbeeldingen naar het softwareweergavevenster en selecteer Automatische registratie om automatische coregistratie van de resulterende PET- en MR-afbeeldingen uit te voeren.
- Selecteer in het menu Registratie-instellingen de optie Rigide transformatie. Gebruik Shift en Rotation in het menu Rigid/Affine .
- Klik in het menu Algemene rolselectie op MM als referentie en Statische PET-scan als reslice.
- Inspecteer de medegeregistreerde PET/MR-afbeeldingen om de juiste uitlijning te garanderen. Gebruik indien nodig handmatige registratie om de afbeeldingen handmatig aan te passen.
- Lokaliseer de orthotopische tumor in de lever met behulp van het MR-beeld. Gebruik geïnterpoleerde ellips ROI om een VOI op de tumor te tekenen, met behulp van de MR-afbeelding als referentie. Breng de gecreëerde tumor VOI over van de MR naar het PET-beeld. Selecteer het penseel en het gummetje om de VOI-rand dia-voor-dia zorgvuldig te definiëren. Zorg ervoor dat u spillover van radioactiviteitsopname vanuit de lever op het PET-beeld vermijdt.
- Gebruik Ellipsoid VOI om een 3 mm3 VOI op de lever te creëren als referentieorgaan. Zorg ervoor dat u gebieden met zichtbare vasculaire en galstructuren in de lever vermijdt door het MR-beeld als leidraad te gebruiken.
- Selecteer Roi-tabel weergeven om de naam van alle getekende VOI's te wijzigen. Noteer alle benodigde gegevens, bijvoorbeeld radioactiviteit (kBq/ml) en tumorvolume (mm3), in een spreadsheet. Sla een kopie van de VOI-tekeningen op en archiveer zowel de onbewerkte als gereconstrueerde beeldgegevens op een externe harde schijf wanneer deze zijn voltooid.
- Bereken de gestandaardiseerde opnamewaarde (SUV) voor alle VOI's met behulp van de volgende vergelijking11:
SUV = CPET(t)/(ID/BW)
waarbij CPET(t) de gemeten activiteit in de VOI is, ID de geïnjecteerde dosis gemeten in kBq en BW het lichaamsgewicht van de muis in kg, uitgaande van een weefseldichtheid van 1 g/ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een geschikt tumorblok voor opeenvolgende orthotopische implantatie te verkrijgen, werden eerst stabiele klonen gegenereerd door subcutane injectie van 200 μL celsuspensie in DPBS (met MHCC97L-cellen) in de onderste flank van naakte muizen (figuur 1A). Tumorgroei werd gecontroleerd en toen de tumorgrootte 800-1000 mm 3 bereikte (ongeveer 4 weken na injectie), werden muizen geëuthanaseerd en het resulterende tumorblok werd in ongeveer 1 mm3 fragmenten gesneden voor daaropvolgende leverorthotopische implantatie in een andere partij naakte muizen (n = 6). Muizen werden gerandomiseerd in twee groepen: controle (C1, n = 3) en ligatie van de leverslagader (H2, n = 3). HAL werd uitgevoerd door een fijne draad rond de hoofdtak van de leverslagader te binden. C1-muizen werden gespaard van HAL voorafgaand aan orthotopische implantatie. Deze manipulatie leidde tot tumorhypoxie bij H2-maar niet bij C1-muizen, en de hypoxische status van de tumor kon niet-invasief worden gecontroleerd met behulp van de PET-hypoxische tracer [18F] FMISO. PET/MR-studies toonden aan dat een toename van de tumoropname [18 F]FMISO alleen werd waargenomen bij de H2-muizen, terwijl, met behulp van de glycolytische marker [18F]FDG, de tumoropname vergelijkbaar bleef tussen de twee groepen (figuur 1B).
HAL-geïnduceerde hypoxie in tumoren werd verder gevalideerd door de expressieniveaus van HIF-1α12 te onderzoeken en vergelijkingen werden gemaakt tussen de groepen. Consistent met een meer hypoxische tumor na HAL, vertoonde de H2-groep een hogere HIF-1α-expressie dan de C1-groep (optische dichtheid: respectievelijk 0,17 vs. 0,13, H2 vs. C1), wat overeenkomt met hun tumor [18F] FMISO-opname (figuur 2A). [18F] De opname van FMISO werd gekwantificeerd met behulp van de op SUV's gebaseerde benadering. H2-tumoren vertoonden een 2,3-voudige toename van [18F]FMISO-opname in vergelijking met C1-tumoren (SUVmax: 1,2 vs. 2,8, respectievelijk, figuur 2B). Evenzo resulteerde HAL ook in een hogere lever-SUV-opname in H2 dan C1-muizen (figuur 2C). Alles bij elkaar genomen laten we hier zien dat HAL effectief tumorhypoxie kan induceren in HCC orthotopische xenografts, en tumorhypoxie kan niet-invasief worden gecontroleerd met behulp van [18F] FMISO PET-beeldvorming, ondersteund door de ex vivo immunohistochemiemarker HIF-1α-expressie. Bovendien biedt de integratie van MR-beeldvorming een uitstekend contrast met zacht weefsel om een duidelijke afbakening van de tumor van de lever mogelijk te maken, waardoor nauwkeurige PET-kwantificering mogelijk is.
Figuur 1: In vivo PET/MR beeldvorming van orthotopische HCC muizen xenografts. (A) Schematische weergave van subcutane en orthotopische xenograftcreaties en PET-beeldvormingsstudies in orthotopische MHCC97L-tumoren. (B) Representatieve maximale intensiteitsprojectie (MIP) PET-beelden van [18 F]FMISO en [18F]FDG bij muizen met orthotopische MHCC97L-tumoren (C1) zonder of (H2) met HAL. Blauwe cirkels geven de locatie van de tumor aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van muizen met orthotopische MHCC97L-tumoren met en zonder HAL. (A) Representatieve mede-geregistreerde [18F]FMISO PET/MR-beelden, immunohistochemische kleuring voor HIF-1α en hematoxyline en eosine (HE) in tumorsecties. (B-C) Kwantitatieve analyse van [18F]FMISO-opname in de tumor en lever. N = 3 voor elke groep. Waarden van SUV worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie beschreven we de procedures om HAL uit te voeren op leverorthotopische HCC-xenografts met behulp van subcutane tumoren, samen met methoden voor de niet-invasieve monitoring van tumorhypoxie in orthotopische xenografts met behulp van [18 F] FMISO en [18F] FDG PET / MR. Onze interesse ligt in de metabole beeldvorming van verschillende kanker- en ziektemodellen voor vroege diagnose en evaluatie van de behandelingsrespons11,13,14,15. Tot op heden zijn de creatie van HAL HCC-xenografts en hun in vivo tumormetabolisme zelden beschreven in de literatuur, wat ons ertoe aanzette om de metabole kenmerken van deze tumormodellen te onderzoeken met behulp van PET-beeldvorming.
De succesvolle oprichting van orthotopische xenografts met HAL als een robuust muizenmodel om hypoxie in HCC te bestuderen, vertegenwoordigt een belangrijk aspect voor het bestuderen van HCC-biologie in vivo. Van hypoxie is bekend dat het de maligniteit van kanker stimuleert. Bovendien is intratumorale hypoxie geassocieerd met verhoogde proliferatie, metastase en radio- en chemoresistantie en rechtvaardigt een grondige karakterisering van de respons op hypoxische aandoeningen7. Terwijl subcutane xenografts vaak worden gebruikt om HCC-tumorigenese of behandelingsstrategieën te bestuderen, kunnen orthotopische modellen de menselijke HCC-ontwikkeling beter samenvatten, omdat ze de micro-omgeving van de tumor nauwkeuriger weerspiegelen, met name de invloeden op vascularisatie en tumor-stroma-interacties in de richting van HCC-metastase12. De opname van HAL in HCC orthotopische muizen maakt de inductie van intra-tumorale hypoxie mogelijk door de hepatische arteriële bloederige toevoer naar de tumorte blokkeren 7. Dergelijke diermodellen maken het mogelijk mechanismen die ten grondslag liggen aan de effecten van HAL op HCC op te helderen en nieuwe wegen te creëren voor effectieve therapieën gericht op de hypoxieroute in HCC. Voor orthotopische implantatie gebruikten we de tumorkubus van de onderhuidse tumor in plaats van directe injectie van HCC-celsuspensies. We hebben ontdekt dat directe celinjecties vaak een klein volume lekkage van de injectieplaats veroorzaken, ook al werd de procedure zo langzaam mogelijk uitgevoerd met een laag injectievolume. Dit kan mogelijk leiden tot peritoneale metastase, wat schadelijk is voor het welzijn van dieren en uiteindelijk de algehele onderzoeksresultaten beïnvloedt. Aan de andere kant zou implantatie van een klein tumorblok het probleem oplossen, hoewel ervoor moet worden gezorgd dat de tumor na implantatie veilig wordt gehecht. Bij het isoleren van kleine tumorblokjes uit het onderhuidse tumorblok, is het ook raadzaam om de kerngebieden van de vaste tumor te vermijden, die relatief minder gevasculariseerd en meer metabolisch gestrest zijn als gevolg van hypoxie en voedingsgebrek. Dit zal de opname van dode tumorcellen verminderen die necrotisch lijken te zijn in de kleine tumorkubus en zal meer consistente tumorgroeisnelheden behouden bij individuele muizen.
Hypoxie is een prognostische factor van kankerresistentie en het monitoren van veranderingen in hypoxie met behulp van PET maakt de detectie en kwantificering van hypoxische weefsels in hoge gevoeligheid en specificiteit mogelijk. Een belangrijke overweging voor [18 F]FMISO en [18F]FDG PET betreft de opnametijd van de radiotracer en de wijze van toediening bij muizen. Beide radiotracers hebben verschillende in vivo farmacokinetiek, één is het fysiologische opnameverschil, waargenomen in de darm / blaas en hart / blaas voor respectievelijk [18 F] FMISO en [18 F] FDG, en de andere is dat [18 F] FMISO zich ophoopt in het hypoxische gebied van de tumor, en [18F] FDG wordt bij voorkeur opgenomen in het hoge metabole tumorgebied 16. De hoge lipofilie en langzame leverklaring van [18F] FMISO vereisen een 2-4 uur na injectietijd om een goed tumor-levercontrastte verkrijgen 17. We vonden dat 3 uur na injectie voldoende is om tumor [18F] FMISO-opname uit de lever te differentiëren en af te bakenen voor zowel hypoxische (H2) als controle (C1) groepen. In het geval van [18F]FDG PET is een 1 uur na injectietijd voldoende om een goed contrast op te leveren, zoals eerder beschreven13,15, en werd in deze studie gebruikt. Niettemin is het noodzakelijk om een consistente opnametijd van de radiotracer te behouden om de betrouwbaarheid van PET-resultaten te garanderen, vooral voor SUV-gebaseerde analyses. Hier gebruikten we intraveneuze technieken om radiotracer toe te dienen aan de muizen. Succesvolle staartaderinjectie wordt aangegeven door een zichtbare bloedflits vóór de radiotracerinfusie, waarbij de naald nauwkeurig in de ader wordt geplaatst. Een groot nadeel van deze methode is dat de verwachte bloedflits moeilijk waar te nemen kan zijn als gevolg van hypotensie, met variabiliteit waargenomen tussen muizen. Niettemin kan een dergelijke moeilijkheid worden overwonnen door de staart gedurende een korte periode van 1-2 minuten voorafgaand aan het inbrengen van de naald te verwarmen, hetzij met een warm washandje of met een warmtelamp om de bloedstroom te verhogen en de zichtbaarheid van de ader te verbeteren voor een succesvolle injectie.
Met het toenemende gebruik van PET-beeldvorming om de biodistributie van radiotracers bij kleine dieren te kwantificeren, is een belangrijke overweging om op te merken het gebruik van een nauwkeurige en goed gekalibreerde PET-scanner om goede, reproduceerbare en kwantificeerbare PET-gegevens op te leveren. Een nauwkeurig PET-systeem maakt het mogelijk om beeldvormingsstudies op een meer tijdsefficiënte en kosteneffectieve manier uit te voeren en maakt de implementatie van de 3V-principes (vervanging, reductie en verfijning) in dieronderzoek mogelijk. Om die reden moeten routinematige kwaliteitscontrole-inspecties worden uitgevoerd, bij voorkeur wekelijks, om de PET- en MR-componenten van het beeldvormingssysteem te onderzoeken volgens de aanbeveling van de fabrikant. In het bijzonder moet de nauwkeurigheid van de PET-activiteit regelmatig worden gecontroleerd en geregistreerd, alsook vóór het begin van een beeldvormingsexperiment, om de betrouwbaarheid van de PET-kwantificering te waarborgen. Dit is absoluut noodzakelijk voor alle longitudinale studies waarbij de kwantitatieve evaluatie van de tumor en weefsels gedurende een onderzoeksperiode wordt uitgevoerd om zinvolle en vergelijkbare resultaten te produceren. Kalibratie van het systeem is vereist wanneer de nauwkeurigheid van de PET-activiteit buiten het aanbevolen bereik blijkt te liggen, evenals wanneer een verkeerde uitlijning van PET- en MR-beelden wordt ontdekt.
Hoewel de hier beschreven technieken PET-beeldvorming van de hypoxische HCC-xenografts mogelijk maken voor een breed scala aan in vivo onderzoeken, moeten enkele beperkingen worden overwogen bij het overwegen van het gebruik van deze protocollen. De creatie van HAL HCC xenografts is een complexe intra-abdominale chirurgische procedure om uit te voeren op 6-8 weken oude immunodeficiënte muizen. Bovendien kan de kleine leverslagader bij deze jonge muizen moeilijk te lokaliseren zijn, waardoor het ligatieproces technisch uitdagend is. Deze procedures vereisen voldoende opgeleid personeel om de opvolgingssnelheid van de operatie te verbeteren, evenals de overleving van muizen gedurende een bepaalde periode, d.w.z. 4-6 weken voordat xenografts zich vormen, terwijl de levering van uitgebreide dierenzorg wordt verwacht gedurende de hele operatieperiode, die zowel tijd- als middelenintensief is. Er wordt ook verwacht dat de creatie van orthotopische HCC-xenografts met behulp van deze methode ongeveer 8 weken voorafgaand aan succesvolle PET-beeldvorming zal vergen, omdat implantatie van de tumorkubus wordt gebruikt in plaats van directe injectie van celsuspensies om peritoneale metastase te voorkomen. Niettemin kunnen deze beperkingen worden overwonnen met een adequate planning en opleiding van onderzoekspersoneel. Ook is de steekproefomvang van de hier gerapporteerde experimentele groepen klein, wat mogelijk niet geschikt is voor statistische analyse. Onze waarnemingen onthullen echter subjectief een trend waarbij HAL-geïnduceerde hypoxie werd gemeten in zowel de tumor als de lever in de H2 in vergelijking met de C1-groep, die wordt ondersteund door meer prominente HIF-1α-kleuring in de H2-tumormonsters. We werken momenteel aan het uitbreiden van de tumormodellen met andere menselijke HCC-cellijnen. Ook zijn er therapeutische studies aan de gang die zich richten op de hypoxieroute in HCC waarbij deze xenografts betrokken zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We erkennen de steun van het Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) voor de beeldvormingsexperimenten met kleine dieren. We danken ook de steun van het Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) aan de Universiteit van Hong Kong voor de levering van [18 F] FMISO en [18F] FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
