Summary
여기에서 우리는 간동맥 결찰을 포함하거나 포함하지 않는 동소 간세포 암종 이종이식편을 만들고 [18 F]플루오로미소니다졸([18 F]FMISO) 및 [18F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG).
Abstract
인간 질병을 요약하는 간세포 암종(HCC)의 전임상 실험 모델은 종양 형성을 연구하고 새로운 치료 접근법을 평가하는 중요한 도구입니다. 양전자 방출 단층 촬영(PET)을 사용한 비침습적 전신 영상은 분자 수준에서 조직의 생체 내 특성에 대한 중요한 통찰력을 실시간으로 제공합니다. 우리는 여기에서 종양 저산소증을 유도하기 위한 간동맥 결찰술(HAL)을 동반하거나 동반하지 않는 동소 간세포암종 이종이식 생성을 위한 프로토콜과 [18 F]플루오로미소니다졸([18 F]FMISO) 및 [18 F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG) PET/자기 공명(MR) 영상. 종양 저산소증은 저산소증 마커 [18F]FMISO를 사용하여 쉽게 시각화할 수 있었고, [18F]FMISO 흡수는 HAL을 받은 HCC 마우스에서 비 HAL 그룹보다 더 높았지만 [18F]FDG는 두 그룹 간의 종양 저산소증을 구별할 수 없었습니다. HAL 종양은 또한 저산소증에 대한 반응으로 더 높은 수준의 저산소증 유도 인자 (HIF)-1α 발현을 나타냈다. HAL 종양의 정량화는 표준화된 값 흡수(SUV) 접근법에 기초하여 [18F]FMISO 흡수의 2.3배 증가를 보여주었다.
Introduction
간세포 암종(HCC)은 전 세계적으로 6번째로 많이 진단된 암이자 3번째로 흔한 암 사망 원인으로, 2020년에 900,000명 이상의 새로운 사례와 800,000명 이상의 사망자가 발생했습니다1. 주요 위험 인자는 바이러스 감염(B형 및 C형 간염 바이러스), 알코올 남용, 당뇨병 및 비알코올성 지방간염2의 결과로 발생하는 간경변입니다. 간세포암종의 관리는 다소 복잡하며, 병기 병기에 따라 외과적 절제술, 열적 또는 화학적 절제술, 이식, 경동맥 화학색전술, 방사선 및 화학요법을 포함한 여러 치료 옵션을 이용할 수 있다 2,3. 간세포암종은 화학요법 불응성 종양으로, 치료 요법 후 환자의 최대 70%에서 질병이 재발한다2.
높은 수준의 종양 이질성에도 불구하고, 간세포암종은 두 가지 일반적인 결과와 관련이 있다: (i) 간세포암은 매우 저산소성이고, (ii) 종양 저산소증은 더 큰 종양 공격성 및 치료 실패와 관련이 있다. HCC 세포의 통제되지 않은 증식은 혈관 형성에 앞서 높은 산소 소비율을 초래하여 저산소 미세 환경을 만듭니다. 낮은 종양 내 산소 수치는 종양 공격성 및 치료 반응에 영향을 미치는 다양한 생물학적 반응을 유발합니다. 저산소증 유발 인자(HIF)는 종종 저산소증에 대한 반응에서 필수 전사 조절자로 인식됩니다 2,3. 따라서 저산소증을 감지하는 능력은 종양 조직을 시각화하고 침습적 절차가 필요한 접근하기 어려운 부위를 식별하는 데 중요합니다. 또한 종양 공격성으로 이어지는 분자 변화를 더 잘 이해하고 환자 치료 결과를 개선하는 데 도움이 됩니다.
양전자 방출 단층 촬영(PET)을 사용한 분자 영상은 HCC를 포함한 많은 암의 진단 및 병기 결정에 일반적으로 사용됩니다. 특히, [18F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG)와 [11C]아세테이트를 포함하는 이중 추적자 PET 이미징을 함께 사용하면 HCC 진단에서 전반적인 민감도를 크게 높일 수 있습니다 4,5. 반면에 저산소증의 영상은 일반적으로 사용되는 저산소 마커 [18F]플루오로미소니다졸([18F]FMISO)을 사용하여 달성할 수 있습니다. 임상적 실습에서 저산소증의 비침습적 평가는 방사선 치료 계획을 위해 다양한 유형의 종양과 부위를 구별하는 데 중요하다6.
전임상 영상은 다양한 질병에 대한 마우스 모델의 비침습적 및 종단적 평가에 없어서는 안될 도구가 되었습니다. 강력하고 재현성이 높은 HCC 모델은 인간 HCC의 병태생리학 및 새로운 치료법 평가에 대한 전임상 및 중개 연구를 위한 중요한 플랫폼을 나타냅니다. PET 이미징과 함께 생체 내 행동을 설명하여 주어진 시점에 대한 분자 수준에서 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서 우리는 [18F]FMISO 및 [18F]FDG PET/MR을 사용하여 간동맥 결찰(HAL) 동소 HCC 이종이식편 생성 및 생체 내 종양 대사 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. HAL의 혼입은 생체 내에서 종양 저산소증을 유도하기 위해 동맥혈 공급을 효과적으로 차단할 수 있기 때문에, 생체 내에서 종양 저산소증을 연구하기 위해 형질전환 또는 화학적으로 유도된 HCC 마우스 이종이식편의 적합한 모델을 만든다 7,8. 또한, 피모니다졸을 사용한 생체 외 면역조직화학 염색과 달리, 저산소증으로 인한 종양 대사의 변화를 쉽게 시각화하고 PET 이미징을 사용하여 비침습적으로 정확하게 정량화할 수 있어 치료 반응의 종단적 평가 또는 내성 출현 측정이 가능합니다 3,7,8 . 여기에 표시된 우리의 방법을 사용하면 생체 내에서 HCC 생물학을 연구하기 위해 PET/MR 이미징을 사용하여 종양 저산소증의 비침습적 모니터링과 함께 강력한 저산소 HCC 모델을 만들 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 연구는 AAALAC(Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)의 인증을 받은 프로그램인 홍콩 대학교 비교 의학 연구 센터(CCMR)의 교육 및 연구에서 살아있는 동물 사용 위원회(CULATR)에 따라 수행되었습니다. 연구에 사용된 동물은 6-8주령의 암컷 BALB/cAnN-nu(누드) 마우스였으며 체중은 20g ± 2g이었습니다. 음식과 물은 임의로 제공되었습니다.
1. 인간 간세포 암종 세포주의 피하 주사
참고: MHCC97은 피하 HCC 이종이식 모델을 생성하는 데 사용되는 인간 HCC 세포주입니다. MHCC97L 세포는 중화인민공화국상하이 에 있는 푸단대학교 중산병원의 간암연구소로부터 입수하고9 단일연속반복(STR) 프로파일링에 의해 인증한다.
- MHCC97L 세포를 배양하고 5%CO2 가 공급된 가습 배양기에서 T-75 세포 배양 플라스크에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 배양 배지에서 유지한다( 재료 표 참조). 2일마다 배양 배지를 교체하고 80%-90% 밀도로 세포를 수확합니다.
참고: 시작 셀 번호는 1.5 x 10 6 셀이며 셀은6-8 통로 내에서 사용됩니다. - 배양액을 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(trypsin-EDTA)을 사용할 때까지 암실에서 4°C에서 보관한다. 배양 배지를 37°C로 예비하고 트립신 EDTA를 사용 전에 실온으로 예열한다. 이 섹션에 사용된 모든 시약 및 소모품에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
- 배양 배지를 제거합니다. 10mL의 멸균 인산염 완충 식염수(DPBS, 재료 표 참조)로 세포층을 헹굽니다.
- 배양 플라스크에 5 mL의 트립신-EDTA를 넣고 37°C에서 세포를 배양한다. 세포층이 분산되어 플라스크에서 완전히 분리될 때까지 20x 배율( 재료 표 참조)로 도립 현미경으로 세포를 확인합니다. 세포가 트립신-EDTA에 15분 이상 남아 있지 않은지 확인하십시오.
- 배양 플라스크에 배양 배지 5mL를 추가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 세포를 흡인합니다. 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 1,107 x g 에서 5분 동안 회전합니다( 재료 표 참조).
- 상층액을 제거하고 PBS 1mL로 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 단세포 현탁액을 얻기 위해 철저하게 피펫팅한다. 자동 세포 계수기( 재료 표 참조)를 사용하여 세포 수를 결정하고 PBS에서 5 x 106 cells/mL 농도로 세포 현탁액을 준비합니다.
- 1mL 주사기에 25G 바늘로 200μL의 세포 현탁액을 채취합니다. 각 주사기에는 1 x 106 MHCC97L 세포(200μL)가 들어 있습니다. 주사기를 젖은 얼음 위에 보관하십시오.
- 케타민(87.5mg/kg)과 자일라진(12.5mg/kg)의 혼합물을 복강내(ip) 주사하여 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사를 사용하여 적절한 마취를 확인하십시오. 건조와 각막 궤양의 잠재적인 형성을 방지하기 위해 마우스에 눈 윤활제를 바르십시오. 마우스를 멸균 패드의 앙와위 자세로 놓습니다( 재료 표 참조).
- 마우스의 아래쪽 옆구리(왼쪽 또는 오른쪽) 근처의 등쪽 부위를 70% 에탄올로 소독합니다( 재료 표 참조). 집게로 피부를 들어 올리고 바늘 경사를 피부 아래에 부드럽게 삽입합니다.
- 바늘을 빼낼 때 주사 부위에서 세포 현탁액이 우발적으로 누출되는 것을 방지하기 위해 천자 부위에서 피하 평면을 따라 바늘을 4-5mm 전진시킵니다. 바늘 삽입이 우발적인 장기 손상을 일으킬 수 있는 피부 아래 너무 깊숙이 있지 않은지 확인하십시오.
- 집게를 풀고 반대쪽을 관통하지 않도록주의하면서 주사기의 내용물을 조심스럽게 천천히 배출하십시오. 주사 부위가 부풀어 오르는지 확인하기 위해 바늘을 빼냅니다. 마우스를 미리 예열된 가열 패드 위에 있는 케이지에 다시 넣어 마취 회복을 돕고 이동성을 회복합니다. 마우스가 완전히 깨어나고 흉골 누운 자세를 유지할 때까지 마우스를 계속 모니터링합니다.
- 매주 마우스의 종양 성장과 웰빙을 모니터링합니다. 캘리퍼를 사용하여 종양 부피(V)를 측정합니다( 재료 표 참조). 하기 식10을 사용하여 종양 부피를 계산하고 기록한다.
V = (여 2× L)/2
여기서 W는 너비이고 L은 종양의 길이입니다. - 주사 후 4-6주 사이에 800-1000mm3 사이의 상당한 크기의 피하 종양이 얻어지는지 확인합니다. 총 종양 부하가 체중의 10 %를 초과하지 않도록하십시오.
2. 동소 간 이식 및 간동맥 결찰술
- 소독된 생물학적 안전 캐비닛에 다음 수술용 시약 및 도구를 준비합니다: 접시에 배양액 10mL, 10% 포비돈 요오드 용액, 70% 에탄올, 고압 멸균 수술 도구(예: 날카로운 가위, 스프링 가위, 집게(곡선 미세 및 직선 둔기), 바늘 홀더, 메스 블레이드, 6-0 및 5-0 나일론 봉합사, 가열 패드.
- 모든 수술 기구를 오토클레이브하고 멸균 벤치에서만 취급하십시오. 수술 절차 전반에 걸쳐 생쥐에게 적절하고 필요한 수술 전, 수술 중 및 수술 후 관리를 제공합니다(아래 단계 참조).
- 수술 전 통증 완화를 위해 수술 시작 최소 30분 전에 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 피하 주사합니다. 수술 후 관리 및 관리를 위해 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 8-12시간마다 한 번씩 3일 동안 지속적으로 피하 주사합니다. 이 섹션에 사용된 모든 시약 및 소모품에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
- 피하 종양이 있는 마우스를 i.p. 펜토바르비탈(330mg/kg) 주사. 메스 칼날을 사용하여 종양 부위의 피부를 절개하십시오. 피하 종양 블록을 절제하고 즉시 배양 배지로 옮깁니다. 가능한 한 빨리 이 단계를 수행합니다.
- 날카로운 수술용 가위를 사용하여 종양 블록을 1mm3 개의 작은 종양 큐브로 자릅니다. 모든 종양 큐브를 배양 배지에 보관하십시오. 피하 종양 블록의 핵심 영역을 사용하지 마십시오.
- 케타민(87.5mg/kg)과 자일라진(12.5mg/kg)의 혼합물을 i.p. 주사하여 후속 동소 종양 이식 수술을 받을 마우스를 마취합니다. 마우스를 마취하기 전에 부프레노르핀을 투여한 후 최소 30분이 경과했는지 확인하십시오. 건조와 각막 궤양의 잠재적인 형성을 피하기 위해 마우스에 눈 윤활제를 바르십시오.
- 예열된 가열 패드 위에 있는 멸균 패드에 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다. 수술 절차가 끝날 때까지 15분마다 마우스의 생리적 상태를 모니터링하고 기록합니다.
- 마우스의 팔다리를 뻗습니다. 복부 복부와 흉부의 노출을 최대화하기 위해 테이프로 고정하십시오. 마우스의 복부 피부 전체를 10 % 포비돈 요오드 용액으로 소독 한 다음 70 % 에탄올로 소독하십시오. 발가락 꼬집기(페달 철회 반사)에 반응이 없는지 확인하여 마우스의 마취 깊이를 평가합니다.
- 날카로운 가위를 사용하여 복막에 접근하기 위해 약 10mm 정중선 절개를 하여 개복술을 시행합니다. 집게로 검상돌기를 머리 쪽으로 고정하고 당기고 늑골하 견인기를 적용하여 수술 부위를 엽니다. 수술 부위를 잘 외과적으로 볼 수 있도록 적절한 절개가 이루어졌는지 확인하십시오.
- 젖은 거즈 면봉으로 중앙값과 왼쪽 돌출부를 위쪽으로 집어넣습니다. 복부 바깥쪽의 내장을 마우스의 왼쪽으로 옮기고 젖은 거즈 면봉으로 덮으십시오. 최적화된 시각화를 위해 돋보기 아래에서 췌장 머리에서 시작하여 간경의 뿌리까지 총 간동맥(CHA)에 간동맥 결찰술(HAL)을 수행합니다.
- 젖은 거즈 면봉으로 중앙 및 왼쪽 로브를 앞/아래로 집어넣어 왼쪽 엽을 노출시킵니다. 멸균 메스 블레이드로 왼쪽 엽 표면에 길이와 깊이가 약 2mm인 절개를 합니다.
참고: 종양 이식을 위해 간의 정중엽을 사용하여 인접한 복부 장기에 대한 외상으로 인한 우발적인 파열이나 열상을 최소화하는 것도 가능합니다. - 멸균 된 집게로 간 절개 부위에 종양 조각을 즉시 삽입하십시오. 종양이 간에서 안전하게 앉을 수 있도록 묻어 두십시오. 절개 부위에 6-0 나일론 봉합사로 8자 봉합사를 적용하여 간과 지혈에 적절한 종양 조각 이식을 보장합니다. 과도한 출혈을 피하기 위해 가능한 한 빨리이 수술을 수행하십시오. 완료되면 중단 된 5-0 봉합사로 복부 절개를 닫습니다.
- 마우스를 미리 예열된 가열 패드 위에 있는 케이지에 다시 넣어 마취 회복을 돕고 교정 반사를 회복합니다. 마우스가 완전히 깨어나고 흉골 누운 자세를 유지할 때까지 15분마다 마우스의 생리적 상태를 계속 모니터링하고 기록합니다.
- 모든 마우스가 동소 종양 이식을 통과 할 때까지 절차를 반복하십시오. 수술 후 3일 동안 매일 생리적 상태를 지속적으로 모니터링하여 모든 마우스에게 수술 후 관리를 제공합니다. 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 8-12시간마다 투여합니다.
3. PET/MR 교정 및 워크플로우 설정
참고: 이미징은 전임상 PET/MR 3T 시스템을 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조).
- 5% 이소플루란(1L/min 의료용 O2)을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다. 각 스캔에 대해 마취된 마우스를 지속적으로 가열하여 이미징 베드에 조심스럽게 놓습니다. 먼저 정적 [18F]FMISO 또는 [18F]FDG PET 스캔에 대한 해부학적 참조로 MR(스카우트 보기)을 사용하여 스캔한 다음 해부학적 참조 MR 이미징을 수행합니다.
- 소프트웨어에서 순차적 PET/MR 이미징 워크플로우를 생성하여 정적 PET 스캔, T1 강조(감쇠 보정) 및 T2 강조(해부학적 참조) MR 이미징, 예정된 이미징 세션 1일 전에 PET 재구성을 포함합니다.
- PET를 획득하려면 400-600keV 수준 식별, F-18 연구 동위원소, 1-5 일치 모드 및 20분 스캔을 선택합니다.
- 전신 T1 강조 MR을 획득하려면 TE = 4.3ms, TR = 16ms, 시야(FOV) = 90mm x 60mm, 여기 수(NEX) = 3, 두께 0.9mm의 슬라이스 28개, 복셀 크기 = 0.375mm3 x 0.375mm 3 x 0.9mm3의 그래디언트 에코-3D를 사용합니다.
- 전신 T2 가중 MR을 획득하려면 TE = 71.8ms, TR = 3000ms, FOV = 90mm x 60mm, NEX = 5, 0.9mm 두께의 슬라이스 28개, 복셀 크기 = 0.265mm 3 x 0.268mm3 x 0.9mm3의 고속 스핀 에코 2D를 사용합니다.
- PET를 재구성하려면 Tera-Tomo(TT3D) 알고리즘, 반복 = 8, 부분 집합 = 6, 1-3 일치 모드를 선택하고 감쇠, 데드 타임, 랜덤, 감쇠 및 산란 보정을 사용하여 전체 복셀 크기가 0.3mm인 이미지를 만듭니다3.
- 실험 시작 전에 PET 활성 테스트를 수행하여 PET 정량정확도를 확인합니다 11.
- 제조업체의 권장 사항에 따라 물이나 식염수에 희석한 5-8MBq[18F]FMISO로 5mL 주사기를 채웁니다. 선량 교정기를 사용하여 주사기의 활동을 기록하십시오( 재료 표 참조). 측정 시간을 기록하십시오.
- 전체 주사기를 덮기 위해 재구성된 이미지에 관심 볼륨(VOI)을 그립니다. 이미지에서 회복된 활동을 선량 교정기에서 얻은 값과 비교합니다. 회복된 활동이 ±5% 이내일 때 이미징 연구를 진행합니다.
4. [18 F] FMISO와 [18F] FDG 주입
- 이미징 연구를 시작하기 30분 전에 공급자로부터 [18F]FMISO의 임상 용량을 얻습니다. 방사성 물질을 취급할 때는 실험복, 장갑, 오버 안경, 필름 배지 및 링 선량계와 같은 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 방사성 물질의 교차 오염을 피하기 위해 장갑을 자주 교체하십시오.
- 방사성 저장 용액을 L-블록 탁상용 실드 뒤에 있는 납 저장 용기에 넣습니다. [18F]FMISO의 분취량을 분배하고 멸균된 식염수로 희석합니다. 총 활성 농도가 100μL에서 18-20MBq인지 확인합니다.
- 바늘이 있는 18mL주사기로 [1F]FMISO를 그립니다( 재료 표 참조). 선량 교정기에 표시된 방사능과 시간을 기록하십시오.
- 방사성 추적자를 주입하기 전에 마우스 무게를 기록합니다. 5% 이소플루란(1L/min 의료용 O2)을 사용하여 마우스를 마취한 다음 준비된 [18F]FMISO를 꼬리 정맥을 통해 조심스럽게 주입합니다. 붕괴 보정을 설명하기 위해 주사기의 주입 시간과 잔류물 활성을 기록합니다. PET 스캔 전에 [180 F]FMISO 흡수를 허용하기 위해 마우스를 케이지에 18분 동안 다시 넣습니다. [1 F]FMISO PET 후 18일 동안 마우스가 회복되도록 합니다.
참고: [18F]FMISO 및 [18F]FDG에 대한 생체 내 약동학 프로파일이 매우 다름에도 불구하고, 두 방사성 추적자는 반감기가 109.77분(< 2시간)인 PET 방사성 핵종인 F-18로 방사성 표지됩니다. PET 신호는 F-18에서 발생하기 때문에 초기 주입된 방사능의 절반은 2시간마다 손실됩니다. 이 경우 주입 후 24시간 후에 잔류 신호를 더 이상 PET 스캐너에서 감지할 수 없습니다. 또한, [18 F]FMISO(18 F]FDG(3 일) 주사 사이의 1일 간격은 [18 F]FDG PET가 수행될 때 [18 F]FMISO의 완전한 붕괴를 허용하므로 [18F]FDG PET 스캔에서 [18F]FMISO 신호가 겹치지 않습니다. - 4.1.-4.4단계를 반복합니다. 3일째 [18F]FDG 주사의 경우, 100μL에서 6-8MBq의 총 활성 농도를 PET 스캔 시작 전 60분 흡수로 주입하는 것을 제외하고.
- 다음 수식18을 사용하여 주입된 [18F]FMISO 또는 [11F]FDG 활성을 계산합니다.
주입 활성(MBq) = 주입 전 주사기의 활성 - 주입 후 주사기 내 활성
5. PET/MR 획득
- 예약된 PET 스캔 전에 공기 히터를 켜서 마우스 이미징 베드를 예열합니다. 5% 이소플루란(1L/min 의료용 O2)을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다.
- 적절하게 마취되고 발가락 꼬집음 반응을 사용하여 확인되면 조심스럽게 즉시 마우스를 가열 베드로 옮기고 마취를 2%-2.5% 이소플루란으로 유지합니다. 머리가 엎드린 마우스를 바이트 바에 놓고 건조함과 각막 궤양의 잠재적인 형성을 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 윤활제를 바릅니다. 이미징 베드를 플라스틱 시트로 덮어 베드 주변 온도를 유지합니다.
- 마우스의 호흡수와 체온을 각각 사내 호흡 패드와 열 프로브를 사용하여 모니터링하고 기록합니다. 이소플루란 수준을 조정하여 마우스의 체온이 37°C로 유지되고 호흡수가 분당 40-50회 호흡(bpm) 범위로 유지되는지 확인합니다.
- 스카우트 보기를 수행하여 스캐너 내부의 마우스 위치를 찾습니다. 몸통 영역이 MR의 중앙 FOV에 위치하도록 마우스 침대 위치를 조정하여 마우스 본체 전체를 덮습니다.
- PET 스캔을 시작하려면 스터디 목록 창에서 PET 획득을 선택한 다음 이전 획득 시 스캔 범위를 선택하여 스카우트 뷰에서 미리 결정된 마우스 베드 위치를 사용합니다. 준비(Prepare) > 확인(OK )을 클릭하여 마우스 베드를 MR에서 PET로 자동 이동하고 수집을 시작합니다.
- Radiopharmaceutical Editor에서 적절한 방사성 핵종을 선택한 다음 18 단계에서 측정 한 [18F] FMISO 또는 [4.3F] FDG 주입 전후의 주입 용량과 시간에 대한 세부 정보를 입력합니다. 및 4.4 단계. Subject Information 메뉴에서 마우스 무게를 입력합니다.
- PET 스캔이 완료되면 MR 획득을 진행합니다. 이렇게 하려면 준비를 선택하여 마우스를 PET에서 MR로 이동합니다. OK(확인 )를 클릭하여 계속합니다.
- 모든 스캔이 완료되면 홈 을 선택하여 이미징 베드를 기본 위치로 다시 이동합니다.
- 마취를 끄고 의료용 O2로 이미징 베드를 세척하십시오. 마우스 페달 인출 반사를 확인하십시오. 마취 회복을 돕고 교정 반사를 회복하기 위해 이미징 베드에서 가열 패드 위에 놓인 깨끗한 하우징 케이지로 마우스를 다시 옮깁니다.
- Raw Scan(원시 스캔)에서 PET Acquisition(PET 획득)을 선택하여 PET 재구성을 위해 수집된 원시 PET 데이터를 로드합니다. 재질 맵으로 사용할 MM을 선택합니다. 3.6단계에서 설명한 대로 매개변수를 사용하여 PET 재구성을 진행합니다.
- PET 이미징 연구 후 마우스를 취급할 때 지역 및 기관 지침을 엄격히 준수하십시오. 마우스와 직접 접촉한 모든 사용한 소모품(예: 주사기, 바늘, 장갑, 물티슈 및 생물학적 폐기물)(예: 케이지 침구 및 배설물)은 방사성 폐기물로 처리하고 현지 규정에 따라 주의해서 취급하십시오.
6. PET 이미지 분석
- 이미지 분석 소프트웨어(재료 표 참조)를 열고 DICOM 데이터 로드를 선택하여 PET 및 MR 이미지를 엽니다.
- 해당 PET 및 MR 이미지를 소프트웨어 디스플레이 창으로 드래그하고 자동 등록을 선택하여 결과 PET 및 MR 이미지의 자동 공동 등록을 수행합니다.
- Registration Setup(등록 설정) 메뉴에서 Rigid transformation(강체 변환)을 선택합니다. Shift 및 Rotation 메뉴의 Rigid/Affine 메뉴를 사용합니다.
- Global Role Selection(전역 역할 선택) 메뉴에서 MM을 Reference(참조)로, Static PET Scan(정적 PET 스캔)을 Reslice(리슬라이스)로 클릭합니다.
- 공동 등록된 PET/MR 이미지를 검사하여 적절한 정렬을 확인합니다. 필요한 경우 수동 등록을 사용하여 이미지를 수동으로 조정합니다.
- MR 이미지를 사용하여 간에서 동소 종양을 찾습니다. Interpolated Ellipse ROI 를 사용하여 참조용 MR 이미지를 사용하여 종양에 VOI를 그립니다. 생성된 종양 VOI를 MR에서 PET 이미지로 전송합니다. 브러시 도구 및 지우개 도구를 선택하여 슬라이드별로 VOI 테두리를 신중하게 정의합니다. PET 이미지에서 간에서 방사능 흡수가 유출되지 않도록 하십시오.
- 타원 VOI를 사용하여 참조 기관으로 간에 3mm3 VOI를 만듭니다. MR 이미지를 가이드로 사용하여 눈에 보이는 간혈관 및 담도 구조의 영역을 피하십시오.
- ROI 테이블 표시를 선택하여 그려진 모든 VOI의 이름을 바꿉니다. 방사능(kBq/mL) 및 종양 부피(mm3)와 같은 필요한 모든 데이터를 스프레드시트에 기록합니다. VOI 도면의 사본을 저장하고 완료되면 원시 및 재구성 된 이미징 데이터를 외장 하드 드라이브에 보관합니다.
- 다음 방정식11을 사용하여 모든 VOI에 대한 표준화된 흡수 값(SUV)을 계산합니다.
SUV = CPET(t)/(ID/BW)
여기서 CPET(t)는 VOI에서 측정된 활성, ID 는 kBq 단위로 측정된 주입 용량, BW 는 조직 밀도가 1g/mL라고 가정할 때 마우스 체중(kg)입니다.
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Representative Results
연속적인 동소 이식에 적합한 종양 블록을 얻기 위해, 먼저 DPBS(MHCC97L 세포 함유)에 200μL의 세포 현탁액을 누드 마우스의 하부 측면 내로 피하 주사하여 안정한 클론을 생성하였다(도 1A). 종양 성장을 모니터링하고, 종양 크기가 800-1000 mm3 (주사 후 약 4주)에 도달했을 때, 마우스를 안락사시키고, 생성된 종양 블록을 누드 마우스의 또 다른 배치 내로의 후속 간 동소 이식을 위해 대략 1mm3 단편으로 절단하였다 (n = 6). 마우스를 대조군(C1, n=3)과 간동맥 결찰(H2, n=3)의 두 그룹으로 무작위 배정했습니다. HAL은 간동맥의 주가지 주위에 가는 실을 묶어 수행되었습니다. C1 마우스는 동소 이식 전에 HAL로부터 보호되었다. 이 조작은 H2에서 종양 저산소증을 유발했지만 C1 마우스에서는 그렇지 않았으며 종양 저산소 상태는 PET 저산소 추적자 [18F]FMISO를 사용하여 비침습적으로 모니터링할 수 있었습니다. PET/MR 연구에 따르면 종양 [18F]FMISO 흡수의 증가는 H2 마우스에서만 관찰된 반면, 당분해 마커 [18F]FDG를 사용하면 종양 흡수가 두 그룹 간에 유사하게 유지되었습니다(그림 1B).
종양에서 HAL 유발 저산소증은 HIF-1α12의 발현 수준을 조사하여 추가로 검증되었으며 그룹 간 비교가 이루어졌습니다. HAL 후 저산소 종양이 더 많았던 것과 일관되게, H2 그룹은 C1 그룹보다 더 높은 HIF-1α 발현을 나타냈으며(광학 밀도: 각각 0.17 대 0.13, H2 대 C1), 이는 종양[18F]FMISO 흡수를 확증합니다(그림 2A). 【 18층 】 FMISO 흡수는 SUV 기반 접근 방식을 사용하여 정량화되었습니다. H2 종양은 C1 종양과 비교할 때 [18F]FMISO 흡수가 2.3배 증가한 것으로 나타났습니다(SUV최대: 각각 1.2 대 2.8, 그림 2B). 유사하게, HAL은 또한 C1 마우스보다 H2에서 더 높은 간 SUV 흡수를 초래했습니다(그림 2C). 종합하면, 여기에서 HAL이 HCC 동소 이종이식편에서 종양 저산소증을 효과적으로 유도할 수 있고 종양 저산소증은 생체 외 면역조직화학 마커 HIF-1α 발현에 의해 뒷받침되는 [18F]FMISO PET 이미징을 사용하여 비침습적으로 모니터링할 수 있음을 보여줍니다. 또한 MR 이미징의 통합은 우수한 연조직 대비를 제공하여 간에서 종양을 명확하게 묘사할 수 있어 정확한 PET 정량화가 가능합니다.
그림 1: 동소 HCC 마우스 이종이식의 생체 내 PET/MR 이미징. (A) 동소 MHCC97L 종양에서 피하 및 동소 이종이식 생성 및 PET 이미징 연구의 개략도. (B) HAL 없이 또는 (H2) 동소 MHCC97L 종양(C1)이 있는 마우스에서 [18F]FMISO 및 [18F]FDG의 대표적인 최대 강도 투영(MIP) PET 이미지. 파란색 원은 종양의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: HAL 유무에 관계없이 동소 MHCC97L 종양이 있는 마우스의 분석. (A) 대표적인 공동 등록된 [18F]FMISO PET/MR 이미지, HIF-1α에 대한 면역조직화학 염색, 종양 섹션의 헤마톡실린 및 에오신(HE). (비씨) 종양 및 간에서 [18F]FMISO 흡수의 정량 분석. 각 그룹에 대해 N = 3입니다. SUV의 값은 평균± 표준 오차 평균(SEM)으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서 우리는 [18F]FMISO 및 [18F]FDG PET/MR을 사용하여 동소 이종 이식편에서 종양 저산소증의 비침습적 모니터링 방법과 함께 피하 종양을 사용하여 간 동소 HCC 이종이식편에 HAL을 수행하는 절차를 설명했습니다. 우리의 관심은 조기 진단 및 치료 반응 평가를 위한 다양한 암 및 질병 모델의 대사 영상에 있습니다11,13,14,15. 현재까지 HAL HCC 이종이식의 생성과 생체 내 종양 대사는 문헌에 거의 설명되지 않았으며, 이로 인해 PET 이미징을 사용하여 이러한 종양 모델의 대사 특성을 조사하게 되었습니다.
HCC에서 저산소증을 연구하기 위한 강력한 마우스 모델로서 HAL을 사용한 동소 이종이식편의 성공적인 확립은 생체 내에서 HCC 생물학을 연구하기 위한 중요한 측면을 나타냅니다. 저산소증은 암 악성 종양을 자극하는 것으로 알려져 있습니다. 또한, 종양 내 저산소증은 증식, 전이, 방사선 및 화학 저항성 향상과 관련이 있으며 저산소 상태에 대한 반응의 철저한 특성화를 보증한다7. 간세포암종 종양 형성 또는 치료 전략을 연구하기 위해 피하 이종이식은 종종 사용되지만, 동소 모델은 종양 미세환경, 특히 간세포암종 전이에 대한 혈관형성 및 종양-기질 상호작용에 미치는 영향을 보다 정확하게 반영하기 때문에 인간 간세포암종 발달을 더 잘 요약할 수 있다12. HAL을 HCC 동소 마우스에 혼입시키는 것은 종양으로의 간 동맥 혈액 공급을 차단함으로써 종양내 저산소증의 유도를 허용한다7. 이러한 동물 모델은 간세포암종에 대한 HAL의 효과의 기전을 밝히고 간세포암종에서 저산소증 경로를 표적으로 하는 효과적인 치료법을 위한 새로운 길을 만들 수 있습니다. 동소 이식을 위해 HCC 세포 현탁액을 직접 주입하는 대신 피하 종양의 종양 큐브를 활용했습니다. 우리는 직접 세포 주입이 낮은 주입량으로 가능한 한 천천히 절차를 수행했음에도 불구하고 주사 부위에서 소량의 누출을 유발하는 경우가 많다는 것을 발견했습니다. 이것은 잠재적으로 복막 전이로 이어질 수 있으며, 이는 동물의 웰빙에 해롭고 궁극적으로 전체 연구 결과에 영향을 미칩니다. 반면에 작은 종양 블록을 이식하면 문제를 극복할 수 있지만 이식 후 종양이 안전하게 봉합되도록 주의를 기울여야 합니다. 피하 종양 블록에서 작은 종양 큐브를 분리 할 때, 저산소증과 영양 결핍으로 인해 상대적으로 혈관이 덜 형성되고 대사 적으로 스트레스를받는 고형 종양의 핵심 영역을 피하는 것이 좋습니다. 그렇게 하면 작은 종양 큐브 내에 괴사된 것으로 보이는 죽은 종양 세포의 포함이 줄어들고 개별 마우스에서 보다 일관된 종양 성장률을 유지할 수 있습니다.
저산소증은 암 저항성의 예후 인자이며, PET를 사용하여 저산소증의 변화를 모니터링하면 높은 민감도와 특이성으로 저산소 조직을 검출하고 정량화 할 수 있습니다. [18F]FMISO 및 [18F]FDG PET에 대한 중요한 고려 사항은 마우스의 방사성 추적자 흡수 시간 및 투여 경로와 관련이 있습니다. 두 방사성 추적자는 생체 내 약동학이 다르며, 하나는 [18F]FMISO 및 [18F]FDG에 대해 장/방광 및 심장/방광에서 각각 관찰되는 생리학적 흡수 차이이고, 다른 하나는 [18F]FMISO가 종양의 저산소 영역에 축적되고 [18F]FDG가 높은 대사성 종양 영역 16에서 우선적으로 흡수된다는 것입니다. [18F]FMISO의 높은 친유성과 느린 간 청소율은 우수한 종양 대 간 조영제를 얻기 위해 주사 후 2-4시간의 시간이 필요합니다17. 우리는 주사 후 3시간이 저산소증(H2) 및 대조군(C1) 그룹 모두에 대해 간에서 종양[18F]FMISO 흡수를 구별하고 묘사하기에 충분하다는 것을 발견했습니다. [18F]FDG PET의 경우, 주입 후 1시간의 시간은 이전에 설명한 바와 같이 좋은 대비를 생성하기에 적절하며,13,15, 이 연구에 사용되었습니다. 그럼에도 불구하고, 특히 SUV 기반 분석의 경우 PET 결과의 신뢰성을 보장하기 위해서는 일관된 방사성 추적자 흡수 시간을 유지하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 생쥐에게 방사성 추적자를 투여하기 위해 정맥 주사 기술을 사용했습니다. 성공적인 꼬리 정맥 주사는 바늘이 정맥 내에 정확하게 위치하는 방사성 추적자 주입 전에 가시적인 혈액 역화로 표시됩니다. 이 방법의 주요 단점은 예상되는 혈액 역화가 저혈압으로 인해 관찰하기 어려울 수 있으며 생쥐 간에 가변성이 관찰된다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 이러한 어려움은 바늘을 삽입하기 전에 따뜻한 수건이나 열 램프로 꼬리를 따뜻하게 하여 혈류를 증가시키고 성공적인 주사를 위해 정맥 가시성을 개선함으로써 극복할 수 있습니다.
작은 동물에서 방사성 추적자 생체 분포를 정량화하기 위해 PET 이미징의 사용이 증가함에 따라 주목해야 할 중요한 고려 사항은 정확하고 잘 보정된 PET 스캐너를 사용하여 우수하고 재현 가능하며 정량화 가능한 PET 데이터를 생성하는 것입니다. 정확한 PET 시스템을 통해 보다 시간 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 이미징 연구를 수행할 수 있으며 동물 연구에서 3R 원칙(교체, 감소 및 정제)을 구현할 수 있습니다. 이러한 이유로 제조업체의 권장 사항에 따라 이미징 시스템의 PET 및 MR 구성 요소를 검사하기 위해 일상적인 품질 관리 검사를 가급적이면 매주 수행해야 합니다. 특히, PET 정량화의 신뢰성을 보장하기 위해 이미징 실험을 시작하기 전뿐만 아니라 PET 활성에 대한 정확도를 자주 확인하고 기록해야 합니다. 이는 의미 있고 비교 가능한 결과를 얻기 위해 검사 기간 동안 종양 및 조직의 정량적 평가와 관련된 모든 종단 연구에 필수적입니다. PET 활동 정확도가 권장 범위를 벗어난 경우와 PET 및 MR 이미지의 정렬 불량이 발견된 경우 시스템 보정이 필요합니다.
여기에 설명된 기술은 광범위한 생체 내 조사를 위해 저산소 HCC 이종이식편의 PET 이미징을 가능하게 하지만 이러한 프로토콜의 사용을 고려할 때 몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. HAL HCC 이종이식편의 생성은 6-8주령의 면역결핍 마우스에서 수행하는 복잡한 복강내 수술 절차입니다. 또한, 이 어린 생쥐의 작은 간동맥은 찾기가 어려울 수 있어 결찰 과정이 기술적으로 어려울 수 있습니다. 이러한 절차는 수술 승계율을 개선하고 일정 기간(즉, 이종 이식편이 형성되기 4-6주 전)에 걸쳐 마우스의 생존을 개선하기 위해 적절하게 훈련된 인력이 필요하며, 수술 기간 동안 광범위한 동물 관리 제공이 예상되며, 이는 시간과 자원 집약적입니다. 또한 복막 전이를 피하기 위해 세포 현탁액을 직접 주입하는 대신 종양 큐브를 이식하기 때문에 이 방법을 사용하여 동소 간세포암종 이종이식을 만드는 데 성공적인 PET 이미징 약 8주가 필요할 것으로 예상됩니다. 그럼에도 불구하고 이러한 한계는 연구 직원의 적절한 계획과 교육을 통해 극복할 수 있습니다. 또한 여기에 보고된 실험 그룹의 표본 크기가 작아 통계 분석에 적합하지 않을 수 있습니다. 그러나 우리의 관찰은 H2 종양 샘플에서 더 두드러진 HIF-1α 염색에 의해 뒷받침되는 C1 그룹과 비교하여 H2의 종양과 간 모두에서 HAL 유발 저산소증이 측정되는 경향을 주관적으로 보여줍니다. 우리는 현재 다른 인간 HCC 세포주로 종양 모델을 확장하기 위해 노력하고 있습니다. 또한, 이러한 이종이식편과 관련된 간세포암종의 저산소증 경로를 표적으로 하는 치료 연구가 진행 중이다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 작은 동물 이미징 실험에 대한 홍콩 항암 신탁 기금, 홍콩 연구 보조금 위원회 공동 연구 기금(CRF C7018-14E)의 지원을 인정합니다. 또한 [18F]FMISO 및 [18F]FDG를 제공한 홍콩 대학교의 MIMCC(Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center)의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
