Summary
Здесь мы представляем протокол для создания ксенотрансплантатов ортотопической гепатоцеллюлярной карциномы с перевязкой печеночной артерии и без нее и выполняем неинвазивную позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) гипоксии опухоли с использованием [18 F] фторизонидазола ([18 F]FMISO) и [18 F] фтордезоксиглюкозы ([18F]FDG).
Abstract
Доклинические экспериментальные модели гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), которые повторяют заболевание человека, представляют собой важный инструмент для изучения онкогенеза и оценки новых терапевтических подходов. Неинвазивная визуализация всего тела с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) дает критическое представление о характеристиках тканей in vivo на молекулярном уровне в режиме реального времени. Мы представляем здесь протокол создания ортотопического ксенотрансплантата ГЦК с перевязкой печеночной артерии (HAL) и без нее, чтобы вызвать гипоксию опухоли и оценить их опухолевый метаболизм in vivo с использованием [18 F] фторизонидазола ([18 F]FMISO) и [18 F] фтордезоксиглюкозы ([18F] FDG) ПЭТ/магнитно-резонансной (МРТ) томографии. Гипоксию опухоли можно было легко визуализировать с помощью маркера гипоксии [18 F]FMISO, и было обнаружено, что поглощение [18 F] FMISO было выше у мышей с ГЦК, перенесших HAL, чем в группе без HAL, тогда как [18F]FDG не мог различить гипоксию опухоли между двумя группами. Опухоли HAL также показали более высокий уровень экспрессии индуцируемого гипоксией фактора (HIF)-1α в ответ на гипоксию. Количественная оценка опухолей HAL показала 2,3-кратное увеличение поглощения [18F] FMISO на основе стандартизированного подхода поглощения стоимости (SUV).
Introduction
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является шестым наиболее диагностируемым раком и третьей по распространенности причиной смерти от рака во всем мире: в 2020 году было зарегистрировано более 900 000 новых случаев и 800 000 смертей1. Основным фактором риска является цирроз печени, который возникает в результате вирусных инфекций (вирусов гепатита В и С), злоупотребления алкоголем, диабета и неалкогольного стеатогепатита2. Лечение ГЦК довольно сложное, и существует несколько вариантов лечения, включая хирургическую резекцию, термическую или химическую абляцию, трансплантацию, трансартериальную химиоэмболизацию, лучевую терапию и химиотерапию, в зависимости от стадии заболевания 2,3. ГЦК представляет собой рефрактерную к химиотерапии опухоль с рецидивом заболевания у 70% пациентов после лечебной терапии2.
Несмотря на высокую степень гетерогенности опухоли, ГЦК связан с двумя общими исходами: (i) ГЦК очень гипоксичен и (ii) гипоксия опухоли связана с большей агрессивностью опухоли и неэффективностью лечения. Неконтролируемая пролиферация клеток ГЦК приводит к высокой скорости потребления кислорода, которая предшествует васкуляризации, создавая тем самым гипоксическое микроокружение. Низкий внутриопухолевый уровень кислорода вызывает ряд биологических реакций, которые влияют на агрессивность опухоли и реакцию на лечение. Индуцируемые гипоксией факторы (HIF) часто признаются важными транскрипционными регуляторами в ответ на гипоксию 2,3. Следовательно, способность обнаруживать гипоксию имеет решающее значение для визуализации опухолевых тканей и выявления труднодоступных участков, которые требуют инвазивных процедур. Это также помогает лучше понять молекулярные изменения, которые приводят к агрессивности опухоли, и улучшить результаты лечения пациентов.
Молекулярная визуализация с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) обычно используется для диагностики и определения стадии многих видов рака, включая ГЦК. В частности, комбинированное использование ПЭТ-визуализации с двумя индикаторами с участием [18 F] фтордезоксиглюкозы ([18F] ФДГ) и [11C] ацетата может значительно повысить общую чувствительность при диагностике ГЦК 4,5. С другой стороны, визуализация гипоксии может быть достигнута с помощью широко используемого гипоксического маркера [18 F] фторизонидазола ([18F]FMISO). В клинической практике неинвазивная оценка гипоксии важна для дифференциации различных типов опухолей и областей для планирования лучевой терапии6.
Доклиническая визуализация стала незаменимым инструментом для неинвазивной и продольной оценки моделей мышей для различных заболеваний. Надежная и воспроизводимая модель ГЦК представляет собой важную платформу для доклинических и трансляционных исследований патофизиологии ГЦК человека и оценки новых методов лечения. Вместе с ПЭТ-визуализацией поведение in vivo может быть выяснено, чтобы обеспечить важную информацию на молекулярном уровне для любого заданного момента времени. Здесь мы описываем протокол генерации ортотопических ксенотрансплантатов ГЦК для перевязки печеночной артерии (HAL) и анализа их опухолевого метаболизма in vivo с использованием [18 F]FMISO и [18F]FDG PET/MR. Включение HAL делает подходящую модель трансгенных или химически индуцированных ксенотрансплантатов мышей ГЦК для изучения гипоксии опухоли in vivo, поскольку HAL может эффективно блокировать артериальное кровоснабжение, вызывая внутриопухолевую гипоксию 7,8. Кроме того, в отличие от иммуногистохимического окрашивания ex vivo с использованием пимонидазола, изменения метаболизма опухоли в результате гипоксии могут быть легко визуализированы и точно количественно количественно неинвазивно с помощью ПЭТ-визуализации, что позволяет проводить продольную оценку ответа на лечение или измерять возникновение резистентности 3,7,8 . Наш метод, показанный здесь, позволяет создать надежную гипоксическую модель ГЦК вместе с неинвазивным мониторингом гипоксии опухоли с использованием ПЭТ/МРТ для изучения биологии ГЦК in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных проводились в соответствии с Комитетом по использованию живых животных в обучении и исследованиях (CULATR) в Центре сравнительных медицинских исследований (CCMR) при Университете Гонконга, программой, аккредитованной Ассоциацией по оценке и аккредитации Международной организации по уходу за лабораторными животными (AAALAC). Животные, использованные в исследовании, были самками мышей BALB/cAnN-nu (обнаженных) в возрасте 6-8 недель, весом 20 г ± 2 г. Пища и вода предоставлялись ad libitum.
1. Подкожная инъекция клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы человека
ПРИМЕЧАНИЕ: MHCC97 представляет собой клеточную линию ГЦК человека, которая используется для создания подкожной модели ксенотрансплантата ГЦК. Клетки MHCC97L получены из Института рака печени, больницы Чжуншань Фуданьского университета, Шанхай, Китайская Народная Республика9 и аутентифицированы с помощью профилирования с коротким тандемным повтором (STR).
- Культивируют клетки MHCC97L и поддерживают в питательных средах с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина и стрептомицина в колбе для культивирования клеток T-75 при 37 °C в увлажненном инкубаторе, снабженном 5% CO2 (см. Таблицу материалов). Меняйте питательную среду каждые 2 дня и собирайте клетки при слиянии 80-90%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начальный номер ячейки составляет 1,5 x 10 6 ячеек, и ячейки используются в пределах6-8 проходов. - Храните питательные среды и трипсин-этилендиаминтетрауксусную кислоту (трипсин-ЭДТА) при температуре 4 °C в темноте до использования. Перед использованием предварительно подогрейте питательную среду до 37 °C, а трипсин-ЭДТА до комнатной температуры. Обратитесь к Таблице материалов для всех реагентов и расходных материалов, используемых в этом разделе.
- Удалите питательную среду. Промойте клеточный слой 10 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (DPBS, см. Таблицу материалов).
- Добавьте 5 мл трипсина-ЭДТА в колбу для культивирования и инкубируйте клетки при 37 ° C. Проверяйте клетки под инвертированным микроскопом при 20-кратном увеличении (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока клеточный слой не рассеется и полностью не отделится от колбы. Убедитесь, что клетки не остаются в трипсина-ЭДТА более чем на 15 минут.
- Добавьте 5 мл питательных сред в колбу для культуры. Аспирируйте клетки, аккуратно пипетируя. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и отжимайте при 1,107 x g в течение 5 мин (см. Таблицу материалов).
- Удалите надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу с 1 мл PBS. Тщательно проведите пипетку, чтобы получить одноклеточную суспензию. Определите номер ячеек с помощью автоматизированного счетчика ячеек (см. Таблицу материалов) и приготовьте клеточную суспензию до концентрации 5 х 106 клеток/мл в PBS.
- Наберите 200 мкл клеточной суспензии иглой 25 г в шприц объемом 1 мл. Каждый шприц содержит 1 x 106 клеток MHCC97L (в 200 мкл). Держите шприц на мокром льду.
- Обезболивают мышей внутрибрюшинной (в/) инъекцией смеси кетамина (87,5 мг/кг) и ксилазина (12,5 мг/кг). Обеспечьте надлежащую анестезию с помощью рефлекса защемления пальцев ног. Обязательно нанесите смазку для глаз на мышь, чтобы предотвратить высыхание и возможное образование язв роговицы. Поместите мышь в положение лежа на спине на стерильной подушке (см. Таблицу материалов).
- Стерилизуйте дорсальную область возле нижнего фланга (левой или правой стороны) мыши 70% этанолом (см. Таблицу материалов). Поднимите кожу щипцами и аккуратно вставьте иглу под кожу.
- Продвинуть иглу на 4-5 мм вдоль подкожной плоскости от места прокола во избежание случайного вытекания клеточной суспензии из места инъекции при извлечении иглы. Убедитесь, что введение иглы не находится слишком глубоко под кожей, что может привести к случайному повреждению органов.
- Отпустите щипцы и осторожно и медленно выгрузите содержимое шприца, стараясь не проникнуть в противоположную сторону. Вытащите иглу, чтобы проверить, нет ли отека на месте инъекции. Поместите мышь обратно в клетку, сидящую поверх предварительно разогретой грелки, чтобы помочь восстановиться после анестезии и восстановить подвижность. Продолжайте следить за мышью до тех пор, пока она полностью не проснется и не сохранит лежачее положение грудины.
- Еженедельно следите за ростом опухоли и самочувствием мыши. Измерьте объем опухоли (V) с помощью штангенциркуля (см. Таблицу материалов). Рассчитайте и запишите объем опухоли по следующей формуле10:
V = (Ш 2× л)/2
где W — ширина, а L — длина опухоли. - Через 4-6 недель после инъекции убедитесь, что получен значительный размер подкожной опухоли, между 800-1000 мм3 . Следите, чтобы общая опухолевая нагрузка не превышала 10% от массы тела.
2. Ортотопическая имплантация печени и перевязка печеночной артерии
- В продезинфицированном шкафу биологической безопасности готовят следующие хирургические реагенты и инструменты: 10 мл питательных сред в посуде, 10% раствор повидон-йода, 70% этанол, автоклавные хирургические инструменты, т. е. острые ножницы, пружинные ножницы, щипцы (изогнутые тонкие и прямые тупые), иглодержатель, лезвие скальпеля, нейлоновый шов 6-0 и 5-0, грелка.
- Автоклавируйте все хирургические инструменты и обрабатывайте их только на стерильной скамье. Обеспечьте адекватный и необходимый до-, интра- и послеоперационный уход за мышами на протяжении всех хирургических процедур (см. Шаги ниже).
- Для облегчения боли перед операцией вводите мышь подкожную инъекцию бупренорфина (0,1 мг / кг) не менее чем за 30 минут до начала хирургической процедуры. Для послеоперационного ухода и ведения вводите мышам подкожную инъекцию бупренорфина (0,1 мг / кг) в течение 3 дней непрерывно, один раз каждые 8-12 часов. Обратитесь к Таблице материалов для всех реагентов и расходных материалов, используемых в этом разделе.
- Усыпить мышь с подкожной опухолью с помощью внутривенной инъекции пентобарбитала (330 мг / кг). Сделайте разрез на коже места опухоли с помощью лезвия скальпеля. Иссекают подкожный опухолевый блок и сразу же переносят его на питательную среду. Выполните этот шаг как можно быстрее.
- Разрежьте опухолевый блок на3 небольших опухолевых куба толщиной 1 мм с помощью острых хирургических ножниц. Храните все опухолевые кубики в питательной среде. Избегайте использования основной области подкожного опухолевого блока.
- Обезболите мышь, которая будет проходить последующую операцию по имплантации ортотопической опухоли, с помощью внутривенной инъекции смеси кетамина (87,5 мг / кг) и ксилазина (12,5 мг / кг). Убедитесь, что прошло не менее 30 минут после введения бупренорфина перед анестезией мыши. Обязательно нанесите смазку для глаз на мышь, чтобы избежать высыхания и возможного образования язв роговицы.
- Поместите мышь в положение лежа на спине на стерильной подушечке, которая находится поверх предварительно разогретой грелки. Контролируйте и записывайте физиологическое состояние мыши каждые 15 минут до окончания хирургической процедуры.
- Вытяните конечности мыши. Закрепите их лентой, чтобы максимально обнажить брюшную полость живота и грудную клетку. Стерилизуют всю кожу живота мыши 10% раствором повидон-йода, а затем 70% этанолом. Оцените глубину анестезии мыши, проверив отсутствие реакции на защемление пальца ноги - рефлекс отвода педали.
- Выполните лапаротомию, сделав разрез примерно 10 мм по средней линии, чтобы получить доступ к брюшине с помощью острых ножниц. Зажмите и потяните мечевидный отросток к головке щипцами и примените подреберные ретракторы, чтобы открыть операционное поле. Убедитесь, что сделан надлежащий разрез, чтобы обеспечить хороший хирургический обзор места операции.
- Втяните срединную и левую доли вверх с помощью влажного марлевого тампона. Переместите кишечник за пределы брюшной полости на левую сторону мыши и накройте его влажным марлевым тампоном. Выполните перевязку печеночной артерии (HAL) на общей печеночной артерии (CHA), которая начинается от головки поджелудочной железы к ее корню в печеночной ножке, под увеличительной лампой для оптимизации визуализации.
- Втяните срединную и левую доли назад/вниз влажным марлевым тампоном, чтобы обнажить левую долю. Сделайте надрез примерно 2 мм в длину и глубину на поверхности левой доли стерильным лезвием скальпеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать срединную долю печени для имплантации опухоли, чтобы свести к минимуму случайные разрывы или рваные раны в результате травмы соседних органов брюшной полости. - Сразу же вставьте фрагмент опухоли в разрез печени стерильными щипцами. Закопайте опухоль так, чтобы она надежно сидела в печени. Наложите на место разреза шов в виде восьмерки с нейлоновым швом 6-0, чтобы обеспечить правильную имплантацию опухолевого фрагмента в печень и гемостаз. Выполняйте эту операцию как можно быстрее, чтобы избежать чрезмерного кровотечения. По завершении закрыть разрез брюшной полости прерванными швами 5-0.
- Поместите мышь обратно в клетку, сидящую поверх предварительно разогретой грелки, чтобы помочь восстановиться после анестезии и восстановить рефлекс выпрямления. Продолжайте контролировать и записывать физиологическое состояние мыши каждые 15 минут, пока мышь полностью не проснется и не сохранит лежачее положение грудины.
- Повторяйте процедуру до тех пор, пока все мыши не пройдут имплантацию ортотопической опухоли. Обеспечьте послеоперационный уход за всеми мышами, постоянно контролируя их физиологическое состояние ежедневно в течение следующих 3 дней после хирургической операции. Давать бупренорфин (0,1 мг/кг) каждые 8-12 ч.
3. Настройка калибровки ПЭТ/МРТ и рабочего процесса
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация выполняется с использованием доклинической системы ПЭТ/МРТ 3Т (см. Таблицу материалов).
- Используйте 5% изофлуран (1 л / мин медицинскийO2) для анестезии мыши в индукционной камере. Для каждого сканирования осторожно помещайте анестезированную мышь на кровать для визуализации с непрерывным нагревом; во-первых, сканирование с помощью МРТ (вид разведчика) в качестве анатомического эталона для статического ПЭТ-сканирования [18 F]FMISO или [18F] FDG, а затем анатомическая эталонная МР-томография.
- Создайте последовательный рабочий процесс ПЭТ/МРТ в программном обеспечении (см. Таблицу материалов), чтобы включить статическое ПЭТ-сканирование, Т1-взвешенную (коррекция затухания) и Т2-взвешенную (анатомическая эталонную) МРТ-томографию и реконструкцию ПЭТ за 1 день до запланированного сеанса визуализации.
- Чтобы получить ПЭТ, выберите дискриминацию на уровне 400-600 кэВ, изотоп исследования F-18, режим совпадения 1-5 и 20-минутное сканирование.
- Чтобы получить T1-взвешенный МРТ всего тела, используйте градиентное эхо-3D с TE = 4,3 мс, TR = 16 мс, полем зрения (FOV) = 90 мм x 60 мм, количеством возбуждений (NEX) = 3, 28 срезов толщиной 0,9 мм и размером вокселя = 0,375 мм, 3 x 0,375 мм,3 x 0,9мм3.
- Для получения T2-взвешенной МРТ всего тела используйте эхо быстрого вращения 2D с TE = 71,8 мс, TR = 3000 мс, FOV = 90 мм x 60 мм, NEX = 5, 28 срезов толщиной 0,9 мм, размер вокселя = 0,265 мм, 3 x 0,268 мм,3 x 0,9мм3.
- Чтобы реконструировать ПЭТ, выберите алгоритм Tera-Tomo (TT3D), итерации = 8, подмножества = 6, режим совпадения 1-3 и с поправками на затухание, мертвое время, случайность, затухание и рассеяние, чтобы создать изображения с общим размером вокселя 0,3 мм3.
- Перед началом эксперимента проведите тест на активность ПЭТ, чтобы проверить точность количественного определения ПЭТ11.
- Наполните шприц объемом 5 мл 5-8 МБк [18F]FMISO, разведенным в воде или физиологическом растворе, в соответствии с рекомендацией производителя. Используйте калибратор дозы для регистрации активности шприца (см. Таблицу материалов). Обратите внимание на время измерения.
- Нарисуйте интересующий объем (VOI) на реконструированном изображении, чтобы покрыть весь шприц. Сравните восстановленную активность по изображению со значением, полученным с помощью калибратора дозы. Приступайте к визуализирующим исследованиям, когда восстановленная активность будет точной в пределах ±5%.
4. [18 Ф] FMISO и [18F] Впрыск ФДГ
- Получите клиническую дозу [18F]FMISO от поставщика за 30 минут до начала визуализирующих исследований. При работе с радиоактивными материалами надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как лабораторный халат, перчатки, очки, значок с пленкой и кольцевые дозиметры. Часто меняйте перчатки, чтобы избежать перекрестного загрязнения радиоактивными веществами.
- Поместите радиоактивные растворы в контейнер для хранения свинца за настольным экраном L-блока. Распределите аликвоту [18F]FMISO и разбавьте стерилизованным физиологическим раствором. Убедитесь, что общая концентрация активности составляет 18-20 МБк в 100 мкл.
- Составьте [18F]FMISO с помощью шприца объемом 1 мл с иглой (см. Таблицу материалов). Запишите радиоактивность и время, показанные на измерителе дозы.
- Запишите вес мыши перед инъекцией радиоиндикатора. Используйте 5% изофлуран (1 л / мин медицинский O2) для анестезии мыши, затем осторожно введите приготовленный [18F]FMISO через хвостовую вену. Запишите время инъекции и остаточную активность шприца, чтобы учесть коррекцию распада. Поместите мышь обратно в клетку на 180 минут, чтобы обеспечить поглощение FMISO [18F] перед ПЭТ-сканированием. Дайте мыши восстановиться в течение 1 дня после [18F]FMISO PET.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на очень разные фармакокинетические профили in vivo для [18 F]FMISO и [18 F]FDG, оба радиоиндикатора имеют радиоактивную метку F-18, который представляет собой радионуклид ПЭТ с периодом полураспада 109,77мин (< 2 ч). Поскольку сигнал ПЭТ исходит от F-18, половина первоначальной введенной радиоактивности будет теряться каждые 2 часа. В этом случае остаточный сигнал через 24 часа после инъекции больше не может быть обнаружен ПЭТ-сканером. Кроме того, 1-дневный промежуток между инъекциями [18 F]FMISO (1-й день) и [18 F] FDG (3-й день) позволит полностью разрушить [18 F]FMISO при выполнении [18 F]FDG PET, следовательно, не будет перекрытия сигнала [18 F]FMISO при ПЭТ-сканировании [18F] FDG. - Повторите шаги 4.1.-4.4. для инъекции [18F] ФДГ на 3-й день, за исключением того, что общая концентрация активности 6-8 МБк в 100 мкл вводится с поглощением за 60 минут до начала ПЭТ-сканирования.
- Рассчитайте инжектированную активность [18F]FMISO или [18F]FDG, используя следующую формулу 11:
Инъекционная активность (MBq) = Активность в шприце до инъекции - Активность в шприце после инъекции
5. Приобретение ПЭТ/МР
- Включите воздушный обогреватель, чтобы согреть кровать визуализации мыши перед запланированным ПЭТ-сканированием. Используйте 5% изофлуран (1 л / мин медицинскийO2) для анестезии мыши в индукционной камере.
- После надлежащей анестезии и проверки с помощью реакции защемления пальцев ног осторожно и немедленно перенесите мышь в нагревательную кровать и поддерживайте анестезию на уровне 2-2,5% изофлурана. Положите мышь лежащей головой на полосу укуса и нанесите смазку для глаз на оба глаза, чтобы избежать высыхания и возможного образования язв роговицы. Накройте кровать для визуализации пластиковым листом, чтобы поддерживать температуру окружающей среды кровати.
- Контролируйте и записывайте частоту дыхания и температуру тела мыши с помощью встроенной дыхательной подушечки и термозонда соответственно. Убедитесь, что температура тела мыши поддерживается на уровне 37 °C, а частота дыхания поддерживается в диапазоне 40-50 вдохов в минуту (уд/мин), регулируя уровень изофлурана.
- Выполните скаутское представление, чтобы определить положение мыши внутри сканера. Отрегулируйте положение лежанки мыши, чтобы покрыть все тело мыши, при этом область туловища расположена в центре поля зрения MR.
- Чтобы начать ПЭТ-сканирование, выберите « Получение ПЭТ» в окне списка исследований, затем выберите «Диапазон сканирования при предыдущем сборе », чтобы использовать заранее определенное положение лежанки мыши в представлении разведчика. Нажмите « Подготовить» > «ОК», чтобы автоматически переместить ложе мыши из MR в PET и начать сбор.
- В редакторе радиофармпрепаратов выберите соответствующий радионуклид, затем введите сведения о дозе инъекции и времени до и после инъекции [18 F]FMISO или [18F]FDG, как измерено на шаге 4.3. и шаг 4.4. Введите вес мыши в меню «Информация о предмете».
- Приступайте к получению МРТ после завершения ПЭТ-сканирования. Для этого выберите Подготовиться , чтобы переместить мышь в MR из PET. Нажмите кнопку ОК , чтобы продолжить.
- После завершения всех сканирований выберите « Главная », чтобы переместить станок визуализации обратно в положение по умолчанию.
- Выключите анестезию и промойте томографическую кровать медицинским O2. Проверьте рефлекс отвода педали мыши. Перенесите мышь с кровати визуализации обратно в чистую клетку, расположенную поверх грелки, чтобы помочь восстановиться после анестезии и восстановить рефлекс выпрямления.
- В разделе « Необработанное сканирование» выберите «Получение ПЭТ», чтобы загрузить полученные необработанные данные ПЭТ для реконструкции ПЭТ . Выберите MM для использования в качестве карты материалов. Продолжите реконструкцию ПЭТ, используя параметр, описанный в шаге 3.6.
- Строго придерживайтесь местных и институциональных рекомендаций при работе с мышами после исследований ПЭТ-визуализации. Относитесь ко всем использованным расходным материалам, например, шприцам, иглам, перчаткам, салфеткам и биологическим отходам, например, подстилке клетки и фекалиям, которые находились в непосредственном контакте с мышью, как к радиоактивным отходам, и обращайтесь с ними осторожно в соответствии с местными правилами.
6. Анализ ПЭТ-изображений
- Откройте программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалов) и выберите «Загрузить данные DICOM », чтобы открыть изображения ПЭТ и МРТ.
- Перетащите соответствующие изображения ПЭТ и МРТ в окно отображения программного обеспечения и выберите «Автоматическая регистрация », чтобы выполнить автоматическую совместную регистрацию результирующих изображений ПЭТ и МРТ.
- В меню « Настройка регистрации » выберите « Жесткое преобразование». Используйте « Shift » и « Поворот» в меню «Жесткий/аффинный ».
- В меню « Выбор глобальной роли » выберите « MM в качестве эталона » и « Статическое сканирование ПЭТ в качестве разреза».
- Осмотрите совместно зарегистрированные изображения ПЭТ/МРТ, чтобы убедиться в правильности выравнивания. При необходимости используйте ручную регистрацию для настройки изображений вручную.
- Найдите ортотопическую опухоль в печени с помощью МРТ-изображения. Используйте интерполированный эллипс ROI , чтобы нарисовать VOI на опухоли, используя МРТ-изображение для справки. Перенесите созданный опухолевый VOI с МРТ на ПЭТ-изображение. Выберите инструменты «Кисть » и « Ластик», чтобы аккуратно определить границу VOI слайд за слайдом. Убедитесь, что на ПЭТ-изображении не происходит утечки радиоактивности из печени.
- Используйте эллипсоид VOI для создания 3 мм3 VOI на печени в качестве эталонного органа. Убедитесь, что вы избегаете областей видимых печеночных, сосудистых и желчевыводящих структур, используя МРТ-изображение в качестве ориентира.
- Выберите Показать таблицу ROI , чтобы переименовать все нарисованные VOI. Запишите все необходимые данные, например, радиоактивность (кБк/мл) и объем опухоли (мм3), в электронную таблицу. Сохраните копию чертежей VOI и заархивируйте как необработанные, так и восстановленные данные изображения на внешний жесткий диск после завершения.
- Рассчитайте стандартизованное значение поглощения (SUV) для всех VOI, используя следующее уравнение11:
Внедорожник = CPET (t) / (ID / BW)
где CPET (t) - измеренная активность в VOI, ID - введенная доза, измеренная в кБк, а BW - масса тела мыши в кг, предполагая, что плотность ткани составляет 1 г / мл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы получить подходящий опухолевый блок для последовательной ортотопической имплантации, стабильные клоны сначала были получены путем подкожной инъекции 200 мкл клеточной суспензии в DPBS (содержащих клетки MHCC97L) в нижнюю часть бока голых мышей (рис. 1A). Рост опухоли контролировали, и, когда размер опухоли достигал 800-1000мм3 (примерно через 4 недели после инъекции), мышей усыпляли, и полученный опухолевый блок разрезали примерно на фрагменты размером примерно 1 мм3 для последующей ортотопической имплантации печени другой партии голых мышей (n = 6). Мыши были рандомизированы на две группы: контрольная (C1, n = 3) и перевязка печеночной артерии (H2, n = 3). HAL выполняли путем завязывания тонкой нити вокруг основной ветви печеночной артерии. Мыши C1 были избавлены от HAL до ортотопической имплантации. Эта манипуляция приводила к гипоксии опухоли у мышей H2, но не у мышей C1, и гипоксический статус опухоли можно было неинвазивно контролировать с помощью гипоксического индикатора ПЭТ [18F]FMISO. Исследования ПЭТ/МРТ показали, что увеличение поглощения опухоли [18 F]FMISO наблюдалось только у мышей H2, тогда как при использовании гликолитического маркера [18F]FDG поглощение опухоли оставалось одинаковым между двумя группами (рис. 1B).
HAL-индуцированная гипоксия в опухолях была дополнительно подтверждена путем зондирования уровней экспрессии HIF-1α12, и были проведены сравнения между группами. В соответствии с более гипоксической опухолью после HAL, группа H2 продемонстрировала более высокую экспрессию HIF-1α, чем группа C1 (оптическая плотность: 0,17 против 0,13, H2 против C1, соответственно), что подтверждается поглощением их опухолью [18F] FMISO (рис. 2A). [18Ф] Использование FMISO было количественно оценено с использованием подхода, основанного на внедорожниках. Опухоли H2 показали увеличение поглощения FMISO [18F] в 2,3 раза по сравнению с опухолями C1 (макс. SUV: 1,2 против 2,8 соответственно, рис. 2B). Точно так же HAL также приводил к более высокому поглощению SUV печени у мышей H2, чем у мышей C1 (рис. 2C). Взятые вместе, мы показываем здесь, что HAL может эффективно индуцировать гипоксию опухоли в ортотопических ксенотрансплантатах ГЦК, а гипоксия опухоли может неинвазивно контролироваться с помощью [18F]FMISO PET-IMAGING, поддерживаемой экспрессией иммуногистохимического маркера ex vivo HIF-1α. Кроме того, включение МРТ-визуализации обеспечивает превосходный контраст мягких тканей, что позволяет четко отделить опухоль от печени, что делает возможным точное количественное определение ПЭТ.
Рисунок 1: ПЭТ/МРТ ксенотрансплантатов мышей с ГЦК in vivo. (A) Схема создания подкожных и ортотопических ксенотрансплантатов и исследований ПЭТ-визуализации при ортотопических опухолях MHCC97L. (B) Репрезентативные ПЭТ-изображения проекции максимальной интенсивности (MIP) [18 F]FMISO и [18F]FDG у мышей, несущих ортотопические опухоли MHCC97L (C1) без или (H2) с HAL. Синие круги указывают на расположение опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ мышей с ортотопическими опухолями MHCC97L с HAL и без него. (A) Репрезентативные совместно зарегистрированные [18F]FMISO ПЭТ/МР-изображения, иммуногистохимическое окрашивание для HIF-1α, а также гематоксилин и эозин (HE) в срезах опухолей. (Б-С) Количественный анализ поглощения [18F]FMISO опухолью и печенью. N = 3 для каждой группы. Значения SUV представлены как среднее ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы описали процедуры выполнения HAL на ортотопических ксенотрансплантатах печени ГЦК с использованием подкожных опухолей, а также методы неинвазивного мониторинга гипоксии опухоли в ортотопических ксенотрансплантатах с использованием [18 F]FMISO и [18F]FDG PET/MR. Наш интерес заключается в метаболической визуализации различных моделей рака и заболеваний для ранней диагностики и оценки ответа на лечение11,13,14,15. На сегодняшний день создание ксенотрансплантатов HAL HCC и их опухолевый метаболизм in vivo редко описывались в литературе, что побудило нас исследовать метаболические характеристики этих моделей опухолей с помощью ПЭТ-визуализации.
Успешное создание ортотопических ксенотрансплантатов с HAL в качестве надежной модели мышей для изучения гипоксии при ГЦК представляет собой важный аспект для изучения биологии ГЦК in vivo. Известно, что гипоксия стимулирует злокачественные новообразования рака. Кроме того, внутриопухолевая гипоксия ассоциировалась с усиленной пролиферацией, метастазированием, радио- и химиорезистентностью и требует тщательной характеристики ответа на гипоксические состояния7. В то время как подкожные ксенотрансплантаты часто используются для изучения онкогенеза ГЦК или стратегий лечения, ортотопические модели могут лучше повторять развитие ГЦК у человека, поскольку они более точно отражают микроокружение опухоли, в частности, влияние на васкуляризацию и взаимодействие опухоли и стромы с метастазами ГЦК12. Включение HAL в ортотопические мыши с ГЦК позволяет индукировать внутриопухолевую гипоксию, блокируя кровоснабжение печеночной артерии опухоли7. Такие модели на животных позволяют выяснить механизмы, лежащие в основе воздействия HAL на ГЦК, и создать новые возможности для эффективных терапевтических средств, нацеленных на путь гипоксии при ГЦК. Для ортотопической имплантации мы использовали опухолевый куб из подкожной опухоли вместо прямой инъекции суспензий клеток ГЦК. Мы обнаружили, что прямые инъекции клеток часто вызывают небольшой объем утечки из места инъекции, даже несмотря на то, что процедура проводилась как можно медленнее с небольшим объемом инъекции. Это потенциально может привести к метастазированию в брюшину, что наносит ущерб благополучию животных, что в конечном итоге влияет на общий результат исследования. С другой стороны, имплантация небольшого опухолевого блока решит проблему, хотя необходимо позаботиться о том, чтобы опухоль была надежно зашита после имплантации. При выделении небольших опухолевых кубиков из подкожного опухолевого блока также рекомендуется избегать основных областей солидной опухоли, которые относительно менее васкуляризированы и более метаболически напряжены из-за гипоксии и дефицита питательных веществ. Это уменьшит включение мертвых опухолевых клеток, которые, по-видимому, некротизированы в маленьком опухолевом кубе, и будет поддерживать более стабильные темпы роста опухоли у отдельных мышей.
Гипоксия является прогностическим фактором резистентности к раку, и мониторинг изменений гипоксии с помощью ПЭТ позволяет выявлять и количественно оценивать гипоксические ткани с высокой чувствительностью и специфичностью. Важным соображением для [18 F]FMISO и [18F]FDG PET является время поглощения радиоактивного индикатора и путь введения у мышей. Оба радиоиндикатора имеют различную фармакокинетику in vivo, одна из которых представляет собой физиологическую разницу в поглощении, наблюдаемую в кишечнике/мочевом пузыре и сердце/мочевом пузыре для [18 F]FMISO и [18 F]ФДГ, соответственно, а другая заключается в том, что [18 F]FMISO накапливается в гипоксической области опухоли, а [18 F] ФДГ преимущественно поглощается в области опухоли с высоким уровнем метаболизма 16. Высокая липофильность и медленный печеночный клиренс [18F]FMISO требуют 2-4 ч после инъекции для получения хорошего контраста опухоли и печени17. Мы обнаружили, что 3 ч после инъекции достаточно для дифференциации и оконтуривания поглощения опухоли [18F] FMISO из печени как для гипоксической (H2), так и для контрольной (C1) групп. В случае [18 F]FDG PET 1 ч после инъекции достаточно для получения хорошего контраста, как описано ранее13,15, и было использовано в этом исследовании. Тем не менее, поддержание постоянного времени поглощения радиоиндикатора является обязательным условием для обеспечения надежности результатов ПЭТ, особенно для анализов на основе внедорожников. Здесь мы использовали внутривенные методы для введения радиоиндикатора мышам. На успешную инъекцию в хвостовую вену указывает видимое воспоминание крови перед инфузией радиоиндикатора, когда игла точно расположена в вене. Основным недостатком этого метода является то, что ожидаемое воспламенение крови может быть трудно наблюдать из-за гипотензии, с вариабельностью, наблюдаемой между мышами. Тем не менее, такую трудность можно преодолеть, прогрев хвост в течение короткого периода времени в 1-2 минуты перед введением иглы, либо теплой мочалкой, либо тепловой лампой, чтобы увеличить кровоток и улучшить видимость вены для успешной инъекции.
В связи с растущим использованием ПЭТ-визуализации для количественной оценки биораспределения радиоиндикаторов у мелких животных важно отметить использование точного и хорошо откалиброванного ПЭТ-сканера для получения хороших, воспроизводимых и поддающихся количественной оценке данных о ПЭТ. Точная система ПЭТ позволяет проводить визуализирующие исследования более эффективным и экономичным способом и позволяет реализовать принципы 3R (замена, сокращение и уточнение) в исследованиях на животных. По этой причине необходимо проводить регулярные проверки контроля качества, предпочтительно на еженедельной основе, для проверки компонентов ПЭТ и МРТ системы визуализации в соответствии с рекомендацией производителя. В частности, точность активности ПЭТ должна проверяться и регистрироваться часто, а также до начала эксперимента по визуализации, чтобы обеспечить надежность количественной оценки ПЭТ. Это необходимо для любых лонгитюдных исследований, включающих количественную оценку опухоли и тканей в течение периода обследования, чтобы получить значимые и сопоставимые результаты. Калибровка системы требуется при обнаружении точности активности ПЭТ вне рекомендуемого диапазона, а также при обнаружении несоосности изображений ПЭТ и МРТ.
Несмотря на то, что описанные здесь методы позволяют проводить ПЭТ-визуализацию гипоксических ксенотрансплантатов ГЦК для широкого спектра исследований in vivo , при рассмотрении вопроса об использовании этих протоколов следует учитывать некоторые ограничения. Создание ксенотрансплантатов HAL HCC представляет собой сложную интраабдоминальную хирургическую процедуру, выполняемую на мышах с иммунодефицитом в возрасте 6-8 недель. Кроме того, миниатюрную печеночную артерию у этих молодых мышей может быть трудно обнаружить, что делает процесс перевязки технически сложным. Эти процедуры требуют соответствующим образом обученного персонала для улучшения скорости последовательности операций, а также выживаемости мышей в течение определенного периода времени, т.е. за 4-6 недель до образования ксенотрансплантатов, в то время как ожидается обеспечение обширного ухода за животными в течение всего периода операции, которые являются как трудоемкими, так и ресурсоемкими. Также ожидается, что создание ортотопических ксенотрансплантатов ГЦК с использованием этого метода потребует около 8 недель до успешной ПЭТ-визуализации, поскольку используется имплантация опухолевого куба, а не прямая инъекция клеточных суспензий, чтобы избежать метастазов в брюшину. Тем не менее, эти ограничения могут быть преодолены при надлежащем планировании и обучении исследовательского персонала. Кроме того, размер выборки экспериментальных групп, представленных здесь, невелик, что может не подходить для статистического анализа. Однако наши наблюдения субъективно выявляют тенденцию, при которой HAL-индуцированная гипоксия измерялась как в опухоли, так и в печени в группе H2 по сравнению с группой C1, что подтверждается более выраженным окрашиванием HIF-1α в образцах опухоли H2. В настоящее время мы работаем над расширением моделей опухолей с помощью других клеточных линий ГЦК человека. Кроме того, проводятся терапевтические исследования, нацеленные на путь гипоксии при ГЦК с участием этих ксенотрансплантатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Мы выражаем признательность Гонконгскому трастовому фонду по борьбе с раком, Фонду совместных исследований Совета по исследовательским грантам Гонконга (CRF C7018-14E) в проведении экспериментов по визуализации мелких животных. Мы также благодарим Центр молекулярной визуализации и медицинских циклотронов (MIMCC) при Университете Гонконга за предоставление [18 F]FMISO и [18F]FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
