Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung orthotoper hepatozellulärer Karzinom-Xenotransplantate mit und ohne Leberarterienligatur vor und führen eine nicht-invasive Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung der Tumorhypoxie unter Verwendung von [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) und [18 F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) durch.
Abstract
Präklinische experimentelle Modelle des hepatozellulären Karzinoms (HCC), die menschliche Erkrankungen rekapitulieren, stellen ein wichtiges Werkzeug dar, um die Tumorgenese zu untersuchen und neue Therapieansätze zu evaluieren. Die nicht-invasive Ganzkörperbildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) liefert in Echtzeit entscheidende Einblicke in die In-vivo-Eigenschaften von Geweben auf molekularer Ebene. Wir präsentieren hier ein Protokoll für die orthotope HCC-Xenotransplantat-Erstellung mit und ohne hepatische Arterienligatur (HAL) zur Induktion von Tumorhypoxie und die Beurteilung ihres Tumorstoffwechsels in vivo unter Verwendung von [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) und [18 F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) PET/Magnetresonanz (MR) Bildgebung. Die Tumorhypoxie konnte mit dem Hypoxiemarker [18 F]FMISO leicht sichtbar gemacht werden, und es wurde festgestellt, dass die [18 F]FMISO-Aufnahme bei HCC-Mäusen, die HAL unterzogen wurden, höher war als in der Nicht-HAL-Gruppe, während [18F]FDG die Tumorhypoxie zwischen den beiden Gruppen nicht unterscheiden konnte. HAL-Tumoren zeigten auch eine höhere Expression des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF)-1α als Reaktion auf Hypoxie. Die Quantifizierung von HAL-Tumoren zeigte einen 2,3-fachen Anstieg der [18F]FMISO-Aufnahme basierend auf dem Ansatz der standardisierten Wertaufnahme (SUV).
Introduction
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist mit mehr als 900.000 neuen Fällen und 800.000 Todesfällen im Jahr 2020 die sechsthäufigste Krebserkrankung und die dritthäufigste Todesursache durch Krebs weltweit1. Der Hauptrisikofaktor ist die Leberzirrhose, die als Folge von Virusinfektionen (Hepatitis B- und C-Viren), Alkoholmissbrauch, Diabetes und nichtalkoholischer Steatohepatitis2 auftritt. Die Behandlung von HCC ist ziemlich komplex, und es stehen verschiedene Behandlungsoptionen zur Verfügung, darunter chirurgische Resektion, thermische oder chemische Ablation, Transplantation, transarterielle Chemoembolisation, Bestrahlung und Chemotherapie, abhängig vom Krankheitsstadium 2,3. HCC ist ein Chemotherapie-refraktärer Tumor mit einem Wiederauftreten der Erkrankung bei bis zu 70% der Patienten nach kurativer Therapie2.
Trotz des hohen Grades an Tumorheterogenität ist HCC mit zwei gemeinsamen Endpunkten assoziiert: (i) HCC ist sehr hypoxisch und (ii) Tumorhypoxie ist mit größerer Tumoraggressivität und Behandlungsversagen verbunden. Die unkontrollierte Proliferation von HCC-Zellen führt zu einer hohen Sauerstoffverbrauchsrate, die der Vaskularisierung vorausgeht, wodurch eine hypoxische Mikroumgebung entsteht. Niedrige intratumorale Sauerstoffwerte lösen dann eine Reihe von biologischen Reaktionen aus, die die Aggressivität des Tumors und das Ansprechen auf die Behandlung beeinflussen. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) werden oft als die wesentlichen Transkriptionsregulatoren bei der Reaktion auf Hypoxieanerkannt 2,3. Daher ist die Fähigkeit, Hypoxie zu erkennen, von entscheidender Bedeutung, um neoplastisches Gewebe sichtbar zu machen und die unzugänglichen Stellen zu identifizieren, die invasive Verfahren erfordern. Es hilft auch, die molekularen Veränderungen, die zur Aggressivität des Tumors führen, besser zu verstehen und die Behandlungsergebnisse der Patienten zu verbessern.
Die molekulare Bildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wird häufig bei der Diagnose und Stadieneinteilung vieler Krebsarten, einschließlich HCC, eingesetzt. Insbesondere die kombinierte Verwendung von Dual-Tracer-PET-Bildgebung mit [18 F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) und [11C]Acetat kann die Gesamtsensitivität bei der HCC-Diagnose signifikant erhöhen 4,5. Die Bildgebung der Hypoxie kann hingegen durch die Verwendung des häufig verwendeten hypoxischen Markers [18 F]Fluoromisonidazol ([18F]FMISO) erreicht werden. In der klinischen Praxis ist die nicht-invasive Beurteilung der Hypoxie wichtig, um zwischen verschiedenen Tumorarten und Regionen für die Strahlentherapieplanung zu unterscheiden6.
Die präklinische Bildgebung ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die nicht-invasive und longitudinale Evaluierung von Mausmodellen für verschiedene Krankheiten geworden. Ein robustes und hochreproduzierbares HCC-Modell stellt eine wichtige Plattform für die präklinische und translationale Forschung zur Pathophysiologie des humanen HCC und zur Bewertung neuartiger Therapien dar. Zusammen mit der PET-Bildgebung können In-vivo-Verhaltensweisen aufgeklärt werden, um wichtige Erkenntnisse auf molekularer Ebene für einen bestimmten Zeitpunkt zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung von orthotopen HCC-Xenotransplantaten der Leberarterienligatur (HAL) und die Analyse ihres in vivo Tumormetabolismus unter Verwendung von [18 F]FMISO und [18F]FDG PET/MR. Der Einbau von HAL ist ein geeignetes Modell für transgene oder chemisch induzierte HCC-Mäuse-Xenotransplantate, um Tumorhypoxie in vivo zu untersuchen, da HAL die arterielle Blutversorgung effektiv blockieren kann, um intratumorale Hypoxie zu induzieren 7,8. Darüber hinaus können Veränderungen des Tumorstoffwechsels infolge von Hypoxie im Gegensatz zur immunhistochemischen Ex-vivo-Färbung mit Pimonidazol nicht-invasiv mittels PET-Bildgebung leicht visualisiert und genau quantifiziert werden, was eine longitudinale Beurteilung des Therapieansprechens oder eine Messung des Auftretens von Resistenzen ermöglicht 3,7,8 . Unsere hier gezeigte Methode ermöglicht die Erstellung eines robusten hypoxischen HCC-Modells zusammen mit der nicht-invasiven Überwachung der Tumorhypoxie mittels PET/MR-Bildgebung, um die HCC-Biologie in vivo zu untersuchen.
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Protocol
Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit dem Ausschuss für die Verwendung lebender Tiere in Lehre und Forschung (CULATR) im Zentrum für vergleichende medizinische Forschung (CCMR) an der Universität von Hongkong durchgeführt, einem Programm, das von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditiert ist. Bei den in der Studie verwendeten Tieren handelte es sich um weibliche BALB/cAnN-nu (Nacktmäuse) im Alter von 6-8 Wochen mit einem Gewicht von 20 g ± 2 g. Nahrung und Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt.
1. Subkutane Injektion von humanen hepatozellulären Karzinomzelllinien
HINWEIS: MHCC97 ist eine humane HCC-Zelllinie, die zur Erzeugung des subkutanen HCC-Xenotransplantatmodells verwendet wird. MHCC97L-Zellen werden vom Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital der Fudan University, Shanghai, Volksrepublik China9 gewonnen und durch Short Tandem Repeat (STR) Profiling authentifiziert.
- MHCC97L-Zellen kultivieren und in Nährmedien mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin und Streptomycin in einem T-75-Zellkulturkolben bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 (siehe Materialtabelle) aufbewahren. Wechseln Sie das Nährmedium alle 2 Tage und ernten Sie die Zellen bei 80%-90% Konfluenz.
HINWEIS: Die Startzellennummer beträgt 1,5 x 10 6 Zellen, und die Zellen werden innerhalb von6-8 Passagen verwendet. - Lagern Sie die Nährmedien und die Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (Trypsin-EDTA) bis zur Verwendung bei 4 °C im Dunkeln. Das Nährmedium wird vor Gebrauch auf 37 °C und das Trypsin-EDTA auf Raumtemperatur vorgewärmt. In der Materialtabelle finden Sie alle in diesem Abschnitt verwendeten Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.
- Entfernen Sie die Nährmedien. Spülen Sie die Zellschicht mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS, siehe Materialtabelle).
- 5 ml Trypsin-EDTA werden in den Kulturkolben gegeben und die Zellen bei 37 °C inkubiert. Überprüfen Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung (siehe Materialtabelle), bis die Zellschicht dispergiert und vollständig vom Kolben gelöst ist. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht länger als 15 Minuten in Trypsin-EDTA verbleiben.
- 5 ml Nährmedien in den Kulturkolben geben. Aspirieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 5 min lang bei 1.107 x g geschleudert (siehe Materialtabelle).
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit 1 ml PBS. Pipettieren Sie gründlich, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Bestimmen Sie die Zellzahl mit dem automatischen Zellzähler (siehe Materialtabelle) und bereiten Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 5 x 106 Zellen/ml in PBS vor.
- Ziehen Sie 200 μl Zellsuspension mit einer 25-G-Nadel in eine 1-ml-Spritze. Jede Spritze enthält 1 x 106 MHCC97L-Zellen (in 200 μL). Bewahren Sie die Spritze auf nassem Eis auf.
- Anästhesieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Mischung aus Ketamin (87,5 mg/kg) und Xylazin (12,5 mg/kg). Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Anästhesie mit dem Zehen-Pinch-Reflex. Stellen Sie sicher, dass Sie Augengleitmittel auf die Maus auftragen, um ein Austrocknen und die mögliche Bildung von Hornhautgeschwüren zu verhindern. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine sterile Einlage (siehe Materialtabelle).
- Sterilisieren Sie die dorsale Region in der Nähe der unteren Flanke (entweder links oder rechts) der Maus mit 70% Ethanol (siehe Materialtabelle). Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und führen Sie die Nadelfase vorsichtig unter die Haut ein.
- Schieben Sie die Nadel 4-5 mm entlang der subkutanen Ebene von der Einstichstelle vor, um ein versehentliches Austreten der Zellsuspension von der Injektionsstelle beim Herausziehen der Nadel zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass sich der Nadeleinstich nicht zu tief unter der Haut befindet, was zu versehentlichen Organschäden führen kann.
- Lassen Sie die Pinzette los und entleeren Sie den Inhalt der Spritze vorsichtig und langsam, wobei Sie darauf achten müssen, nicht in die gegenüberliegende Seite einzudringen. Ziehen Sie die Nadel heraus, um zu prüfen, ob die Injektion anschwillt. Legen Sie die Maus wieder in den Käfig und setzen Sie sich auf ein vorgewärmtes Heizkissen, um die Genesung von der Narkose zu unterstützen und die Mobilität wiederzuerlangen. Überwachen Sie die Maus weiter, bis die Maus vollständig wach ist und das Brustbein beibehält.
- Überwachen Sie wöchentlich das Tumorwachstum und das Wohlbefinden der Maus. Messen Sie das Tumorvolumen (V) mit einem Messschieber (siehe Materialtabelle). Berechnen und erfassen Sie das Tumorvolumen mit der folgenden Formel10:
V = (B 2× L)/2
wobei W die Breite und L die Länge des Tumors ist. - Überprüfen Sie zwischen 4 und 6 Wochen nach der Injektion, ob eine signifikante Größe des subkutanen Tumors zwischen 800 und 1000 mm3 erreicht wird. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Tumorlast 10% des Körpergewichts nicht überschreitet.
2. Orthotope Leberimplantation und Leberarterienligatur
- Bereiten Sie die folgenden chirurgischen Reagenzien und Werkzeuge in einer desinfizierten biologischen Sicherheitswerkbank vor: 10 ml Nährmedien in einer Schale, 10% Povidon-Jod-Lösung, 70% Ethanol, autoklavierte chirurgische Instrumente, d.h. scharfe Schere, Federschere, Pinzette (gebogen fein und gerade stumpf), Nadelhalter, Skalpellklinge, 6-0 und 5-0 Nylonnaht, ein Heizkissen.
- Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und handhaben Sie sie nur auf einer sterilen Bank. Sorgen Sie für die angemessene und notwendige prä-, intra- und postoperative Versorgung der Mäuse während der chirurgischen Eingriffe (siehe Schritte unten).
- Zur präoperativen Schmerzlinderung injizieren Sie der Maus mindestens 30 Minuten vor Beginn des chirurgischen Eingriffs eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg/kg). Injizieren Sie der Maus zur postoperativen Pflege und Behandlung 3 Tage lang ununterbrochen alle 8-12 Stunden eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg/kg). In der Materialtabelle finden Sie alle in diesem Abschnitt verwendeten Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.
- Euthanasieren Sie die subkutane tumortragende Maus mit einer i.p. Injektion von Pentobarbital (330 mg/kg). Machen Sie mit einer Skalpellklinge einen Einschnitt in die Haut der Tumorstelle. Entfernen Sie den subkutanen Tumorblock und übertragen Sie ihn sofort in das Nährmedium. Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich durch.
- Schneiden Sie den Tumorblock mit einer scharfen chirurgischen Schere in 1 mm3 kleine Tumorwürfel. Bewahren Sie alle Tumorwürfel im Nährmedium auf. Vermeiden Sie die Verwendung der Kernregion des subkutanen Tumorblocks.
- Anästhesieren Sie die Maus, die sich der anschließenden orthotopen Tumorimplantationsoperation unterziehen wird, mit einer i.p. Injektion einer Mischung aus Ketamin (87,5 mg/kg) und Xylazin (12,5 mg/kg). Stellen Sie sicher, dass nach der Verabreichung des Buprenorphins vor der Betäubung der Maus mindestens 30 Minuten vergangen sind. Achten Sie darauf, Augengleitmittel auf die Maus aufzutragen, um ein Austrocknen und die mögliche Bildung von Hornhautgeschwüren zu vermeiden.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein steriles Pad, das sich auf einem vorgewärmten Heizkissen befindet. Überwachen und zeichnen Sie den physiologischen Zustand der Maus alle 15 Minuten bis zum Ende des chirurgischen Eingriffs auf.
- Strecken Sie die Gliedmaßen der Maus aus. Befestigen Sie sie mit Klebeband, um die Freilegung des ventralen Abdomens und des Brustkorbs zu maximieren. Sterilisieren Sie die gesamte Bauchhaut der Maus mit einer 10% igen Povidon-Jod-Lösung, gefolgt von 70% Ethanol. Beurteilen Sie die Anästhesietiefe der Maus, indem Sie darauf achten, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren - den Pedalzugreflex.
- Führen Sie eine Laparotomie durch, indem Sie mit einer scharfen Schere einen ca. 10 mm großen Mittellinienschnitt machen, um Zugang zum Peritoneum zu erhalten. Klemmen und ziehen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette in Richtung Kopf und wenden Sie die subkostalen Retraktoren an, um das Operationsfeld zu öffnen. Stellen Sie sicher, dass ein richtiger Schnitt gemacht wird, um eine gute chirurgische Sicht auf die Operationsstelle zu ermöglichen.
- Ziehen Sie den Mittelstreifen und die linken Lappen mit einem feuchten Mulltupfer nach oben zurück. Bewegen Sie den Darm außerhalb des Bauches auf die linke Seite der Maus und bedecken Sie ihn mit einem feuchten Mulltupfer. Führen Sie eine Leberarterienligatur (HAL) an der Arteria hepatica communis (CHA) durch, die vom Pankreaskopf bis zu ihrer Wurzel im Leberstiel ausgeht, unter einer Lupe zur optimierten Visualisierung.
- Ziehen Sie den Mittellappen und den linken Lappen mit einem feuchten Mulltupfer nach hinten/unten zurück, um den linken Lappen freizulegen. Machen Sie mit einer sterilen Skalpellklinge einen Schnitt von etwa 2 mm Länge und Tiefe auf der Oberfläche des linken Lappens.
HINWEIS: Es ist auch möglich, den Medianlappen der Leber für die Tumorimplantation zu verwenden, um versehentliche Risse oder Schnittwunden durch ein Trauma benachbarter Bauchorgane zu minimieren. - Führen Sie sofort ein Tumorfragment mit einer sterilen Pinzette in den Leberschnitt ein. Begraben Sie den Tumor so, dass er sicher in der Leber sitzt. Legen Sie eine Achternaht mit einer 6-0-Nylonnaht über die Inzisionsstelle an, um eine ordnungsgemäße Implantation des Tumorfragments in die Leber und die Hämostase sicherzustellen. Führen Sie diesen Vorgang so schnell wie möglich durch, um übermäßige Blutungen zu vermeiden. Schließen Sie nach Abschluss den Bauchschnitt mit unterbrochenen 5-0-Nähten.
- Legen Sie die Maus wieder in den Käfig und sitzen Sie auf einem vorgewärmten Heizkissen, um die Genesung von der Anästhesie zu unterstützen und den Aufrichtungsreflex wiederzuerlangen. Überwachen und zeichnen Sie den physiologischen Zustand der Maus alle 15 Minuten auf, bis die Maus vollständig wach ist und das Brustbein beibehält.
- Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Mäuse eine orthotope Tumorimplantation durchlaufen haben. Bieten Sie allen Mäusen eine postoperative Versorgung an, indem Sie ihren physiologischen Zustand in den nächsten 3 Tagen nach dem chirurgischen Eingriff täglich kontinuierlich überwachen. Geben Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 8-12 h.
3. Einrichten von PET/MR-Kalibrierungen und Workflow
HINWEIS: Die Bildgebung wird mit einem präklinischen PET/MR 3T-System durchgeführt (siehe Materialtabelle).
- Verwenden Sie 5% Isofluran (1 l/min medizinisches O2), um die Maus in einer Induktionskammer zu betäuben. Legen Sie die anästhesierte Maus für jeden Scan vorsichtig auf ein Bildgebungsbett mit kontinuierlicher Erwärmung. Scannen Sie zunächst mit MR (Scout-Ansicht) als anatomische Referenz für statische [18 F]FMISO- oder [18F]FDG PET-Scans, gefolgt von einer anatomischen Referenz-MR-Bildgebung.
- Erstellen Sie in der Software einen sequenziellen PET/MR-Bildgebungs-Workflow (siehe Materialtabelle), der einen statischen PET-Scan, eine T1-gewichtete (Abschwächungskorrektur) und T2-gewichtete (anatomische Referenz) MR-Bildgebung sowie eine PET-Rekonstruktion 1 Tag vor der geplanten Bildgebungssitzung umfasst.
- Um PET zu erfassen, wählen Sie 400-600 keV-Niveau-Unterscheidung, F-18-Studienisotop, 1-5-Koinzidenzmodus und 20-Minuten-Scans.
- Um eine Ganzkörper-T1-gewichtete MR zu erhalten, verwenden Sie Gradientenecho-3D mit TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, Sichtfeld (FOV) = 90 mm x 60 mm, Anzahl der Anregungen (NEX) = 3, 28 Schichten mit 0,9 mm Dicke und Voxelgröße = 0,375 mm 3 x 0,375 mm 3 x 0,9 mm 3.
- Um eine Ganzkörper-T2-gewichtete MR zu erhalten, verwenden Sie Fast-Spin-Echo 2D mit TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 Scheiben mit 0,9 mm Dicke, Voxelgröße = 0,265 mm 3 x 0,268 mm 3 x 0,9 mm3.
- Um PET zu rekonstruieren, wählen Sie den Tera-Tomo-Algorithmus (TT3D), Iterationen = 8, Teilmengen = 6, 1-3 Koinzidenzmodus und mit Zerfalls-, Totzeit-, Zufalls-, Dämpfungs- und Streukorrekturen, um Bilder mit einer Gesamtvoxelgröße von 0,3 mm3 zu erstellen.
- Führen Sie vor Beginn des Experiments einen PET-Aktivitätstest durch, um die Genauigkeit der PET-Quantifizierung zu überprüfen11.
- Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit 5-8 MBq [18F]FMISO, verdünnt in Wasser oder Kochsalzlösung gemäß der Empfehlung des Herstellers. Verwenden Sie einen Dosiskalibrator, um die Aktivität der Spritze aufzuzeichnen (siehe Materialtabelle). Notieren Sie sich den Zeitpunkt der Messung.
- Zeichnen Sie ein interessantes Volumen (VOI) auf das rekonstruierte Bild, um die gesamte Spritze abzudecken. Vergleichen Sie die wiederhergestellte Aktivität aus dem Bild mit dem Wert, der vom Dosiskalibrator erhalten wurde. Fahren Sie mit bildgebenden Untersuchungen fort, wenn die wiederhergestellte Aktivität innerhalb von ±5 % genau ist.
4. [18 F]FMISO- und [18F]FDG-Injektion
- Besorgen Sie sich 30 Minuten vor Beginn der bildgebenden Untersuchungen eine klinische Dosis von [18F]FMISO vom Lieferanten. Tragen Sie beim Umgang mit radioaktiven Stoffen die entsprechende persönliche Schutzausrüstung (PSA), wie z. B. einen Laborkittel, Handschuhe, eine Brille, einen Filmausweis und Ringdosimeter. Wechseln Sie häufig die Handschuhe, um eine Kreuzkontamination der radioaktiven Substanzen zu vermeiden.
- Legen Sie die radioaktiven Stammlösungen in den Bleilagerbehälter hinter einem L-Block-Tischschild. Geben Sie ein Aliquot von [18F]FMISO ab und verdünnen Sie es mit sterilisierter Kochsalzlösung. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtaktivitätskonzentration 18-20 MBq in 100 μl beträgt.
- Erstellen Sie die [18F]FMISO mit einer 1-ml-Spritze mit Nadel (siehe Materialtabelle). Notieren Sie die Radioaktivität und die Zeit, die auf dem Dosiskalibrator angezeigt werden.
- Notieren Sie das Mausgewicht vor der Injektion des Radiotracers. Verwenden Sie 5% Isofluran (1 l/min medizinisches O2), um die Maus zu betäuben, und injizieren Sie dann vorsichtig das vorbereitete [18F]FMISO über die Schwanzvene. Notieren Sie die Injektionszeit und die Rückstandsaktivität der Spritze, um die Karieskorrektur zu berücksichtigen. Legen Sie die Maus für 180 Minuten wieder in den Käfig, um die Aufnahme von [18F]FMISO vor dem PET-Scan zu ermöglichen. Lassen Sie die Maus nach [18F]FMISO PET 1 Tag lang erholen.
HINWEIS: Trotz der sehr unterschiedlichen pharmakokinetischen In-vivo-Profile für [18 F]FMISO und [18 F]FDG sind beide Radiotracer mit F-18 radioaktiv markiert, einem PET-Radionuklid mit einer Halbwertszeit von 109,77min (< 2 h). Da das PET-Signal von F-18 stammt, geht alle 2 Stunden die Hälfte der ursprünglich injizierten Radioaktivität verloren. In diesem Fall kann das Restsignal 24 h nach der Injektion vom PET-Scanner nicht mehr erkannt werden. Darüber hinaus ermöglicht der Abstand von 1 Tag zwischen den Injektionen von [18 F]FMISO (Tag 1) und [18 F]FDG (Tag 3) einen vollständigen Zerfall von [18 F]FMISO, wenn [18 F]FDG PET durchgeführt wird, so dass sich das [18 F]FMISO-Signal im [18F]FDG PET-Scan nicht überlappt. - Wiederholen Sie die Schritte 4.1.-4.4. für die [18F]FDG-Injektion an Tag 3, mit der Ausnahme, dass eine Gesamtaktivitätskonzentration von 6-8 MBq in 100 μl mit einer 60-minütigen Aufnahme vor Beginn des PET-Scans injiziert wird.
- Berechnen Sie die injizierte [18 F]FMISO- oder [18F]FDG-Aktivität mit der folgenden Formel11:
Injizierte Aktivität (MBq) = Aktivität in der Spritze vor der Injektion - Aktivität in der Spritze nach der Injektion
5. PET/MR-Akquisition
- Schalten Sie den Lufterhitzer ein, um das Bildgebungsbett der Maus vor dem geplanten PET-Scan zu erwärmen. Verwenden Sie 5% Isofluran (1 l/min medizinisches O2), um die Maus in einer Induktionskammer zu betäuben.
- Nach richtiger Anästhesie und Überprüfung mit der Zehen-Pinch-Reaktion legen Sie die Maus vorsichtig und sofort auf das Heizbett und halten Sie die Anästhesie bei 2% -2,5% Isofluran aufrecht. Legen Sie die Maus mit dem Kopf auf die Beißstange und tragen Sie Augengleitmittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen und die mögliche Bildung von Hornhautgeschwüren zu vermeiden. Decken Sie das Bildgebungsbett mit einer Plastikfolie ab, um die Umgebungstemperatur des Bettes aufrechtzuerhalten.
- Überwachen und zeichnen Sie die Atemfrequenz und die Körpertemperatur der Maus mit dem hauseigenen Beatmungskissen bzw. der Thermosonde auf. Stellen Sie sicher, dass die Körpertemperatur der Maus bei 37 °C gehalten wird, während die Atemfrequenz im Bereich von 40-50 Atemzügen pro Minute (bpm) gehalten wird, indem Sie den Isofluranspiegel anpassen.
- Führen Sie eine Scout-Ansicht durch, um die Mausposition im Scanner zu ermitteln. Passen Sie die Position des Mausbetts so an, dass der gesamte Mauskörper bedeckt ist, wobei sich die Rumpfregion in der Mitte des Sichtfelds des MR befindet.
- Um einen PET-Scan zu starten, wählen Sie im Listenfenster "Studie" die Option " PET-Erfassung " und dann " Scanbereich bei vorheriger Erfassung " aus, um die vorgegebene Mausbettposition in der Scout-Ansicht zu verwenden. Klicken Sie auf Vorbereiten > OK , um das Mausbett automatisch von MR nach PET zu verschieben und die Erfassung zu starten.
- Wählen Sie im Radiopharma-Editor das entsprechende Radionuklid aus und geben Sie dann die Details der Injektionsdosis und die Zeit vor und nach der Injektion von [18 F]FMISO oder [18F]FDG ein, wie in Schritt 4.3 gemessen. und Schritt 4.4. Geben Sie das Gewicht der Maus im Menü "Betreffinformationen" ein.
- Fahren Sie nach Abschluss des PET-Scans mit den MR-Erfassungen fort. Wählen Sie dazu Vorbereiten , um die Maus von PET in MR zu verschieben. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
- Sobald alle Scans abgeschlossen sind, wählen Sie Startseite , um das Bildgebungsbett wieder in die Standardposition zu verschieben.
- Schalten Sie die Anästhesie aus und spülen Sie das Bildgebungsbett mit medizinischem O2. Überprüfen Sie den Rückzugsreflex des Mauspedals. Übertragen Sie die Maus aus dem Bildgebungsbett zurück in einen sauberen Gehäusekäfig, der auf einem Heizkissen platziert ist, um die Genesung von der Narkose zu unterstützen und den Aufrichtungsreflex wiederzuerlangen.
- Wählen Sie unter "Rohscan" die Option "PET-Erfassung" aus, um die erfassten PET-Rohdaten für die PET-Rekonstruktion zu laden. Wählen Sie MM aus, um es als Materialkarte zu verwenden. Fahren Sie mit der PET-Rekonstruktion fort, indem Sie den in Schritt 3.6 beschriebenen Parameter verwenden.
- Halten Sie sich strikt an die lokalen und institutionellen Richtlinien beim Umgang mit Mäusen nach PET-Bildgebungsstudien. Behandeln Sie alle gebrauchten Verbrauchsmaterialien, z. B. Spritzen, Nadeln, Handschuhe, Tücher und biologische Abfälle, z. B. Käfigeinstreu und Fäkalien, die in direktem Kontakt mit der Maus standen, als radioaktive Abfälle und behandeln Sie sie sorgfältig gemäß den örtlichen Vorschriften.
6. PET-Bildanalyse
- Öffnen Sie die Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle) und wählen Sie DICOM-Daten laden , um die PET- und MR-Bilder zu öffnen.
- Ziehen Sie die entsprechenden PET- und MR-Bilder in das Software-Anzeigefenster und wählen Sie Automatische Registrierung, um die automatische Co-Registrierung der resultierenden PET- und MR-Bilder durchzuführen.
- Wählen Sie im Menü "Registrierung einrichten" die Option "Starre Transformation" aus. Verwenden Sie "Umschalt und Drehung" im Menü "Starre/Affin".
- Klicken Sie im Menü "Globale Rollenauswahl " auf MM als Referenz und "Statischer PET-Scan als Reslice".
- Überprüfen Sie die mitregistrierten PET/MR-Bilder, um eine korrekte Ausrichtung sicherzustellen. Verwenden Sie bei Bedarf die manuelle Registrierung , um die Bilder manuell anzupassen.
- Lokalisieren Sie den orthotopen Tumor in der Leber anhand des MRT-Bildes. Verwenden Sie den ROI der interpolierten Ellipse , um einen VOI auf dem Tumor zu zeichnen, wobei Sie das MR-Bild als Referenz verwenden. Übertragen Sie den erzeugten Tumor-VOI vom MR auf das PET-Bild. Wählen Sie das Pinselwerkzeug und das Radiergummiwerkzeug aus, um den VOI-Rand Folie für Folie sorgfältig zu definieren. Achten Sie darauf, ein Übergreifen der Radioaktivität aus der Leber auf dem PET-Bild zu vermeiden.
- Verwenden Sie Ellipsoid VOI, um ein 3 mm3 VOI auf der Leber als Referenzorgan zu erzeugen. Achten Sie darauf, Bereiche mit sichtbaren Leber-, Gefäß- und Gallenstrukturen zu vermeiden, indem Sie das MRT-Bild als Leitfaden verwenden.
- Wählen Sie ROI-Tabelle anzeigen aus, um alle gezeichneten VOIs umzubenennen. Halten Sie alle notwendigen Daten, z. B. Radioaktivität (kBq/ml) und Tumorvolumen (mm3), in einer Tabelle fest. Speichern Sie eine Kopie der VOI-Zeichnungen und archivieren Sie sowohl die Rohdaten als auch die rekonstruierten Bilddaten auf einer externen Festplatte, wenn Sie fertig sind.
- Berechnen Sie den standardisierten Aufnahmewert (SUV) für alle VOIs mit der folgenden Gleichung11:
SUV = CPET(t)/(ID/BW)
wobei CPET(t) die gemessene Aktivität im VOI, ID die injizierte Dosis in kBq und BW das Körpergewicht der Maus in kg ist, wobei eine Gewebedichte von 1 g/ml angenommen wird.
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Representative Results
Um einen geeigneten Tumorblock für die sukzessive orthotope Implantation zu erhalten, wurden zunächst stabile Klone durch subkutane Injektion von 200 μl Zellsuspension in DPBS (mit MHCC97L-Zellen) in die untere Flanke von Nacktmäusen erzeugt (Abbildung 1A). Das Tumorwachstum wurde überwacht, und als die Tumorgröße 800-1000 mm 3 erreichte (etwa 4 Wochen nach der Injektion), wurden die Mäuse eingeschläfert, und der resultierende Tumorblock wurde in etwa 1 mm3 Fragmente geschnitten, um anschließend die orthotope Implantation der Leber in eine andere Charge von Nacktmäusen (n = 6) durchzuführen. Die Mäuse wurden randomisiert in zwei Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe (C1, n = 3) und Leberarterienligatur (H2, n = 3). HAL wurde durchgeführt, indem ein feiner Faden um den Hauptast der Leberarterie gebunden wurde. C1-Mäuse wurden vor der orthotopen Implantation von HAL verschont. Diese Manipulation führte zu einer Tumorhypoxie bei H2-, aber nicht bei C1-Mäusen, und der hypoxische Status des Tumors konnte nicht-invasiv mit dem hypoxischen PET-Tracer [18F]FMISO überwacht werden. PET/MR-Studien zeigten, dass nur bei den H2-Mäusen ein Anstieg der Tumoraufnahme [18 F]FMISO beobachtet wurde, während die Tumoraufnahme unter Verwendung des glykolytischen Markers [18F]FDG zwischen den beiden Gruppen ähnlich blieb (Abbildung 1B).
Die HAL-induzierte Hypoxie in Tumoren wurde weiter validiert, indem die Expressionsniveaus von HIF-1α12 untersucht wurden, und es wurden Vergleiche zwischen den Gruppen angestellt. In Übereinstimmung mit einem hypoxischeren Tumor nach HAL zeigte die H2-Gruppe eine höhere HIF-1α-Expression als die C1-Gruppe (optische Dichte: 0,17 vs. 0,13, H2 vs. C1), was mit ihrer Tumoraufnahme bestätigt wird [18F]FMISO (Abbildung 2A). [18F] Die FMISO-Akzeptanz wurde mit dem SUV-basierten Ansatz quantifiziert. H2-Tumoren zeigten im Vergleich zu C1-Tumoren einen 2,3-fachen Anstieg der [18F]FMISO-Aufnahme (SUVmax: 1,2 vs. 2,8, Abbildung 2B). In ähnlicher Weise führte HAL auch zu einer höheren Leber-SUV-Aufnahme in H2 als C1-Mäuse (Abbildung 2C). Zusammenfassend zeigen wir hier, dass HAL Tumorhypoxie in orthotopen HCC-Xenotransplantaten effektiv induzieren kann und Tumorhypoxie nicht-invasiv mit [18F]FMISO PET-Bildgebung überwacht werden kann, unterstützt durch den ex vivo immunhistochemischen Marker HIF-1α-Expression. Darüber hinaus bietet die Einbeziehung der MR-Bildgebung einen hervorragenden Weichteilkontrast, um eine klare Abgrenzung des Tumors von der Leber zu ermöglichen, was eine genaue PET-Quantifizierung ermöglicht.
Abbildung 1: In-vivo-PET/MR-Bildgebung von orthotopen HCC-Mäuse-Xenotransplantaten. (A) Schematische Darstellung von subkutanen und orthotopen Xenotransplantat-Kreationen und PET-Bildgebungsstudien bei orthotopen MHCC97L-Tumoren. (B) Repräsentative maximale Intensitätsprojektion (MIP) PET-Bilder von [18 F]FMISO und [18F]FDG bei Mäusen mit orthotopen MHCC97L-Tumoren (C1) ohne oder (H2) mit HAL. Blaue Kreise zeigen den Ort des Tumors an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Analyse von Mäusen mit orthotopen MHCC97L-Tumoren mit und ohne HAL. (A) Repräsentative Mitregistrierung von [18F]FMISO PET/MR-Bildern, immunhistochemische Färbung für HIF-1α sowie Hämatoxylin und Eosin (HE) in Tumorschnitten. (B-C) Quantitative Analyse der [18F]FMISO-Aufnahme im Tumor und in der Leber. N = 3 für jede Gruppe. Die Werte von SUV werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In dieser Studie beschrieben wir die Verfahren zur Durchführung von HAL an orthotopen HCC-Xenotransplantaten in der Leber unter Verwendung subkutaner Tumoren sowie Methoden zur nicht-invasiven Überwachung der Tumorhypoxie bei orthotopen Xenotransplantaten unter Verwendung von [18 F]FMISO und [18F]FDG PET/MR. Unser Interesse gilt der metabolischen Bildgebung verschiedener Krebs- und Krankheitsmodelle zur Früherkennung und Bewertung des Therapieansprechens11,13,14,15. Die Herstellung von HAL-HCC-Xenotransplantaten und deren in vivo Tumormetabolismus wurden bisher nur selten in der Literatur beschrieben, was uns dazu veranlasste, die metabolischen Eigenschaften dieser Tumormodelle mittels PET-Bildgebung zu untersuchen.
Die erfolgreiche Etablierung orthotoper Xenotransplantate mit HAL als robustes Mausmodell zur Untersuchung der Hypoxie bei HCC stellt einen wichtigen Aspekt für die Untersuchung der HCC-Biologie in vivo dar. Es ist bekannt, dass Hypoxie die Malignität von Krebs stimuliert. Darüber hinaus wurde intratumorale Hypoxie mit einer verstärkten Proliferation, Metastasierung sowie Radio- und Chemoresistenz in Verbindung gebracht und rechtfertigt eine gründliche Charakterisierung der Reaktion auf hypoxische Zustände7. Während subkutane Xenotransplantate häufig zur Untersuchung der HCC-Tumorgenese oder von Behandlungsstrategien verwendet werden, können orthotope Modelle die Entwicklung des menschlichen HCC besser rekapitulieren, da sie die Mikroumgebung des Tumors genauer widerspiegeln, insbesondere die Einflüsse auf die Vaskularisierung und die Tumor-Stroma-Interaktionen gegenüber der HCC-Metastasierung12. Der Einbau von HAL in orthotope HCC-Mäuse ermöglicht die Induktion einer intratumoralen Hypoxie, indem die hepatische arterielle Blutversorgung des Tumors blockiertwird 7. Solche Tiermodelle ermöglichen die Aufklärung der Mechanismen, die den Wirkungen von HAL auf HCC zugrunde liegen, und schaffen neue Wege für wirksame Therapeutika, die auf den Hypoxie-Signalweg bei HCC abzielen. Für die orthotope Implantation verwendeten wir den Tumorwürfel aus dem subkutanen Tumor anstelle der direkten Injektion von HCC-Zellsuspensionen. Wir haben festgestellt, dass direkte Zellinjektionen oft ein geringes Leckvolumen an der Injektionsstelle verursachen, obwohl das Verfahren so langsam wie möglich mit einem geringen Injektionsvolumen durchgeführt wurde. Dies kann möglicherweise zu Peritonealmetastasen führen, die sich nachteilig auf das Wohlbefinden der Tiere auswirken und sich letztendlich auf das Gesamtergebnis der Studie auswirken. Auf der anderen Seite würde die Implantation eines kleinen Tumorblocks das Problem lösen, obwohl darauf geachtet werden muss, dass der Tumor nach der Implantation sicher vernäht wird. Bei der Isolierung kleiner Tumorwürfel aus dem subkutanen Tumorblock ist es auch ratsam, die Kernregionen des soliden Tumors zu meiden, die aufgrund von Hypoxie und Nährstoffmangel relativ weniger vaskularisiert und metabolisch stärker belastet sind. Auf diese Weise wird der Einschluss von toten Tumorzellen, die innerhalb des kleinen Tumorwürfels nekrotisch zu sein scheinen, reduziert und die Tumorwachstumsraten bei einzelnen Mäusen konstanter aufrechterhalten.
Hypoxie ist ein prognostischer Faktor der Krebsresistenz, und die Überwachung von Veränderungen der Hypoxie mittels PET ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung von hypoxischem Gewebe in hoher Sensitivität und Spezifität. Eine wichtige Überlegung für [18 F]FMISO und [18F]FDG PET betrifft die Radiotracer-Aufnahmezeit und den Verabreichungsweg bei Mäusen. Beide Radiotracer weisen eine unterschiedliche In-vivo-Pharmakokinetik auf, wobei zum einen der physiologische Aufnahmeunterschied ist, der im Darm/in der Blase und im Herzen/in der Blase für [18 F]FMISO bzw. [18 F]FDG beobachtet wird, und der andere ist, dass sich [18 F]FMISO in der hypoxischen Region des Tumors anreichert und [18 F]FDG bevorzugt in der Tumorregion mit hohem Stoffwechsel aufgenommen wird 16. Die hohe Lipophilie und die langsame hepatische Clearance von [18F]FMISO erfordern eine Zeit von 2-4 Stunden nach der Injektion, um einen guten Tumor-Leber-Kontrast zu erhalten17. Wir fanden heraus, dass 3 Stunden nach der Injektion ausreichend ist, um die Tumoraufnahme [18F]FMISO aus der Leber sowohl für hypoxische (H2) als auch für Kontrollgruppen (C1) zu differenzieren und abzugrenzen. Im Fall von [18 F]FDG PET ist eine Zeit von 1 h nach der Injektion ausreichend, um einen guten Kontrast zu erzielen, wie zuvor beschrieben13,15, und wurde in dieser Studie verwendet. Nichtsdestotrotz ist die Einhaltung einer konstanten Radiotracer-Aufnahmezeit unerlässlich, um die Zuverlässigkeit der PET-Ergebnisse zu gewährleisten, insbesondere bei SUV-basierten Analysen. Hier verwendeten wir intravenöse Techniken, um den Mäusen Radiotracer zu verabreichen. Eine erfolgreiche Schwanzveneninjektion wird durch einen sichtbaren Blutflashback vor der Radiotracer-Infusion angezeigt, bei dem die Nadel genau in der Vene positioniert ist. Ein großer Nachteil dieser Methode besteht darin, dass der erwartete Blut-Flashback aufgrund von Hypotonie schwer zu beobachten sein kann, wobei eine Variabilität zwischen den Mäusen beobachtet wird. Diese Schwierigkeit kann jedoch überwunden werden, indem der Schwanz für einen kurzen Zeitraum von 1-2 Minuten vor dem Einführen der Nadel entweder mit einem warmen Waschlappen oder mit einer Wärmelampe erwärmt wird, um den Blutfluss zu erhöhen und die Sichtbarkeit der Vene für eine erfolgreiche Injektion zu verbessern.
Mit dem zunehmenden Einsatz der PET-Bildgebung zur Quantifizierung der Radiotracer-Bioverteilung bei Kleintieren ist die Verwendung eines genauen und gut kalibrierten PET-Scanners eine wichtige Überlegung, um gute, reproduzierbare und quantifizierbare PET-Daten zu liefern. Ein genaues PET-System ermöglicht eine zeiteffizientere und kostengünstigere Durchführung von bildgebenden Untersuchungen und ermöglicht die Umsetzung der 3R-Prinzipien (Replacement, Reduction, and Refinement) in der Tierforschung. Aus diesem Grund müssen routinemäßige Qualitätskontrollen, vorzugsweise wöchentlich, durchgeführt werden, um die PET- und MR-Komponenten des Bildgebungssystems gemäß der Empfehlung des Herstellers zu untersuchen. Insbesondere sollte die Genauigkeit der PET-Aktivität häufig sowie vor Beginn eines bildgebenden Experiments überprüft und aufgezeichnet werden, um die Zuverlässigkeit der PET-Quantifizierung zu gewährleisten. Dies ist für alle Längsschnittstudien, bei denen der Tumor und das Gewebe über einen Untersuchungszeitraum quantitativ bewertet werden, unerlässlich, um aussagekräftige und vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Eine Kalibrierung des Systems ist erforderlich, wenn festgestellt wird, dass die Genauigkeit der PET-Aktivität außerhalb des empfohlenen Bereichs liegt, sowie wenn eine Fehlausrichtung von PET- und MR-Bildern festgestellt wird.
Obwohl die hier beschriebenen Techniken die PET-Bildgebung der hypoxischen HCC-Xenotransplantate für eine Vielzahl von In-vivo-Untersuchungen ermöglichen, sollten einige Einschränkungen berücksichtigt werden, wenn die Verwendung dieser Protokolle in Betracht gezogen wird. Die Herstellung von HAL HCC-Xenotransplantaten ist ein komplexer intraabdominaler chirurgischer Eingriff, der an 6-8 Wochen alten immundefizienten Mäusen durchgeführt wird. Darüber hinaus kann die winzige Leberarterie bei diesen jungen Mäusen schwer zu lokalisieren sein, was den Ligationsprozess technisch schwierig macht. Diese Verfahren erfordern entsprechend geschultes Personal, um die Operationsabfolge sowie das Überleben der Mäuse über einen bestimmten Zeitraum, d.h. 4-6 Wochen vor der Bildung von Xenotransplantaten, zu verbessern, während während der gesamten Operationszeit eine umfangreiche Tierpflege erwartet wird, die sowohl zeit- als auch ressourcenintensiv ist. Es wird auch erwartet, dass die Herstellung von orthotopen HCC-Xenotransplantaten mit dieser Methode etwa 8 Wochen vor einer erfolgreichen PET-Bildgebung erforderlich sein wird, da die Implantation des Tumorwürfels anstelle der direkten Injektion von Zellsuspensionen verwendet wird, um eine Peritonealmetastasierung zu vermeiden. Dennoch können diese Einschränkungen durch eine angemessene Planung und Schulung des Forschungspersonals überwunden werden. Außerdem ist die Stichprobengröße der hier berichteten Versuchsgruppen klein, was für eine statistische Analyse möglicherweise nicht geeignet ist. Unsere Beobachtungen zeigen jedoch subjektiv einen Trend, bei dem eine HAL-induzierte Hypoxie sowohl im Tumor als auch in der Leber in der H2-Gruppe im Vergleich zur C1-Gruppe gemessen wurde, was durch eine stärkere HIF-1α-Färbung in den H2-Tumorproben unterstützt wird. Derzeit arbeiten wir daran, die Tumormodelle mit anderen humanen HCC-Zelllinien zu erweitern. Außerdem sind therapeutische Studien im Gange, die auf den Hypoxie-Signalweg bei HCC abzielen und an denen diese Xenotransplantate beteiligt sind.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir bedanken uns für die Unterstützung des Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) für die Bildgebungsexperimente bei Kleintieren. Wir danken auch für die Unterstützung des Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) an der University of Hong Kong für die Bereitstellung von [18 F]FMISO und [18F]FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
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