Apresentamos um protocolo para medir os módulos elásticos de áreas ricas em colágeno em fígado normal e doente usando microscopia de força atômica. O uso simultâneo da microscopia de polarização fornece alta precisão espacial para localizar áreas ricas em colágeno nas seções do fígado.
O enrijecimento da matriz tem sido reconhecido como um dos principais impulsionadores da progressão da fibrose hepática. Tem efeitos profundos em vários aspectos do comportamento celular, como a função celular, diferenciação e motilidade. No entanto, como esses processos não são homogêneos em todo o órgão, tornou-se cada vez mais importante entender as mudanças nas propriedades mecânicas dos tecidos no nível celular.
Para poder monitorar o enrijecimento de áreas ricas em colágeno dentro dos lobos hepáticos, este trabalho apresenta um protocolo para a medição de módulos elásticos do tecido hepático com alta precisão espacial por microscopia de força atômica (AFM). AFM é um método sensível com o potencial de caracterizar propriedades mecânicas locais, calculadas como módulo de Young (também referido como elástico). A AFM associada à microscopia de polarização pode ser usada para localizar especificamente as áreas de desenvolvimento de fibrose com base na birrefringência das fibras colágenas nos tecidos. Usando o protocolo apresentado, caracterizamos a rigidez de áreas ricas em colágeno de fígados fibróticos de camundongos e áreas correspondentes nos fígados de camundongos controle.
Um aumento proeminente na rigidez das áreas positivas para colágeno foi observado com o desenvolvimento de fibrose. O protocolo apresentado permite um método altamente reprodutível de medição da AFM, devido ao uso de tecido hepático levemente fixo, que pode ser usado para aprofundar a compreensão das mudanças iniciadas pela doença nas propriedades mecânicas do tecido local e seu efeito sobre o destino das células vizinhas.
O fígado é um órgão vital para a manutenção da homeostase em organismos 1,2. As doenças hepáticas crônicas são responsáveis por ~ 2 milhões de mortes em todo o mundo anualmente3. Eles se originam mais comumente como infecções virais, distúrbios autoimunes, síndromes metabólicas ou doenças relacionadas ao abuso de álcool e são acompanhados por fibrose hepática progressiva. A lesão hepática provoca uma resposta inflamatória, o que leva à ativação de células depositando matriz extracelular (ECM) em uma resposta de cicatrização de feridas. No entanto, na presença de um insulto crônico, o excesso de MEC forma tecido cicatricial não resolvido dentro do fígado, levando ao desenvolvimento de fibrose hepática, cirrose, carcinoma hepático e, finalmente, à insuficiência hepática4.
A lesão de hepatócitos resulta imediatamente em aumento da rigidez hepática 5,6. Isso afeta diretamente a função dos hepatócitos, ativa as células estreladas hepáticas (HSCs) e os fibroblastos portais e resulta em sua transdiferenciação para miofibroblastos depositantes de colágeno 7,8. A deposição de ECM fibrosa aumenta ainda mais a rigidez hepática, criando um ciclo de feedback auto-amplificador de enrijecimento hepático e ativação celular produtora de matriz.
A rigidez hepática tornou-se, assim, um parâmetro importante no prognóstico da doença hepática. A alteração nas propriedades biomecânicas do tecido pode ser detectada mais cedo do que a fibrose pode ser diagnosticada por análise histológica. Portanto, várias técnicas para a medição da rigidez hepática foram desenvolvidas em pesquisas e aplicações clínicas. Em contextos clínicos, a elastografia transitória (TE)9,10,11,12,13 e a elastografia por ressonância magnética (MRE)14,15,16,17,18 têm sido empregadas para diagnosticar de forma não invasiva os estágios iniciais do dano hepático, examinando a rigidez hepática macroscópica 19.
Na TE, ondas ultrassonográficas de amplitude leve e baixa frequência (50 Hz) são propagadas pelo fígado, e sua velocidade é medida, que é então utilizada para o cálculo do módulo elástico tecidual13. No entanto, essa técnica não é útil para pacientes com ascite, obesidade ou espaços intercostais inferiores devido à transmissão inadequada das ondas ultrassonográficas através dos tecidos ao redor do fígado9.
A ERM é baseada na modalidade de ressonância magnética e usa ondas de cisalhamento mecânico de 20-200 Hz para atingir o fígado. Uma sequência específica de ressonância magnética é então utilizada para traçar as ondas dentro do tecido e calcular a rigidez tecidual16. Os valores de rigidez relatados com as técnicas de ET e ERM correlacionam-se bem com o grau de fibrose hepática obtido a partir de biópsias de amostras de fígado humano classificadas usando escores histológicos do METAVIR20 (Tabela 1). A ET e a ERM também foram adaptadas para a mensuração da rigidez hepática em modelos de roedores para fins de pesquisa21,22,23. No entanto, como ambos os métodos derivam os valores de rigidez da resposta do tecido às ondas de cisalhamento propagadoras, os valores obtidos podem não refletir a rigidez mecânica absoluta do tecido.
Para uma caracterização mecânica direta de fígados de roedores, Barnes et al. desenvolveram um ensaio modelo-gel-tecido (ensaio MGT) envolvendo a incorporação de tecido hepático em gel de poliacrilamida24. Este gel é comprimido por uma força uniforme pulsada a partir da qual o módulo de Young pode ser calculado. O ensaio de MGT mostra uma boa correlação com um ensaio de indentação adaptado para fígados normais e fibróticos24 (Tabela 1).
Tabela 1: Valores de rigidez hepática no nível do volume. TE e MRE em comparação com medições mecânicas ex vivo diretas de módulos elásticos hepáticos usando ensaios de recuo e MGT para fígados de diferentes fontes. A relação entre E e G é dada por E = 2G (1 + v), onde v é a razão de Poisson da amostra; F0 a F4 representam o escore de fibrose no sistema de pontuação METAVIR, com F0 denotando baixa ou nenhuma fibrose e F4 fígados cirróticos. Abreviaturas: TE = elastografia transitória; ERM = elastografia por ressonância magnética; MGT = modelo-gel-tecido; E = módulo elástico (de Young); G = módulo de cisalhamento. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Uma das principais desvantagens das medições genéricas de rigidez hepática é que elas não fornecem resolução em nível celular da heterogeneidade da rigidez no fígado. Durante a progressão da fibrose, áreas ricas em colágeno apresentam maior rigidez em relação ao parênquima circundante25,26. Esse gradiente de rigidez influencia localmente as células residentes e desempenha um papel importante na condução da heterogeneidade do HSC27. Assim, as alterações nas propriedades mecânicas locais durante o desenvolvimento da doença hepática precisam ser caracterizadas em um nível microscópico para entender melhor a progressão da fibrose.
O AFM permite que as propriedades mecânicas do tecido sejam medidas com alta resolução e alta sensibilidade à força. O AFM usa a ponta de um cantilever para recuar a superfície de uma amostra com forças tão baixas quanto vários piconewtons, induzindo uma deformação em um nível microscópico ou nanoscópico com base na geometria e no tamanho da ponta empregada. A resposta de força da amostra à deformação aplicada é então medida como a deflexão no cantilever28. As curvas de força-deslocamento são coletadas a partir da aproximação e retração do balanço, que pode ser equipado com modelos mecânicos de contato apropriados para avaliar a rigidez local da amostra29.
Além de medir a rigidez de uma determinada área, o AFM também pode fornecer informações topográficas sobre características específicas da amostra, como a estrutura das fibras de colágeno30,31,32. Vários estudos descreveram a aplicação de AFM para medir a rigidez de vários tecidos saudáveis e doentes, como pele 32,33, pulmão 34,35, cérebro36, mamário37,38,39, cartilagem 40 ou coração41,42,43,44 de amostras de modelos de pacientes e camundongos. Além disso, a AFM também tem sido utilizada in vitro para determinar a rigidez de células e andaimes proteicos extracelulares45,46,47.
A medição das propriedades mecânicas de amostras biológicas usando AFM não é trivial devido à sua suavidade e fragilidade. Assim, vários estudos padronizaram diferentes condições e configurações, que produzem valores amplamente flutuantes dos módulos de Young (revisados por Mckee et al.48). Semelhante a outros tecidos moles, os valores do módulo hepático de Young em diferentes graus de fibrose hepática também apresentam extensa variação (Tabela 2). As diferenças nos valores do módulo de Young decorrem de diferenças no modo de operação do AFM, ponta do cantilever, método de preparação da amostra, espessura da amostra, profundidade e forças de recuo, ambiente do tecido hepático durante a medição e método de análise (Tabela 2).
Tabela 2: Valores de rigidez hepática a nível celular. Os valores de rigidez hepática obtidos usando AFM descrevem as propriedades mecânicas do fígado no nível celular. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; E = módulo elástico (de Young); PFA = paraformaldeído; PBS = solução salina tamponada com fosfato. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Este trabalho descreve um protocolo para a medida reprodutível dos módulos de Young de áreas fibróticas ricas em colágeno no tecido hepático por AFM com uma localização precisa fornecida pelo uso de microscopia de polarização. Administramos tetracloreto de carbono (CCl4) para induzir a deposição de colágeno de forma centrolobular49 em um modelo de camundongo, imitando de forma confiável aspectos cruciais da fibrose hepática humana50. Imagens microscópicas polarizadas possibilitam a visualização do colágeno no fígado devido à birrefringência das fibras colágenas51, o que permite o posicionamento preciso da ponta do cantilever sobre a área de interesse desejada dentro do lóbulo hepático52.
O protocolo apresentado fornece um método reprodutível passo-a-passo para a medição da AFM do tecido hepático normal e fibrótico do rato. A microscopia de polarização acoplada fornece alta precisão espacial e permite a visualização de fibras de colágeno devido à sua birrefringência. Além disso, uma descrição detalhada da análise das curvas de força obtidas é fornecida. A medição da rigidez da AFM pode ser realizada no nível celular, o que permite que as alterações locais nas propriedades mecânicas do tecido hepático devido ao desenvolvimento de doença fibrótica sejam monitoradas. A fibrose hepática não é um processo homogêneo que afeta todo o órgão. Pelo contrário, áreas de septos fibróticos ricos em colágeno são intercaladas com áreas de baixos ou nenhum depósito de colágeno. Assim, as alterações de rigidez são específicas do microambiente local e afetam apenas as células localmente em contato com áreas danificadas por lesões. Essa microescala de heterogeneidade de rigidez também é aparente nos detalhes dos mapas de módulos do AFM Young, onde pontos de alta rigidez margeiam as áreas de rigidez quase normal. Essa variação mostra que mesmo a área do tecido cicatricial do colágeno não é mecanicamente homogênea e requer que a medida da AFM seja caracterizada em nível celular (Figura 4).
O protocolo apresentado permite a mensuração da rigidez hepática por AFM independentemente da coleção hepática, pois todos os lobos hepáticos embutidos na OCT podem ser armazenados por um período prolongado a -80 °C. No entanto, uma vez que o tecido é seccionado, recomendamos medir as amostras dentro de ~ 2 semanas, pois observamos um amolecimento gradual das seções de tecido armazenadas por longos períodos de tempo (Figura 5).
O AFM equipado com microscopia de polarização permite localizar com precisão a área de interesse dentro da estrutura do lóbulo hepático. No entanto, também possui algumas limitações que precisam ser consideradas na interpretação dos resultados. Os valores de rigidez aqui obtidos foram medidos à temperatura ambiente. Assumimos que os efeitos da temperatura sobre as propriedades mecânicas dos tecidos moles serão pequenos; no entanto, esta pode ser uma das razões para diferenças entre os valores relatados in vivo de propriedades mecânicas dos tecidos hepáticos e os valores deste estudo.
Além disso, este protocolo permite a análise AFM do tecido hepático por até 3 h, o que requer uma fixação leve do tecido. A fixação leve das seções teciduais, bem como o ciclo de congelamento-descongelamento, provavelmente afetarão os valores absolutos do módulo de Young. Assim, os valores relatados dos módulos de Young podem diferir dos valores in vivo. Mais estudos são necessários para otimizar o protocolo de mensuração dos valores absolutos do módulo de Young a partir de cortes hepáticos, o que pode ser alcançado por um método diferente para fixação do tecido hepático64.
No entanto, observamos um aumento da rigidez de áreas ricas em colágeno nos fígados de camundongos tratados com CCl4 por 3 semanas em comparação com 6 semanas. Tais alterações correspondem à progressão da fibrose durante a lesão prolongada (Figura 4) e mostram que diferenças relativas podem ser investigadas entre os diferentes tratamentos utilizando o protocolo apresentado. Isso está de acordo com as observações de Calò et al., que mostraram que cortes hepáticos levemente fixos mostram diferenças semelhantes nos valores de rigidez entre áreas ricas em colágeno e sem colágeno como no tecido fresco25.
Utilizamos o cantilever SD-qp-BioT-TL-10 (constante teórica de mola ~0,09 N/m) modificado com uma ponta esférica de 5,7 μm de diâmetro para minimizar a ruptura mecânica do tecido hepático durante as medições. Um talão de 5,7 μm permitiu o recuo suficiente da amostra para sondar sua rigidez, preservando sua integridade. Um grânulo com um diâmetro menor pode ser usado, após várias otimizações, para obter maior resolução nos mapas de rigidez, mas pode levar a uma maior superestimação dos valores do módulo de Young (para mais detalhes, ver Crichton et al.65). Usando o conjunto de contas de balanço especificado, fomos capazes de caracterizar a rigidez da amostra em uma ampla faixa, de dezenas de unidades de Pa a ~100 kPa.
O modelo de Sneddon foi utilizado para derivar o módulo de Young a partir de curvas de força, pois permite a análise de reentrâncias profundas com sondas coloidais62. O modelo de Sneddon, ao contrário do modelo de Hertz, não sofre da restrição de que o raio de contato deve ser muito menor do que o raio da esfera. Assume, ainda, que a espessura da amostra é várias vezes maior que a profundidade de recuo 30,66. No presente estudo, o recuo foi de ~2 μm com um tamanho de grânulo de 5,7 μm e uma espessura de amostra de 30 μm em áreas ricas em colágeno; assim, o modelo de Sneddon era apropriado. Outros modelos63 considerando a força de adesão entre ponta e substrato podem ser utilizados para diferentes tipos de tecidos.
A análise em AtomicJ implementa correções para a espessura finita das amostras para minimizar a contribuição de um substrato enquanto se deriva o módulo de Young62,67. Na análise das curvas de força obtidas, utilizou-se uma única razão de Poisson de 0,45, que já foi previamente recomendada para órgãos de partes moles24. Esta aproximação não tem um efeito significativo sobre os valores calculados do módulo de Young, uma vez que a mudança no valor da razão de Poisson de 0,4 para 0,5 resulta apenas em uma diminuição de 0,893x nos valores do módulo de Young calculados de acordo com a equação de Sneddon. Dadas as diferenças múltiplas no módulo de Young entre as diferentes durações dos tratamentos com CCl4, os erros produzidos pela aproximação da razão de Poisson são apenas marginais.
Utilizamos curvas de retirada para calcular os valores de rigidez, pois estávamos interessados na resposta elástica do tecido à carga fornecida pelo cantilever e não na resposta plástica ao recuo68. Devido à resposta viscoelástica do tecido mole, as curvas de retirada de ajuste podem superestimar o módulo de Young, o que deve ser mantido em mente. Além disso, observamos que a análise de dados com curvas de aproximação produz tendências semelhantes nos valores de rigidez entre as áreas fibrótica e de controle, embora os valores absolutos sejam correspondentemente menores (dados não mostrados).
Ao otimizar o protocolo, identificamos várias etapas críticas para a reprodutibilidade das medições. Primeiro, é importante garantir que o talão esteja aproximadamente no centro da ponta translúcida enquanto se conecta ao balanço. Isso evita possíveis desequilíbrios mecânicos durante o recuo. Em segundo lugar, durante a fixação hepática com PFA, é necessário seguir rigorosamente os limites de tempo para descongelamento e fixação. Alterar o tempo desta etapa pode afetar severamente as propriedades mecânicas das seções de tecido. Em terceiro lugar, o cantilever deve ser repetidamente calibrado com monitoramento contínuo e entrada de valores de temperatura simultânea para evitar que quaisquer artefatos ocorram em valores de rigidez devido a flutuações de temperatura. Por último, uma única secção de fígado não deve ser medida por mais de 3 h a partir da preparação, uma vez que a PBS sobreposta pode evaporar durante períodos mais longos. Os leitores podem consultar a tabela de solução de problemas (Tabela 3) para resolver problemas encontrados durante a medição do AFM, também discutida em extensão em Norman et al.46.
Tabela 3: Guia de solução de problemas. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
O protocolo apresentado permite a sondagem reprodutível de AFM do tecido hepático. Tem o potencial de revelar informações sobre o desenvolvimento e eventual regressão da doença hepática fibrótica em nível microscópico e pode contribuir para o desenvolvimento de terapias direcionadas a regiões de cicatrizes fibróticas formadas durante a progressão da doença hepática crônica.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Agência de Bolsas da República Checa (18-02699S), pelo Projeto de Investigação Institucional da Academia Checa de Ciências (RVO 68378050) e pelo projeto MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Consórcio da UE Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC, financiado pelo projeto de infraestruturas MEYS CR LM2018127 e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional-Projeto “UP CIISB” (N.º. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) apoiou financeiramente as medições na CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Também reconhecemos o Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Tcheca, apoiado pela MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) e RVO: 68378050-KAV-NPUI, por seu apoio com a imagem de microscopia aqui apresentada.
AFM head | Bruker | JPK nanowizard 3 | |
Cameras | Andor | Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled) | |
The Imagingsource | S/N:12310015 | ||
Cantilever | SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors | S/N:73750F05 | |
Cryotome | Leica | CM1950 | |
Epoxy resin glue (Long working time ) | Bison epoxy universal | ||
Melamine beads; diameter, 5.7 um | Microparticles, GmbH | MF-R-5.7 | |
Microscope | Olympus | IX81 | |
Hydrophobic slide marker | SuperHT | PAP PEN | |
Software | JPK nanowizard v6.1.151 | ||
AtomicJ v2.3.1 | |||
Superfrost slides | Thermoscientific | ref no. J1800AMNZ | |
System | Ubuntu 14.04.5 LTS | ||
Vibration isolation control unit | Tablestable | AVI-200-S |