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In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

Questo protocollo descrive un modello di enterocolite necrotizzante apicale (NEC) in un piatto che utilizza enteroidi intestinali piccoli con polarità invertita, consentendo l'accesso alla superficie apicale. Forniamo un protocollo di colorazione immunofluorescente per rilevare l'interruzione epiteliale correlata al NEC e un metodo per determinare la vitalità degli enteroidi apicali-out sottoposti al protocollo NEC-in-a-dish.

Abstract

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante che colpisce i neonati pretermine, caratterizzata da infiammazione intestinale e necrosi. Gli enteroidi sono recentemente emersi come un sistema promettente per modellare le patologie gastrointestinali. Tuttavia, i metodi attualmente utilizzati per la manipolazione enteroide non hanno accesso alla superficie apicale dell'epitelio (tridimensionale [3D]) o richiedono molto tempo e risorse (monostrati bidimensionali [2D]). Questi metodi spesso richiedono passaggi aggiuntivi, come la microiniezione, affinché il modello diventi fisiologicamente traducibile. Qui, descriviamo un protocollo fisiologicamente rilevante e poco costoso per studiare NEC in vitro invertendo la polarità enteroide, con conseguente superficie apicale rivolta verso l'esterno (apical-out). Viene inoltre fornito un protocollo di colorazione immunofluorescente per esaminare l'integrità della barriera enteroide e l'espressione proteica giunzionale in seguito all'esposizione al fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) o al lipopolisaccaride (LPS) in condizioni normossiche o ipossiche. Viene inoltre valutata la vitalità di enteroidi 3D apical-out esposti a LPS normossici o ipossici o TNF-α per 24 ore. Gli enteroidi esposti a LPS o TNF-α, in combinazione con ipossia, hanno mostrato un'interruzione dell'architettura epiteliale, una perdita di espressione della proteina di giunzione aderente e una riduzione della vitalità cellulare. Questo protocollo descrive un nuovo modello apical-out NEC-in-a-dish che presenta una piattaforma fisiologicamente rilevante ed economica per identificare potenziali bersagli epiteliali per le terapie NEC e studiare la risposta intestinale pretermine alle terapie.

Introduction

L'enterocolite necrotizzante (NEC), una grave malattia infiammatoria dell'intestino tenue che si verifica fino al 10% dei neonati pretermine, è comunemente associata ad elevata morbilità e mortalità 1,2. I tassi di mortalità che si avvicinano al 50% nei neonati con peso alla nascita molto basso (<1500 g), che richiedono un intervento chirurgico, non sono rari3. Mentre l'esatta eziologia di NEC non è attualmente compresa, si ritiene che i fattori di rischio, come l'alimentazione artificiale, si aggravino con anomalie fisiologiche, come la disbiosi, un epitelio intestinale immaturo e una barriera intestinale disfunzionale, nello sviluppo della malattia 2,4. Nonostante gli sforzi significativi, nell'ultimo decennio si sono verificati pochi progressi nella prevenzione o nel trattamento del NEC5. È necessario un nuovo metodo in vitro per studiare la NEC e la disfunzione della barriera epiteliale intestinale associata per far progredire la comprensione della patogenesi della malattia, poiché i risultati dei modelli animali hanno, finora, tradotto male al lettodel paziente 6.

Un certo numero di modelli in vitro sono stati utilizzati per studiare i meccanismi in gioco durante NEC. La linea cellulare epiteliale intestinale umana, Caco-2, è tra i modelli in vitro più comunemente utilizzati di NEC 7,8. Le cellule Caco-2 emulano le caratteristiche morfologiche del bordo del pennello dell'intestino tenue, ma, come linea cellulare, non si differenziano nell'ampia varietà di tipi di cellule in vivo, comprese le cellule caliciformi che producono muco, richieste per un modello altamente traducibile. HT-29-MTX, cellule di adenocarcinoma del colon umano, includono un fenotipo misto di enterociti e cellule caliciformi, ma mancano ancora di tipi cellulari basati sulla cripta dell'epitelio intestinale9. IEC-6 e IEC-18 sono linee cellulari non trasformate con una morfologia immatura simile a una cripta ileale ma non derivano da tessuto umano, limitando la loro capacità traslazionale. Le linee cellulari intestinali FHs 74-Int e H4 derivano dal tessuto fetale umano e non formano giunzioni strette o monostrati polarizzati10,11, e quindi sono immature rispetto anche ai neonati più prematuri suscettibili alla NEC. Tipicamente, i modelli in vitro NEC utilizzano trattamenti lipopolisaccaridici (LPS) per indurre il recettore toll-like 4 (TLR4), un recettore importante che avvia l'infiammazione intestinale in NEC12. Il danno mediato attraverso il trattamento con specie reattive dell'ossigeno (ROS), tipicamente attraverso il perossido di idrogeno, è spesso usato per indurre danni ossidativi simili a NEC e apoptosi13,14. Come principale motore dell'infiammazione intestinale, il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), un componente a valle della segnalazione infiammatoria TLR4, è anche comunemente utilizzato in questi modelli in vitro per imitare la patogenesi in vivo 15.

Gli organoidi, generati da cellule staminali pluripotenti inducibili (iPSC), sono cresciuti in popolarità come modello in vitro dell'intestino grazie alla loro capacità di ricapitolare la complessa architettura in vivo e la composizione del tipo cellulare del tessuto da cui derivano16,17. Un sistema in vitro correlato, gli enteroidi, sono organoidi derivati da cripte intestinali resecate che sono più facilmente stabiliti e mantenuti rispetto agli organoidi derivati da iPSC. Gli enteroidi sono tipicamente coltivati in una matrice extracellulare tridimensionale (3D) (ECM) con accesso sperimentale limitato alla superficie cellulare basolaterale. Metodi, come la microiniezione18,19, sono stati sviluppati per superare questa barriera alla superficie apicale, ma l'accumulo di detriti cellulari e muco all'interno del lume rende la microiniezione sia tecnicamente difficile che incoerente. Poiché le piattaforme di microiniezione robotizzata personalizzate non sono ampiamente accessibili20, la variabilità da laboratorio a laboratorio nelle capacità tecniche e nella tecnica generale diventano variabili significative da superare con i protocolli di microiniezione. Monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi 3D dissociati, che comprendono ancora tutti i principali tipi di cellule dell'epitelio intestinale, consentono l'accesso alla superficie apicale ma sono stati tradizionalmente difficili da mantenere senza uno strato di alimentazione di miofibroblasti mesenchimali21. Mentre i supporti permeabili alla coltura cellulare possono essere utilizzati per accedere sia al lato apicale che basolaterale dei monostrati enteroidi senza l'uso di miofibroblasti sottostanti, questi inserti richiedono l'escissione e il montaggio della membrana prima dell'uso con modalità quali la microscopia confocale, risultando in un processo tecnicamente più impegnativo e difficile quando si utilizzano metodi di microscopia tradizionali22. NEC è stato modellato in vitro utilizzando enteroidi 3D tradizionali 23,24,25 e supporti permeabili 26,27, e l'infiammazione intestinale è stata recentemente replicata con modelli gut-on-a-chip 28,29. Mentre i modelli gut-on-a-chip che incorporano la microfluidica sono, di gran lunga, i modelli più avanzati e traducibili, questa tecnologia è costosa, complessa e inaccessibile alla maggior parte dei ricercatori30.

I recenti progressi nelle tecniche enteroidi apicali-out hanno permesso un accesso più facile alla superficie apicale degli enteroidi 3D senza rischiare di danneggiare l'integrità strutturale dell'epitelio in vitro 31,32,33. Gli enteroidi apicali-out condividono la composizione del tipo di cellula e la funzione barriera dell'epitelio intestinale in vivo, ma, a differenza dei tipici enteroidi 3D, le superfici apicali di queste cellule sono rivolte verso il terreno di coltura, consentendo studi più fisiologicamente rilevanti sull'assorbimento dei nutrienti, l'infezione microbica e la secrezione luminale31. Un ulteriore vantaggio degli enteroidi apical-out è la capacità di distribuire omogeneamente agenti sperimentali agli enteroidi. Non è richiesta una variazione dei volumi di trattamento in base alle dimensioni degli enteroidi, come avviene con la microiniezione, e la capacità di mantenere questi enteroidi nella coltura in sospensione annulla qualsiasi interferenza ECM sulla diffusione dell'agente sperimentale32.

L'enterocolite necrotizzante è una malattia multifattoriale che coinvolge più tipi di cellule epiteliali intestinali e una varietà di fattori ambientali e fisiopatologici34. La variegata composizione cellulare degli enteroidi intestinali è un netto miglioramento rispetto alle monocolture nella modellazione di una malattia complessa come la NEC. È interessante notare che, mentre una singola esposizione infiammatoria è spesso sufficiente per indurre danni in monocolture in vitro , gli enteroidi, come con i modelli murini23, sembrano richiedere un minimo di due componenti infiammatori per indurre danni simili a NEC6. Qui, presentiamo un modello apical-out NEC-in-a-dish, utilizzando enteroidi apical-out in combinazione con ipossia (un'importante caratteristica clinica di NEC6) e LPS o TNF-α, come modello in vitro migliorato e più fisiologicamente rilevante per studiare le risposte epiteliali all'infiammazione simile a NEC e, potenzialmente, identificare bersagli terapeutici. Descriviamo un protocollo per invertire la polarità degli enteroidi 3D dell'intestino tenue, nonché un protocollo di colorazione immunofluorescente per identificare la rottura della barriera epiteliale e le alterazioni dell'espressione proteica giunzionale. Infine, dimostriamo ulteriormente un semplice saggio di vitalità enteroide per determinare l'impatto del nostro modello NEC-in-a-dish a doppio colpo.

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Protocol

Tutte le procedure animali in questo studio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma. Campioni di convenienza dell'intestino tenue da un primate pretermine non umano (NHP, 90% gestazione, babbuino olivastro, Papio anubis) sono stati ottenuti dopo l'eutanasia per uno studio separato (Protocollo #101523-16-039-I).

1. Istituzione del modello NEC-in-a-dish enteroide apical-out

  1. Preparazione di trattamenti con mezzi e enteroidi
    NOTA: Una volta preparato seguendo la tecnica asettica standard, il supporto può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
    1. Preparare terreni privi di antibiotici (AFM) mescolando 50 ml di terreno di crescita organoide umano con 50 ml di integratore di organoidi (vedere Tabella dei materiali). Preparare 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico/1x soluzione salina tamponata con fosfato (EDTA/PBS) aggiungendo 100 μL di 0,5 M EDTA a 9.900 μL di PBS.
    2. Chill Dulbecco modificato eagle's medium/nutrient Ham's mixture F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) a 2-8 °C.
    3. Preparare la soluzione madre di TNF-α sospendendo 100 μg di polvere di TNF-α in 1 mL di 1x PBS. Diluire ulteriormente lo stock di TNF-α a concentrazioni di 20 ng/mL e 50 ng/mL utilizzando AFM come solvente. Preparare la soluzione madre di LPS sospendendo 2 mg di LPS in 1 mL di 1x PBS. Diluire ulteriormente LPS stock a 100 μg/mL e 200 μg/mL utilizzando AFM come solvente.
  2. Invertire la polarità degli enteroidi 3D
    NOTA: La seguente procedura è destinata all'inversione di una singola piastra di coltura tissutale a fondo piatto a 24 pozzetti in due piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti a bassissimo attacco. Le piastre di coltura tissutale devono essere riscaldate a 37 °C per almeno 30 minuti prima dell'uso. La derivazione di enteroidi 3D basolateral-out è stata ottenuta come descritto in precedenza da molti gruppi35,36, con lievi modifiche per i mezzi (dettagliato sopra). La procedura generale di derivazione enteroide non differisce da quella umana. In breve, il tessuto asportato viene lavato, tagliato in piccoli frammenti e incubato nel tampone di distruzione cellulare. La soluzione cellulare viene quindi eseguita attraverso un filtro cellulare da 70 μM, risultando in cripte placcate ad alta densità.
    1. Aspirare i mezzi da ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti di enteroidi basolaterali 3D stabiliti.
    2. Aggiungere 500 μL di EDTA/PBS ghiacciato da 5 mM a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e interrompere meccanicamente delicatamente l'estratto della membrana basale / cupola ECM pipettando su e giù con una pipetta p200 almeno 5x-6x.
    3. Trasferire il contenuto di quattro pozzetti in un tubo conico da 15 ml e aggiungere 8 ml di EDTA/PBS ghiacciato al tubo conico. Trasferire i restanti 20 pozzi nello stesso modo.
    4. Incubare tubi conici da 15 mL a 4 °C per 1 h su piattaforma rotante o agitatore a 330 giri/min. Dopo 1 ora di incubazione, centrifugare i tubi conici a 300 x g per 3 minuti a 4 °C. Rimuovere e scartare il surnatante da ogni tubo.
    5. Unire e lavare i pellet cellulari con 5 ml di DMEM/F12 e distribuire la sospensione cellulare in due tubi conici da 15 ml.
    6. Pellettare le celle centrifugando a 300 x g per 3 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 12 ml di AFM a ciascun tubo, assicurandosi che i pellet cellulari siano risospesi.
    7. Pipettare 500 μL della sospensione enteroide in ciascun pozzetto di due piastre di attacco ultra-basse da 24 pozzetti.
    8. Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO 2 per2-5 giorni o fino a quando gli enteroidi non hanno invertito la polarità.
    9. Per verificare l'inversione enteroide, stabilire prima la colorazione immunofluorescente di conferma e il tempo medio di inversione (~ 3 giorni), quindi confermare l'inversione di polarità utilizzando una visualizzazione di base al microscopio ottico. Gli enteroidi apicali-out sono molto cellulari nell'aspetto, mentre gli enteroidi basolaterali sono spesso dominati dalla presenza di un grande lume centrale o gemmazione (vedi Figura supplementare 1).
      NOTA: una volta che la procedura è stata standardizzata, il tasso di conversione in apical-out supera in genere il 95%. L'uso di enteroidi apical-out è inteso come un esperimento terminale, anche se è teoricamente possibile far passare enteroidi apical-out in un piccolo numero di enteroidi basolaterali-out.
  3. Apical-out NEC-in-a-dish
    NOTA: Una volta che gli enteroidi hanno invertito la polarità, utilizzare rapidamente le colture negli esperimenti successivi, poiché la loro longevità nella conformazione apical-out non è stata confermata oltre i 3-4 giorni. Per il seguente modello NEC-in-a-dish, gli enteroidi sono stati trattati per 24 ore, quindi raccolti immediatamente dopo e conservati per esperimenti a valle.
    1. Una volta che gli enteroidi hanno invertito visivamente la polarità con almeno il 95% di efficienza, rimuovere le piastre dall'incubatore e raccogliere otto pozzetti di una piastra a 24 pozzetti in un tubo conico da 15 ml. Poiché gli enteroidi apical-out sono in sospensione, è sufficiente pipettare la soluzione enteroid/media. Centrifugare il tubo da 15 mL a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
    2. Una volta che le cellule sono pellettizzate, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 ml di AFM miscelato con il volume desiderato (10 μL qui per abbinare il massimo volume di trattamento aggiunto) di 1x PBS (controllo).
    3. Pipettare 500 μL di sospensione enteroide/PBS/AFM in otto pozzetti di una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti e incubare la piastra a 37 °C e al 5% di CO2 per 24 ore.
    4. Ripetere i passaggi 1.3.1.-1.3.3. per i trattamenti con TNF-α (20 ng/mL e 50 ng/mL) e LPS (100 μg/mL e 200 μg/mL) alla normossia. Per tutti i trattamenti per l'ipossia, ripetere i passaggi 1.3.1.-1.3.3., ma porre la piastra in un'incubatrice separata a 37 °C, 5% CO 2 e 1% O2 per 24 ore.
      NOTA: Passo 1.3.4. può essere eseguita contemporaneamente ai passaggi 1.3.1.-1.3.3, ma, per chiarezza, la procedura di cui sopra è stata separata dal trattamento al fine di ridurre la complessità.

2. Colorazione immunofluorescente e microscopia confocale

  1. Preparazione di soluzioni coloranti
    1. Preparare Triton X-100 allo 0,1% miscelando 7 μL di Triton X-100 in 1x PBS fino a un volume finale di 7 ml. Preparare PBST (PBS-Tween) aggiungendo 30 μL di Tween-20 a 1x PBS a un volume finale di 30 ml.
    2. Preparare il 10% di siero normale d'asina (NDS)/PBST aggiungendo 700 μL di NDS a 6,3 ml di PBST. Preparare NDS/PBST all'1% aggiungendo 70 μL di NDS al PBST per un volume finale di 7 ml.
      NOTA: Il siero d'asino è stato usato qui per correlare con l'ospite anticorpale secondario. Tuttavia, le specie di siero bloccante devono corrispondere alle specie di anticorpi secondari per bloccare correttamente il legame non specifico.
  2. Colorazione (Giorno 1)
    1. Trasferire il contenuto di quattro pozzetti di una piastra da 24 pozzetti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Ripetere l'operazione per tutti i pozzetti/trattamenti desiderati, con ogni trattamento in una provetta separata. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Una volta che gli enteroidi sono pellettati, rimuovere il surnatante.
    2. Risospendere i pellet cellulari in 300 μL di fissativo di formaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Dopo 30 minuti, centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 500 μL di sterile, RT 1x PBS.
    3. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μL di Triton X-100 allo 0,1%, quindi lasciare riposare per 1 ora a RT.
    4. Dopo 1 ora, centrifugare le provette a 300 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Lavare con 500 μL di 1x PBS e posizionare i tubi su un rotatore o agitatore a 200 rpm per 15 minuti a 2-8 °C. Ripeti questo per un totale di 4x.
    5. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 500 μL di NDS/PBST al 10% e incubare a RT per 45 minuti. Durante l'incubazione, preparare soluzioni di anticorpi primari combinando 20 μL di anticorpo anti-villina ricombinante, 10 μL di anticorpo E-caderina e 1970 μL di NDS/PBST all'1% per otto pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.
    6. Dopo i 45 minuti di incubazione, centrifugare le provette a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Posizionare i tubi sul ghiaccio. Rimuovere il surnatante e sostituirlo con 250 μL di soluzione anticorpale primaria. Incubare le provette per una notte a 2-8 °C.
  3. Colorazione (Giorno 2)
    1. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 250-500 μL di PBST a ciascun tubo, a seconda delle dimensioni del pellet, e posizionare sul rotatore o agitatore a 200 giri / min per 1 ora a 2-8 °C. Ripetere il lavaggio PBST 4x.
    2. Preparare la soluzione anticorpale secondaria aggiungendo 52 μL di Cy3 asino anti-coniglio IgG (H + L) al 50% di glicerolo e 5,2 μL di 488 anticorpi secondari verde fluorescente anti-topo asino a 5142,8 μL di NDS / PBST all'1%.
    3. Dopo l'ultimo lavaggio e centrifugazione PBST, rimuovere il surnatante dai tubi. Erogare 200 μL di soluzione anticorpale secondaria a ciascuna provetta e incubare al buio per una notte a 2-8 °C.
  4. Montaggio di enteroidi apicali-out colorati (Giorno 1)
    1. Portare il montante a base di glicerolo contenente colorante nucleare blu a RT in 1 ora.
    2. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Rimuovere 100 μL del surnatante e risospendere le cellule nei restanti ~100 μL di surnatante. Trasferire la sospensione cellulare in provette da 0,5 ml.
    3. Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 s per pellettare le celle. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di colorazione di acido nucleico rosso lontano. Incubare i tubi a RT per 10 minuti.
    4. Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 s per pellettare le celle. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di 1x PBS. Ripetere per un secondo lavaggio.
    5. Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 s per pellettare le celle e rimuovere 70 μL del surnatante. Risospendere le celle nel volume rimanente di PBS e trasferire il contenuto in un coprivetrino etichettato (24 mm x 60 mm).
    6. Applicare 75 μL di montante direttamente sul campione e rimuovere eventuali bolle con una punta di pipetta. Lasciare che i coprivetrini si polimerizzino durante la notte (18-24 h) a RT al buio.
  5. Montaggio di enteroidi apicali-out colorati (Giorno 2)
    1. Dopo la polimerizzazione durante la notte, applicare uno strato sottile (~ 15 μL) di glicerolo sui vetrini. Montare il vetrino sul vetrino e premere delicatamente in posizione. Tocca per rimuovere eventuali bolle tra la copertina e la diapositiva.
    2. Lasciare che il coprislip si posizioni su RT al buio per un minimo di 2 ore, prima di scattare immagini con un ingrandimento 20x con un microscopio confocale. Per la visualizzazione microscopica degli enteroidi utilizzando vari metodi di acquisizione confocale, fare riferimento a Lallemant et al.37.
  6. Quantificazione immunofluorescente
    NOTA: questo metodo determina la fluorescenza totale corretta rimuovendo il segnale di fondo utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Aprire le immagini confocali in ImageJ e delineare l'area desiderata con lo strumento regione di interesse (ROI).
    2. Impostare i parametri definiti dall'utente passando a Analizza > Imposta misure. Selezionare Area > Densità integrata > Valore medio grigio nella scheda Impostazioni.
    3. Passare ad Analizza > misura. Apparirà una finestra pop-up contenente le misure. Copia e incolla queste misurazioni in un foglio di calcolo.
    4. Per sottrarre il segnale di sfondo, selezionare una piccola area non fluorescente dell'immagine. Passare ad Analizza > misura per quell'area . Apparirà una finestra pop-up contenente le misure. Copia e incolla l'output in un foglio di calcolo.
    5. Moltiplicare l'area della cella selezionata per la fluorescenza media delle letture di fondo e sottrarre la somma dalla densità integrata per calcolare la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF). Ripetere i passaggi precedenti per tutte le immagini di interesse, mantenendo i record in un foglio di calcolo o in un pacchetto software statistico (vedere Tabella dei materiali).

3. Vitalità cellulare NEC-in-a-dish apical-out

  1. Trattamenti enteroidi
    1. Stabilire un modello NEC-in-a-dish apical-out per 24 ore, come nel passaggio 1.
    2. Saggio di vitalità cellulare reagente per la notte a 4 °C. Il giorno del test, portare il reagente a RT 30 minuti prima dell'uso. Capovolgere il reagente per miscelare.
    3. Prima di eseguire il test, rimuovere 100 μL di terreno da ciascun pozzetto, lasciando i restanti 400 μL. Aggiungere 400 μL di reagente di analisi di vitalità cellulare a ciascun pozzetto.
    4. Mescolare energicamente bene il contenuto su uno shaker a piastre a RT per 5 minuti a 200 giri / min per indurre la lisi cellulare. Dopo l'agitazione, incubare la piastra a RT per altri 25 minuti.
    5. Dopo 25 minuti di incubazione, mescolare il contenuto di un pozzetto tramite pipettaggio e trasferire 200 μL degli 800 μL in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, opaca, in polistirene, con fondo chiaro. Ripetere l'operazione per i restanti 600 μL, creando quattro repliche tecniche per pozzetto. Trasferire il contenuto rimanente di ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti in questo modo.
    6. Utilizzando un lettore di piastre in grado di luminescenza, registrare i valori a 0,25 ms di integrazione e confrontare i valori relativi tra i trattamenti. In alternativa, confrontare la luminescenza del trattamento con uno standard di adenosina trifosfato (ATP).

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Representative Results

L'uso di enteroidi per modellare l'infiammazione intestinale, anche nel contesto dell'enterocolite necrotizzante, è ora comune. Tuttavia, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati non hanno accesso alla superficie apicale degli enteroidi, negando la rilevanza fisiologica dei composti destinati all'eventuale uso come terapie orali, o sono tecnicamente difficili e richiedono tempo, come con i monostrati derivati dagli enteroidi. Per aumentare l'utilità degli attuali modelli enteroidi in vitro di NEC, abbiamo invertito la polarità degli enteroidi e, in combinazione con ipossia 24 ore e LPS o TNF-α, generato un modello NEC-in-a-dish apical-out. La colorazione immunofluorescente ha confermato la localizzazione apical-out dei nuclei (blu) verso il lume e la rilevazione del villino32 (marcatore apicale rosso) sul bordo esterno dell'epitelio (Figura 1A). L'esposizione a 200 μg/mL di LPS, 50 ng/mL di TNF-α o ipossia da sola non ha indotto cambiamenti evidenti nella morfologia cellulare grossolana, E-caderina38 (verde), o localizzazione della villina o intensità fluorescente rispetto al controllo (Figura 1A-D; Figura 2). Il trattamento con LPS o TNF-α, in combinazione con ipossia, ha interrotto l'architettura epiteliale e causato una significativa perdita di espressione proteica della giunzione aderente e del bordo del pennello, indicata dalla perdita di E-caderina e colorazione villina (Figura 1E-F; Figura 2). Queste riduzioni del bordo del pennello degli enterociti e delle espressioni proteiche della giunzione aderente indicano probabilmente una riduzione dell'integrità della barriera epiteliale e sono una caratteristica comune sia del NEC chirurgico umano che della modellazione in vitro della malattia23.

Per determinare l'impatto dei componenti NEC-in-a-dish sulla vitalità degli enteroidi 3D apical-out, la vitalità cellulare è stata valutata utilizzando un saggio di vitalità cellulare progettato per colture 3D, incentrato sulla quantificazione dell'ATP dopo la lisi cellulare. Gli enteroidi sono stati trattati con LPS (200 μg/ml) o TNF-α (50 ng/mL) per 24 ore in condizioni normossiche o ipossiche. LPS o TNF-α da soli non hanno influenzato significativamente la vitalità cellulare rispetto al controllo (Figura 3A). Tuttavia, riduzioni significative della vitalità si sono verificate quando enteroidi apical-out sono stati trattati con 200 μg/mL LPS o 50 ng/mL TNF-α in combinazione con ipossia (****p < 0,0001) rispetto alla sola ipossia (Figura 3B). Questi esperimenti dimostrano la versatilità e la rilevanza fisiologica dell'utilizzo di enteroidi apical-out in un modello NEC-in-a-dish economico e semplice.

Figure 1
Figura 1: Conferma del fenotipo apical-out e degli effetti morfologici del lipopolisaccaride (LPS), del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e dell'ipossia. Colorazione immunoistochimica rappresentativa di enteroidi apicali-out 3D per il bordo del pennello degli enterociti e le proteine di giunzione aderenti dopo 24 ore. (A) Controllo, (B) ipossia, (C) LPS (200 μg/mL), (D) TNF-α (50 ng/mL), (E) LPS (200 μg/mL) + ipossia, (F) TNF-α (50 ng/mL) + ipossia. Barra di scala = 50 μm per ogni immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Quantificazione dell'intensità di colorazione per le proteine di giunzione del bordo dello spazzolo e aderenti dopo trattamenti di lipopolisaccaride (LPS) 24 ore su 24, fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e ipossia. (A) livelli di Villin (rosso) confrontati tra i trattamenti; a = p < 0,0001 rispetto al controllo; b = p < 0,05 rispetto al controllo; c = p < 0,0001 rispetto all'ipossia; d = p < 0,05 rispetto all'ipossia; e = p < 0,001 rispetto al TNF-α; f = p < 0,01 rispetto a LPS + ipossia; g = p < 0,0001 rispetto a LPS; e (B) livelli di E-caderina (verde) confrontati tra i trattamenti; a = p < 0,0001 rispetto al controllo; b = p < 0,0001 rispetto all'ipossia; c = p < 0,01 rispetto a LPS; d = p < 0,01 rispetto al TNF-α; e = p < 0,05 rispetto a LPS + ipossia. La significatività è stata valutata utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con il test di Tukey per l'analisi post-hoc, presentato come errore medio ± standard della media (SEM) (n ≥ 7 / gruppo). Il controllo rappresenta la normoxia con PBS come controllo del veicolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Effetto del lipopolisaccaride (LPS), del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e dell'ipossia sulla vitalità delle cellule apicali. La vitalità degli enteroidi 3D apical-out trattati con LPS (200 μg/mL) o TNF-α (50 ng/mL) per 24 ore in condizioni (A) normossiche o (B) ipossiche è stata misurata tramite luminescenza. La significatività statistica è stata calcolata utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con il test di Tukey per l'analisi post-hoc. Gli enteroidi trattati con LPS (200 μg/mL) e TNF-α (50 ng/mL), in combinazione con ipossia, erano significativamente meno vitali rispetto alla sola ipossia, osservata qui con un aumento della luminescenza. LPS (200 μg/mL) o TNF-α (50 ng/mL), in condizioni normossiche, non differivano dal controllo. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM), n = 8/gruppo, ****p < 0,0001. Il controllo rappresenta la normoxia con PBS come controllo del veicolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Morfologia degli enteroidi tridimensionali. (A) Mentre gli enteroidi basolaterali-out sono dominati dalla comparsa di un lume centrale grande e aperto, con o senza gemmazione, (B) gli enteroidi apicali-out sono caratterizzati da un aspetto cellulare denso. Barra di scala = 100 μm per ogni immagine. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il recente sviluppo di modelli enteroidi derivati da cripte epiteliali intestinali consente un tessuto in vitro più fisiologicamente rilevante in cui studiare la patogenesi dell'enterocolite necrotizzante. Nonostante includano tutti i principali tipi di cellule differenziate dell'epitelio intestinale, gli enteroidi 3D sono ancora soggetti a diverse limitazioni significative. Gli enteroidi convenzionali basolaterali-out sono sospesi in cupole di idrogel ECM 3D, la cui composizione e densità possono limitare la normale diffusione all'interno dell'ambiente di coltura tissutale39. È importante sottolineare che questi enteroidi forniscono un accesso limitato alla superficie apicale delle cellule, che è la superficie che, in vivo, interagirebbe con batteri e antigeni luminali, come il legame TLR4 degli enterociti di LPS.

Mentre la fisiopatologia della NEC rimane poco chiara, si ritiene che l'aumento dell'espressione e dell'attivazione del TLR4 apicale nell'epitelio intestinale pretermine svolga un ruolo di primo piano40. A valle dell'attivazione di TLR4, l'aumento della permeabilità intestinale, la ridotta riparazione epiteliale e la traslocazione batterica provocano una barriera intestinale disfunzionale, che porta alla necrosi dell'intestino2. Si ritiene che questo ciclo infiammatorio nell'intestino distale dei neonati prematuri abbia origine nel lume intestinale, iniziando dalla superficie apicale degli enterociti. Pertanto, i modelli che utilizzano enteroidi 3D basolateral-out in studi meccanicistici che coinvolgono la traslocazione batterica dell'epitelio intestinale non ricapitolano la patogenesi in vivo come è attualmente inteso e probabilmente produrranno informazioni non ottimali.

Qui, descriviamo la creazione di un modello apical-out NEC-in-a-dish, che consente un facile accesso alla superficie apicale delle cellule enteroidi e, presumibilmente, risultando in un modello fisiologicamente più rilevante rispetto ai tradizionali enteroidi basolaterali 3D. L'inversione di polarità in questi enteroidi consente alle potenziali terapie somministrate per via orale di essere semplicemente aggiunte ai mezzi e assorbite naturalmente dagli enterociti, come avverrebbe in vivo. Questo approccio non richiede tecniche costose e tecnicamente impegnative, come la microiniezione, ed è più rispettoso delle risorse rispetto alla creazione di monostrati 2D o modelli gut-on-a-chip.

I nostri risultati rappresentativi indicano che enteroidi apical-out sottoposti a LPS o TNF-α, in combinazione con ipossia, subiscono una ridotta vitalità, un'architettura epiteliale interrotta e una riduzione dell'espressione della proteina di giunzione aderente rispetto al controllo o rispetto all'ipossia o al trattamento con mediatore infiammatorio da solo, imitando le caratteristiche note del NEC in vivo. L'interruzione delle giunzioni aderenti, critica per la funzione della barriera epiteliale intestinale41, è stata riportata in NEC42,43. Probabilmente si è verificata anche una rottura architettonica a giunzione stretta, che è importante anche nel NEC44, anche se questi cambiamenti saranno valutati in studi futuri. In un tessuto fisiologicamente traducibile, questo modello dual-hit consente lo studio delle risposte intestinali pretermine a fattori inerenti alla NEC, fornendo al contempo una piattaforma attraverso la quale è possibile identificare potenziali nuovi bersagli terapeutici. Studi futuri possono estendere l'applicazione di enteroidi apical-out oltre NEC a studi focalizzati su infezioni parassitarie, batteriche o virali31,32, interazioni ospite-microbioma 45 e funzione di assorbimento gastrointestinale 46, ma nel contesto fisiologico del neonato pretermine.

Questo protocollo per il NEC-in-a-dish in apical-out include diversi passaggi critici che meritano di essere enfatizzati. La composizione e la freschezza dei terreni di coltura cellulare sono importanti per evitare un'eccessiva variabilità longitudinale negli esperimenti e garantire che gli enteroidi siano sani prima del trattamento sperimentale. Allo stesso modo, le soluzioni madre di TNF-α e LPS devono essere aliquotate e conservate a -80 °C per evitare cicli eccessivi di congelamento/disgelo e preservare un'attività ottimale. Infine, occorre prestare attenzione per garantire che tutta la ECM sia solubilizzata durante l'incubazione EDTA/PBS. La rimozione incompleta della ECM potrebbe causare enteroidi che non riescono a invertire la polarità. Se necessario, il periodo di incubazione può essere esteso a 1,5 ore per garantire la completa rimozione della matrice.

Mentre questo modello apical-out NEC-in-a-dish è economico e semplice, il metodo è soggetto a diverse limitazioni. Apical-out NEC-in-a-dish non è fisiologicamente rilevante come i modelli gut-on-a-chip28,29, ma rappresenta un'opzione intermedia dove e quando le opzioni chip non sono accessibili. Inoltre, come coltura in sospensione, gli enteroidi devono essere raccolti, pellettati e risospesi per i cambi di supporto, aggiungendo una fase di centrifugazione a un processo altrimenti semplice. Un'altra limitazione è la longevità degli enteroidi apicali-out, in quanto sono generalmente considerati adatti solo per analisi end-point. Poiché i recettori dei fattori di crescita basolaterali non sono più in costante contatto con i fattori di crescita dei media, gli enteroidi apical-out sono caratterizzati da una ridotta proliferazione rispetto agli enteroidi basolaterali-out, con conseguente relativa incapacità di far passare colture apical-out31,32. Inoltre, non è noto se la composizione esatta, comprese le proporzioni relative, dei tipi di cellule sia rappresentata negli enteroidi rispetto al tessuto in vivo, ma gli studi generalmente suggeriscono differenze minori31,32. Infine, lo sviluppo 24 ore su 24 di questo modello NEC-in-a-dish apical-out, sebbene conveniente, può essere relativamente breve rispetto ai modelli NEC basati su formule in vivo 47, richiedendo potenzialmente un'ulteriore standardizzazione se si desiderano periodi di intervento più lunghi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare e non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. HC è supportato dalla sovvenzione P20GM134973 del National Institutes of Health. KB è supportato da una sovvenzione della Children's Hospital Foundation (CHF) e della Presbyterian Health Foundation (PHF). Ringraziamo il Laboratorio per la ricerca di biologia molecolare e citometria dell'OUHSC per l'uso della Core Facility, che ha fornito l'imaging confocale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

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Medicina Numero 184
<em>In vitro </em> Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante
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Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

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