Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In vitro Apical-out Enteroid modell av nekrotiserande enterokolit

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

Detta protokoll beskriver en apikal-ut nekrotiserande enterokolit (NEC) -i-en-skålmodell som använder små intestinala enteroider med omvänd polaritet, vilket möjliggör åtkomst till den apikala ytan. Vi tillhandahåller ett immunofluorescerande färgningsprotokoll för att detektera NEC-relaterade epitelstörningar och en metod för att bestämma livskraften hos apikala enteroider som utsätts för NEC-in-a-dish-protokollet.

Abstract

Nekrotiserande enterokolit (NEC) är en förödande sjukdom som drabbar för tidigt födda barn, kännetecknad av tarminflammation och nekros. Enteroider har nyligen framträtt som ett lovande system för att modellera gastrointestinala patologier. Men för närvarande används metoder för enteroid manipulation antingen saknar tillgång till epitelets apikala yta (tredimensionell [3D]) eller är tidskrävande och resurskrävande (tvådimensionella [2D] monolager). Dessa metoder kräver ofta ytterligare steg, såsom mikroinjektion, för att modellen ska bli fysiologiskt översättbar. Här beskriver vi ett fysiologiskt relevant och billigt protokoll för att studera NEC in vitro genom att vända enteroidpolaritet, vilket resulterar i att den apikala ytan vetter utåt (apikal-ut). Ett immunofluorescerande färgningsprotokoll för att undersöka enteroidbarriärens integritet och korsande proteinuttryck efter exponering för tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α) eller lipopolysackarid (LPS) under normoxiska eller hypoxiska förhållanden tillhandahålls också. Viabiliteten hos 3D-apikala enteroider som utsätts för normoxiska eller hypoxiska LPS eller TNF-α i 24 timmar utvärderas också. Enteroider som utsattes för antingen LPS eller TNF-α, i kombination med hypoxi, uppvisade störningar i epitelarkitekturen, en förlust av adherens korsningsproteinuttryck och en minskning av cellviabiliteten. Detta protokoll beskriver en ny apikal-ut NEC-in-a-dish-modell som presenterar en fysiologiskt relevant och kostnadseffektiv plattform för att identifiera potentiella epitelmål för NEC-terapier och studera det prematura tarmsvaret på terapier.

Introduction

Nekrotiserande enterokolit (NEC), en allvarlig inflammatorisk sjukdom i tunntarmen som förekommer hos upp till 10% av för tidigt födda barn, är vanligtvis förknippad med hög sjuklighet och dödlighet 1,2. Dödligheten närmar sig 50% hos spädbarn med mycket låg födelsevikt (<1500 g), som kräver kirurgisk ingrepp, är inte ovanliga3. Medan den exakta etiologin för NEC för närvarande inte är förstådd, tros riskfaktorer, såsom formelmatning, förvärras med fysiologiska anomalier, såsom dysbios, ett omoget tarmepitel och en dysfunktionell tarmbarriär, i utvecklingen av sjukdomen 2,4. Trots betydande ansträngningar har få framsteg gjorts när det gäller förebyggande eller behandling av NEC under det senaste årtiondet5. En ny in vitro-metod för att studera NEC och tillhörande tarmepitelbarriärdysfunktion krävs för att öka förståelsen för sjukdomspatogenesen, eftersom resultat från djurmodeller hittills har översatts dåligt till sängkanten6.

Ett antal in vitro-modeller har använts för att undersöka mekanismerna som spelar in under NEC. Den humana tarmepitelcelllinjen, Caco-2, är bland de vanligaste in vitro-modellerna av NEC 7,8. Caco-2-celler emulerar borstgränsmorfologiska egenskaper hos tunntarmen, men som en cellinje skiljer de sig inte åt i det stora utbudet av in vivo-celltyper, inklusive slemproducerande bägareceller, som krävs för en mycket översättbar modell. HT-29-MTX, humana kolon adenokarcinomceller, inkluderar en blandad enterocyt- och bägare cellfenotyp, men saknar fortfarande kryptbaserade celltyper av tarmepitelet9. IEC-6 och IEC-18 är icke-transformerade cellinjer med en omogen ileal kryptliknande morfologi men härrör inte från mänsklig vävnad, vilket begränsar deras translationella kapacitet. FHs 74-Int och H4 tarmcellinjer härrör från mänsklig fostervävnad och bildar inte täta korsningar eller polariserade monolager10,11, och är därmed omogna jämfört med även de mest för tidigt födda barn som är mottagliga för NEC. Vanligtvis använder NEC in vitro-modeller lipopolysackarid (LPS) behandlingar för att inducera tollliknande receptor 4 (TLR4), en viktig receptor som initierar tarminflammation i NEC12. Skador medierade genom behandling av reaktiva syrearter (ROS), vanligtvis via väteperoxid, används ofta för att inducera NEC-liknande oxidativ skada och apoptos13,14. Som den främsta drivkraften för tarminflammation används tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α), en nedströms komponent i den inflammatoriska TLR4-signaleringen, också vanligtvis i dessa in vitro-modeller för att efterlikna in vivo-patogenes 15.

Organoider, genererade från inducerbara pluripotenta stamceller (iPSC), har vuxit i popularitet som en in vitro-modell av tarmen på grund av deras förmåga att rekapitulera den komplexa in vivo-arkitekturen och celltypskompositionen hos vävnaden från vilken de härrör16,17. Ett besläktat in vitro-system, enteroider, är organoider härledda från resekterade tarmkrypter som lättare kan etableras och underhållas än iPSC-härledda organoider. Enteroider odlas vanligtvis i en tredimensionell (3D) extracellulär matris (ECM) med experimentell åtkomst begränsad till den basolaterala cellytan. Metoder, såsom mikroinjektion18,19, har utvecklats för att övervinna denna barriär mot den apikala ytan, men uppbyggnaden av sloughed cellulärt skräp och slem i lumen gör mikroinjektion både tekniskt svårt och inkonsekvent. Eftersom anpassade robotmikroinjektionsplattformar inte är allmänt tillgängliga20, blir lab-to-lab-variabilitet i teknisk förmåga och allmän teknik betydande variabler att övervinna med mikroinjektionsprotokoll. Tvådimensionella (2D) monolager härledda från dissocierade 3D-enteroider, som fortfarande består av alla större celltyper i tarmepitelet, möjliggör åtkomst till den apikala ytan men har traditionellt varit svåra att upprätthålla utan ett matarskikt av mesenkymala myofibroblaster21. Medan cellodlingspermeabla stöd kan användas för att komma åt både apikala och basolaterala sidor av enteroidmonolager utan användning av underliggande myofibroblaster, kräver dessa insatser excision och montering av membranet före användning med modaliteter som konfokalmikroskopi, vilket resulterar i en mer tekniskt krävande och svår process vid användning av traditionella mikroskopimetoder22. NEC har modellerats in vitro med traditionella 3D-enteroider 23,24,25 och permeabla stöder 26,27, och tarminflammation har nyligen replikerats med gut-on-a-chip-modeller 28,29. Medan gut-on-a-chip-modeller som innehåller mikrofluidik är de överlägset mest avancerade och översättningsbara modellerna, är denna teknik dyr, komplex och otillgänglig för de flesta utredare30.

De senaste framstegen inom apikal-out enteroidtekniker har möjliggjort enklare åtkomst till den apikala ytan av 3D-enteroider utan att riskera att skada den strukturella integriteten hos in vitro-epitelet31,32,33. Apikala enteroider delar celltypskompositionen och barriärfunktionen hos in vivo tarmepitel, men till skillnad från typiska 3D-enteroider vetter de apikala ytorna på dessa celler mot odlingsmediet, vilket möjliggör mer fysiologiskt relevanta studier om näringsabsorption, mikrobiell infektion och luminalsekretion31. En ytterligare fördel med apikala enteroider är förmågan att homogent distribuera experimentella medel till enteroider. Varierande behandlingsvolymer baserat på enteroidstorlek krävs inte, som det är med mikroinjektion, och förmågan att upprätthålla dessa enteroider i suspensionskultur förnekar all ECM-interferens vid experimentell agentdiffusion32.

Nekrotiserande enterokolit är en multifaktoriell sjukdom som involverar flera tarmepitelcelltyper och en mängd olika miljö- och patofysiologiska faktorer34. Den varierade cellsammansättningen av intestinala enteroider är en klar förbättring jämfört med monokulturer vid modellering av en komplex sjukdom som NEC. Intressant nog, medan en enda inflammatorisk exponering ofta är tillräcklig för att inducera skador i in vitro-monokulturer, verkar enteroider, som med musmodeller23, kräva minst två inflammatoriska komponenter för att inducera NEC-liknande skada6. Här presenterar vi en apikal-ut NEC-in-a-dish-modell, med apikala enteroider i kombination med hypoxi (en viktig klinisk egenskap hos NEC6) och antingen LPS eller TNF-α, som en förbättrad och mer fysiologiskt relevant in vitro-modell för att studera epitelsvar på NEC-liknande inflammation och potentiellt identifiera terapeutiska mål. Vi beskriver ett protokoll för att vända polariteten hos tunntarmens 3D-enteroider, samt ett immunofluorescerande färgningsprotokoll för att identifiera epitelbarriärstörningar och korsande proteinuttrycksförändringar. Slutligen demonstrerar vi ytterligare en enkel enteroid viabilitetsanalys för att bestämma effekten av vår dual-hit, apikal-out NEC-in-a-dish-modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök i denna studie godkändes av University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Tunntarmsprover från en prematur icke-mänsklig primat (NHP, 90% dräktighet, olivbabian, Papio anubis) erhölls efter eutanasi för en separat studie (protokoll #101523-16-039-I).

1. Upprättande av apikal-out enteroid NEC-in-a-dish-modell

  1. Beredning av media och enteroidbehandlingar
    OBS: När de har beretts enligt standard aseptisk teknik kan mediet förvaras vid 4 ° C i upp till 1 vecka.
    1. Förbered antibiotikafria medier (AFM) genom att blanda 50 ml humant organoid tillväxtmedium med 50 ml organoidtillskott (se materialtabell). Bered 5 mM etylendiamintetraättiksyra/1x fosfatbuffrad saltlösning (EDTA/PBS) genom att tillsätta 100 μl 0,5 M EDTA till 9 900 μl PBS.
    2. Kyl Dulbeccos modifierade örnmedium/näringsämne Skinkas blandning F12 + 15 mM HEPES-buffert (DMEM/F12) vid 2-8 °C.
    3. Förbered TNF-α stamlösning genom att suspendera 100 μg TNF-α pulver i 1 ml 1x PBS. Späd TNF-α stam ytterligare till 20 ng/ml och 50 ng/ml koncentrationer med AFM som lösningsmedel. Förbered LPS-stamlösning genom att suspendera 2 mg LPS i 1 ml 1x PBS. Ytterligare spädd stam-LPS till 100 μg/ml och 200 μg/ml med AFM som lösningsmedel.
  2. Vända polariteten hos 3D-enteroider
    OBS: Följande procedur är avsedd för återföring av en enda 24-brunns platt bottenvävnadsodlingsplatta till två 24-brunnars ultralåga fästvävnadsodlingsplattor. Vävnadsodlingsplattorna ska värmas till 37 °C i minst 30 minuter före användning. Härledningen av basolateral-out 3D-enteroider uppnåddes som beskrivits tidigare av många grupper35,36, med små modifieringar för media (beskrivs ovan). Det allmänna enteroidavledningsförfarandet skiljer sig inte från det hos människor. I korthet tvättas utskuren vävnad, skärs i små fragment och inkuberas i cellstörningsbuffert. Celllösningen körs sedan genom en 70 μM cellsil, vilket resulterar i krypter som är pläterade med hög densitet.
    1. Aspirera media från varje brunn i en 24-brunnsplatta med etablerade 3D-basolaterala enteroider.
    2. Tillsätt 500 μL 5 mM iskall EDTA/PBS till varje brunn på 24-brunnsplattan och stör försiktigt knoppmembranets extrakt/ECM-kupol genom att pipettera upp och ner med en p200-pipett minst 5x-6x.
    3. Överför innehållet i fyra brunnar till ett 15 ml koniskt rör och tillsätt 8 ml iskall EDTA / PBS till det koniska röret. Överför de återstående 20 brunnarna på samma sätt.
    4. Inkubera 15 ml koniska rör vid 4 °C i 1 timme på en roterande plattform eller skakapparat vid 330 rpm. Efter inkubationen på 1 timme centrifugerar du de koniska rören vid 300 x g i 3 minuter vid 4 °C. Ta bort och kassera supernatanten från varje rör.
    5. Kombinera och tvätta cellpelletsen med 5 ml DMEM/F12 och fördela cellsuspensionen i två 15 ml koniska rör.
    6. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 3 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och tillsätt 12 ml AFM till varje rör, så att cellpelletsen återupplivas.
    7. Pipettera 500 μL av enteroidsuspensionen i varje brunn av två 24-brunns ultralåga fästplattor.
    8. Inkubera plattorna vid 37 °C och 5%CO2 i 2-5 dagar eller tills enteroider har omvänd polaritet.
    9. För att kontrollera enteroidomvandling, upprätta först den bekräftande immunofluorescerande färgningen och den genomsnittliga tiden till reversering (~ 3 dagar) och bekräfta sedan polaritetsomvandlingen med hjälp av en grundläggande ljusmikroskopvisualisering. Apikala enteroider är mycket cellulära till utseendet, medan basolaterala enteroider ofta domineras av närvaron av en stor central lumen eller spirande (se kompletterande figur 1).
      OBS: När proceduren har standardiserats överstiger konverteringsfrekvensen till apical-out vanligtvis 95%. Användningen av apikala enteroider är avsedd som ett terminalt experiment, även om det är teoretiskt möjligt att passera apikala enteroider i ett litet antal basolaterala enteroider.
  3. Apikal-ut NEC-i-en-maträtt
    OBS: När enteroiderna har vänt polariteten, använd kulturerna i efterföljande experiment snabbt, eftersom deras livslängd i apikal-out-konformation inte har bekräftats efter 3-4 dagar. För följande NEC-in-a-dish-modell behandlades enteroiderna i 24 timmar, samlades sedan omedelbart efteråt och bevarades för nedströmsexperiment.
    1. När enteroiderna visuellt har vänt polariteten med minst 95% effektivitet, ta bort plattorna från inkubatorn och samla åtta brunnar av en 24-brunnsplatta i ett 15 ml koniskt rör. Eftersom de apikala enteroiderna är i suspension, pipettera helt enkelt enteroid / media-lösningen. Centrifugera 15 ml röret vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
    2. När cellerna har pelleterats, ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 4 ml AFM blandad med önskad volym (10 μL här för att matcha den högsta tillsatta behandlingsvolymen) på 1x PBS (kontroll).
    3. Pipettera 500 μL enteroid/PBS/AFM-suspension i åtta brunnar med en ultralåg fästplatta med 24 brunnar och inkubera plattan vid 37 °C och 5 %CO2 i 24 timmar.
    4. Upprepa steg 1.3.1–1.3.3. för TNF-α (20 ng/ml och 50 ng/ml) och LPS (100 μg/ml och 200 μg/ml) behandlingar vid normoxi. För alla hypoxibehandlingar, upprepa steg 1.3.1-1.3.3., men placera plattan i en separat inkubator vid 37 °C, 5% CO2 och 1%O2 i 24 timmar.
      OBS: Steg 1.3.4. kan göras samtidigt med steg 1.3.1.-1.3.3, men för tydlighetens skull separerades proceduren ovan genom behandling för att minska komplexiteten.

2. Immunofluorescerande färgning och konfokalmikroskopi

  1. Beredning av färgningslösningar
    1. Förbered 0,1% Triton X-100 genom att blanda 7 μL Triton X-100 i 1x PBS till en slutlig volym på 7 ml. Förbered PBST (PBS-Tween) genom att tillsätta 30 μL Tween-20 till 1x PBS till en slutlig volym på 30 ml.
    2. Bered 10% normalt åsneserum (NDS)/PBST genom att tillsätta 700 μL NDS till 6,3 ml PBST. Förbered 1% NDS / PBST genom att tillsätta 70 μL NDS till PBST till en slutlig volym på 7 ml.
      OBS: Åsneserum användes här för att korrelera med den sekundära antikroppsvärden. De blockerande serumarterna bör dock matcha de sekundära antikroppsarterna för att korrekt blockera icke-specifik bindning.
  2. Färgning (dag 1)
    1. Överför innehållet i fyra brunnar i en 24-brunnsplatta till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa för alla önskade brunnar/behandlingar, med varje behandling i ett separat rör. Centrifugera rören vid 300 x g i 4 minuter vid 4 °C. När enteroiderna har pelleterats, ta bort supernatanten.
    2. Återsuspendera cellpelletsen i 300 μl 4% formaldehydfixeringsmedel i 30 minuter vid rumstemperatur (RT). Efter 30 min, centrifugera rören vid 300 x g i 4 min vid 4 °C, ta bort supernatanten och tvätta pelleten med 500 μL steril, RT 1x PBS.
    3. Centrifugera rören vid 300 x g i 4 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och tillsätt 500 μL 0,1% Triton X-100 och låt sitta i 1 h vid RT.
    4. Centrifugera rören vid 300 x g i 4 minuter vid 4 °C efter 1 timme och avlägsna supernatanten. Tvätta med 500 μl 1x PBS och placera rören på en rotator eller shaker vid 200 rpm i 15 min vid 2-8 °C. Upprepa detta totalt 4x.
    5. Centrifugera rören vid 300 x g i 4 minuter vid 4 °C och avlägsna supernatanten. Tillsätt 500 μl 10 % NDS/PBST och inkubera vid RT i 45 minuter. Under inkubationen, förbered primära antikroppslösningar genom att kombinera 20 μL rekombinant anti-villinantikropp, 10 μL E-kadherinantikropp och 1970 μL 1% NDS / PBST för åtta brunnar med en 24-brunnsplatta.
    6. Efter inkubationen på 45 minuter centrifugerar du rören vid 300 x g i 4 minuter vid 4 °C. Placera rören på is. Ta bort supernatanten och ersätt med 250 μl primär antikroppslösning. Inkubera rören över natten vid 2–8 °C.
  3. Färgning (dag 2)
    1. Centrifugera rören vid 300 x g i 4 minuter vid 4 °C och avlägsna supernatanten. Tillsätt 250–500 μl PBST till varje rör, beroende på pelletens storlek, och placera på rotatorn eller skakapparaten vid 200 rpm i 1 timme vid 2–8 °C. Upprepa PBST-tvätten 4x.
    2. Förbered sekundär antikroppslösning genom att tillsätta 52 μL Cy3-åsna anti-kanin IgG (H + L) till 50% glycerol och 5,2 μL åsna anti-mus fluorescerande grön 488 sekundära antikroppar till 5142,8 μL av 1% NDS / PBST.
    3. Efter den sista PBST-tvätten och centrifugeringen, ta bort supernatanten från rören. Fördela 200 μl sekundär antikroppslösning på varje rör och inkubera i mörker över natten vid 2–8 °C.
  4. Montering av färgade apikala enteroider (dag 1)
    1. Ta med glycerolbaserat fästelement som innehåller blåkärnfärgämne till RT över 1 timme.
    2. Centrifugera rören vid 300 x g i 4 minuter vid 4 °C. Ta bort 100 μL av supernatanten och återsuspendera cellerna i de återstående ~ 100 μL supernatanten. Överför cellsuspensionen till 0,5 ml rör.
    3. Centrifugera rören i en minicentrifug i 20 s för att pelletera cellerna. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelletsen i 100 μl långröd nukleinsyrafläck. Inkubera rören vid RT i 10 minuter.
    4. Centrifugera rören i en minicentrifug i 20 s för att pelletera cellerna. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelletsen i 100 μL 1x PBS. Upprepa för en andra tvätt.
    5. Centrifugera rören i en minicentrifug i 20 s för att pelletera cellerna och ta bort 70 μL av supernatanten. Återsuspendera cellerna i den återstående volymen PBS och överför innehållet till en märkt täckskiva (24 mm x 60 mm).
    6. Applicera 75 μL monteringsmedel direkt på provet och ta bort eventuella bubblor med en pipettspets. Låt täckglasen härda över natten (18-24 h) vid RT i mörker.
  5. Montering av färgade apikala enteroider (dag 2)
    1. Efter härdning över natten, applicera ett tunt lager (~ 15 μL) glycerol på täckglasen. Montera täckglaset på glasskivan och tryck försiktigt på plats. Tryck för att ta bort eventuella bubblor mellan täckglaset och bilden.
    2. Låt täckglaset ställas in på RT i mörkret i minst 2 timmar innan du avbildar med 20x förstoring med ett konfokalmikroskop. För mikroskopisk visualisering av enteroider med hjälp av olika konfokala förvärvsmetoder, se Lallemant et al.37.
  6. Immunofluorescerande kvantifiering
    OBS: Denna metod bestämmer den korrigerade totala fluorescensen genom att ta bort bakgrundssignalen med ImageJ-programvaran (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Öppna konfokalbilderna i ImageJ och skissera önskat område med roi-verktyget (region of interest).
    2. Ange användardefinierade parametrar genom att gå till Analysera > Ange mått. Välj Område > Integrerad densitet > Medelgrått värde under fliken Inställningar.
    3. Navigera till Analysera > mått. Ett popup-fönster visas som innehåller mätningarna. Kopiera och klistra in dessa mått i ett kalkylblad.
    4. Om du vill subtrahera bakgrundssignalen väljer du ett litet icke-fluorescerande område i bilden. Gå till Analysera > mått för den regionen. Ett popup-fönster visas som innehåller mätningarna. Kopiera och klistra in utdata i ett kalkylblad.
    5. Multiplicera arean för den valda cellen med den genomsnittliga fluorescensen för bakgrundsavläsningar och subtrahera summan från den integrerade densiteten för att beräkna den korrigerade totala cellfluorescensen (CTCF). Upprepa stegen ovan för alla bilder av intresse, samtidigt som du behåller poster i ett kalkylblad eller statistiskt programvarupaket (se Materialförteckning).

3. Apical-out NEC-in-a-dish cellviabilitet

  1. Enteroid behandlingar
    1. Upprätta apikal-ut NEC-in-a-dish-modell i 24 timmar, som i steg 1.
    2. Analysreagens för tinande cellviabilitet över natten vid 4 °C. På analysdagen, ta reagenset till RT 30 min före användning. Invertera reagenset för att blanda.
    3. Innan du utför analysen, ta bort 100 μL media från varje brunn och lämna de återstående 400 μl. Tillsätt 400 μL cellviabilitetsanalysreagens till varje brunn.
    4. Blanda innehållet kraftigt på en tallriksskakare vid RT i 5 minuter vid 200 rpm för att inducera celllys. Efter skakning, inkubera plattan vid RT i ytterligare 25 minuter.
    5. Efter 25 minuters inkubation, blanda innehållet i en brunn via pipettering och överför 200 μl av 800 μl till en enda brunn av en 96-brunn, ogenomskinlig, polystyren, klarbottnad platta. Upprepa för de återstående 600 μl, vilket skapar fyra tekniska replikat per brunn. Överför det återstående innehållet i varje brunn på 24-brunnsplattan till en 96-brunnsplatta på detta sätt.
    6. Använd en plattläsare som kan luminiscens, registrera värden vid 0,25 ms integration och jämför de relativa värdena mellan behandlingar. Alternativt kan du jämföra behandlingsluminescens med en adenosintrifosfat (ATP) -standard.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Användningen av enteroider för att modellera tarminflammation, även inom ramen för nekrotiserande enterokolit, är nu vanligt. De flesta metoder som för närvarande används saknar emellertid antingen tillgång till den apikala ytan av enteroider, vilket förnekar den fysiologiska relevansen av föreningar avsedda för eventuell användning som orala terapier, eller är tekniskt svåra och tidskrävande, som med enteroid-härledda monolager. För att öka användbarheten av nuvarande in vitro-enteroidmodeller av NEC vände vi polariteten hos enteroider och genererade i kombination med 24 h hypoxi och LPS eller TNF-α en apikal-ut NEC-in-a-dish-modell. Immunofluorescerande färgning bekräftade apikal lokalisering av kärnor (blå) mot lumen och detektion av villin32 (röd, apikal markör) vid epitelets ytterkant (figur 1A). Exponering för 200 μg / ml LPS, 50 ng / ml TNF-α eller hypoxi ensam inducerade inte öppna förändringar i bruttocellmorfologi, E-kadherin38 (grön) eller villinlokalisering eller fluorescerande intensitet jämfört med kontroll (Figur 1A-D; Figur 2). Behandling med LPS eller TNF-α, i kombination med hypoxi, störde epitelarkitekturen och orsakade en signifikant förlust av vidhäftande korsning och borstgränsproteinuttryck, indikerat av förlusten av E-kadherin och villinfärgning (Figur 1E-F; Figur 2). Dessa minskningar av enterocytborstgränsen och vidhäftande korsningsproteinuttryck indikerar sannolikt en minskning av epitelbarriärens integritet och är ett vanligt inslag i både humankirurgisk NEC och in vitro-modellering av sjukdomen23.

För att bestämma effekten av NEC-in-a-dish-komponenter på livskraften hos 3D-apikal-out-enteroider utvärderades cellviabiliteten med hjälp av en cellviabilitetsanalys utformad för 3D-kulturer, centrerad på ATP-kvantifiering efter celllys. Enteroider behandlades med LPS (200 μg/ml) eller TNF-α (50 ng/ml) i 24 timmar under normoxiska eller hypoxiska förhållanden. LPS eller TNF-α ensam påverkade inte signifikant cellviabiliteten jämfört med kontroll (figur 3A). Signifikanta minskningar av viabiliteten inträffade dock när apikala enteroider behandlades med 200 μg/ml LPS eller 50 ng/ml TNF-α i kombination med hypoxi (****p < 0,0001) jämfört med enbart hypoxi (figur 3B). Dessa experiment visar mångsidigheten och den fysiologiska relevansen av att använda apikala enteroider i en kostnadseffektiv och enkel NEC-in-a-dish-modell.

Figure 1
Figur 1: Bekräftelse av apikal-out fenotyp och morfologiska effekter av lipopolysackarid (LPS), tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) och hypoxi. Representativ immunohistokemisk färgning av 3D-apikala enteroider för enterocytborstgräns och vidhäftande korsningsproteiner efter 24 timmar. (A) Kontroll, (B) hypoxi, (C) LPS (200 μg / ml), (D) TNF-α (50 ng / ml), (E) LPS (200 μg / ml) + hypoxi, (F) TNF-α (50 ng / ml) + hypoxi. Skalstreck = 50 μm för varje bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kvantifiering av färgningsintensitet för borstkant och vidhäftande korsningsproteiner efter 24 h lipopolysackarid (LPS), tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) och hypoxibehandlingar. (A) Villin (röd) nivåer jämfört mellan behandlingar; a = p < 0,0001 jämfört med kontroll; b = p < 0,05 jämfört med kontroll; c = p < 0,0001 jämfört med hypoxi; d = p < 0,05 jämfört med hypoxi; e = p < 0,001 jämfört med TNF-α; f = p < 0,01 jämfört med LPS + hypoxi; g = p < 0,0001 jämfört med LPS; och (B) E-kadherin (gröna) nivåer jämfört mellan behandlingar; a = p < 0,0001 jämfört med kontroll; b = p < 0,0001 jämfört med hypoxi; c = p < 0,01 jämfört med LPS; d = p < 0,01 jämfört med TNF-α; e = p < 0,05 jämfört med LPS + hypoxi. Signifikansen bedömdes med hjälp av envägsanalys av varians (ANOVA) med Tukeys test för post-hoc-analys, presenterat som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM) (n ≥ 7/grupp). Kontroll representerar normoxia med PBS som fordonskontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Effekt av lipopolysackarid (LPS), tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) och hypoxi på apikal-out cellviabilitet. Viviabiliteten hos 3D-apikala enteroider behandlade med LPS (200 μg/ml) eller TNF-α (50 ng/ml) under 24 timmar under (A) normoxiska eller (B) hypoxiska förhållanden mättes via luminescens. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av envägsanalys av varians (ANOVA) med Tukeys test för post-hoc-analys. Enteroider behandlade med LPS (200 μg/ml) och TNF-α (50 ng/ml), i kombination med hypoxi, var signifikant mindre livskraftiga jämfört med enbart hypoxi, sett här med en ökning av luminescensen. LPS (200 μg/ml) eller TNF-α (50 ng/ml), under normoxiska förhållanden, skilde sig inte från kontrollen. Data presenteras som medelvärde ± medelfel för medelvärdet (SEM), n = 8/grupp, ****p < 0,0001. Kontroll representerar normoxia med PBS som fordonskontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Morfologi av tredimensionella enteroider. (A) Medan basolaterala enteroider domineras av utseendet på en stor och öppen central lumen, med eller utan spirande, (B) kännetecknas apikala enteroider av ett tätt, cellulärt utseende. Skalstreck = 100 μm för varje bild. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den senaste utvecklingen av enteroidmodeller härledda från tarmepitelkrypter möjliggör en mer fysiologiskt relevant in vitro-vävnad för att studera nekrotiserande enterokolitpatogenes. Trots att alla större differentierade celltyper i tarmepitelet inkluderas är 3D-enteroider fortfarande föremål för flera betydande begränsningar. De konventionella, basolaterala enteroiderna suspenderas i 3D ECM-hydrogelkupoler, vars sammansättning och densitet kan begränsa normal diffusion inom vävnadsodlingsmiljön39. Viktigt är att dessa enteroider ger begränsad tillgång till cellernas apikala yta, vilket är den yta som in vivo skulle interagera med luminala bakterier och antigener, såsom enterocyt TLR4-bindning av LPS.

Medan patofysiologin för NEC fortfarande är oklar, tros ökat uttryck och aktivering av apikal TLR4 i det prematura tarmepitelet spela en framträdande roll40. Nedströms TLR4-aktivering, ökad tarmpermeabilitet, minskad epitelreparation och bakteriell translokation resulterar i en dysfunktionell tarmbarriär, vilket leder till nekros i tarmen2. Denna inflammatoriska cykel i distal tarm hos för tidigt födda barn tros ha sitt ursprung i tarmlumen, initieras vid den apikala ytan av enterocyter. Således rekapitulerar modeller som använder basolaterala 3D-enteroider i mekanistiska studier som involverar bakteriell translokation av tarmepitelet inte in vivo-patogenes som för närvarande förstås och kommer sannolikt att ge suboptimal information.

Här beskriver vi upprättandet av en apikal-ut NEC-in-a-dish-modell, vilket möjliggör enkel åtkomst till den apikala ytan av enteroidceller och förmodligen resulterar i en mer fysiologiskt relevant modell jämfört med konventionella 3D-basolateral-out enteroider. Polaritetsomvandlingen i dessa enteroider gör det möjligt för potentiella oralt administrerade terapier att helt enkelt läggas till media och tas upp naturligt av enterocyter, vilket skulle inträffa in vivo. Detta tillvägagångssätt kräver inte dyra och tekniskt utmanande tekniker, såsom mikroinjektion, och är mer resursvänligt än etableringen av 2D-monolager eller gut-on-a-chip-modeller.

Våra representativa resultat indikerar apikala enteroider som utsätts för LPS eller TNF-α, i kombination med hypoxi, lider av minskad livskraft, störd epitelarkitektur och en minskning av adherens junction proteinuttryck jämfört med kontroll, eller jämfört med hypoxi eller inflammatorisk mediatorbehandling ensam, vilket efterliknar de kända egenskaperna hos in vivo NEC. Störningar i adherenskorsningar, kritiska för tarmepitelbarriärfunktionen41, har rapporterats i NEC42,43. Täta korsningsarkitekturstörningar, vilket också är viktigt i NEC44, inträffade sannolikt också, även om dessa förändringar kommer att utvärderas i framtida studier. I en fysiologiskt översättbar vävnad möjliggör denna dual-hit-modell studier av prematura tarmsvar på faktorer som är inneboende i NEC, samtidigt som den ger en plattform genom vilken potentiellt nya terapeutiska mål kan identifieras. Framtida studier kan utvidga tillämpningen av apikala enteroider utöver NEC till studier fokuserade på parasitiska, bakteriella eller virusinfektioner31,32, värd-mikrobiominteraktioner 45 och gastrointestinal absorptiv funktion 46, men inom det fysiologiska sammanhanget för det för tidigt födda barnet.

Detta protokoll för apikal-ut NEC-in-a-dish innehåller flera kritiska steg som motiverar betoning. Cellodlingsmediernas sammansättning och färskhet är viktiga för att undvika överdriven longitudinell variation i experiment och säkerställa att enteroider är friska före experimentell behandling. På samma sätt bör stamlösningar av TNF-α och LPS alikvoteras och förvaras vid -80 °C för att undvika alltför stora frys-/upptiningscykler och bevara optimal aktivitet. Slutligen bör man se till att all ECM solubiliseras under EDTA/PBS-inkubationen. Ofullständigt avlägsnande av ECM kan leda till att enteroider inte lyckas vända polariteten. Vid behov kan inkubationsperioden förlängas till 1,5 h för att säkerställa fullständigt avlägsnande av matrisen.

Även om denna apikala NEC-in-a-dish-modell är kostnadseffektiv och enkel, är metoden föremål för flera begränsningar. Apikal-ut NEC-in-a-dish är inte lika fysiologiskt relevant som gut-on-a-chip-modellerna28,29 men representerar ett mellanliggande alternativ där och när chipalternativ inte är tillgängliga. Dessutom, som en suspensionskultur, måste enteroider samlas upp, pelleteras och återsuspenderas för medieförändringar, vilket ger ett centrifugeringssteg till en annars enkel process. En annan begränsning är livslängden hos apikala enteroider, eftersom de i allmänhet anses vara lämpliga endast för slutpunktsanalyser. Eftersom basolaterala tillväxtfaktorreceptorer inte längre är i konstant kontakt med mediatillväxtfaktorer, kännetecknas apikala enteroider av minskad proliferation jämfört med basolaterala enteroider, vilket resulterar i den relativa oförmågan att passera apikala kulturer31,32. Dessutom är det inte känt om den exakta sammansättningen, inklusive de relativa proportionerna, av celltyper representeras i enteroider jämfört med in vivo-vävnad, men studier tyder i allmänhet på mindre skillnader31,32. Slutligen kan 24-timmarsutvecklingen av denna apikala NEC-in-a-dish-modell, även om den är bekväm, vara relativt kort i jämförelse med in vivo-formelbaserade NEC-modeller47, vilket potentiellt kräver ytterligare standardisering om längre interventionsperioder önskas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja och har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. HC stöds av bidrag P20GM134973 från National Institutes of Health. KB stöds av ett bidrag från Children's Hospital Foundation (CHF) och Presbyterian Health Foundation (PHF). Vi tackar laboratoriet för molekylärbiologi och cytometriforskning vid OUHSC för användningen av Core Facility, som tillhandahöll konfokal avbildning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), Baltimore, Md. 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).

Tags

Medicin utgåva 184
<em>In vitro </em> Apical-out Enteroid modell av nekrotiserande enterokolit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter