Summary
이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 - 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.
Abstract
괴사 성 장염 (NEC)은 장내 염증과 괴사를 특징으로하는 조산아에 영향을 미치는 치명적인 질병입니다. 엔테로이드는 최근 위장 병리를 모델링하는 유망한 시스템으로 부상했습니다. 그러나 현재 사용되는 엔테로이드 조작 방법은 상피의 정점 표면 (3 차원 [3D])에 대한 액세스가 부족하거나 시간이 많이 걸리고 자원 집약적 인 (2 차원 [2D] 단층)입니다. 이러한 방법은 종종 모델이 생리적으로 번역 가능해지기 위해 미세 주입과 같은 추가 단계가 필요합니다. 여기에서, 우리는 장내 극성을 역전시켜 시험관 내에서 NEC를 연구하기위한 생리 학적으로 관련되고 저렴한 프로토콜을 설명하며, 그 결과 정점 표면이 바깥쪽으로 향하게됩니다 (apical-out). 노목스 또는 저산소 조건 하에서 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 노출된 후 장내 장벽 완전성 및 접합 단백질 발현을 검사하기 위한 면역형광 염색 프로토콜이 또한 제공된다. 24시간 동안 노목성 또는 저산소 LPS 또는 TNF-α에 노출된 3D apical-out enteroids의 생존력도 또한 평가된다. 저산소증과 함께 LPS 또는 TNF-α에 노출된 엔테로이드는 상피 구조의 파괴, 부착물 접합 단백질 발현의 손실 및 세포 생존력의 감소를 나타내었다. 이 프로토콜은 NEC 요법의 잠재적 상피 표적을 식별하고 치료제에 대한 조기 장 반응을 연구하는 생리학적으로 관련되고 비용 효율적인 플랫폼을 제시하는 새로운 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 설명합니다.
Introduction
조산아의 최대 10 %에서 발생하는 소장의 심각한 염증성 질환 인 괴사 성 장염 (NEC)은 일반적으로 높은 이환률 및 사망률 1,2과 관련이 있습니다. 외과 적 개입이 필요한 매우 낮은 출생 체중 (<1500g) 유아의 사망률이 50 %에 근접하는 것은 드문 일이 아닙니다3. NEC의 정확한 병인은 현재 이해되지 않았지만, 수식 먹이기와 같은 위험 요소는 질병2,4의 발달에서 dysbiosis, 미성숙 장 상피 및 기능 장애 장 장벽과 같은 생리 학적 이상을 가진 화합물로 생각됩니다. 상당한 노력에도 불구하고, NEC의 예방 또는 치료에 거의 진전이 없었다 지난 십 년동안 5. NEC 및 관련 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하기위한 새로운 시험관 내 방법은 동물 모델의 연구 결과가 지금까지 침대 옆으로 잘못 번역 된 것처럼 질병의 병인에 대한 이해를 증진시키는 데 필요합니다6.
다수의 시험관내 모델이 NEC 동안 작용 메카니즘을 조사하기 위해 이용되었다. 인간 장 상피 세포주인 Caco-2는 NEC 7,8의 시험관내 모델에서 가장 일반적으로 활용되는 모델 중 하나입니다. Caco-2 세포는 소장의 테두리 형태학적 특징을 에뮬레이트하지만, 세포주로서, 점액 생성 잔 세포를 포함하는 매우 다양한 생체내 세포 유형으로 분화되지 않으며, 고도로 번역가능한 모델에 요구된다. HT-29-MTX, 인간 결장 선암종 세포는, 혼합된 장내세포 및 잔 세포 표현형을 포함하지만, 여전히 장내 상피9의 크립트계 세포 유형이 결여되어 있다. IEC-6 및 IEC-18은 미성숙 장폐색-유사 형태를 갖는 형질전환되지 않은 세포주이지만, 인간 조직으로부터 유래되지 않으며, 이들의 번역 능력을 제한한다. FHs 74-Int 및 H4 장 세포주는 인간 태아 조직으로부터 유래되고 단단한 접합부 또는 편광 단층10,11을 형성하지 않으며, 따라서 NEC에 감수성인 가장 미숙아에 비해 미성숙하다. 전형적으로, 시험관내 NEC 모델은 NEC12에서 장 염증을 개시하는 주요 수용체인 톨 유사 수용체 4(TLR4)를 유도하기 위해 리포폴리사카라이드(LPS) 치료법을 이용한다. 반응성 산소 종(ROS) 처리를 통해 매개되는 손상은, 전형적으로 과산화수소를 통해, NEC와 같은 산화적 손상 및 아폽토시스(apoptosis)13,14를 유도하는데 종종 사용된다. 장 염증의 주요 동인으로서, 염증성 TLR4 신호전달의 하류 성분인 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 또한 생체내 병인(15)을 모방하기 위해 이들 시험관내 모델에서 일반적으로 활용된다.
유도성 만능 줄기 세포 (iPSCs)로부터 생성 된 오가노이드는 이들이 유래 된 조직의 복잡한 생체 내 구조 및 세포 유형 조성을 재구성 할 수있는 능력으로 인해 장의 시험관 내 모델로서 인기를 얻었습니다16,17. 관련 시험관내 시스템인 엔테로이드는 iPSC 유래 오가노이드보다 더 쉽게 확립되고 유지되는 절제된 장내 크립트로부터 유래된 오가노이드이다. 엔테로이드는 전형적으로 기저측성 세포 표면에 제한된 실험적 접근을 갖는 3차원(3D) 세포외 매트릭스(ECM)에서 성장한다. 미세 주입18,19와 같은 방법은 정점 표면에 대한 이러한 장벽을 극복하기 위해 개발되었지만 루멘 내에 슬로프 된 세포 파편과 점액이 축적되면 미세 주입이 기술적으로 어렵고 일관성이 없습니다. 맞춤형 로봇 미세 주입 플랫폼이 널리 접근 할 수 없기 때문에20, 기술 능력 및 일반 기술의 실험실 간 변동성은 미세 주입 프로토콜로 극복하기위한 중요한 변수가됩니다. 해리된 3D 엔테로이드로부터 유래된 2차원(2D) 단일층은, 여전히 장 상피의 모든 주요 세포 유형을 포함하며, 정점 표면에 대한 접근을 허용하지만, 전통적으로 중간엽 근섬유아세포(21)의 피더층 없이는 유지하기가 어려웠다. 세포 배양 투과성 지지체는 근본적인 근섬유아세포를 사용하지 않고 엔테로이드 단층의 정점 및 기저측 측면 모두에 접근하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 삽입물은 공초점 현미경과 같은 양식과 함께 사용하기 전에 막의 절제 및 장착이 필요하며, 이는 전통적인 현미경 검사법(22)을 사용할 때 기술적으로 더 까다롭고 어려운 과정을 초래한다. NEC는 전통적인 3D 엔테로이드 23,24,25 및 투과성 지지 체 26,27을 사용하여 시험관 내에서 모델링되었으며, 장 염증은 최근 장내 온 칩 모델28,29로 복제되었습니다. 미세유체학을 통합한 장-온-어-칩 모델은 지금까지 가장 진보되고 번역 가능한 모델이지만, 이 기술은 비싸고, 복잡하며, 대부분의 조사자(30)가 접근할 수 없다.
apical-out enteroid 기술의 최근 발전은 시험관내 상피31,32,33의 구조적 완전성에 대한 손상의 위험없이 3D 엔테로이드의 정점 표면에 더 쉽게 접근 할 수있게했습니다. Apical-out enteroids는 생체 내 장 상피의 세포 유형 조성 및 장벽 기능을 공유하지만, 일반적인 3D 엔테로이드와 달리 이들 세포의 정점 표면은 배양 배지에 직면하여 영양 흡수, 미생물 감염 및 발광 분비에 대한보다 생리 학적으로 관련된 연구를 가능하게합니다31. apical-out enteroids의 추가적인 이점은 실험 제제를 엔테로이드에 균질하게 분배하는 능력이다. 엔테로이드 크기에 기초한 다양한 치료 부피는 미세주입과 마찬가지로 요구되지 않으며, 현탁 배양물에서 이러한 엔테로이드를 유지하는 능력은 실험제 확산(32)에 대한 임의의 ECM 간섭을 무효화한다.
괴사성 장염은 여러 장 상피 세포 유형 및 다양한 환경 및 병리 생리학적 요인34를 포함하는 다인자 질환이다. 장 장내 장내 세포의 다양한 세포 조성은 NEC와 같은 복잡한 질병을 모델링 할 때 단일 배양에 비해 명확한 개선입니다. 흥미롭게도, 단일 염증 노출이 종종 시험관내 단일배양물에서 손상을 유도하기에 충분한 반면, 엔테로이드는 마우스 모델(23)과 마찬가지로, NEC 유사 손상을 유도하기 위해 최소 두 개의 염증 성분을 필요로 하는 것으로 보인다6. 여기에서, 우리는 저산소증 (NEC6의 중요한 임상 적 특징) 및 LPS 또는 TNF-α과 함께 apical-out enteroids를 사용하여 NEC와 같은 염증에 대한 상피 반응을 연구하고 잠재적으로 치료 표적을 확인하기 위해 개선 된 생리학 적으로 관련성이 높은 시험관 내 모델로서 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 제시합니다. 우리는 소장 3D 엔테로이드의 극성을 역전시키는 프로토콜과 상피 장벽 붕괴 및 접합 단백질 발현 변화를 확인하기위한 면역 형광 염색 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이중 히트, apical-out NEC-in-a-dish 모델의 영향을 결정하기 위해 간단한 엔테로이드 생존력 분석을 추가로 시연합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구의 모든 동물 절차는 오클라호마 대학 건강 과학 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 조산 비인간 영장류(NHP, 90% 임신, 올리브 비봉, 파피오 아누비스)로부터의 소장 편의 샘플을 별도의 연구를 위해 안락사 후 수득하였다(프로토콜 #101523-16-039-I).
1. 아피칼 아웃 엔테로이드 NEC-in-a-dish 모델 구축
- 배지 및 엔테로이드 치료의 제조
참고: 일단 표준 무균 기술에 따라 제조되면, 매체는 4°C에서 최대 1주일 동안 저장될 수 있다.- 50mL의 인간 오가노이드 성장 배지와 50mL의 오가노이드 보충제를 혼합하여 무항생제 배지(AFM) 를 준비합니다(자료표 참조). 9,900 μL의 PBS에 0.5 M EDTA 100 μL를 첨가하여 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산/1x 인산염 완충 식염수(EDTA/PBS)를 제조하였다.
- Chill Dulbecco의 변형된 독수리의 배지/영양소 햄의 혼합물 F12 + 15 mM HEPES 버퍼(DMEM/F12)를 2-8°C에서 냉각시킨다.
- 100 μg의 TNF-α 분말을 1x PBS 1 mL에 현탁시켜 TNF-α 원액을 제조하였다. 용매로서 AFM을 사용하여 TNF-α 스톡을 20 ng/mL 및 50 ng/mL 농도로 추가로 희석한다. LPS 2 mg을 1 mL의 1x PBS에 현탁시켜 LPS 원액을 제조하였다. AFM을 용매로 사용하여 스톡 LPS를 100 μg/mL 및 200 μg/mL로 추가로 희석합니다.
- 3D 엔테로이드의 극성 반전
참고: 다음 절차는 단일 24웰 평평한 바닥 조직 배양 플레이트를 두 개의 24웰 초저 부착 조직 배양 플레이트로 되돌리기 위한 것입니다. 조직 배양 플레이트는 사용 전에 적어도 30분 동안 37°C로 가온되어야 한다. 기저측성 3D 엔테로이드의 유도는 많은 그룹(35,36)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 달성되었으며, 매체에 대한 약간의 수정(위에서 상세히 설명함)이 있었다. 일반적인 엔테로이드 유도 절차는 인간의 그것과 다르지 않습니다. 간단히 말해서, 적출된 조직은 세척되고, 작은 단편으로 절단되고, 세포 파쇄 완충액에서 인큐베이션된다. 이어서, 세포 용액은 70 μM 세포 스트레이너를 통해 실행되어, 고밀도로 플레이팅되는 크립트를 생성한다.- 확립된 3D 기저측성 엔테로이드로 구성된 24웰 플레이트의 각 웰에서 흡인된 배지.
- 500μL의 5mM 빙냉 EDTA/PBS를 24웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 최소 5x-6x의 p200 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 기저막 추출물/ECM 돔을 부드럽게 기계적으로 파괴합니다.
- 네 개의 웰의 내용물을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 EDTA/PBS 8mL를 원뿔형 튜브에 첨가합니다. 나머지 20개의 웰을 동일한 방식으로 옮깁니다.
- 15 mL 코니컬 튜브를 4°C에서 330 rpm의 회전 플랫폼 또는 진탕기 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 1시간 인큐베이션 후, 원뿔형 튜브를 4°C에서 3분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 각 튜브에서 상층액을 제거하고 버립니다.
- 세포 펠릿을 5mL의 DMEM/F12로 결합 및 세척하고 세포 현탁액을 두 개의 15mL 코니컬 튜브에 분배합니다.
- 세포를 4°C에서 3분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 펠릿화하였다. 상층액을 제거하고 AFM 12mL를 각 튜브에 첨가하여 세포 펠릿이 재현탁되도록 합니다.
- 500 μL의 엔테로이드 현탁액을 두 개의 24-웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 피펫한다.
- 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 2-5 일 동안 또는 엔테로이드가 극성을 역전시킬 때까지 인큐베이션한다.
- 엔테로이드 반전을 확인하기 위해서는 먼저 확인 면역 형광 염색 및 평균 반전 시간 (~ 3 일)을 설정 한 다음 기본 광학 현미경 시각화를 사용하여 극성 반전을 확인합니다. Apical-out enteroids는 외관상 매우 세포성이며, basolateral-out enteroids는 종종 큰 중앙 루멘 또는 싹을 틔우는 것에 의해 지배됩니다 ( 보충 그림 1 참조).
참고: 절차가 표준화되면 apical-out으로의 전환율은 일반적으로 95%를 초과합니다. apical-out enteroids의 사용은 말단 실험으로 의도되었지만 이론적으로 apical-out enteroids를 소수의 basolateral-out enteroids로 통과시키는 것이 가능합니다.
- Apical-out NEC-in-a-dish
참고 : 엔테로이드가 극성을 역전시킨 후에는 apical-out 입체 형태에서의 수명이 3-4 일 이상 확인되지 않았으므로 후속 실험에서 배양물을 신속하게 사용하십시오. 다음의 NEC-in-a-dish 모델의 경우, 엔테로이드를 24시간 동안 처리한 다음, 직후에 수집하여 하류 실험을 위해 보존하였다.- 엔테로이드가 95% 이상의 효율로 극성을 시각적으로 역전시키면, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 24웰 플레이트의 8개의 웰을 15mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. apical-out enteroids가 현탁액에 있기 때문에, 단순히 엔테로이드 / 미디어 솔루션을 피펫하십시오. 15 mL 튜브를 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
- 일단 세포가 펠릿화되면, 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 1x PBS (대조군)의 원하는 부피 (여기에 첨가된 최고 처리 부피와 일치하도록 10 μL)와 혼합된 AFM 4 mL에 재현탁시켰다.
- 500 μL의 엔테로이드/PBS/AFM 현탁액을 24-웰 초저 부착 플레이트의 8개 웰에 피펫하고, 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션한다.
- 1.3.1.-1.3.3단계를 반복합니다. TNF-α (20 ng / mL 및 50 ng / mL) 및 LPS (100 μg / mL 및 200 μg / mL) 노목시아에서의 치료. 모든 저산소증 치료에 대해, 단계 1.3.1.-1.3.3.을 반복하되, 플레이트를 24시간 동안 37°C, 5%CO2, 및 1%O2 의 별도의 인큐베이터에 놓는다.
참고: 1.3.4 단계. 1.3.1.-1.3.3 단계와 동시에 수행 할 수 있지만 명확성을 위해 위의 절차는 복잡성을 줄이기 위해 처리로 분리되었습니다.
2. 면역형광염색 및 공초점 현미경 검사
- 염색액의 제조
- 7 mL의 최종 부피로 1x PBS에 7 μL의 트리톤 X-100을 혼합하여 0.1% 트리톤 X-100을 제조하였다. 30 mL의 최종 부피에 1x PBS에 30 μL의 트윈-20을 첨가하여 PBST (PBS-Tween)를 제조하였다.
- PBST의 6.3 mL에 NDS 700 μL를 첨가하여 10% 정상 당나귀 혈청 (NDS)/PBST를 준비하십시오. PBST에 NDS 70μL를 첨가하여 1% NDS/PBST를 7mL의 최종 부피로 준비한다.
주: 당나귀 혈청은 이차 항체 숙주와 상관관계를 맺기 위해 여기에서 사용되었다. 그러나, 차단 혈청 종은 비특이적 결합을 적절하게 차단하기 위해 이차 항체 종과 일치해야 한다.
- 염색 (1 일째)
- 24-웰 플레이트의 네 웰의 내용물을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 원하는 모든 웰 / 트리트먼트에 대해 반복하고 각 처리는 별도의 튜브에서 반복하십시오. 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 엔테로이드가 펠릿화되면 상층액을 제거하십시오.
- 세포 펠렛을 실온에서 30분 동안 고정성 4% 포름알데히드 고정성 300 μL에 재현탁시켰다(RT). 30분 후, 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠렛을 500 μL의 멸균, RT 1x PBS로 세척하였다.
- 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 0.1% 트리톤 X-100의 500 μL를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 앉히십시오.
- 1시간 후, 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 500 μL의 1x PBS로 세척하고, 튜브를 2-8°C에서 15분 동안 200 rpm으로 회전기 또는 진탕기 상에 놓는다. 이것을 총 4 배 반복하십시오.
- 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 500 μL의 10% NDS/PBST를 첨가하고, RT에서 45분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 동안, 24-웰 플레이트의 8개 웰에 대해 20μL의 재조합 항빌린 항체, 10μL의 E-카데린 항체 및 1970μL의 1% NDS/PBST를 결합하여 1차 항체 용액을 제조하였다.
- 45분 인큐베이션 후, 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 상청액을 제거하고 250μL의 일차 항체 용액으로 교체한다. 튜브를 2-8°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
- 염색 (2 일째)
- 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 펠렛의 크기에 따라 각 튜브에 250-500 μL의 PBST를 첨가하고, 2-8°C에서 1시간 동안 200 rpm으로 회전기 또는 진탕기에 놓는다. PBST 세척을 4x 반복한다.
- 52 μL의 Cy3 당나귀 항토끼 IgG (H+L)를 50% 글리세롤에 첨가하고 5.2 μL의 당나귀 항-마우스 형광 녹색 488 이차 항체를 1% NDS/PBST의 5142.8 μL에 첨가하여 2차 항체 용액을 제조하였다.
- 마지막 PBST 세척 및 원심분리에 이어서, 튜브로부터 상청액을 제거하였다. 200 μL의 이차 항체 용액을 각 튜브에 분주하고 2-8°C에서 밤새 어둠 속에서 인큐베이션한다.
- 스테인드 아피칼 아웃 엔테로이드 장착 (Day 1)
- 청색 핵 염료를 함유 한 글리세롤 기반 마운트를 1 시간 이상 RT로 가져 오십시오.
- 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 상청액 100μL를 제거하고 나머지 ∼100μL의 상청액에 세포를 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 0.5 mL 튜브로 옮긴다.
- 튜브를 20초 동안 미니 원심분리기에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 100 μL의 원거리 적색 핵산 염색에 재현탁시켰다. 튜브를 RT에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 튜브를 20초 동안 미니 원심분리기에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 1x PBS의 100 μL에 재현탁시켰다. 두 번째 세척을 반복하십시오.
- 튜브를 20초 동안 미니 원심분리기에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 70 μL의 상층액을 제거하였다. 세포를 PBS의 잔여 부피에 재현탁시키고, 내용물을 표지된 커버슬립 (24 mm x 60 mm)으로 옮긴다.
- 75μL의 장착제를 시편에 직접 바르고 피펫 팁으로 기포를 제거합니다. 커버 슬립이 어둠 속에서 RT에서 밤새 (18-24 시간) 경화되도록하십시오.
- 스테인드 아피칼 아웃 엔테로이드 장착 (Day 2)
- 밤새 경화시킨 후, 글리세롤의 박층(∼15 μL)을 커버슬립에 도포한다. 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 제자리에 살짝 밀어 넣습니다. 탭하여 커버슬립과 슬라이드 사이의 거품을 제거합니다.
- 커버슬립을 공초점 현미경으로 20x 배율로 이미징하기 전에 최소 2시간 동안 어둠 속에서 RT로 설정되도록 합니다. 다양한 공초점 획득 방법을 사용한 엔테로이드의 현미경 시각화는 Lallemant et al.37을 참조하십시오.
- 면역형광 정량화
참고: 이 방법은 ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 배경 신호를 제거하여 보정된 총 형광을 결정합니다.- ImageJ에서 공초점 이미지를 열고 관심 영역(ROI) 도구로 원하는 영역의 윤곽을 그립니다.
- 분석 > 측정 설정으로 이동하여 사용자 정의 매개변수를 설정합니다. 설정 탭>서 영역 > 통합 밀도 평균 회색 값을 선택합니다.
- 측정 분석으로 이동>니다. 측정값이 포함된 팝업 창이 나타납니다. 이러한 측정값을 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.
- 배경 신호를 빼려면 이미지의 작은 비형광 영역을 선택합니다. 해당 지역에 대한 분석 > 측정 으로 이동합니다. 측정값이 포함된 팝업 창이 나타납니다. 출력을 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.
- 선택된 세포의 면적에 배경 판독값의 평균 형광을 곱하고, 통합 밀도에서 합을 빼서 보정된 총 세포 형광(CTCF)을 계산한다. 스프레드시트 또는 통계 소프트웨어 패키지에 레코드를 유지하면서 관심 있는 모든 이미지에 대해 위의 단계를 반복 합니다(자료 표 참조).
3. Apical-out NEC-in-a-dish 세포 생존력
- 엔테로이드 트리트먼트
- 1 단계에서와 같이 24 시간 동안 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 수립하십시오.
- 세포 생존율 분석 시약을 4°C에서 하룻밤 동안 해동시킨다. 분석 당일, 사용 30 분 전에 시약을 RT로 가져 오십시오. 혼합할 시약을 반전시킨다.
- 분석을 수행하기 전에 각 웰에서 100μL의 배지를 제거하고 나머지 400μL를 남겨 둡니다. 각 웰에 세포 생존율 분석 시약 400μL를 추가합니다.
- 내용물을 200 rpm에서 5분 동안 RT에서 플레이트 진탕기 상에서 잘 혼합하여 세포 용해를 유도하였다. 진탕 후, 플레이트를 RT에서 추가로 25분 동안 인큐베이션한다.
- 25분 인큐베이션 후, 피펫팅을 통해 하나의 웰의 내용물을 혼합하고, 800 μL의 200 μL를 96-웰, 불투명, 폴리스티렌, 클리어-바닥 플레이트의 단일 웰로 옮긴다. 나머지 600μL에 대해 반복하여 웰당 네 번의 기술적 반복실험을 생성합니다. 이러한 방식으로 24-웰 플레이트의 각 웰의 나머지 내용물을 96-웰 플레이트로 옮긴다.
- 발광이 가능한 플레이트 리더를 사용하여 0.25ms 적분에서 값을 기록하고 치료 간의 상대 값을 비교합니다. 또는 치료 발광을 아데노신 삼인산염(ATP) 표준과 비교한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
장내 염증을 모델링하기 위해 엔테로이드를 사용하는 것은 괴사 성 장염의 맥락에서도 이제는 일반적입니다. 그러나 현재 사용되는 대부분의 방법은 엔테로이드의 정점 표면에 대한 접근이 부족하여 경구 치료제로 궁극적으로 사용하기위한 화합물의 생리적 관련성을 부정하거나 엔테로이드 유래 단층과 마찬가지로 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. NEC의 현재 시험관내 엔테로이드 모델의 유용성을 증가시키기 위해, 우리는 엔테로이드의 극성을 역전시키고, 24 시간 저산소증 및 LPS 또는 TNF-α과 결합하여 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 생성하였다. 면역형광 염색은 루멘을 향한 핵(청색)의 정점 국소화와 상피의 외부 가장자리에서 빌린32(적색, 정점 마커)의 검출을 확인하였다(도 1A). 200 μg/mL LPS, 50 ng/mL TNF-α 또는 저산소증 단독에 대한 노출은 대조군에 비해 총 세포 형태학, E-cadherin38 (녹색) 또는 빌린 국소화 또는 형광 강도의 명백한 변화를 유도하지 않았다 (도 1A-D; 그림 2). LPS 또는 TNF-α에 의한 치료는, 저산소증과 조합하여, 상피 구조를 교란시키고, 부착물 접합 및 솔보인 단백질 발현의 현저한 손실을 야기하고, E-cadherin 및 빌린 염색의 손실에 의해 지시된다 (도 1E-F; 그림 2). 장세포 솔 경계 및 부착 접합 단백질 발현의 이러한 감소는 상피 장벽 완전성의 감소를 나타낼 가능성이 높으며, 인간 외과적 NEC 및 질환(23)의 시험관내 모델링 둘 다의 공통된 특징이다.
NEC-in-a-dish 성분이 3D apical-out enteroids의 생존력에 미치는 영향을 결정하기 위해, 세포 용해 후 ATP 정량화에 중점을 둔 3D 배양을 위해 설계된 세포 생존율 검정을 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. 엔테로이드를 노목산 또는 저산소 조건 하에서 24시간 동안 LPS(200 μg/mL) 또는 TNF-α(50 ng/mL)로 처리하였다. LPS 또는 TNF-α 단독으로는 대조군에 비해 세포 생존율에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 3A). 그러나 저산소증 단독에 비해 apical-out enteroids를 저산소증(****p α 0.0001)과 함께 200μg/mL LPS 또는 50ng/mL TNF-<로 처리했을 때 생존력이 크게 감소했습니다(그림 3B). 이 실험은 비용 효율적이고 간단한 NEC-in-a-dish 모델에서 apical-out enteroids를 활용하는 다양성과 생리적 관련성을 보여줍니다.
그림 1: 리포폴리사카라이드(LPS), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 저산소증의 apical-out 표현형 및 형태학적 효과의 확인. 장세포 솔 경계 및 부착 접합 단백질에 대한 3D apical-out enteroids의 대표적인 면역조직화학 염색은 24시간 후에 (A) 대조군, (B) 저산소증, (C) LPS (200 μg/mL), (D) TNF-α (50 ng/mL), (E) LPS (200 μg/mL) + 저산소증, (F) TNF-α (50 ng/mL) + 저산소증. 스케일 바 = 각 이미지에 대해 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 24시간 리포폴리사카라이드(LPS), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 저산소증 처리 후 솔 테두리 및 부착 접합 단백질에 대한 염색 강도의 정량화. (A) 베일린(적색) 처리 중 비교; a = p < 대조군과 비교하여 0.0001; b = p < 대조군과 비교하여 0.05; c = p < 저산소증과 비교하여 0.0001; d = p < 저산소증과 비교하여 0.05; e= p < TNF-α과 비교하여 0.001; f = p < LPS + 저산소증과 비교하여 0.01; g = p < LPS와 비교하여 0.0001; 및 (B) E-카데린(녹색) 수준과 비교하여 치료; a = p < 대조군과 비교하여 0.0001; b = p < 저산소증과 비교하여 0.0001; c = p < LPS와 비교하여 0.01; d= p < TNF-α과 비교하여 0.01; e = p < 0.05 LPS + 저산소증과 비교하여. 유의성은 사후 분석을 위한 Tukey의 검정과 함께 분산의 단방향 분석(ANOVA)을 사용하여 평가되었으며, 평균(SEM)의 평균 ± 표준 오차(n ≥7/그룹)로 제시되었습니다. 제어는 차량 제어로서 PBS를 갖는 노르목시아를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 리포폴리사카라이드(LPS), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 및 저산소증이 정점 세포 생존율에 미치는 영향. LPS (200 μg/mL) 또는 TNF-α (50 ng/mL)로 처리된 3D apical-out enteroids의 생존능은 (A) 노르녹스 또는 (B) 저산소 조건 하에서 24시간 동안 발광을 통해 측정되었다. 통계적 유의성은 사후 분석을 위한 Tukey의 검정과 함께 분산의 단방향 분석(ANOVA)을 사용하여 계산하였다. 저산소증과 함께 LPS (200 μg / mL) 및 TNF-α (50 ng / mL)로 처리 된 엔테로이드는 저산소증 단독에 비해 현저히 덜 생존 할 수 있었으며 여기에서 발광이 증가한 것으로 나타났습니다. LPS (200 μg / mL) 또는 TNF-α (50 ng / mL)는 노목스 조건 하에서 대조군과 다르지 않았습니다. 데이터는 평균(SEM), n =8/군, ****p ± 0.0001의 평균 < 표준 오차로서 제시된다. 제어는 차량 제어로서 PBS를 갖는 노르목시아를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 : 입체 엔테로이드의 형태학. (A) 기저측성 엔테로이드는 싹이 트거나 싹트지 않고 크고 개방된 중앙 루멘의 출현에 의해 지배되는 반면, (B) 정점-아웃 엔테로이드는 조밀한 세포 외관을 특징으로 한다. 스케일 바 = 각 이미지에 대해 100μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
장 상피 크립트에서 유래 된 엔테로이드 모델의 최근 개발은 괴사 성 장염 병인을 연구하는보다 생리학적으로 관련된 시험관 내 조직을 허용합니다. 장 상피의 모든 주요 분화된 세포 유형을 포함함에도 불구하고, 3D 엔테로이드는 여전히 몇 가지 중요한 제한의 대상이 된다. 종래의, 기저측성-아웃 엔테로이드는 3D ECM 하이드로겔 돔에 현탁되며, 그 조성 및 밀도는 조직 배양 환경(39) 내에서 정상적인 확산을 제한할 수 있다. 중요하게도, 이들 엔테로이드는 세포의 정점 표면에 대한 제한된 접근을 공급하는데, 이는 생체내에서 LPS의 장세포 TLR4 결합과 같은 발광 박테리아 및 항원과 상호작용할 수 있는 표면이다.
NEC의 병태생리학은 불분명하지만, 조산기 장 상피에서 정점 TLR4의 발현 및 활성화의 증가는 두드러진 역할을 하는 것으로 생각된다40. TLR4 활성화의 하류, 장 투과성 증가, 상피 복구 감소 및 박테리아 전좌는 기능 장애가있는 장 장벽을 초래하여 장2의 괴사를 초래합니다. 미숙아의 원위 장에서이 염증주기는 장내 내강에서 시작하여 장내 세포의 정점 표면에서 시작되는 것으로 생각됩니다. 따라서, 장 상피의 박테리아 전좌를 수반하는 기계론적 연구에서 기저측성 아웃 3D 엔테로이드를 활용하는 모델은 현재 이해되고 있는 바와 같이 생체내 병인을 재검토하지 않으며 차선책의 정보를 산출할 가능성이 있다.
여기에서, 우리는 apical-out NEC-in-a-dish 모델의 확립을 설명하고, 엔테로이드 세포의 정점 표면에 쉽게 접근 할 수있게하고, 아마도 기존의 3D basolateral-out enteroids와 비교하여 생리 학적으로 관련성이 높은 모델을 초래합니다. 이러한 엔테로이드의 극성 반전은 잠재적인 경구 투여된 치료제가 단순히 배지에 첨가되고 생체내에서 발생하는 것처럼 장세포에 의해 자연적으로 흡수될 수 있게 한다. 이 접근법은 미세주입과 같이 비싸고 기술적으로 까다로운 기술을 필요로 하지 않으며, 2D 단층 또는 장온어칩 모델을 수립하는 것보다 더 자원친화적이다.
우리의 대표적인 결과는 LPS 또는 TNF-α를 투여받은 아피칼-아웃 엔테로이드가 저산소증과 조합되어, 생존력 감소, 상피 구조 파괴, 및 대조군에 비해 부착물 접합 단백질 발현의 감소를 겪거나, 저산소증 또는 염증성 매개체 단독 치료와 비교하여, 생체내 NEC의 공지된 특징을 모방함을 나타낸다. 장 상피 장벽 기능(41)에 중요한 부착 접합부의 붕괴는 NEC42,43에서 보고되었다. NEC44에서도 중요한 타이트한 접합 건축 파괴도 발생했을 가능성이 높지만 향후 연구에서 이러한 변화가 평가 될 것입니다. 생리학적으로 번역가능한 조직에서, 이 이중 히트 모델은 NEC에 내재된 인자들에 대한 조산기 장 반응의 연구를 가능하게 하며, 잠재적으로 새로운 치료 표적이 확인될 수 있는 플랫폼을 제공한다. 미래의 연구는 NEC를 넘어 기생충, 박테리아 또는 바이러스 감염31,32, 숙주 - 미생물 상호 작용 (45) 및 위장 흡수 기능(46)에 초점을 맞춘 연구로 apical-out enteroids의 적용을 확장 할 수 있지만 조산아의 생리적 맥락 내에서.
apical-out NEC-in-a-dish를 위한 이 프로토콜에는 강조를 보증하는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 세포 배양 배지의 조성과 신선도는 실험에서 과도한 종방향 변동성을 피하고 실험 치료 전에 엔테로이드가 건강한지 확인하는 데 중요합니다. 마찬가지로, TNF-α 및 LPS의 스톡 용액은 과도한 동결/해동 사이클을 방지하고 최적의 활성을 보존하기 위해 -80°C에서 분취 및 보관되어야 합니다. 마지막으로, EDTA/PBS 인큐베이션 동안 모든 ECM이 가용화되도록 주의해야 합니다. ECM의 불완전한 제거는 엔테로이드가 극성을 역전시키지 못하는 결과를 초래할 수 있습니다. 필요한 경우, 잠복기를 1.5 h로 연장하여 매트릭스를 완전히 제거 할 수 있습니다.
이 apical-out NEC-in-a-dish 모델은 비용 효율적이고 간단하지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. Apical-out NEC-in-a-dish는 장내 칩 모델28,29만큼 생리적으로 관련이 없지만 칩 옵션에 액세스 할 수없는 중간 옵션을 나타냅니다. 또한, 현탁액 배양물로서, 엔테로이드는 배지 변경을 위해 수집, 펠릿화 및 재현탁되어야 하며, 그렇지 않으면 간단한 공정에 원심분리 단계를 추가한다. 또 다른 한계는 일반적으로 종말점 분석에만 적합한 것으로 간주되기 때문에 apical-out enteroids의 수명입니다. 기저측성 성장 인자 수용체가 더 이상 배지 성장 인자와 지속적으로 접촉하지 않기 때문에, 정점-아웃 엔테로이드는 기저 측방성 엔테로이드에 비해 감소된 증식을 특징으로 하며, 그 결과 정점 아웃 배양물(apical-out cultures)을 통과할 수 없는 상대적 불능을 초래한다(31,32). 추가적으로, 세포 유형의 상대적 비율을 포함하는 정확한 조성물이 생체내 조직과 비교하여 엔테로이드로 나타내어지는지는 알려져 있지 않지만, 연구는 일반적으로 미미한 차이31,32를 제시한다. 마지막으로, 이 apical-out NEC-in-a-dish 모델의 24시간 개발은 편리하지만, 생체내 포뮬러-기반 NEC 모델(47)과 비교하여 상대적으로 짧을 수 있으며, 더 긴 기간의 개입이 요구된다면 잠재적으로 추가적인 표준화가 필요할 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없으며 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. HC는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 보조금 P20GM134973에 의해 지원됩니다. KB는 어린이 병원 재단 (CHF)과 장로교 건강 재단 (PHF) 보조금의 지원을 받습니다. 우리는 공초점 이미징을 제공 한 핵심 시설의 사용에 대한 OUHSC의 분자 생물학 및 세포 측정 연구 연구소에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Fisher Scientific | 15575-020 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Cover Glass 24 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 102460 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-21202 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate | Sigma-Aldrich | AP182C | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| E-cadherin antibody (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| ImageJ | Fiji | N/A | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
| Leica SP8 Confocal Microscope | Leica Biosystems | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | 566460 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
| Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] | Abcam | ab130751 | |
| Recombinant Human TNF-α protein 100 µg | Bio-Techne | 210-TA-100/CF | |
| SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
| TO-PRO-3 Iodide (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | Thermo Scientific | AB0350 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |
References
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Neu, J., Walker, W. A.
- Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
- Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R.
- Neu, J.
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), Baltimore, Md. 7067-7079 (2011).
- Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
- Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
- De Plaen, I. G.
- Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
- Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
- Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
- Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
- Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
- Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
- Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
- Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
- Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
- Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
- Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
- Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
- Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
- Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
- Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
- Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
- Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).
