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Medicine

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

Abstract

La enterocolitis necrosante (ECN) es una enfermedad devastadora que afecta a los recién nacidos prematuros, caracterizada por inflamación intestinal y necrosis. Los enteroides han surgido recientemente como un sistema prometedor para modelar patologías gastrointestinales. Sin embargo, los métodos utilizados actualmente para la manipulación enteroide carecen de acceso a la superficie apical del epitelio (tridimensional [3D]) o consumen mucho tiempo y recursos (monocapas bidimensionales [2D]). Estos métodos a menudo requieren pasos adicionales, como la microinyección, para que el modelo se vuelva fisiológicamente traducible. Aquí, describimos un protocolo fisiológicamente relevante y económico para estudiar NEC in vitro invirtiendo la polaridad enteroide, lo que resulta en la superficie apical hacia afuera (apical-out). También se proporciona un protocolo de tinción inmunofluorescente para examinar la integridad de la barrera enteroide y la expresión de proteínas de unión después de la exposición al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o lipopolisacárido (LPS) en condiciones normóxicas o hipóxicas. También se evalúa la viabilidad de enteroides apicales 3D expuestos a LPS normóxico o hipóxico o TNF-α durante 24 h. Los enteroides expuestos a LPS o TNF-α, en combinación con hipoxia, exhibieron una interrupción de la arquitectura epitelial, una pérdida de la expresión de proteínas de unión adherentes y una reducción en la viabilidad celular. Este protocolo describe un nuevo modelo apical-out NEC-in-a-dish que presenta una plataforma fisiológicamente relevante y rentable para identificar posibles objetivos epiteliales para terapias NEC y estudiar la respuesta intestinal prematura a la terapéutica.

Introduction

La enterocolitis necrosante (ECN), una enfermedad inflamatoria grave del intestino delgado que ocurre en hasta 10% de los recién nacidos prematuros, se asocia comúnmente con alta morbilidad y mortalidad 1,2. Las tasas de mortalidad cercanas al 50% en lactantes de muy bajo peso al nacer (<1500 g), que requieren intervención quirúrgica, no son infrecuentes3. Mientras que la etiología exacta de la ECN no se comprende actualmente, se cree que los factores de riesgo, como la alimentación con fórmula, se combinan con anomalías fisiológicas, como disbiosis, epitelio intestinal inmaduro y barrera intestinal disfuncional, en el desarrollo de la enfermedad 2,4. A pesar de los esfuerzos significativos, se ha avanzado poco en la prevención o el tratamiento de la ECN en la última década5. Se requiere un nuevo método in vitro para estudiar la ECN y la disfunción de la barrera epitelial intestinal asociada para avanzar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad, ya que los hallazgos de modelos animales, hasta ahora, se han traducido mal a la cabecera6.

Se han utilizado varios modelos in vitro para investigar los mecanismos en juego durante la ECN. La línea celular epitelial intestinal humana, Caco-2, se encuentra entre los modelos in vitro más utilizados de NEC 7,8. Las células Caco-2 emulan las características morfológicas del borde en cepillo del intestino delgado, pero, como línea celular, no se diferencian en la amplia variedad de tipos de células in vivo, incluidas las células caliciformes productoras de moco, requeridas para un modelo altamente traducible. HT-29-MTX, células de adenocarcinoma de colon humano, incluyen un fenotipo mixto de enterocito y cáliz, pero aún carecen de tipos de células basadas en criptas del epitelio intestinal9. IEC-6 e IEC-18 son líneas celulares no transformadas con una morfología ileal inmadura similar a la cripta pero no se derivan de tejido humano, lo que limita su capacidad de traducción. Las líneas celulares intestinales FH 74-Int y H4 se derivan del tejido fetal humano y no forman uniones estrechas ni monocapas polarizadas10,11, y por lo tanto son inmaduras en comparación incluso con los bebés más prematuros susceptibles a la ECN. Por lo general, los modelos in vitro de NEC utilizan tratamientos de lipopolisacáridos (LPS) para inducir el receptor tipo toll 4 (TLR4), un receptor importante que inicia la inflamación intestinal en NEC12. El daño mediado por el tratamiento con especies reactivas de oxígeno (ROS), típicamente a través del peróxido de hidrógeno, se utiliza a menudo para inducir daño oxidativo similar al NEC y apoptosis13,14. Como principal impulsor de la inflamación intestinal, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), un componente posterior de la señalización inflamatoria TLR4, también se utiliza comúnmente en estos modelos in vitro para imitar la patogénesis in vivo 15.

Los organoides, generados a partir de células madre pluripotentes inducibles (iPSCs), han crecido en popularidad como modelo in vitro del intestino debido a su capacidad para recapitular la compleja arquitectura in vivo y la composición de tipo celular del tejido del que se derivan16,17. Un sistema in vitro relacionado, los enteroides, son organoides derivados de criptas intestinales resecadas que son más fáciles de establecer y mantener que los organoides derivados de iPSC. Los enteroides se cultivan típicamente en una matriz extracelular (ECM) tridimensional (3D) con acceso experimental limitado a la superficie celular basolateral. Se han desarrollado métodos, como la microinyección18,19, para superar esta barrera a la superficie apical, pero la acumulación de desechos celulares desprendidos y moco dentro del lumen hace que la microinyección sea técnicamente difícil e inconsistente. Como las plataformas de microinyección robótica personalizadas no son ampliamente accesibles20, la variabilidad de laboratorio a laboratorio en la capacidad técnica y la técnica general se convierten en variables significativas para superar con los protocolos de microinyección. Las monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides 3D disociados, que aún comprenden todos los principales tipos celulares del epitelio intestinal, permiten el acceso a la superficie apical, pero tradicionalmente han sido difíciles de mantener sin una capa alimentadora de miofibroblastos mesenquimales21. Mientras que los soportes permeables al cultivo celular pueden ser utilizados para acceder tanto al lado apical como basolateral de monocapas enteroides sin el uso de miofibroblastos subyacentes, estos insertos requieren escisión y montaje de la membrana antes de su uso con modalidades como la microscopía confocal, lo que resulta en un proceso técnicamente más exigente y difícil cuando se utilizan métodos tradicionales de microscopía22. NEC se ha modelado in vitro utilizando enteroides 3D tradicionales 23,24,25 y soportes permeables 26,27, y la inflamación intestinal se ha replicado recientemente con modelos gut-on-a-chip28,29. Si bien los modelos gut-on-a-chip que incorporan microfluídica son, con mucho, los modelos más avanzados y traducibles, esta tecnología es costosa, compleja e inaccesible para la mayoría de los investigadores30.

Los avances recientes en las técnicas de enteroides apical-out han permitido un acceso más fácil a la superficie apical de enteroides 3D sin correr el riesgo de dañar la integridad estructural del epitelio in vitro 31,32,33. Los enteroides apicales comparten la composición del tipo celular y la función de barrera del epitelio intestinal in vivo, pero, a diferencia de los enteroides 3D típicos, las superficies apicales de estas células se enfrentan al medio de cultivo, lo que permite estudios fisiológicamente más relevantes sobre la absorción de nutrientes, la infección microbiana y la secreción luminal31. Una ventaja adicional de los enteroides apicales es la capacidad de distribuir homogéneamente agentes experimentales a enteroides. No se requiere variar los volúmenes de tratamiento según el tamaño enteroide, como ocurre con la microinyección, y la capacidad de mantener estos enteroides en cultivo en suspensión niega cualquier interferencia de la ECM en la difusión del agente experimental32.

La enterocolitis necrosante es una enfermedad multifactorial que involucra múltiples tipos de células epiteliales intestinales y una variedad de factores ambientales y fisiopatológicos34. La composición celular variada de los enteroides intestinales es una clara mejora sobre los monocultivos en el modelado de una enfermedad compleja como la ECN. Curiosamente, mientras que una sola exposición inflamatoria es a menudo suficiente para inducir daño en monocultivos in vitro , los enteroides, como con los modelos de ratón23, parecen requerir un mínimo de dos componentes inflamatorios para inducir un daño similar al NEC6. Aquí, presentamos un modelo apical-out NEC-in-a-dish, utilizando enteroides apical-out en combinación con hipoxia (una característica clínica importante de NEC6) y LPS o TNF-α, como un modelo in vitro mejorado y fisiológicamente más relevante para estudiar las respuestas epiteliales a la inflamación similar a la ECN y, potencialmente, identificar objetivos terapéuticos. Describimos un protocolo para invertir la polaridad de enteroides 3D del intestino delgado, así como un protocolo de tinción inmunofluorescente para identificar la interrupción de la barrera epitelial y las alteraciones de la expresión de proteínas de unión. Finalmente, demostramos además un ensayo de viabilidad enteroide simple para determinar el impacto de nuestro modelo NEC-in-a-a-dish de doble golpe y salida apical.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma. Se obtuvieron muestras de conveniencia del intestino delgado de un primate no humano prematuro (NHP, 90% de gestación, babuino olivo, Papio anubis) después de la eutanasia para un estudio separado (Protocolo # 101523-16-039-I).

1. Establecimiento del modelo enteroide apical-out NEC-in-a-dish

  1. Preparación de tratamientos de medios y enteroides
    NOTA: Una vez preparado siguiendo la técnica aséptica estándar, el medio se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
    1. Prepare medios libres de antibióticos (AFM) mezclando 50 ml de medios de crecimiento de organoides humanos con 50 ml de suplemento organoide (consulte la Tabla de materiales). Preparar 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético/solución salina tamponada con fosfato (EDTA/PBS) añadiendo 100 μL de 0,5 M EDTA a 9.900 μL de PBS.
    2. Enfriar el medio del águila modificada de Dulbecco/nutriente Mezcla de jamón F12 + 15 mM HEPES Tampón (DMEM/F12) a 2-8 °C.
    3. Preparar la solución madre de TNF-α suspendiendo 100 μg de polvo de TNF-α en 1 ml de 1x PBS. Diluya aún más el stock de TNF-α a concentraciones de 20 ng / ml y 50 ng / ml utilizando AFM como solvente. Prepare la solución madre de LPS suspendiendo 2 mg de LPS en 1 ml de 1x PBS. Diluir más LPS madre diluido a 100 μg/ml y 200 μg/ml utilizando AFM como disolvente.
  2. Invertir la polaridad de enteroides 3D
    NOTA: El siguiente procedimiento está diseñado para la inversión de una sola placa de cultivo de tejido de fondo plano de 24 pocillos en dos placas de cultivo de tejido de fijación ultra baja de 24 pocillos. Las placas de cultivo de tejidos deben calentarse a 37 °C durante al menos 30 minutos antes de su uso. La derivación de enteroides 3D basolaterales hacia fuera se logró como se describió previamente por muchos grupos35,36, con ligeras modificaciones para los medios (detallados anteriormente). El procedimiento general de derivación enteroide no difiere del de los humanos. En resumen, el tejido extirpado se lava, se corta en pequeños fragmentos y se incuba en un tampón de interrupción celular. La solución celular se ejecuta a través de un filtro celular de 70 μM, lo que resulta en criptas que se chapan en una alta densidad.
    1. Aspirar medios de cada pocillo de una placa de 24 pocillos de enteroides basolaterales 3D establecidos.
    2. Agregue 500 μL de EDTA/PBS helado de 5 mM a cada pocillo de la placa de 24 pocillos e interrumpa mecánicamente suavemente el extracto de la membrana basal/domo ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta p200 un mínimo de 5x-6x.
    3. Transfiera el contenido de cuatro pocillos a un tubo cónico de 15 ml y agregue 8 ml de EDTA/PBS helado al tubo cónico. Transfiera los 20 pozos restantes de la misma manera.
    4. Incubar tubos cónicos de 15 ml a 4 °C durante 1 h en una plataforma giratoria o agitador a 330 rpm. Después de la incubación de 1 h, centrifugar los tubos cónicos a 300 x g durante 3 min a 4 °C. Retire y deseche el sobrenadante de cada tubo.
    5. Combine y lave los gránulos celulares con 5 ml de DMEM/F12 y distribuya la suspensión celular en dos tubos cónicos de 15 ml.
    6. Granular las células centrifugando a 300 x g durante 3 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 12 ml de AFM a cada tubo, asegurándose de que los gránulos celulares se resuspendan.
    7. Pipetear 500 μL de la suspensión enteroide en cada pocillo de dos placas de fijación ultrabaja de 24 pocillos.
    8. Incubar las placas a 37 °C y 5% deCO2 durante 2-5 días o hasta que los enteroides hayan invertido la polaridad.
    9. Para verificar la reversión enteroide, primero establezca la tinción inmunofluorescente confirmatoria y el tiempo promedio de reversión (~ 3 días), luego confirme la inversión de polaridad utilizando una visualización básica de microscopio óptico. Los enteroides apicales son muy celulares en apariencia, mientras que los enteroides basolaterales a menudo están dominados por la presencia de una gran luz central o gemación (ver Figura suplementaria 1).
      NOTA: Una vez que el procedimiento ha sido estandarizado, la tasa de conversión a apical-out típicamente supera el 95%. El uso de enteroides apicales de salida pretende ser un experimento terminal, aunque teóricamente es posible pasar enteroides apicales a un pequeño número de enteroides basolaterales.
  3. Salida apical NEC-in-a-dish
    NOTA: Una vez que los enteroides hayan invertido la polaridad, use los cultivos en experimentos posteriores rápidamente, ya que su longevidad en la conformación apical-out no se ha confirmado más allá de 3-4 días. Para el siguiente modelo de NEC en un plato, los enteroides se trataron durante 24 h, luego se recolectaron inmediatamente después y se conservaron para experimentos posteriores.
    1. Una vez que los enteroides hayan invertido visualmente la polaridad con al menos un 95% de eficiencia, retire las placas de la incubadora y recoja ocho pocillos de una placa de 24 pocillos en un tubo cónico de 15 ml. Como los enteroides apical-out están en suspensión, simplemente pipetea la solución enteroide/media. Centrifugar el tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
    2. Una vez que las células estén peletizadas, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 4 ml de AFM mezclado con el volumen deseado (10 μL aquí para que coincida con el volumen de tratamiento más alto agregado) de 1x PBS (control).
    3. Pipetear 500 μL de suspensión enteroide/PBS/AFM en ocho pocillos de una placa de fijación ultrabaja de 24 pocillos e incubar la placa a 37 °C y 5% deCO2 durante 24 h.
    4. Repita los pasos 1.3.1.-1.3.3. para los tratamientos TNF-α (20 ng/ml y 50 ng/ml) y LPS (100 μg/ml y 200 μg/ml) en normoxia. Para todos los tratamientos de hipoxia, repita los pasos 1.3.1.-1.3.3., pero coloque la placa en una incubadora separada a 37 °C, 5% de CO2 y 1% deO2 durante 24 h.
      NOTA: Paso 1.3.4. se puede hacer simultáneamente con los pasos 1.3.1.-1.3.3, pero, para mayor claridad, el procedimiento anterior se separó por tratamiento para reducir la complejidad.

2. Tinción inmunofluorescente y microscopía confocal

  1. Preparación de soluciones de tinción
    1. Preparar Triton X-100 al 0,1% mezclando 7 μL de Triton X-100 en 1x PBS hasta un volumen final de 7 mL. Prepare PBST (PBS-Tween) agregando 30 μL de Tween-20 a 1x PBS a un volumen final de 30 ml.
    2. Prepare suero de burro normal (NDS)/PBST al 10% agregando 700 μL de NDS a 6.3 ml de PBST. Preparar NDS/PBST al 1% añadiendo 70 μL de NDS a PBST a un volumen final de 7 ml.
      NOTA: El suero de burro se utilizó aquí para correlacionarse con el huésped de anticuerpos secundario. Sin embargo, las especies de suero bloqueantes deben coincidir con las especies de anticuerpos secundarias para bloquear adecuadamente la unión no específica.
  2. Tinción (Día 1)
    1. Transfiera el contenido de cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita para todos los pozos / tratamientos deseados, con cada tratamiento en un tubo separado. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Una vez que los enteroides estén peletizados, retire el sobrenadante.
    2. Resuspender los gránulos celulares en 300 μL de fijador de formaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Después de 30 min, centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y lavar el pellet con 500 μL de ESTÉRIL, RT 1x PBS.
    3. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 500 μL de Triton X-100 al 0,1%, y deje reposar durante 1 h en RT.
    4. Después de 1 h, centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Lavar con 500 μL de 1x PBS y colocar los tubos en un rotador o agitador a 200 rpm durante 15 min a 2-8 °C. Repita esto un total de 4x.
    5. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Añadir 500 μL de NDS/PBST al 10% e incubar a RT durante 45 min. Durante la incubación, preparar soluciones de anticuerpos primarios combinando 20 μL de anticuerpo antivillina recombinante, 10 μL de anticuerpo E-cadherina y 1970 μL de NDS/PBST al 1% para ocho pocillos de una placa de 24 pocillos.
    6. Después de la incubación de 45 minutos, centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Coloque los tubos sobre hielo. Retire el sobrenadante y sustitúyalo por 250 μL de solución de anticuerpos primarios. Incubar los tubos durante la noche a 2-8 °C.
  3. Tinción (Día 2)
    1. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Añadir 250-500 μL de PBST a cada tubo, dependiendo del tamaño del pellet, y colocar en el rotador o agitador a 200 rpm durante 1 h a 2-8 °C. Repita el lavado PBST 4x.
    2. Preparar la solución secundaria de anticuerpos añadiendo 52 μL de Cy3 burro anti-conejo IgG (H + L) al 50% de glicerol y 5,2 μL de anticuerpos secundarios verde fluorescente 488 de burro a 5142,8 μL de NDS/PBST al 1%.
    3. Después del último lavado y centrifugación de PBST, retire el sobrenadante de los tubos. Dispensar 200 μL de solución de anticuerpos secundarios en cada tubo e incubar en la oscuridad durante la noche a 2-8 °C.
  4. Montaje de enteroides apicales teñidos (Día 1)
    1. Lleve el montante a base de glicerol que contenga colorante nuclear azul a RT durante 1 h.
    2. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Retire 100 μL del sobrenadante y resuspenda las células en los ~100 μL restantes de sobrenadante. Transfiera la suspensión celular a tubos de 0,5 ml.
    3. Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 s para granular las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 100 μL de tinción de ácido nucleico rojo lejano. Incubar los tubos a RT durante 10 min.
    4. Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 s para granular las células. Retire el sobrenadante y resuspenda los gránulos celulares en 100 μL de 1x PBS. Repita para un segundo lavado.
    5. Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 s para granular las células y eliminar 70 μL del sobrenadante. Vuelva a suspender las celdas en el volumen restante de PBS y transfiera el contenido a un cubreobjetos etiquetado (24 mm x 60 mm).
    6. Aplicar 75 μL de montante directamente sobre la muestra y eliminar las burbujas con la punta de una pipeta. Deje que los cubreobjetos se curen durante la noche (18-24 h) en RT en la oscuridad.
  5. Montaje de enteroides apicales teñidos (Día 2)
    1. Después de curar durante la noche, aplique una capa delgada (~ 15 μL) de glicerol a los cubreobjetos. Monte el cubreobjetos en la corredera de vidrio y presione suavemente en su lugar. Toque para eliminar cualquier burbuja entre el cubreobjetos y la corredera.
    2. Deje que el cubreobjetos se fije en RT en la oscuridad durante un mínimo de 2 h, antes de obtener imágenes con un aumento de 20x con un microscopio confocal. Para la visualización microscópica de enteroides utilizando diversos métodos de adquisición confocal, véase Lallemant et al.37.
  6. Cuantificación inmunofluorescente
    NOTA: Este método determina la fluorescencia total corregida eliminando la señal de fondo utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Abra las imágenes confocales en ImageJ y delinee el área deseada con la herramienta de región de interés (ROI).
    2. Para definir parámetros definidos por el usuario, vaya a Analizar > Establecer medidas. Seleccione Área > Densidad integrada > Valor gris medio en la pestaña de configuración.
    3. Desplácese hasta Analizar > medir. Aparecerá una ventana emergente con las mediciones. Copia y pega estas medidas en una hoja de cálculo.
    4. Para restar la señal de fondo, seleccione una pequeña área no fluorescente de la imagen. Vaya a Analizar > medida para esa región. Aparecerá una ventana emergente con las mediciones. Copia y pega la salida en una hoja de cálculo.
    5. Multiplique el área de la célula seleccionada por la fluorescencia promedio de las lecturas de fondo y reste la suma de la densidad integrada para calcular la fluorescencia celular total corregida (CTCF). Repita los pasos anteriores para todas las imágenes de interés, mientras mantiene los registros en una hoja de cálculo o paquete de software estadístico (consulte Tabla de materiales).

3. Viabilidad celular de NEC en un plato apical

  1. Tratamientos enteroides
    1. Establezca el modelo NEC-in-a-dish apical-out durante 24 h, como en el Paso 1.
    2. Reactivo del ensayo de viabilidad celular de descongelación durante la noche a 4 °C. El día del ensayo, lleve el reactivo a RT 30 min antes de usarlo. Invierta el reactivo para mezclar.
    3. Antes de realizar el ensayo, retire 100 μL de medio de cada pocillo, dejando los 400 μL restantes. Agregue 400 μL de reactivo de ensayo de viabilidad celular a cada pocillo.
    4. Mezclar vigorosamente bien el contenido en un agitador de placas a RT durante 5 min a 200 rpm para inducir la lisis celular. Después de agitar, incubar el plato en RT durante 25 minutos adicionales.
    5. Después de 25 minutos de incubación, mezclar el contenido de un pocillo mediante pipeteo y transferir 200 μL de los 800 μL a un solo pocillo de una placa de 96 pocillos, opaca, de poliestireno y fondo transparente. Repita para los 600 μL restantes, creando cuatro réplicas técnicas por pozo. Transfiera el contenido restante de cada pocillo de la placa de 24 pocillos a una placa de 96 pocillos de esta manera.
    6. Utilizando un lector de placas capaz de luminiscencia, registre los valores a 0,25 ms de integración y compare los valores relativos entre los tratamientos. Alternativamente, compare la luminiscencia del tratamiento con un estándar de trifosfato de adenosina (ATP).

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Representative Results

El uso de enteroides para modelar la inflamación intestinal, incluso en el contexto de la enterocolitis necrosante, es ahora común. Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados actualmente carecen de acceso a la superficie apical de los enteroides, negando la relevancia fisiológica de los compuestos destinados a su uso eventual como terapéutica oral, o son técnicamente difíciles y requieren mucho tiempo, como con las monocapas derivadas de enteroides. Para aumentar la utilidad de los modelos enteroides in vitro actuales de NEC, invertimos la polaridad de los enteroides y, en combinación con hipoxia de 24 h y LPS o TNF-α, generamos un modelo de NEC apical-en-un-plato. La tinción inmunofluorescente confirmó la localización apical-out de los núcleos (azul) hacia el lumen y la detección de villin32 (marcador rojo apical) en el borde exterior del epitelio (Figura 1A). La exposición a 200 μg/ml LPS, 50 ng/ml TNF-α o hipoxia sola no indujo cambios manifiestos en la morfología de las células macroscópicas, la E-cadherina38 (verde), o la localización de las vellosidades o la intensidad fluorescente en comparación con el control (Figura 1A-D; Figura 2). El tratamiento con LPS o TNF-α, en combinación con hipoxia, alteró la arquitectura epitelial y causó una pérdida significativa de la unión de adherentes y la expresión de proteínas del borde en cepillo, indicada por la pérdida de E-cadherina y tinción de villinas (Figura 1E-F; Figura 2). Estas reducciones en el borde en cepillo de enterocitos y las expresiones de proteínas de unión adherentes probablemente indican una reducción en la integridad de la barrera epitelial y son una característica común tanto de la NEC quirúrgica humana como del modelado in vitro de la enfermedad23.

Para determinar el impacto de los componentes de NEC en una placa en la viabilidad de enteroides apicales 3D, se evaluó la viabilidad celular utilizando un ensayo de viabilidad celular diseñado para cultivos 3D, centrado en la cuantificación de ATP después de la lisis celular. Los enteroides fueron tratados con LPS (200 μg/ml) o TNF-α (50 ng/ml) durante 24 h en condiciones normóxicas o hipóxicas. LPS o TNF-α solos no afectaron significativamente la viabilidad celular en comparación con el control (Figura 3A). Sin embargo, se produjeron reducciones significativas en la viabilidad cuando los enteroides apicales se trataron con 200 μg/ml de LPS o 50 ng/ml de TNF-α en combinación con hipoxia (****p < 0,0001) en comparación con hipoxia sola (Figura 3B). Estos experimentos demuestran la versatilidad y relevancia fisiológica de utilizar enteroides apicales en un modelo de NEC en un plato rentable y sencillo.

Figure 1
Figura 1: Confirmación del fenotipo apical-out y los efectos morfológicos del lipopolisacárido (LPS), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la hipoxia. Tinción inmunohistoquímica representativa de enteroides apical-out 3D para borde en cepillo de enterocitos y proteínas de unión adherentes después de 24 h. (A) Control, (B) hipoxia, (C) LPS (200 μg/mL), (D) TNF-α (50 ng/mL), (E) LPS (200 μg/mL) + hipoxia, (F) TNF-α (50 ng/mL) + hipoxia. Barra de escala = 50 μm para cada imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cuantificación de la intensidad de tinción para el borde en cepillo y las proteínas de unión adherente después de tratamientos con lipopolisacáridos (LPS) de 24 h, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e hipoxia. (A) Niveles de villina (rojo) comparados entre los tratamientos; a = p < 0,0001 en comparación con el control; b = p < 0,05 en comparación con el control; c = p < 0,0001 en comparación con hipoxia; d = p < 0,05 en comparación con hipoxia; e = p < 0,001 en comparación con TNF-α; f = p < 0,01 en comparación con LPS + hipoxia; g = p < 0,0001 en comparación con LPS; y (B) niveles de E-cadherina (verde) comparados entre los tratamientos; a = p < 0,0001 en comparación con el control; b = p < 0,0001 en comparación con hipoxia; c = p < 0,01 en comparación con LPS; d = p < 0,01 en comparación con TNF-α; e = p < 0,05 en comparación con LPS + hipoxia. La significancia se evaluó mediante análisis unidireccional de varianza (ANOVA) con la prueba de Tukey para análisis post-hoc, presentada como media ± error estándar de la media (SEM ) (n ≥ 7/grupo). El control representa la normoxia con PBS como control del vehículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efecto del lipopolisacárido (LPS), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la hipoxia sobre la viabilidad celular apical. La viabilidad de enteroides apicales 3D tratados con LPS (200 μg/mL) o TNF-α (50 ng/mL) durante 24 h bajo (A) condiciones normóxicas o (B) hipóxicas se midió mediante luminiscencia. La significación estadística se calculó mediante análisis unidireccional de varianza (ANOVA) con la prueba de Tukey para el análisis post-hoc. Los enteroides tratados con LPS (200 μg/mL) y TNF-α (50 ng/mL), en combinación con hipoxia, fueron significativamente menos viables en comparación con la hipoxia sola, observada aquí con un aumento de la luminiscencia. LPS (200 μg/mL) o TNF-α (50 ng/mL), en condiciones normóxicas, no difirieron del control. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM), n = 8/grupo, ****p < 0,0001. El control representa la normoxia con PBS como control del vehículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Morfología de enteroides tridimensionales. (A) Mientras que los enteroides basolaterales hacia fuera están dominados por la apariencia de una luz central grande y abierta, con o sin gemación, (B) los enteroides apicales se caracterizan por una apariencia densa y celular. Barra de escala = 100 μm para cada imagen. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El reciente desarrollo de modelos enteroides derivados de criptas epiteliales intestinales permite un tejido in vitro fisiológicamente más relevante en el que estudiar la patogénesis necrosante de la enterocolitis. A pesar de incluir todos los principales tipos de células diferenciadas del epitelio intestinal, los enteroides 3D todavía están sujetos a varias limitaciones significativas. Los enteroides convencionales basolaterales están suspendidos en domos de hidrogel 3D ECM, cuya composición y densidad pueden limitar la difusión normal dentro del ambiente de cultivo tisular39. Es importante destacar que estos enteroides proporcionan acceso limitado a la superficie apical de las células, que es la superficie que, in vivo, interactuaría con bacterias y antígenos luminales, como la unión de enterocitos TLR4 de LPS.

Si bien la fisiopatología de la ECN sigue sin estar clara, se cree que el aumento de la expresión y la activación de TLR4 apical en el epitelio intestinal prematuro desempeñan un papel destacado40. Aguas abajo de la activación de TLR4, el aumento de la permeabilidad intestinal, la reducción de la reparación epitelial y la translocación bacteriana dan como resultado una barrera intestinal disfuncional, que conduce a la necrosis del intestino2. Se cree que este ciclo inflamatorio en el intestino distal de los bebés prematuros se origina en la luz intestinal, iniciándose en la superficie apical de los enterocitos. Por lo tanto, los modelos que utilizan enteroides 3D basolaterales en estudios mecanicistas que involucran la translocación bacteriana del epitelio intestinal no recapitulan la patogénesis in vivo como se entiende actualmente y es probable que produzcan información subóptima.

Aquí, describimos el establecimiento de un modelo NEC-in-a-dish apical-out, que permite un fácil acceso a la superficie apical de las células enteroides y, presumiblemente, resulta en un modelo fisiológicamente más relevante en comparación con los enteroides basolaterales convencionales 3D. La inversión de polaridad en estos enteroides permite que las posibles terapias administradas por vía oral se agreguen simplemente a los medios y sean absorbidas naturalmente por los enterocitos, como ocurriría in vivo. Este enfoque no requiere técnicas costosas y técnicamente desafiantes, como la microinyección, y es más amigable con los recursos que el establecimiento de monocapas 2D o modelos de tripa en un chip.

Nuestros resultados representativos indican que los enteroides apicales sometidos a LPS o TNF-α, en combinación con hipoxia, sufren una viabilidad reducida, una arquitectura epitelial alterada y una reducción en la expresión de proteínas de unión adherentes en comparación con el control, o en comparación con el tratamiento con hipoxia o mediador inflamatorio solo, imitando las características conocidas de la ECN in vivo. La interrupción de las uniones adherentes, crítica para la función de la barrera epitelial intestinal41, ha sido reportada en NEC42,43. La interrupción arquitectónica de unión estrecha, que también es importante en NEC44, probablemente también ocurrió, aunque estos cambios se evaluarán en estudios futuros. En un tejido fisiológicamente traducible, este modelo de doble golpe permite el estudio de las respuestas intestinales prematuras a factores inherentes a la ECN, al tiempo que proporciona una plataforma a través de la cual se pueden identificar objetivos terapéuticos potencialmente novedosos. Los estudios futuros pueden extender la aplicación de enteroides apicales más allá de la NEC a estudios centrados en infecciones parasitarias, bacterianas o virales31,32, interacciones huésped-microbioma 45 y función de absorción gastrointestinal 46, pero dentro del contexto fisiológico del recién nacido prematuro.

Este protocolo para el NEC-in-a-dish apical-out incluye varios pasos críticos que merecen énfasis. La composición y la frescura de los medios de cultivo celular son importantes para evitar una variabilidad longitudinal excesiva en los experimentos y garantizar que los enteroides estén sanos antes del tratamiento experimental. Del mismo modo, las soluciones madre de TNF-α y LPS deben alicotizarse y almacenarse a -80 °C para evitar ciclos excesivos de congelación/descongelación y preservar una actividad óptima. Finalmente, se debe tener cuidado para asegurar que toda la ECM se solubilice durante la incubación de EDTA / PBS. La eliminación incompleta de la ECM podría provocar que los enteroides no inviertan la polaridad. Si es necesario, el período de incubación puede extenderse a 1,5 h para garantizar la eliminación completa de la matriz.

Si bien este modelo de NEC en un plato apical-out es rentable y sencillo, el método está sujeto a varias limitaciones. El NEC-in-a-dish apical out no es tan fisiológicamente relevante como los modelos gut-on-a-chip28,29, pero representa una opción intermedia donde y cuando las opciones de chip no son accesibles. Además, como cultivo en suspensión, los enteroides deben recolectarse, peletizarse y resuspenderse para cambios de medios, agregando un paso de centrifugación a un proceso que de otro modo sería simple. Otra limitación es la longevidad de los enteroides apicales, ya que generalmente se consideran adecuados solo para análisis de punto final. Como los receptores del factor de crecimiento basolateral ya no están en contacto constante con los factores de crecimiento de los medios, los enteroides apicales se caracterizan por una proliferación reducida en comparación con los enteroides basolaterales, lo que resulta en la relativa incapacidad para pasar cultivos apicales31,32. Además, no se sabe si la composición exacta, incluidas las proporciones relativas, de los tipos celulares están representados en enteroides en comparación con el tejido in vivo, pero los estudios generalmente sugieren diferencias menores31,32. Finalmente, el desarrollo de 24 h de este modelo NEC-in-a-dish apical-out, aunque conveniente, puede ser relativamente breve en comparación con los modelos NEC basados en fórmulas in vivo 47, lo que potencialmente requiere estandarización adicional si se desean períodos más largos de intervención.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar y no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. HC es apoyado por la subvención P20GM134973 de los Institutos Nacionales de Salud. KB cuenta con el apoyo de una subvención de Children's Hospital Foundation (CHF) y Presbyterian Health Foundation (PHF). Agradecemos al Laboratorio de Investigación de Biología Molecular y Citometría de OUHSC por el uso de la Instalación Básica, que proporcionó imágenes confocales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

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References

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Medicina Número 184
<em>In vitro </em> Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante
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Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

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