In vitro  Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Kathryn Burge; Adam Wilson; Hala Chaaban

doi:10.3791/64003

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Artículo de método

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

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DOI:

10.3791/64003

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8 de junio de 2022

Kathryn Burge¹ , Adam Wilson¹ , Hala Chaaban¹

¹Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

Resumen

La enterocolitis necrosante (ECN) es una enfermedad devastadora que afecta a los recién nacidos prematuros, caracterizada por inflamación intestinal y necrosis. Los enteroides han surgido recientemente como un sistema prometedor para modelar patologías gastrointestinales. Sin embargo, los métodos utilizados actualmente para la manipulación enteroide carecen de acceso a la superficie apical del epitelio (tridimensional [3D]) o consumen mucho tiempo y recursos (monocapas bidimensionales [2D]). Estos métodos a menudo requieren pasos adicionales, como la microinyección, para que el modelo se vuelva fisiológicamente traducible. Aquí, describimos un protocolo fisiológicamente relevante y económico para estudiar NEC in vitro invirtiendo la polaridad enteroide, lo que resulta en la superficie apical hacia afuera (apical-out). También se proporciona un protocolo de tinción inmunofluorescente para examinar la integridad de la barrera enteroide y la expresión de proteínas de unión después de la exposición al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o lipopolisacárido (LPS) en condiciones normóxicas o hipóxicas. También se evalúa la viabilidad de enteroides apicales 3D expuestos a LPS normóxico o hipóxico o TNF-α durante 24 h. Los enteroides expuestos a LPS o TNF-α, en combinación con hipoxia, exhibieron una interrupción de la arquitectura epitelial, una pérdida de la expresión de proteínas de unión adherentes y una reducción en la viabilidad celular. Este protocolo describe un nuevo modelo apical-out NEC-in-a-dish que presenta una plataforma fisiológicamente relevante y rentable para identificar posibles objetivos epiteliales para terapias NEC y estudiar la respuesta intestinal prematura a la terapéutica.

Introducción

La enterocolitis necrosante (ECN), una enfermedad inflamatoria grave del intestino delgado que ocurre en hasta 10% de los recién nacidos prematuros, se asocia comúnmente con alta morbilidad y mortalidad ^1,2. Las tasas de mortalidad cercanas al 50% en lactantes de muy bajo peso al nacer (<1500 g), que requieren intervención quirúrgica, no son infrecuentes³. Mientras que la etiología exacta de la ECN no se comprende actualmente, se cree que los factores de riesgo, como la alimentación con fórmula, se combinan con anomalías fisiológicas, como disbiosis, epitelio intestinal inmaduro y barre....