Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In vitro Apical-Out Enteroid Modell av nekrotiserende enterokolitt

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

Denne protokollen beskriver en apikal-ut nekrotiserende enterokolitt (NEC) -i-en-parabol-modell som bruker små intestinale enteroider med reversert polaritet, noe som gir tilgang til den apikale overflaten. Vi tilbyr en immunfluorescerende fargeprotokoll for å oppdage NEC-relatert epitelforstyrrelse og en metode for å bestemme levedyktigheten til apikale enteroider utsatt for NEC-in-a-dish-protokollen.

Abstract

Nekrotiserende enterokolitt (NEC) er en ødeleggende sykdom som påvirker premature spedbarn, preget av tarmbetennelse og nekrose. Enteroider har nylig dukket opp som et lovende system for å modellere gastrointestinale patologier. Imidlertid mangler nåværende metoder for enteroid manipulasjon enten tilgang til epitelets apikale overflate (tredimensjonal [3D]) eller er tidkrevende og ressurskrevende (todimensjonale [2D] monolag). Disse metodene krever ofte flere trinn, for eksempel mikroinjeksjon, for at modellen skal bli fysiologisk oversettbar. Her beskriver vi en fysiologisk relevant og billig protokoll for å studere NEC in vitro ved å reversere enteroid polaritet, noe som resulterer i at den apikale overflaten vender utover (apikal-ut). En immunfluorescerende fargeprotokoll for å undersøke enteroid barriereintegritet og junctional proteinuttrykk etter eksponering for tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) eller lipopolysakkarid (LPS) under normoksiske eller hypoksiske forhold er også gitt. Levedyktigheten til 3D apikale ut enteroider utsatt for normoksisk eller hypoksisk LPS eller TNF-α i 24 timer blir også evaluert. Enteroider eksponert for enten LPS eller TNF-α, i kombinasjon med hypoksi, viste forstyrrelse av epitelarkitektur, tap av adherens junction proteinuttrykk og en reduksjon i cellens levedyktighet. Denne protokollen beskriver en ny apikal-ut NEC-in-a-dish-modell som presenterer en fysiologisk relevant og kostnadseffektiv plattform for å identifisere potensielle epitelmål for NEC-terapier og studere for tidlig intestinal respons på terapi.

Introduction

Nekrotiserende enterokolitt (NEC), en alvorlig inflammatorisk sykdom i tynntarmen som forekommer hos opptil 10% av premature spedbarn, er ofte forbundet med høy sykelighet og dødelighet 1,2. Dødelighet som nærmer seg 50% hos svært lav fødselsvekt (<1500 g) spedbarn, som krever kirurgisk inngrep, er ikke uvanlig3. Mens den eksakte etiologien til NEC for øyeblikket ikke forstås, antas risikofaktorer, som formelfôring, å sammensettes med fysiologiske anomalier, som dysbiose, et umodent tarmepitel og en dysfunksjonell tarmbarriere, i utviklingen av sykdommen 2,4. Til tross for betydelig innsats har det skjedd liten fremgang i forebygging eller behandling av NEC i løpet av det siste tiåret5. En ny in vitro-metode for å studere NEC og tilhørende tarmepitelbarrieredysfunksjon er nødvendig for å fremme forståelsen av patogenesen av sykdommen, da funn fra dyremodeller hittil har oversatt dårlig til sengen6.

En rekke in vitro-modeller har blitt brukt for å undersøke mekanismene som er i spill under NEC. Den humane tarmepitelcellelinjen, Caco-2, er blant de mest brukte in vitro-modellene av NEC 7,8. Caco-2-celler emulerer børstegrensens morfologiske egenskaper i tynntarmen, men som en cellelinje skiller de seg ikke ut i det store utvalget av in vivo-celletyper, inkludert slimproduserende begerceller, som kreves for en svært oversettbar modell. HT-29-MTX, humane adenokarsinomceller i tykktarmen, inkluderer en blandet enterocytt og begercellefenotype, men mangler fortsatt kryptbaserte celletyper i tarmepitelet9. IEC-6 og IEC-18 er ikke-transformerte cellelinjer med en umoden ileal kryptlignende morfologi, men er ikke avledet fra menneskelig vev, noe som begrenser deres translasjonskapasitet. FHs 74-Int og H4 tarmcellelinjer er avledet fra humant fostervev og danner ikke tette veikryss eller polariserte monolag10,11, og er dermed umodne sammenlignet med selv de mest premature spedbarnene som er utsatt for NEC. Vanligvis bruker NEC in vitro-modeller lipopolysakkarid (LPS) behandlinger for å indusere tolllignende reseptor 4 (TLR4), en viktig reseptor som initierer tarmbetennelse i NEC12. Skader mediert gjennom reaktive oksygenarter (ROS) behandling, vanligvis via hydrogenperoksid, brukes ofte til å indusere NEC-lignende oksidativ skade og apoptose13,14. Som hoveddriver for tarmbetennelse, er tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α), en nedstrømskomponent i inflammatorisk TLR4-signalering, også ofte brukt i disse in vitro-modellene for å etterligne in vivo patogenese15.

Organoider, generert fra induserbare pluripotente stamceller (iPSCs), har vokst i popularitet som en in vitro-modell av tarmen på grunn av deres evne til å rekapitulere komplekset in vivo-arkitektur og celletypesammensetning av vevet de er avledet fra16,17. Et relatert in vitro-system, enteroider, er organoider avledet fra resekterte tarmkrypter som er lettere etablert og vedlikeholdt enn iPSC-avledede organoider. Enteroider dyrkes vanligvis i en tredimensjonal (3D) ekstracellulær matrise (ECM) med eksperimentell tilgang begrenset til den basolaterale celleoverflaten. Metoder, som mikroinjeksjon18,19, er utviklet for å overvinne denne barrieren mot den apikale overflaten, men oppbyggingen av sloughed cellulært rusk og slim i lumen gjør mikroinjeksjon både teknisk vanskelig og inkonsekvent. Siden tilpassede robotmikroinjeksjonsplattformer ikke er allment tilgjengelige20, blir lab-til-lab-variabilitet i teknisk evne og generell teknikk betydelige variabler å overvinne med mikroinjeksjonsprotokoller. Todimensjonale (2D) monolag avledet fra dissosierte 3D-enteroider, som fortsatt omfatter alle hovedcelletyper i tarmepitelet, gir tilgang til den apikale overflaten, men har tradisjonelt vært vanskelig å opprettholde uten et materlag av mesenkymale myofibroblaster21. Mens cellekulturpermeable støtter kan brukes til å få tilgang til både apikale og basolaterale sider av enteroid monolag uten bruk av underliggende myofibroblaster, krever disse innsatsene eksisjon og montering av membranen før bruk med modaliteter som konfokalmikroskopi, noe som resulterer i en mer teknisk krevende og vanskelig prosess ved bruk av tradisjonelle mikroskopimetoder22. NEC har blitt modellert in vitro ved hjelp av tradisjonelle 3D-enteroider 23,24,25 og permeable støtter 26,27, og tarmbetennelse har nylig blitt replikert med gut-on-a-chip-modeller 28,29. Mens gut-on-a-chip-modeller som inneholder mikrofluidikk er de desidert mest avanserte og oversettbare modellene, er denne teknologien dyr, kompleks og utilgjengelig for de fleste etterforskere30.

Nylige fremskritt innen apikale enteroidteknikker har gitt lettere tilgang til den apikale overflaten av 3D-enteroider uten å risikere skade på den strukturelle integriteten til in vitro-epitelet 31,32,33. Apical-out enteroider deler celletypesammensetningen og barrierefunksjonen til in vivo tarmepitel, men i motsetning til typiske 3D-enteroider vender de apikale overflatene til disse cellene mot kulturmediet, noe som muliggjør mer fysiologisk relevante studier på næringsabsorpsjon, mikrobiell infeksjon og luminal sekresjon31. En ekstra fordel med apikale enteroider er evnen til homogent å distribuere eksperimentelle midler til enteroider. Varierende behandlingsvolum basert på enteroidstørrelse er ikke nødvendig, som det er med mikroinjeksjon, og evnen til å opprettholde disse enteroidene i suspensjonskultur negerer enhver ECM-interferens på eksperimentell agentdiffusjon32.

Nekrotiserende enterokolitt er en multifaktoriell sykdom som involverer flere tarmepitelcelletyper og en rekke miljømessige og patofysiologiske faktorer34. Den varierte cellesammensetningen av intestinale enteroider er en klar forbedring i forhold til monokulturer i modellering av en kompleks sykdom som NEC. Interessant nok, mens en enkelt inflammatorisk eksponering ofte er tilstrekkelig til å indusere skade i in vitro monokulturer, synes enteroider, som med musemodeller23, å kreve minst to inflammatoriske komponenter for å indusere NEC-lignende skade6. Her presenterer vi en apikal-ut NEC-in-a-dish-modell, ved bruk av apikale enteroider i kombinasjon med hypoksi (et viktig klinisk trekk ved NEC6) og enten LPS eller TNF-α, som en forbedret og mer fysiologisk relevant in vitro-modell for å studere epitelresponser på NEC-lignende betennelse og potensielt identifisere terapeutiske mål. Vi beskriver en protokoll for reversering av polariteten til tynntarms 3D-enteroider, samt en immunfluorescerende fargeprotokoll for å identifisere epitelbarriereforstyrrelser og kryssende proteinuttrykksendringer. Til slutt demonstrerer vi videre en enkel enteroid levedyktighetsanalyse for å bestemme virkningen av vår dual-hit, apikal-ut NEC-in-a-dish-modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer i denne studien ble godkjent av University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Tynntarmsprøver fra en for tidlig ikke-menneskelig primat (NHP, 90% svangerskap, olivenbavian, Papio anubis) ble oppnådd etter eutanasi for en egen studie (protokoll # 101523-16-039-I).

1. Etablering av apikal-ut enteroid NEC-in-a-dish modell

  1. Forberedelse av media og enteroid behandlinger
    MERK: Når mediet er tilberedt etter standard aseptisk teknikk, kan det oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke.
    1. Forbered antibiotikafrie medier (AFM) ved å blande 50 ml humane organoide vekstmedier med 50 ml organoidtilskudd (se tabell over materialer). Forbered 5 mM etylendiamintetraeddiksyre / 1x fosfatbufret saltvann (EDTA / PBS) ved å tilsette 100 μL 0,5 M EDTA til 9,900 μL PBS.
    2. Chill Dulbeccos modifiserte blanding av ørnens medium/næringsstoff skinke F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) ved 2-8 °C.
    3. Forbered TNF-α stamløsning ved å suspendere 100 μg TNF-α pulver i 1 ml 1x PBS. Fortynn TNF-α-stammen ytterligere til 20 ng / ml og 50 ng / ml konsentrasjoner ved bruk av AFM som løsningsmiddel. Klargjør LPS-lagerløsning ved å suspendere 2 mg LPS i 1 ml 1x PBS. Ytterligere fortynnet lager LPS til 100 μg / ml og 200 μg / ml ved bruk av AFM som løsningsmiddel.
  2. Reversere polariteten til 3D-enteroider
    MERK: Følgende prosedyre er beregnet for reversering av en enkelt 24-brønns flatbunnsvevskulturplate i to 24-brønns ultra-lave festevevskulturplater. Vevsdyrkningsplatene skal varmes opp til 37 °C i minst 30 minutter før bruk. Derivasjonen av basolaterale 3D-enteroider ble oppnådd som beskrevet tidligere av mange grupper35,36, med små modifikasjoner for media (beskrevet ovenfor). Den generelle enteroid-avledningsprosedyren skiller seg ikke fra menneskers. Kort sagt, utskåret vev vaskes, kuttes i små fragmenter og inkuberes i celleforstyrrelsesbuffer. Celleløsningen kjøres deretter gjennom en 70 μM cellesil, noe som resulterer i krypter som er belagt med høy tetthet.
    1. Aspirerende medier fra hver brønn i en 24-brønns plate med etablerte 3D basolaterale enteroider.
    2. Tilsett 500 μL 5 mM iskald EDTA/PBS til hver brønn i 24-brønnsplaten og forstyrr forsiktig kjellermembranekstraktet/ECM-kuppelen mekanisk ved å pipettere opp og ned med en p200-pipette minimum 5x-6x.
    3. Overfør innholdet i fire brønner til et 15 ml konisk rør og tilsett 8 ml iskald EDTA/PBS til det koniske røret. Overfør de resterende 20 brønnene på samme måte.
    4. Inkuber 15 ml koniske rør ved 4 °C i 1 time på en roterende plattform eller shaker ved 330 o / min. Etter inkubasjonen på 1 time sentrifuger de koniske rørene ved 300 x g i 3 minutter ved 4 °C. Fjern og kast supernatanten fra hvert rør.
    5. Kombiner og vask cellepellets med 5 ml DMEM/F12 og fordel cellesuspensjonen i to 15 ml koniske rør.
    6. Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 3 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og tilsett 12 ml AFM til hvert rør, slik at cellepellets blir resuspendert.
    7. Pipette 500 μL av enteroidsuspensjonen i hver brønn i to 24-brønns ultralave festeplater.
    8. Inkuber platene ved 37 °C og 5 % CO 2 i2-5 dager eller til enteroider har reversert polariteten.
    9. For å sjekke enteroid reversering, må du først etablere den bekreftende immunfluorescerende fargingen og gjennomsnittlig tid til reversering (~ 3 dager), og bekreft deretter polaritetsreverseringen ved hjelp av en grunnleggende lysmikroskopvisualisering. Apikale enteroider er svært cellulære i utseende, mens basolaterale enteroider ofte domineres av tilstedeværelsen av et stort sentralt lumen eller spirende (se supplerende figur 1).
      MERK: Når prosedyren er standardisert, overstiger konverteringsfrekvensen til apikal ut vanligvis 95%. Bruken av apikale enteroider er ment som et terminalt eksperiment, selv om det er teoretisk mulig å passere apikale ut enteroider til et lite antall basolaterale enteroider.
  3. Apical-ut NEC-in-a-dish
    MERK: Når enteroidene har reversert polariteten, bruk kulturene i påfølgende eksperimenter raskt, da deres levetid i apikal-ut-konformasjon ikke er bekreftet utover 3-4 dager. For den følgende NEC-in-a-dish-modellen ble enteroidene behandlet i 24 timer, deretter samlet umiddelbart etterpå og bevart for nedstrømseksperimenter.
    1. Når enteroider har visuelt reversert polaritet med minst 95% effektivitet, fjern platene fra inkubatoren og samle åtte brønner av en 24-brønnplate i et 15 ml konisk rør. Siden apikale enteroider er i suspensjon, pipetter du bare enteroid/media-løsningen. Sentrifuge 15 ml røret ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    2. Når cellene er pelletert, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 4 ml AFM blandet med ønsket volum (10 μL her for å matche det høyeste tilsatte behandlingsvolumet) på 1x PBS (kontroll).
    3. Pipette 500 μL enteroid/PBS/AFM suspensjon i åtte brønner av en 24-brønns ultralav festeplate og inkuber platen ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
    4. Gjenta trinn 1.3.1.-1.3.3. for TNF-α (20 ng / ml og 50 ng / ml) og LPS (100 μg / ml og 200 μg / ml) behandlinger ved normoksi. For alle hypoksibehandlinger gjentar du trinn 1.3.1.-1.3.3., men legger platen i en separat inkubator ved 37 °C, 5 % CO2 og 1 %O2 i 24 timer.
      MERK: Trinn 1.3.4. kan gjøres samtidig med trinn 1.3.1.-1.3.3, men for klarhetens skyld ble prosedyren ovenfor separert ved behandling for å redusere kompleksiteten.

2. Immunfluorescerende farging og konfokal mikroskopi

  1. Fremstilling av fargeløsninger
    1. Forbered 0,1% Triton X-100 ved å blande 7 μL Triton X-100 i 1x PBS til et endelig volum på 7 ml. Forbered PBST (PBS-Tween) ved å legge til 30 μL Tween-20 til 1x PBS til et endelig volum på 30 ml.
    2. Tilbered 10 % normalt eselserum (NDS)/PBST ved å tilsette 700 μL NDS til 6,3 ml PBST. Forbered 1% NDS / PBST ved å legge 70 μL NDS til PBST til et endelig volum på 7 ml.
      MERK: Eselserum ble brukt her for å korrelere med den sekundære antistoffverten. De blokkerende serumartene bør imidlertid samsvare med den sekundære antistoffarten for å blokkere ikke-spesifikk binding på riktig måte.
  2. Farging (dag 1)
    1. Overfør innholdet i fire brønner i en 24-brønnsplate til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Gjenta for alle ønskede brønner/behandlinger, med hver behandling i et eget rør. Sentrifuge rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C. Når enteroider er pelletert, fjern supernatanten.
    2. Resuspender cellepellets i 300 μL 4% formaldehydfiksativ i 30 minutter ved romtemperatur (RT). Etter 30 min, sentrifuger rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 ° C, fjern supernatanten og vask pelleten med 500 μL steril, RT 1x PBS.
    3. Sentrifuge rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og tilsett 500 μL 0,1% Triton X-100, og la den sitte i 1 time ved RT.
    4. Etter 1 time sentrifuger du rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C og fjerner supernatanten. Vask med 500 μL 1x PBS og legg rørene på en rotator eller shaker ved 200 o / min i 15 minutter ved 2-8 ° C. Gjenta dette totalt 4x.
    5. Sentrifuge rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten. Tilsett 500 μL 10 % NDS/PBST og inkuber ved RT i 45 min. Under inkubasjonen, lag primære antistoffløsninger ved å kombinere 20 μL rekombinant anti-villin antistoff, 10 μL E-cadherin antistoff og 1970 μL på 1% NDS / PBST for åtte brønner av en 24-brønns plate.
    6. Etter inkubasjonen på 45 minutter, sentrifuger rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C. Legg rørene på is. Fjern supernatanten og erstatt med 250 μL primær antistoffløsning. Inkuber rørene over natten ved 2-8 °C.
  3. Farging (dag 2)
    1. Sentrifuge rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten. Tilsett 250-500 μL PBST til hvert rør, avhengig av størrelsen på pelleten, og legg på rotatoren eller shakeren ved 200 o / min i 1 time ved 2-8 ° C. Gjenta PBST-vasken 4x.
    2. Forbered sekundær antistoffløsning ved å tilsette 52 μL Cy3 esel anti-kanin IgG (H + L) til 50% glyserol og 5,2 μL esel anti-mus fluorescerende grønn 488 sekundære antistoffer mot 5142,8 μL av 1% NDS / PBST.
    3. Etter siste PBST-vask og sentrifugering, fjern supernatanten fra rørene. Dispenser 200 μL sekundær antistoffoppløsning til hvert rør og inkuber i mørket over natten ved 2-8 °C.
  4. Montering av flekkete apikale enteroider (dag 1)
    1. Ta glyserolbasert monteringsmiddel som inneholder blått nukleært fargestoff til RT over 1 time.
    2. Sentrifuge rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C. Fjern 100 μL av supernatanten og resuspender cellene i de resterende ~ 100 μL supernatant. Overfør cellesuspensjonen til 0,5 ml rør.
    3. Sentrifuge rørene i en mini sentrifuge i 20 s for å pelletere cellene. Fjern supernatanten og resuspender cellepellets i 100 μL langt rød nukleinsyreflekk. Inkuber rørene ved RT i 10 min.
    4. Sentrifuge rørene i en mini sentrifuge i 20 s for å pelletere cellene. Fjern supernatanten og resuspender cellepellets i 100 μL 1x PBS. Gjenta for en ny vask.
    5. Sentrifuge rørene i en mini sentrifuge i 20 s for å pellet cellene og fjerne 70 μL av supernatanten. Resuspender cellene i det gjenværende volumet av PBS og overfør innholdet til en merket deksel (24 mm x 60 mm).
    6. Påfør 75 μL monteringsmiddel direkte på prøven og fjern eventuelle bobler med en pipettespiss. La dekslene herde over natten (18-24 timer) ved RT i mørket.
  5. Montering av flekkete apikale enteroider (dag 2)
    1. Etter herding over natten, påfør et tynt lag (~ 15 μL) glyserol på dekslene. Monter dekselet på glassglasset og trykk forsiktig på plass. Trykk for å fjerne eventuelle bobler mellom dekselet og lysbildet.
    2. La dekselet settes på RT i mørket i minst 2 timer, før du avbilder ved 20x forstørrelse med et konfokalt mikroskop. For mikroskopisk visualisering av enteroider ved hjelp av ulike konfokale innsamlingsmetoder, se Lallemant et al.37.
  6. Immunfluorescerende kvantifisering
    MERK: Denne metoden bestemmer den korrigerte totale fluorescensen ved å fjerne bakgrunnssignalet ved hjelp av ImageJ-programvare (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Åpne de konfokale bildene i ImageJ og skisser ønsket område med verktøyet for interesseområde (ROI).
    2. Angi brukerdefinerte parametere ved å gå til Analyser > angi mål. Velg Område > Integrert tetthet > Middelgrå verdi under innstillingsfanen.
    3. Naviger til Analyser > mål. Et popup-vindu vises som inneholder målingene. Kopier og lim inn disse målingene i et regneark.
    4. Hvis du vil trekke fra bakgrunnssignalet, velger du et lite ikke-fluorescerende område i bildet. Gå til Analyser > mål for dette området. Et popup-vindu vises som inneholder målingene. Kopier og lim inn utdataene i et regneark.
    5. Multipliser arealet av den valgte cellen med gjennomsnittlig fluorescens av bakgrunnsavlesninger, og trekk summen fra den integrerte tettheten for å beregne den korrigerte totale cellefluorescensen (CTCF). Gjenta trinnene ovenfor for alle bilder av interesse, mens du opprettholder poster i et regneark eller en statistisk programvarepakke (se Materialfortegnelse).

3. Apical-out NEC-in-a-dish celle levedyktighet

  1. Enteroid behandlinger
    1. Etabler apikal-ut NEC-in-a-dish-modell i 24 timer, som i trinn 1.
    2. Thaw celle levedyktighet analyse reagens over natten ved 4 ° C. På analysedagen, ta reagenset til RT 30 min før bruk. Inverter reagenset for å blande.
    3. Før du utfører analysen, fjern 100 μL media fra hver brønn, og la de resterende 400 μL. Tilsett 400 μL celle levedyktighetsanalysereagens til hver brønn.
    4. Bland innholdet kraftig på en plateshaker ved RT i 5 minutter ved 200 o / min for å indusere cellelyse. Etter risting, inkuber platen på RT i ytterligere 25 minutter.
    5. Etter 25 min inkubasjon, bland innholdet i en brønn via pipettering og overfør 200 μL av 800 μL til en enkelt brønn av en 96-brønn, ugjennomsiktig, polystyren, klarbunnet plate. Gjenta for de resterende 600 μL, og lag fire tekniske repliker per brønn. Overfør det gjenværende innholdet i hver brønn i 24-brønnsplaten til en 96-brønnplate på denne måten.
    6. Ved hjelp av en plateleser som er i stand til luminescens, registrer verdier ved 0,25 ms integrasjon og sammenlign de relative verdiene blant behandlinger. Alternativt kan du sammenligne behandlingsluminescens med en adenosintrifosfat (ATP) standard.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruken av enteroider for å modellere tarmbetennelse, selv innenfor rammen av nekrotiserende enterokulitt, er nå vanlig. Imidlertid mangler de fleste metoder som for tiden brukes, enten tilgang til den apikale overflaten av enteroider, og negerer den fysiologiske relevansen av forbindelser beregnet for eventuell bruk som oral terapi, eller er teknisk vanskelige og tidkrevende, som med enteroid-avledede monolag. For å øke nytten av nåværende in vitro enteroidmodeller av NEC, reverserte vi polariteten til enteroider, og i kombinasjon med 24 timers hypoksi og LPS eller TNF-α genererte vi en apikal-ut NEC-in-a-dish-modell. Immunfluorescerende farging bekreftet apikal-ut lokalisering av kjerner (blå) mot lumen og påvisning av villin32 (rød, apikal markør) i ytterkanten av epitelet (figur 1A). Eksponering for 200 μg/ml LPS, 50 ng/ml TNF-α eller hypoksi alene induserte ikke åpenbare endringer i bruttocellemorfologi, E-cadherin38 (grønn) eller villinlokalisering eller fluorescerende intensitet sammenlignet med kontroll (figur 1A-D; Figur 2). Behandling med LPS eller TNF-α, i kombinasjon med hypoksi, forstyrret epitelarkitektur og forårsaket et signifikant tap av adherens-kryss og børstegrenseproteinuttrykk, indikert ved tap av E-cadherin og villinfarging (figur 1E-F; Figur 2). Disse reduksjonene i enterocyttbørstekant og adherens junction proteinuttrykk indikerer sannsynligvis en reduksjon i epitelbarriereintegritet og er et vanlig trekk ved både human kirurgisk NEC og in vitro modellering av sykdommen23.

For å bestemme virkningen av NEC-in-a-dish-komponenter på levedyktigheten til 3D-apikale enteroider, ble cellens levedyktighet evaluert ved hjelp av en celle levedyktighetsanalyse designet for 3D-kulturer, sentrert på ATP-kvantifisering etter cellelyse. Enteroider ble behandlet med LPS (200 μg / ml) eller TNF-α (50 ng / ml) i 24 timer under normoksiske eller hypoksiske forhold. LPS eller TNF-α alene påvirket ikke cellens levedyktighet signifikant sammenlignet med kontroll (figur 3A). Det forekom imidlertid signifikante reduksjoner i levedyktighet når apikale enteroider ble behandlet med 200 μg/ml LPS eller 50 ng/ml TNF-α i kombinasjon med hypoksi (****p < 0,0001) sammenlignet med hypoksi alene (figur 3B). Disse eksperimentene demonstrerer allsidigheten og fysiologisk relevansen av å bruke apikale enteroider i en kostnadseffektiv og grei NEC-in-a-dish-modell.

Figure 1
Figur 1: Bekreftelse av apikal fenotype og morfologiske effekter av lipopolysakkarid (LPS), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og hypoksi. Representativ immunhistokjemisk farging av 3D apikale enteroider for enterocyttbørstekant og adherens junctionproteiner etter 24 timer. (A) Kontroll, (B) hypoksi, (C) LPS (200 μg/ml), (D) TNF-α (50 ng/ml), (E) LPS (200 μg/ml) + hypoksi, (F) TNF-α (50 ng/ml) + hypoksi. Skalalinje = 50 μm for hvert bilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Kvantifisering av fargeintensitet for børstekant og adherens junctionproteiner etter 24 timer lipopolysakkarid (LPS), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og hypoksibehandlinger. (A) Villin (rød) nivåer sammenlignet mellom behandlinger; a = p < 0,0001 sammenlignet med kontroll; b = p < 0,05 sammenlignet med kontroll; c = p < 0,0001 sammenlignet med hypoksi; d = p < 0,05 sammenlignet med hypoksi; e = p < 0,001 sammenlignet med TNF-α; f = p < 0,01 sammenlignet med LPS + hypoksi; g = p < 0,0001 sammenlignet med LPS; og (B) E-cadherin (grønne) nivåer sammenlignet mellom behandlinger; a = p < 0,0001 sammenlignet med kontroll; b = p < 0,0001 sammenlignet med hypoksi; c = p < 0,01 sammenlignet med LPS; d = p < 0,01 sammenlignet med TNF-α; e = p < 0,05 sammenlignet med LPS + hypoksi. Signifikans ble vurdert ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA) med Tukeys test for posthoc-analyse, presentert som gjennomsnittlig ± standardfeil i gjennomsnittet (SEM) (n ≥ 7/gruppe). Kontroll representerer normoksi med PBS som kjøretøykontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Effekt av lipopolysakkarid (LPS), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og hypoksi på apikal-ut celle levedyktighet. Levedyktigheten til 3D apikale enteroider behandlet med LPS (200 μg / ml) eller TNF-α (50 ng / ml) i 24 timer under (A) normoksiske eller (B) hypoksiske forhold ble målt via luminescens. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA) med Tukeys test for post-hoc-analyse. Enteroider behandlet med LPS (200 μg/ml) og TNF-α (50 ng/ml), i kombinasjon med hypoksi, var signifikant mindre levedyktige sammenlignet med hypoksi alene, sett her med økt luminescens. LPS (200 μg/ml) eller TNF-α (50 ng/ml), under normoksiske forhold, skilte seg ikke fra kontroll. Data er presentert som gjennomsnittlig ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM), n = 8/gruppe, **** p < 0,0001. Kontroll representerer normoksi med PBS som kjøretøykontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: Morfologi av tredimensjonale enteroider. (A) Mens basolaterale enteroider domineres av utseendet til et stort og åpent sentralt lumen, med eller uten spirende, (B) apikale enteroider er preget av et tett, cellulært utseende. Skalalinje = 100 μm for hvert bilde. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nylige utviklingen av enteroidmodeller avledet fra tarmepitelkrypter muliggjør et mer fysiologisk relevant in vitro-vev for å studere nekrotiserende enterokolittpatogenese. Til tross for å inkludere alle store differensierte celletyper i tarmepitelet, er 3D-enteroider fortsatt underlagt flere signifikante begrensninger. De konvensjonelle, basolaterale ut-enteroidene suspenderes i 3D ECM-hydrogelkupler, hvis sammensetning og tetthet kan begrense normal diffusjon i vevskulturmiljøet39. Det er viktig at disse enteroidene gir begrenset tilgang til den apikale overflaten av celler, som er overflaten som in vivo vil interagere med luminale bakterier og antigener, slik som enterocytt TLR4-binding av LPS.

Mens patofysiologien til NEC forblir uklar, antas økt uttrykk og aktivering av apikal TLR4 i det premature tarmepitelet å spille en fremtredende rolle40. Nedstrøms for TLR4-aktivering, økt intestinal permeabilitet, redusert epitelreparasjon og bakteriell translokasjon resulterer i en dysfunksjonell tarmbarriere, noe som fører til nekrose av tarmen2. Denne inflammatoriske syklusen i den distale tarmen hos premature spedbarn antas å stamme fra tarmlumenet, som initierer på den apikale overflaten av enterocytter. Modeller som benytter basolaterale 3D-enteroider i mekanistiske studier som involverer bakteriell translokasjon av tarmepitelet, rekapitulerer derfor ikke in vivo patogenese slik det nå forstås og vil sannsynligvis gi suboptimal informasjon.

Her beskriver vi etableringen av en apikal-ut NEC-in-a-dish-modell, noe som gir enkel tilgang til den apikale overflaten av enteroidceller og antagelig resulterer i en mer fysiologisk relevant modell sammenlignet med konvensjonelle 3D basolaterale enteroider. Polaritetsreverseringen i disse enteroidene gjør det mulig for potensielle oralt administrerte terapier å bare legges til media og tas opp naturlig av enterocytter, som ville forekomme in vivo. Denne tilnærmingen krever ikke dyre og teknisk utfordrende teknikker, for eksempel mikroinjeksjon, og er mer ressursvennlig enn etablering av 2D-monolag eller gut-on-a-chip-modeller.

Våre representative resultater indikerer apikale enteroider utsatt for LPS eller TNF-α, i kombinasjon med hypoksi, lider redusert levedyktighet, forstyrret epitelarkitektur og en reduksjon i adherens junction proteinuttrykk sammenlignet med kontroll, eller sammenlignet med hypoksi eller inflammatorisk mediatorbehandling alene, etterligner de kjente egenskapene til in vivo NEC. Forstyrrelse av adherens junctions, kritisk for tarmepitelbarrierefunksjon41, er rapportert i NEC42,43. Stram kryss arkitektonisk forstyrrelse, som også er viktig i NEC44, skjedde sannsynligvis også, selv om disse endringene vil bli evaluert i fremtidige studier. I et fysiologisk oversettbart vev tillater denne dual-hit-modellen studiet av premature tarmresponser på faktorer som er iboende for NEC, samtidig som det gir en plattform der potensielt nye terapeutiske mål kan identifiseres. Fremtidige studier kan utvide anvendelsen av apikale enteroider utover NEC til studier fokusert på parasittiske, bakterielle eller virusinfeksjoner31,32, vertsmikrobiominteraksjoner 45 og gastrointestinal absorberende funksjon 46, men innenfor den fysiologiske konteksten til det premature spedbarnet.

Denne protokollen for apikal-ut NEC-in-a-dish inneholder flere kritiske trinn som garanterer vektlegging. Sammensetningen og friskheten av cellekulturmediene er viktig for å unngå overdreven langsgående variabilitet i eksperimenter og sikre at enteroider er sunne før eksperimentell behandling. På samme måte bør lagerløsninger av TNF-α og LPS aliquoted og lagres ved -80 °C for å unngå overdreven fryse-/tinesykluser og bevare optimal aktivitet. Til slutt bør det tas hensyn til at all ECM er oppløselig under EDTA / PBS-inkubasjonen. Ufullstendig fjerning av ECM kan føre til at enteroider ikke klarer å reversere polariteten. Om nødvendig kan inkubasjonsperioden forlenges til 1,5 timer for å sikre fullstendig fjerning av matrisen.

Selv om denne apikale NEC-in-a-dish-modellen er kostnadseffektiv og grei, er metoden underlagt flere begrensninger. Apical-out NEC-in-a-dish er ikke like fysiologisk relevant som gut-on-a-chip-modeller28,29, men representerer et mellomliggende alternativ der og når chipalternativer ikke er tilgjengelige. I tillegg, som en suspensjonskultur, må enteroider samles, pelleteres og resuspenderes for medieendringer, og legger til et sentrifugeringstrinn til en ellers enkel prosess. En annen begrensning er levetiden til apikale enteroider, da de generelt anses som egnet bare for endepunktsanalyser. Siden basolaterale vekstfaktorreseptorer ikke lenger er i konstant kontakt med medievekstfaktorer, er apikale enteroider preget av redusert proliferasjon sammenlignet med basolaterale enteroider, noe som resulterer i den relative manglende evne til å passere apikale kulturer31,32. I tillegg er det ikke kjent om den nøyaktige sammensetningen, inkludert de relative proporsjonene, av celletyper er representert i enteroider sammenlignet med in vivo vev, men studier tyder generelt på mindre forskjeller31,32. Til slutt kan 24-timers utviklingen av denne apikale NEC-in-a-dish-modellen, selv om den er praktisk, være relativt kort sammenlignet med in vivo formelbaserte NEC-modeller47, som potensielt krever ytterligere standardisering hvis lengre perioder med intervensjon er ønsket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre og har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. HC støttes av tilskudd P20GM134973 fra National Institutes of Health. KB støttes av et Children's Hospital Foundation (CHF) og Presbyterian Health Foundation (PHF) stipend. Vi takker laboratoriet for molekylærbiologi og cytometriforskning ved OUHSC for bruken av kjernefasiliteten, som ga konfokal avbildning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), Baltimore, Md. 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).

Tags

Medisin utgave 184
<em>In vitro </em> Apical-Out Enteroid Modell av nekrotiserende enterokolitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter