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Neuroscience

Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64024
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

O protocolo demonstra que, realizando microtransplante de membranas sinápticas em oócitos Xenopus laevis , é possível registrar respostas consistentes e confiáveis de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropônico e receptores de ácido γ-aminobutírico.

Abstract

Receptores ionotrópicos excitatórios e inibitórios são os principais portões de fluxos de íons que determinam a atividade de sinapses durante a comunicação neurológica fisiológica. Portanto, alterações em sua abundância, função e relações com outros elementos sinápticos têm sido observadas como uma grande correlação de alterações na função cerebral e comprometimento cognitivo em doenças neurodegenerativas e transtornos mentais. Entender como a função dos receptores sinápticos excitatórios e inibitórios é alterada pela doença é de fundamental importância para o desenvolvimento de terapias eficazes. Para obter informações relevantes sobre doenças, é importante registrar a atividade elétrica de receptores neurotransmissores que permanecem funcionais no cérebro humano doente. Até agora esta é a abordagem mais próxima para avaliar alterações patológicas na função dos receptores. Neste trabalho, é apresentada uma metodologia para realizar a microtransplantação de membranas sinápticas, que consiste em reativar membranas sinápticas a partir de tecido cerebral humano congelado que contém receptores humanos, por sua injeção e fusão posterior na membrana de oócitos Xenopus laevis . O protocolo também fornece a estratégia metodológica para obter respostas consistentes e confiáveis dos receptores α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA) e γ-aminobutírico (GABA), bem como novos métodos detalhados que são usados para normalização e análise rigorosa de dados.

Introduction

Distúrbios neurodegenerativos afetam grande parte da população. Embora suas consequências devastadoras sejam bem conhecidas, a ligação entre as alterações funcionais dos receptores neurotransmissores, que são críticas para a função cerebral, e sua sintomatologia ainda é mal compreendida. A variabilidade inter-individual, a natureza crônica da doença e o início insidioso dos sintomas são apenas algumas das razões que atrasaram a compreensão das muitas doenças cerebrais onde os desequilíbrios químicos estão bem documentados 1,2. Modelos animais geraram informações inestimáveis e expandiram nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à fisiologia e à fisiopatologia em sistemas conservados evolutivos; no entanto, várias diferenças entre roedores e humanos impedem a extrapolação direta da função receptora de modelos animais para o cérebro humano3. Assim, os esforços iniciais para estudar receptores humanos nativos foram desenvolvidos pelo laboratório de Ricardo Miledi utilizando tecido removido cirurgicamente e amostras congeladas. Esses experimentos iniciais utilizaram membranas inteiras que incluem receptores sinápticos neuronais e extra-sinápticos, bem como receptores neurotransmissores não neuronais, e embora forneçam informações importantes sobre estados doentes, há uma preocupação de que a mistura de receptores complica a interpretação dos dados 4,5,6,7. É importante ressaltar que as sinapses são o principal alvo em muitas doenças neurodegenerativas 8,9; portanto, ensaios para testar as propriedades funcionais das sinapses afetadas são fundamentais para obter informações sobre mudanças relevantes para a doença que afetam a comunicação sináptica. Aqui, descreve-se uma modificação do método original: microtransplantação de membranas sinápticas (MSM), que se concentra na caracterização fisiológica de preparações de proteína sináptica enriquecida e foi aplicada com sucesso para estudar sinapttos de ratos e humanos 10,11,12,13,14,15 . Com essa metodologia, é possível transplantar receptores sinápticos que antes trabalhavam no cérebro humano, embutidos em seus próprios lipídios nativos e com sua própria coorte de proteínas associadas. Além disso, como os dados do MSM são quantitativos, é possível usar esses dados para se integrar com grandes conjuntos de dados proteômicos ou sequenciamento10.

É importante notar que muitas análises farmacológicas e biofísicas de receptores sinápticos são feitas em proteínas recombinantes16,17. Embora essa abordagem forneça uma melhor visão das relações estrutura-função dos receptores, não pode fornecer informações sobre complexos receptores multimédicos encontrados nos neurônios e suas mudanças na doença. Portanto, uma combinação de proteínas nativas e recombinantes deve fornecer uma análise mais abrangente dos receptores sinápticos.

Existem muitos métodos para preparar sinapstos 10,11,12,13,14,15 que podem ser ajustados para os requisitos de um laboratório. O protocolo começa com a suposição de que as preparações enriquecidas sinaptosômicas foram isoladas e estão prontas para serem processadas para experimentos de microtransplante. No laboratório, o método Syn-Per é usado seguindo as instruções do fabricante. Isso é feito por causa da alta reprodutibilidade em experimentos eletrofisiológicos10,11. Há também literatura abundante explicando como isolar xenopus oócitos18,19, que também podem ser comprados prontos para injeção20.

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Protocol

Todas as pesquisas são realizadas em conformidade com as diretrizes institucionais e aprovadas pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia Irvine (IACUC-1998-1388) e do Ramo Médico da Universidade do Texas (IACUC-1803024). O córtex temporal de um cérebro não-Alzheimer (da mulher, 74 anos, intervalo pós-morte 2,8 h) e um cérebro de D.C.(feminino, 74 anos, intervalo pós-morte 4,5 h) foram fornecidos pelo Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer irvine da Universidade da Califórnia (UCI-ADRC). O consentimento informado para a doação cerebral foi obtido pela UCI-ADRC.

NOTA: O tecido cerebral humano não fixado deve ser tratado como uma fonte de patógenos transmitidos pelo sangue (BBP). Assim, o treinamento bbp é necessário antes do início dos experimentos. Este protocolo é realizado em um laboratório de biossegurança nível 2 (BSL2) sob os requisitos BSL2. As diretrizes e precauções dentro do laboratório incluem: sem alimentos ou bebidas permitidas em laboratório, boas práticas laboratoriais devem ser seguidas, equipamentos de proteção individual (luvas, vestido, sem sapatos de dedo aberto) e a porta deve ser fechada o tempo todo.

1. Preparação de microinjeção de oócito xenopus

  1. Para fazer agulhas de injeção, puxe tubos de borossilicato de 3,5 polegadas usando um puxador de micropipette. Uma vez que as agulhas de microinjeção são puxadas, use um microscópio e uma lâmina de barbear para cortar o suficiente da ponta da agulha para que a microinjeção possa ser realizada (geralmente entre 2-3 mm).
    NOTA: O comprimento da ponta da agulha para cortar pode variar.
  2. Prepare a solução da 1x Barth adicionando 200 mL de Solução de Estoque barth (5x) a 800 mL de água destilada. Encha uma placa de cultura de tecido fundo plano de 24 poços com a solução de 18 °C 1x Barth.
    1. Prepare a solução de ações da Barth 5x da seguinte forma. Em 1 L de água destilada, adicionar 25,71 g de NaCl (cloreto de sódio), 0,372 g de KCl (cloreto de potássio), 0,301 g de CaCl2 (díclodo de cálcio), 0,389 g de Ca(NO3)2(4H2O) (tetrahidrato de nitrato de cálcio), 1,01 g de MgSO4(7H2O) (heptahydrate de sulfato de magnésio), 1,008 g de NaHCO3 (bicarbonato de sódio), e 11,91 g HEPES (4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanethanesulfonic ácido).
  3. Isole os oócitos xenopus usando os protocolos descritos em18,19 e usando estereoscópio ampliado 2x, selecionando oócitos de aparência saudável, oócitos v-VI estágio. Coloque cerca de 10 oócitos por poço e use um dos poços para abrigar oócitos não injetados para serem usados como células de controle na realização de gravações.
  4. Recupere uma pequena placa de Petri, 1 cm de altura e 6 cm de diâmetro, e coloque a malha de nylon dentro para que cubra a parte inferior do prato. Em seguida, despeje 15 mL da solução 1x Barth a ser usada para a realização de microinjeções dos oócitos.
  5. Coloque um nanoinjetor ao longo da linha média da plataforma de microscópio. Gire o ímã para a posição Off e mova lentamente o nanoinjetor para a posição desejada enquanto o suporta cuidadosamente. Quando o nanoinjetor estiver devidamente posicionado, gire o ímã de volta para a posição totalmente On e certifique-se de que ele está seguro.
  6. Para um tamanho amostral de 50,6 nL, use as seguintes configurações na lateral do nanoinjetor: 1 é D (para baixo), 2 é D, 3 é U (para cima), 4 é D, e 5 é U. Posicione um pedaço de termoplástico auto-vedante, ou tampa do tubo de microcentrífuga, no suporte do microscópio, alinhando-o com a trajetória do nanoinjetor.
    NOTA: 50 nL está perto da quantidade máxima de material injetado que o citoplasma pode suportar21.
  7. Encha uma seringa de insulina cerca de metade do seu volume com óleo mineral (cerca de 0,5 mL/cc). Usando esta seringa, encha a agulha de microinjeção com óleo mineral. Certifique-se de que uma gota de óleo visível seja vista na ponta da agulha.
  8. Exponha o êmbolo nanoinjetor a um mínimo de 1-2 cm. Faça isso segurando o botão VAZIO até que o êmbolo esteja visível no comprimento desejado. Uma vez que o êmbolo esteja exposto, coloque lentamente e cuidadosamente a agulha de vidro de microinjeção preenchida com óleo mineral no êmbolo nanoinjetor, e certifique-se de que ele se encaixa bem através do anel O de resistência negra e pára no anel de resistência branca. Certifique-se de não dobrar o êmbolo nanoinjetor no processo.
  9. Uma vez que a agulha de vidro de microinjeção esteja segura e no lugar, pressione ESVAZIAR para anular quaisquer bolhas de ar potenciais. Suavemente, com um tecido de papel, limpe o excesso de óleo mineral.

2. Carregando a amostra

  1. Preparar preparações enriquecidas sinapstosômicas (amostras) da região de interesse do cérebro humano, conforme descrito em 10,11,12,13,14,15, e armazená-los em alíquotas de cerca de 5 μL a -80 °C até o momento da injeção.
  2. Antes da injeção, transfira a alíquota para gelo molhado e mantenha-a no gelo o tempo todo, exceto por sônica e recuperação. O número e os tipos de amostras serão determinados pelo desenho experimental.
  3. Sonicar as amostras selecionadas 3x em um banho com gelo molhado flutuante para evitar o aquecimento da amostra. Use ciclos de 5 s cada vez, esperando 1 min em gelo molhado entre os ciclos.
  4. Coloque 1 μL de amostra no termoplástico. Faça uma internação na superfície, se necessário, antes da colocação da amostra para evitar o movimento da amostra.
  5. Use os botões do manipulador segurando o nanoinjetor para posicionar a agulha e movê-la em direção à amostra a ser preenchida. Uma vez que a ponta da agulha esteja na amostra, pressione e segure o botão FILL até que a amostra suficiente seja colhida. Cerca de 0,5 μL é necessário para 10 oócitos. Usando os botões, mova a agulha do nanoinjetor de volta para a posição mais alta.

3. Injetando os oócitos

NOTA: As membranas sinapstosômicas do córtex de rato padronizado também são injetadas em todos os experimentos em um conjunto de oócitos para medir mudanças na capacidade de fusão entre diferentes lotes de oócitos.

  1. Coloque oócitos selecionados na pequena placa de Petri que tem a malha de nylon e a solução de Barth (cerca de 10 oócitos). Organizar oócitos para que eles não estejam em cima um do outro; isso será útil durante o processo de injeção.
  2. Usando os botões do manipulador segurando o nanoinjetor, mova a agulha em direção aos oócitos. Uma vez que a agulha esteja submersa na solução do Barth, use o pedal do pé para o nanoinjetor para ter certeza de que a agulha de microinjeção está liberando a amostra. Se a amostra estiver sendo liberada, será visível a partir da visualização do microscópio.
  3. Uma vez que esteja confiantemente estabelecido que a amostra está sendo liberada, passe para microinjetar o oócito. Se a amostra não estiver sendo liberada, repita o processo de enchimento da agulha.
  4. Penetre o oócito logo abaixo da superfície com a agulha, não mais fundo, e use o pedal do pé para injetar a amostra. O pedal do pé fará um sinal sonoro quando a amostra for liberada. Espere cerca de 2-3 s. Se a injeção foi bem sucedida, a célula se expandirá. Uma vez que isso aconteça, use os botões no manipulador para sair da célula.
    NOTA: A fusão de membranas no oócito é um processo polarizado; portanto, o oócito deve ser injetado no lado animal da célula, de preferência acima do equador, com o ângulo da agulha em direção ao lado animal para maximizar a fusão da membrana.
  5. Mova a placa de Petri para que o próximo oócito esteja alinhado com a agulha e repita o processo até que todos os oócitos no prato tenham sido injetados. Repita este processo até que o número desejado de oócitos tenha sido injetado. Certifique-se de que um poço de oócitos seja deixado sem injeção para ser usado como controle.
  6. Uma vez injetados todos os oócitos, retraia o nanoinjetor à sua posição original e remove a agulha.

4. Registro de correntes de íons usando um grampo de tensão de dois eletrodos

  1. Para fazer duas agulhas de grampo de tensão de eletrodo (TEVC), puxe tubos de vidro borossilicato polidos de fogo de 15 cm de comprimento usando o puxador de micropipette. Uma vez que a puxar esteja completa, encha com 3 M KCl usando agulhas capilares longas, ou, alternativamente, submergir e ferver as agulhas em solução de 3 M KCl por 15 minutos sob um vácuo contínuo. A alta temperatura ajuda no enchimento dos eletrodos e na remoção de bolhas de ar.
    1. Prepare uma solução de preenchimento de eletrodo de 3 M KCl usando KCl na forma cristalina e água desionizada, e seguindo essas etapas cuidadosamente para que o potencial de referência dos eletrodos não seja alterado. Seque o KCl cuidadosamente em um forno por 2-3 h. Utilizando um equilíbrio analítico, pesar cuidadosamente 223,68 g de KCl. Transfira o KCl para uma garrafa de vidro 1 L. Use esta solução para clorato de fios de eletrodo prateado.
      NOTA: Para puxar eletrodos de vidro, o livro de receitas de pipeta pode ser baixado aqui: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. Ligue todos os equipamentos utilizados para o registro de correntes de íons: sistemas principais, válvulas de solução, luz de microscópio, sistemas de válvulas, grampo de oócito e sistema de vácuo. Ligue o computador de mesa, faça login no WinEDR V3.9.1.1.e certifique-se de que o programa esteja em execução e que os valores de configuração estejam corretos da seguinte forma: gravar em disco, definir a duração da gravação e limpar a opção do simulador.
    1. Forneça os seguintes valores de configuração iniciais para o amplificador: para seção de eletrodo de tensão (Vm), desligue a compensação negativa da capacidade (-C); para a seção de eletrodos de banho (Im), defina o interruptor seletor de ganhos (variam de 0,1 a 10) em 10, e o interruptor de alternador de três posições que seleciona o multiplicador de ganhos (x0.1, x1.0 e x10), em x1.0. As luzes LED indicarão a seleção multiplicadora de ganhos; para seção de grampo, desligue o seletor do modo de fixação, defina o controle de ganho dc para IN e o controle de ganho de largura de banda completa de loop aberto (faixa 0 a 2000) para cerca de 1200; para comandos, fixado em 40mV e definir os controles de resarndo negativo e multiplicador de escala para estar em x2; para eletrodo atual, use o deslocamento ve para estabelecer uma referência zero antes de empalar o oócito.
    2. Para gravar, abra o software WinEDR V3.9.1, vá para o menu superior e selecione Arquivo > Abra novo arquivo. Crie sua própria pasta e salve o arquivo.
    3. Em seguida, no menu principal selecione Gravar > gravar para disco. Quando os dois eletrodos estiverem dentro do oótlito, ligue o ringer no controlador da válvula VC-8 e gire o grampo para Retardar no amplificador OC-725C. Em seguida, volte para o software WinEDR e selecione Gravar no canto superior esquerdo da tela.
    4. No gráfico de marcação no canto inferior esquerdo, anote seu potencial inicial de membrana e pressione Enter. À medida que o experimento continua, você pode escrever o nome das drogas que estão sendo usadas. Uma vez que o experimento acabou, selecione Parar no canto superior esquerdo da tela.
      NOTA: Usamos o software WinEDR ou WinWCP para executar o TEVC porque estes são gratuitos e adequados para experimentos, mas qualquer outro software disponível pode ser usado.
  3. Coma todas as soluções de medicamentos necessárias para realizar o experimento (por exemplo, GABA, Kainate) e confirmar que as válvulas de solução estão funcionando corretamente ligando-as e desligando-as e observando o deslocamento das válvulas de beliscão.
  4. Encha os tubos despejando a solução correspondente no recipiente de seringa conectado ao tubo e rotule o controlador da válvula para se correlacionar com os tubos da solução. Certifique-se de que o fluxo da solução é constante, não há bolhas e que o sistema de vácuo está funcionando corretamente.
  5. Configure o microscópio e a área da câmara de gravação. Coloque as pontes de ágar (veja abaixo) nos respectivos orifícios circulares atrás da câmara de gravação (distal da área de manuseio), conectando os poços para os eletrodos usados como referência de solo e a câmara de gravação. Adicione a solução de trabalho do Ringer (1x) à câmara de gravação e aos poços de eletrodos de referência de solo.
    1. As pontes de ágar são tubos de borossilicato em forma de U, de 2-3 cm de comprimento, preenchidos com 3% de ágar na solução de Ringer. Faça tubos em forma de U cortando tubos de 15 cm de comprimento, dobrando-os na chama aberta e, em seguida, enchendo-os com ágar quente de 3% usando uma seringa de insulina. Armazene pontes de ágar cheias na solução de Ringer na geladeira até o uso.
    2. Faça 20x a solução de estoque da Ringer da seguinte forma: Em 1 L de água destilada, adicione 134,4 g de NaCl, 2.982 g de KCl, 5,29 g de CaCl2 e 23,83 g de HEPES (4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanethanesulfonic ácido). Para a solução de trabalho da Ringer 1x, em um frasco volumoso, adicione 200 mL da solução de estoque da Ringer (20x) a 3.800 mL de água destilada.
  6. Prepare eletrodos de prata clorados antes de cada experimento por eletrólise colocando fios de prata na solução de 3 M KCl e conectando o eletrodo de prata ao terminal positivo de uma bateria de 9 V. Depois de cerca de 3 min uma camada marrom sólida de AgCl é depositada no eletrodo. Coloque os fios de eletrodo de prata clorado na carcaça do eletrodo.
    NOTA: A referência do solo e a gravação de eletrodos clorados são eletrodos de prata/cloreto de prata (Ag/AgCl).
  7. Remova as agulhas de borossilicato da solução KCl. Use uma seringa para extrair uma pequena quantidade de solução KCl da extremidade aberta da agulha de eletrodo e substituir a solução KCl por óleo mineral; isso evitará a evaporação da água e mudanças na concentração de KCl dentro da agulha. Deslize a agulha de vidro sobre o fio de eletrodo de prata clorado e aperte-as no lugar.
  8. Usando os manipuladores direito e esquerdo segurando os eletrodos, guie as agulhas de eletrodo para a câmara de gravação que está cheia de Solução de Ringer.
  9. Verifique a resistência de cada eletrodo zerando os botões de deslocamento Vm e Ve e, em seguida, pressionando os botões de teste de eletrodo . A resistência deve ser entre 0,5-3 MΩ (lida diretamente como 5-30 mV na tela). Se a resistência estiver fora do alcance, substitua usando novos microeletros.
  10. Encha a câmara de gravação com a solução fresca de Ringer. Usando uma pipeta de vidro, coloque um oócito não injetado ou microtransplantado no centro da câmara de gravação. Certifique-se de que o oócito esteja claramente visível sob o microscópio, com o lado animal para cima (consulte NOTA na etapa 3.4).
  11. Guie o eletrodo para a solução do Ringer até que toquem a membrana oócito. Furar suavemente a membrana oócito no lado animal (ver NOTA na etapa 3.4) com ambos os eletrodos e registrar o potencial da membrana de repouso. Ligue o fluxo de solução do Ringer.
  12. Utilizando o amplificador de grampo oócito, altere o modo para Grampo de Tensão e ajuste a tensão de retenção de -80 mV. A corrente no monitor deve ser negativa, geralmente entre 0 e 0,4 microamperes.
  13. Crie um novo arquivo para salvar a gravação como Arquivo > Nova > Salve a Gravação no software. Comece a gravar, pressione gravar > gravar para disco. Adicione informações relevantes ao arquivo usando a caixa de marca de diálogo (nome do teste, drogas usadas, etc.).
  14. Aplique agonistas (por exemplo, GABA, glutamato ou kainate) para estimulação química, abrindo as válvulas e perfundiando-as na câmara de gravação por 15 s. Normalmente, use um ganho de 10x para traçar o número máximo de pontos e reconstruir a resposta. Se as correntes forem muito pequenas, aumente a amplificação ou ganho, para que sejam avaliadas e visíveis. Sempre anote essas mudanças.
    NOTA: A duração da perfusão depende do paradigma experimental. Se o objetivo principal é medir a amplitude máxima, 15 s serão suficientes para atingir o pico para GABA ou o planalto para kainate.
  15. Monitore sempre os níveis de solução. A solução do Ringer precisará ser reabastecida com frequência, pois é usada entre todos os usos da solução. Uma vez concluída a gravação, gire o grampo de tensão para a posição OFF e desligue a válvula de solução do Ringer. Remova o oócito. Pare de gravar e salve o arquivo. Repita estes passos para todos os oócitos injetados.

5. Analisando gravações de TEVC

  1. Guarde uma cópia das gravações em uma unidade USB. A partir daí, abra o arquivo desejado para ser analisado. No arquivo que abre, a gravação pode ser visualizada, marcada e medida. A análise mais comum inclui medição de amplitude máxima, tempo de ativação, dessensibilização e resumo de aplicações repetitivas.
  2. Meça a resposta máxima do AMPA e a resposta máxima do GABA. Para adquirir essas medidas, primeiro estabeleça um nível zero ou linha de base, encontrando a linha vermelha com o cursor e arrastando-a para a corrente gerada pelo aplicativo Ringer ou linha de base.
  3. Uma vez estabelecido o nível zero, determine as medidas de resposta usando o mouse para arrastar o cursor de leitura vertical e verde para a parte desejada do rastreador gráfico. Se quiser, exporte os traços a serem analisados em qualquer outro software preferencial
    NOTA: Se o nível zero não puder ser definido ou houver muito ruído indicado no rastreador, exporte o arquivo WinEDR para um software analítico offline, que permitirá modificações para fornecer uma linha de base de nível e a adição de filtros a fim de reduzir o ruído.

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Representative Results

Poucas horas após a injeção, as membranas sinápticas, carregando seus receptores neurotransmissores e canais de íons, começam a se fundir com a membrana plasmática oócica. A Figura 1 mostra gravações de receptores AMPA e GABAA microtransplantados em oócitos xenopus. Para a maior parte da análise, as respostas de dois ou três oócitos por amostra foram medidas, utilizando dois ou três lotes de oócitos de diferentes sapos, para um total de seis a nove oócitos por amostra. Isso é feito para que uma grande coorte de sujeitos humanos observe diferenças de grupo. A análise é simples e mede a amplitude das respostas. É importante ressaltar que a fusão das membranas transplantadas é um processo polarizado, portanto a seleção do local da injeção é muito importante. A injeção no hemisfério vegetal ou no equador dá resultados consistentes, com todos os oócitos injetados inserindo receptores e gerando correntes de íons que seguem uma distribuição unimodal22. Curiosamente, quando as membranas foram inicialmente injetadas no polo animal, as respostas oócitos seguiram uma distribuição bimodal: um grupo de oócitos não tinha nenhuma ou respostas muito baixas, enquanto o outro grupo tinha respostas grandes, ainda maiores do que as dos oócitos injetados no polo vegetal ou no equador. Para determinar se alguns dos oócitos injetados no polo animal tiveram baixas respostas porque as membranas humanas estavam sendo injetadas e presas dentro do núcleo do oócito, uma mistura de membranas isoladas do órgão elétrico do Torpedo e da codificação cDNA para a subunidade GABAρ1 foi injetada no polo do lado animal. Os receptores nicotínicos das membranas torpedo mostraram uma ativação rápida e rápida dessensibilização durante a perfusão da acetilcolina23, enquanto a subunidade ρ1 forma receptores homomédicos GABAρ1 que não dessensibilizam durante a perfusão contínua do GABA 24,25,26,27. Se a amostra co-injetada foi acidentalmente entregue no núcleo e não no citoplasma, então o cDNA seria transcrito em RNA e traduzido em receptores GABAρ1 funcionais. A Figura 2 mostra que quando a injeção foi direcionada ao núcleo, oócitos com altas respostas à acetilcolina não expressaram receptores GABAρ1; inversamente, oócitos com resposta zero ou baixa aos receptores GABA expressos de acetilcolina. Os resultados deste experimento indicam, em primeiro lugar, que em oócitos de baixa resposta, as membranas foram acidentalmente depositadas no núcleo do oócito; segundo, a injeção de membranas torpedo no núcleo não interfere muito com a transcrição de ρ1 cDNA. Alguns oócitos co-injetados tiveram grandes respostas tanto à acetilcolina quanto ao GABA, sugerindo ruptura do núcleo durante a injeção. A maior inserção de membranas transplantadas no hemisfério animal do oócito espelha a localização polarizada dos receptores neurotransmissores heterologos expressos 26,28. Portanto, injetando no hemisfério animal sem mirar o núcleo, é possível obter respostas maiores. Isso é importante para estudar espécimes com baixa densidade de receptores, por exemplo, a partir do tecido da doença de Alzheimer (DA) com baixo número de receptores (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Correntes representativas de oócitos. Foram registradas correntes de íons de oócitos injetados com membranas de receptores sinápticos humanos. Os receptores AMPA foram ativados com 100 mM Kainate, e receptores GABAA com 1 mM GABA. VH = -80 mV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Co-injeção de Torpedo e GABAρ1. Co-injeção de membranas filtradas (0,1 μm) do órgão elétrico do Torpedo, rico em receptores de acetilcolina, e codificação cDNA para o receptor GABAρ1 no polo animal produziram principalmente dois grupos de oócitos com base em suas respostas: um grupo de oócitos (A) teve grandes respostas à acetylcolina (Ach; 1 mM), mas nenhuma resposta a 1 μM GABA (tensão presa a -80 mV), e oócitos no grupo (B) tiveram respostas nulas ou baixas ao ACh, mas grandes respostas ao GABA. (C) Gráfico mostra erro médio ± de média (SEM) de corrente máxima no grupo 1 (n = 5 oócitos) e grupo 2 (n = 11 oócitos). Um oócito no grupo 2 tinha grandes respostas GABA e ACh sugerindo ruptura do núcleo; consequentemente, a distribuição das respostas foi distorcida a valores baixos, conforme observado pela diferença entre média e mediana da distribuição da corrente de membrana (22 nA vs 6 nA). Este resultado indica que uma das causas dos oócitos de baixa resposta é que as membranas estão sendo injetadas e presas no núcleo do oócito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Inserção polarizada de membranas celulares em oócitos xenopus . Respostas GABA e kainate de oócitos injetados nos polos animais ou vegetais, com membranas não filtradas obtidas de um cérebro não-AD (fêmea, 74 anos, intervalo pós-morte 2,8 h) e um cérebro de ÁD (fêmea, 74 anos, intervalo pós-morte 4,5 h). Os oócitos injetados perto do polo animal, sem atingir o núcleo, deram respostas maiores do que os oócitos injetados no polo vegetal, permitindo assim o estudo de amostras de tecido com número muito baixo de receptores. Teste t do aluno entre polos vegetais e animais: ** p < 0,01, *** p < 0,001, Barras indicam média ± SEM de pico de corrente, n = 5 oócitos cada coluna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A análise de complexos proteicos nativos do cérebro humano é necessária para entender processos homeostáticos e patológicos em distúrbios cerebrais e desenvolver estratégias terapêuticas para prevenir ou tratar doenças. Assim, os bancos cerebrais contendo amostras congeladas instantâneas são uma fonte inestimável de uma grande e principalmente inexplorada riqueza de informações fisiológicas29,30. Uma preocupação inicial para o uso do tecido pós-morte é a clara possibilidade de mRNA ou degradação proteica que pode confundir a interpretação dos dados. Por exemplo, o pH do cérebro mostra consistentemente uma correlação positiva com a quantificação do mRNA por pcr em tempo real quantitativo, e essa correlação é independente da patologia31. Diferenças entre sujeitos do pH podem levar a diferenças de quantificação de mRNA com grandes variâncias que podem obscurecer a interpretação dos resultados32. Curiosamente, apesar da menor quantificação das transcrições de mRNA à medida que o pH acidifica, as covariáveis entre as diferentes transcrições são mantidas33, fornecendo uma estrutura para a obtenção de perfil transcritos confiáveis de estados patológicos. É importante ressaltar que, embora o mRNA seja altamente degradável, as proteínas transmembranas no tecido pós-morte são muito resistentes à degradação34. Experimentos anteriores no laboratório demonstraram que os receptores GABA e glutamato do cérebro humano estão funcionais após intervalos pós-morte extremamente grandes35. Além disso, o método MSM permite medir diretamente os efeitos de potenciais fatores de confusão como pH no momento da morte, estado agonal e degradação de mRNA e proteína diretamente na função dos receptores, fornecendo assim formas de usar essas informações na análise e interpretação dos dados.

Modificações e solução de problemas da técnica
Como mencionado anteriormente, o MSM é uma pequena modificação do transplante original de membranas totais, que é um método amplamente validado e confirmado por muitos laboratórios em acadêmicos e na indústria farmacêutica 12,36,37,38,39,40. Por exemplo, a microtransplante de receptores foi importante no desenvolvimento do LY3130481 de Eli Lilly, que é um antagonista tarp gama-8-seletivo de receptores AMPA que mostra a seletividade da região cerebral12. O MSM segue o mesmo princípio de microtransplante utilizando preparações enriquecidas sinapstosômicas; portanto, ter boas preparações sinatosômicas é importante. Utilizamos o método Syn-Per porque os resultados obtidos com este procedimento são muito consistentes e a amplitude das correntes de íons se correlaciona muito bem com os níveis de proteínas sinápticas em experimentos proteômicos10. No entanto, a microtransplantação ou o MSM podem ser adaptados para estudar receptores de muitas fontes (por exemplo, membranas de insetos 38,39, neurolemma40) com excelentes resultados. Existem alguns distúrbios em que as sinapses são fortemente afetadas como a doença de Alzheimer, ou estão disponíveis em quantidades baixas; neste caso, a injeção das membranas no lado animal ajuda a obter correntes maiores. O aumento da quantidade de proteína injetada também aumenta a fusão das membranas e o tamanho das respostas. Embora exista uma correlação negativa entre a concentração de membranas injetadas e a sobrevivência dos oócitos, é possível encontrar uma concentração adequada de membranas que permita a análise experimental dada.

Limitações do MSM
O MSM é um método quantitativo desenvolvido para o estudo de receptores humanos ou canais de íons; portanto, é bem adequado para estudar tecido com disponibilidade limitada. Como os oócitos xenopus não têm glutamato endógeno ou receptores GABA, qualquer resposta ao GABA ou glutamato em oócitos microtransplantados vem dos receptores injetados que fundiram-se com a membrana dos oócitos. No entanto, uma limitação importante do MSM é o estudo de canais de íons ou transportadores que também são expressos endógenamente nos oócitos, uma vez que a separação das correntes de íons de canais/transportadores microtransplantados e endógenos é difícil. Estudos futuros que silenciam genes endógenos podem ser úteis com essa limitação.

A importância para os métodos existentes é que o MSM incorpora a membrana nativa com suas proteínas e receptores correspondentes e, portanto, proporciona um ambiente mais fisiológico para a análise. Verificou-se que as propriedades dos receptores em sua membrana nativa são retidas após o transplante para os oócitos, como observado nos receptores neurotransmissores AMPA-type GluR1, α7-AcChoRs, e α4β2-AcChoRs de células cultivadas41.

As aplicações futuras da técnica incluem o estudo das propriedades eletrofisiológicas de diferentes proteínas e receptores de interesse nas membranas de células e tecidos cultivados e não cultivados de cérebros humanos saudáveis e doentes.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIA/NIH R01AG070255 e R01AG073133 à AL. Agradecemos também ao Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer Irvine da Universidade da Califórnia (UCI-ADRC) por fornecer o tecido humano mostrado neste manuscrito. O UCI-ADRC é financiado pela concessão do NIH/NIA P30 AG066519.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon

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References

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Neurociência Edição 185
Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais
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Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).

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