Summary
이 프로토콜은 Xenopus laevis 난모세포로 시냅스 막의 미세 이식을 수행함으로써 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 및 γ-아미노부티르산 수용체의 일관되고 신뢰할 수 있는 반응을 기록할 수 있음을 입증한다.
Abstract
흥분성 및 억제성 이온성 수용체는 생리적 뉴런 소통 동안 시냅스의 활성을 결정하는 이온 플럭스의 주요 게이트이다. 따라서 다른 시냅스 요소와의 풍부함, 기능 및 관계의 변화는 신경 퇴행성 질환 및 정신 장애의 뇌 기능 및인지 장애의 주요 상관 관계로 관찰되었습니다. 흥분성 및 억제성 시냅스 수용체의 기능이 질병에 의해 어떻게 변화되는지를 이해하는 것은 효과적인 치료법의 개발을 위해 매우 중요하다. 질병 관련 정보를 얻으려면 병든 인간의 뇌에서 기능적으로 남아있는 신경 전달 물질 수용체의 전기 활동을 기록하는 것이 중요합니다. 지금까지 이것은 수용체 기능의 병리학 적 변화를 평가하는 가장 가까운 접근법입니다. 이 연구에서는 Xenopus laevis 난모세포의 막으로의 주사 및 후부 융합에 의해 인간 수용체를 포함하는 스냅 얼어 붙은 인간 뇌 조직에서 시냅스 막을 재활성화시키는 것으로 구성된 시냅스 막의 미세 이식을 수행하는 방법론이 제시됩니다. 이 프로토콜은 또한 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA) 및 γ-아미노부티르산(GABA) 수용체의 일관되고 신뢰할 수 있는 반응을 얻기 위한 방법론적 전략뿐만 아니라 정상화 및 엄격한 데이터 분석에 사용되는 새로운 상세한 방법을 제공한다.
Introduction
신경 퇴행성 장애는 인구의 많은 비율에 영향을 미칩니다. 그들의 파괴적인 결과는 잘 알려져 있지만, 뇌 기능에 중요한 신경 전달 물질 수용체의 기능적 변화와 증상 사이의 연관성은 여전히 잘 이해되지 않습니다. 개인 간 변동성, 질병의 만성 특성 및 교활한 증상 발병은 화학적 불균형이 잘 문서화 된 많은 뇌 질환에 대한 이해를 지연시킨 이유 중 일부일뿐입니다 1,2. 동물 모델은 귀중한 정보를 생성하고 진화 보존 시스템에서 생리학 및 병리 생리학의 기초가되는 메커니즘에 대한 지식을 확장했습니다. 그러나 설치류와 인간 사이의 여러 종 간 차이는 동물 모델에서 인간의 뇌로 수용체 기능의 직접적인 외삽을 배제합니다3. 따라서, 천연 인간 수용체를 연구하기 위한 초기 노력은 Ricardo Miledi의 실험실에서 외과적으로 제거된 조직과 동결된 샘플을 사용하여 개발되었다. 이 초기 실험은 신경 시냅스 및 여분의 시냅스 수용체뿐만 아니라 비 신경 전달 물질 수용체를 포함하는 전체 막을 사용했으며, 병든 상태에 대한 중요한 정보를 제공하지만 수용체의 혼합이 데이터 4,5,6,7의 해석을 복잡하게 만들 우려가 있습니다. 중요하게도, 시냅스는 많은 신경퇴행성 장애에서 주요 표적이다 8,9; 따라서 영향을받는 시냅스의 기능적 특성을 테스트하기위한 분석은 시냅스 통신에 영향을 미치는 질병 관련 변화에 대한 정보를 얻는 데 필수적입니다. 여기에서, 원래의 방법의 변형이 기술된다 : 시냅스 막 (MSM)의 미세 이식은 풍부한 시냅스 단백질 제제의 생리적 특성화에 중점을두고 쥐와 인간 시냅토좀 연구에 성공적으로 적용되었습니다10,11,12,13,14,15 . 이 방법론을 사용하면 한때 인간의 뇌에서 작동했던 시냅스 수용체를 이식 할 수 있으며, 자신의 고유 지질 및 관련 단백질의 자체 코호트에 묻혀 있습니다. 더욱이, MSM 데이터가 정량적이기 때문에, 이 데이터를 사용하여 큰 프로테오믹 또는 시퀀싱 데이터세트(10)와 통합할 수 있다.
시냅스 수용체의 많은 약리학 적 및 생물 물리학 적 분석이 재조합 단백질16,17에서 수행된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 접근법은 수용체의 구조 - 기능 관계에 대한 더 나은 통찰력을 제공하지만, 뉴런에서 발견되는 복잡한 다량체 수용체 복합체 및 질병의 변화에 대한 정보를 제공 할 수는 없습니다. 따라서, 천연 및 재조합 단백질의 조합은 시냅스 수용체에 대한보다 포괄적 인 분석을 제공해야합니다.
실험실의 요구 사항에 맞게 조정할 수있는 시냅토좀 10,11,12,13,13,14,15를 준비하는 많은 방법이 있습니다. 이 프로토콜은 시냅토좀 농축 제제가 분리되었고 미세이식 실험을 위해 처리 될 준비가되었다는 가정으로 시작됩니다. 실험실에서는 Syn-Per 메서드가 제조업체 지침에 따라 사용됩니다. 이것은 전기생리학적 실험10,11에서 높은 재현성 때문에 행해진다. 또한 제노푸스 난모세포(18,19)를 분리하는 방법을 설명하는 풍부한 문헌이 있으며, 이는 또한 주사 준비(20)를 위해 구입될 수 있다.
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Protocol
모든 연구는 제도적 지침을 준수하여 수행되며 캘리포니아 어바인 대학 (IACUC-1998-1388)과 텍사스 대학 의료 지부 (IACUC-1803024)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 비알츠하이머병(AD) 뇌(여성, 74세, 사후 간격 2.8 h) 및 AD-뇌(여성, 74세, 사후 간격 4.5 h)로부터의 측두엽 피질은 캘리포니아 대학교 어바인 알츠하이머병 연구 센터(UCI-ADRC)에 의해 제공되었다. 뇌 기증에 대한 정보에 입각 한 동의는 UCI-ADRC에 의해 얻어졌습니다.
참고 : 고정되지 않은 인간의 뇌 조직은 혈액 매개 병원균 (BBP)의 원천으로 취급되어야합니다. 따라서, BBP 훈련은 실험을 시작하기 전에 필요하다. 이 프로토콜은 BSL2 요구 사항에 따라 생물 안전 레벨 2 (BSL2) 실험실에서 수행됩니다. 실험실 내의 지침 및 예방 조치에는 실험실에서 음식 또는 음료가 허용되지 않으며, 좋은 실험실 관행을 준수해야하며, 개인 보호 장비 (장갑, 가운, 발가락이 열린 신발 없음)가 필요하며 문을 항상 닫아야합니다.
1. 제노푸스 난모세포 미세주사 제제
- 주사 바늘을 만들려면 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 3.5 인치 붕규산 튜브를 당깁니다. 미세 주사 바늘이 당겨지면 현미경과 면도날을 사용하여 바늘 끝을 충분히 잘라내어 미세 주입을 수행 할 수 있습니다 (일반적으로 2-3mm 사이).
참고 : 절단 할 바늘 끝의 길이는 다를 수 있습니다. - 800 mL의 증류수에 Barth's Stock Solution (5x) 200 mL를 첨가하여 1x Barth 용액을 준비하십시오. 24-웰, 편평한 바닥 조직 배양 플레이트를 18°C 1x Barth 용액으로 채운다.
- 다음과 같이 5x Barth의 원액을 준비하십시오. 증류수 1L에 NaCl 25.71g(염화나트륨), 0.372g의 KCl(염화칼륨), 0.301g의CaCl2(이염화칼슘), 0.389g의 Ca(NO3)2(4H2O)(질산칼슘 4수화물), 1.01g의 MgSO4(7H2O)(황산마그네슘 헵타하이드레이트), 1.008g의 NaHCO3(중탄산나트륨)를 첨가하고, 및 11.91 g HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산).
- 18,19에 기술된 프로토콜을 사용하여 Xenopus 난모세포를 분리하고 2x 확대된 입체 스코프를 사용하여 건강한 모습의 단계 V-VI 난모세포를 선택합니다. 웰 당 약 10 개의 난모세포를 배치하고 웰 중 하나를 사용하여 주입되지 않은 난모세포를 수용하여 녹음을 수행 할 때 대조군 세포로 사용하십시오.
- 높이 1cm, 지름 6cm의 작은 페트리 접시를 꺼내 나일론 메쉬를 접시 바닥을 덮도록 내부에 놓습니다. 그런 다음, 난모세포의 미세주사를 수행하는 데 사용할 1x Barth's 용액 15 mL를 부어준다.
- 현미경 플랫폼의 미드 라인을 따라 나노 인젝터를 배치하십시오. 자석을 Off 위치로 돌리고 조심스럽게 지지하면서 나노인젝터를 원하는 위치로 천천히 움직입니다. 나노 인젝터가 제대로 배치되면 자석을 완전히 켜 진 위치로 돌려 안전한지 확인하십시오.
- 샘플 크기가 50.6 nL인 경우, 나노인젝터의 측면에 다음 설정을 사용하십시오: 1은 D(아래), 2는 D, 3은 U(위쪽), 4는 D, 5는 U. 현미경 스탠드 위에 자체 밀봉 열가소성 수지 또는 마이크로 원심분리 튜브 캡의 조각을 배치하여 나노인젝터의 궤적과 정렬합니다.
참고: 50 nL는 세포질이 견딜 수 있는 주입된 물질의 최대 양근처(21)에 가깝습니다. - 인슐린 주사기 부피의 약 절반을 미네랄 오일 (약 0.5 mL / cc)로 채 웁니다. 이 주사기를 사용하여 미세 주사 바늘을 미네랄 오일로 채 웁니다. 바늘 끝에 보이는 기름 구슬이 보이는지 확인하십시오.
- 나노 인젝터 플런저를 최소 1-2cm에 노출시킵니다. 플런저가 원하는 길이로 보일 때까지 EMPTY 버튼을 누르고 있으면됩니다. 플런저가 노출되면 미네랄 오일이 채워진 미세 주입 유리 바늘을 천천히 조심스럽게 나노 인젝터 플런저에 놓고 검은 색 저항 O 링을 통해 잘 맞는지 확인하고 흰색 저항 링에서 멈 춥니 다. 이 과정에서 나노 인젝터 플런저가 구부러지지 않도록하십시오.
- 미세 주입 유리 바늘이 고정되고 제자리에 고정되면 EMPTY 를 눌러 잠재적 인 기포를 무효화하십시오. 부드럽게 종이 조직으로 과도한 미네랄 오일을 닦아냅니다.
2. 샘플 로딩
- 10,11,12,13,14,15에 기재된 바와 같이 관심있는 인간 뇌 영역으로부터 시냅토좀 농축 제제 (샘플)를 제조하고, 주사 순간까지 -80°C에서 약 5 μL의 분취량으로 저장한다.
- 주사하기 전에 분취량을 젖은 얼음으로 옮기고 초음파 처리 및 회수를 제외하고 항상 얼음 위에 보관하십시오. 샘플의 수와 유형은 실험 설계에 의해 결정될 것이다.
- 샘플의 워밍업을 피하기 위해 떠 다니는 젖은 얼음이있는 욕조에서 선택한 샘플을 3x 초음파 처리하십시오. 매번 5 s 사이클을 사용하고 사이클 사이에 젖은 얼음에서 1 분을 기다리십시오.
- 1 μL의 샘플을 열가소성 플라스틱 상에 놓습니다. 샘플의 이동을 방지하기 위해 샘플 배치 전에 필요한 경우 표면에 들여쓰기를 만듭니다.
- 나노 인젝터를 고정하는 조작기의 손잡이를 사용하여 바늘을 배치하고 채울 샘플 쪽으로 이동하십시오. 바늘 팁이 샘플에 들어가면 충분한 샘플이 채취될 때까지 FILL 버튼을 길게 누릅니다. 10개의 난모세포에 대해 약 0.5 μL가 요구된다. 손잡이를 사용하여 나노 인젝터의 바늘을 다시 가장 높은 위치로 옮깁니다.
3. 난모세포 주입
참고 : 표준화 된 쥐 피질 시냅토솜 막은 또한 난모세포의 다른 배치 사이의 융합 능력의 변화를 측정하기 위해 일련의 난모세포에 모든 실험에서 주입됩니다.
- 선택한 난모세포를 나일론 메쉬와 Barth의 용액 (약 10 개의 난모세포)이 장착 된 작은 Petri 접시에 놓습니다. 난모세포가 서로 위에 있지 않도록 배열하십시오. 이것은 주입 과정에서 도움이 될 것입니다.
- 나노 인젝터를 고정하는 조작기의 손잡이를 사용하여 바늘을 난모세포 쪽으로 이동하십시오. 바늘이 Barth의 용액에 잠기면 나노 인젝터 용 풋 페달을 사용하여 미세 주입 바늘이 샘플을 방출하는지 확인하십시오. 샘플이 방출되는 경우 현미경 뷰에서 볼 수 있습니다.
- 샘플이 방출되고 있다는 것이 자신있게 입증되면 난모세포를 미세 주입하십시오. 샘플이 방출되지 않으면 바늘을 채우는 과정을 반복하십시오.
- 바늘로 표면 바로 아래의 난모세포를 관통하고 더 깊지 않고 발 페달을 사용하여 샘플을 주입하십시오. 풋 페달은 샘플이 방출될 때 삐삐 소리를 냅니다. 약 2-3초 정도 기다립니다. 주입에 성공하면 세포가 확장됩니다. 이런 일이 발생하면 조작기의 손잡이를 사용하여 셀을 종료하십시오.
참고 : 난모세포에서 막의 융합은 편광 과정입니다. 따라서, 난모세포는 세포의 동물 측, 바람직하게는 적도 위에, 막 융합을 최대화하기 위해 바늘의 각도를 동물 측으로 향하여 주사되어야한다. - 다음 난자가 바늘과 정렬되도록 Petri 접시를 옮기고 접시의 모든 난모세포가 주입 될 때까지 과정을 반복하십시오. 원하는 수의 난모세포가 주입 될 때까지이 과정을 반복하십시오. 난모세포의 한 웰이 대조군으로 사용되도록 주사되지 않은 채로 남아 있는지 확인하십시오.
- 모든 난모세포가 주입되면 나노 인젝터를 원래 위치로 후퇴시키고 바늘을 제거하십시오.
4. 두 개의 전극 전압 클램프를 사용하여 이온 전류의 기록
- 두 개의 전극 전압 클램프 (TEVC) 전극 바늘을 만들려면 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 15cm 길이의 화재 연마 붕규산 유리 튜브를 당깁니다. 잡아당김이 완료되면 긴 모세관 바늘을 사용하여 3 M KCl로 채우거나 연속 진공 하에서 15 분 동안 3 M KCl 용액에 바늘을 잠수하고 끓입니다. 고온은 전극을 채우고 기포를 제거하는 데 도움이됩니다.
- 결정질 형태의 KCl과 탈이온수를 사용하여 3 M KCl 전극 충진 용액을 제조하고, 전극의 기준 전위가 변화되지 않도록 이들 단계를 주의 깊게 따른다. KCl을 오븐에서 2-3 시간 동안 조심스럽게 말립니다. 분석 저울을 사용하여 223.68g의 KCl을 조심스럽게 무게. KCl을 1L 유리 병에 옮깁니다. 이 용액을 사용하여 은 전극 와이어를 염소화하십시오.
참고 : 유리 전극을 당기려면 피펫 요리 책을 여기에서 다운로드 할 수 있습니다 : https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
- 결정질 형태의 KCl과 탈이온수를 사용하여 3 M KCl 전극 충진 용액을 제조하고, 전극의 기준 전위가 변화되지 않도록 이들 단계를 주의 깊게 따른다. KCl을 오븐에서 2-3 시간 동안 조심스럽게 말립니다. 분석 저울을 사용하여 223.68g의 KCl을 조심스럽게 무게. KCl을 1L 유리 병에 옮깁니다. 이 용액을 사용하여 은 전극 와이어를 염소화하십시오.
- 이온 전류 기록에 사용되는 모든 장비를 켭니다 : 주 시스템, 솔루션 밸브, 현미경 조명, 밸브 시스템, 난모세포 클램프 및 진공 시스템. 데스크톱 컴퓨터를 켜고 WinEDR V3.9.1.에 로그인한 다음 프로그램이 실행 중인지, 설치 값이 다음과 같이 올바른지 확인합니다: 디스크에 기록, 기록 기간 설정, 시뮬레이터 옵션 지우기.
- 증폭기에 대해 다음과 같은 초기 설정 값을 제공합니다: 전압 전극(Vm) 섹션의 경우 음의 용량 보상(-C)을 끄십시오. 배스 전극(Im) 섹션의 경우 이득 선택기 스위치(0.1 ~ 10 범위)를 10으로 설정하고 이득 승수(x0.1, x1.0 및 x10)를 선택하는 세 위치 토글 스위치를 x1.0으로 설정합니다. LED 표시등은 게인 승수 선택을 나타냅니다. 클램프 섹션의 경우 클램프 모드 선택기를 끄고 DC 이득 제어를 IN으로 설정하고 이득 제어 전체 대역폭 개방 루프 (범위 0 ~ 2000)를 약 1200으로 설정합니다. 명령의 경우 40mV로 설정하고 홀드 컨트롤 음수 및 배율 승수를 x2로 설정하십시오. 전류 전극의 경우, 난모세포를 함축시키기 전에 제로 참조를 확립하기 위해 Ve 오프셋을 사용하십시오.
- 녹화하려면 WinEDR V3.9.1 소프트웨어를 열고 상단 메뉴로 이동하여 파일 > 새 파일 열기를 선택하십시오. 자신의 폴더를 만들고 파일을 저장하십시오.
- 그런 다음 주 메뉴에서 디스크에 레코드 > 레코드를 선택하십시오. 두 전극이 ooctyte 내부에 있으면 VC-8 밸브 컨트롤러에서 링거를 켜고 OC-725C 증폭기에서 클램프를 Slow 로 돌립니다. 그런 다음 WinEDR 소프트웨어로 돌아가서 화면 왼쪽 상단의 레코드를 선택하십시오.
- 왼쪽 하단의 마크 차트에서 초기 멤브레인 전위를 기록하고 Enter 키를 누릅니다. 실험이 계속 진행됨에 따라 사용중인 약물의 이름을 적어 둘 수 있습니다. 실험이 끝나면 화면 왼쪽 상단에서 중지 를 선택합니다.
참고: WinEDR 또는 WinWCP 소프트웨어를 사용하여 TEVC는 무료이며 실험에 적합하지만 사용 가능한 다른 소프트웨어를 사용할 수 있기 때문에 TEVC를 수행합니다.
- 실험을 수행하는 데 필요한 모든 약물 솔루션 (예 : GABA, Kainate)을 구성하고 용액 밸브를 켜고 끄고 핀치 밸브의 변위를 관찰하여 용액 밸브가 제대로 작동하는지 확인하십시오.
- 튜브에 연결된 주사기 리셉터클에 해당 용액을 붓고 밸브 컨트롤러에 라벨을 부착하여 용액 튜브와 상관 관계를 맺도록 튜브를 채 웁니다. 용액의 흐름이 안정적인지, 거품이 없는지 그리고 진공 시스템이 제대로 작동하는지 확인하십시오.
- 현미경 및 기록 챔버 영역을 설정합니다. 아가 브릿지(아래 참조)를 기록 챔버 뒤의 각각의 원형 구멍(취급 영역으로부터 원위)에 배치하고, 접지 기준으로서 사용되는 전극과 기록 챔버에 대한 웰을 연결한다. 링거의 작업 솔루션(1x)을 레코딩 챔버 및 접지 기준 전극 웰에 추가합니다.
- 한천 다리는 길이 2-3cm의 U 자형 붕규산염 튜브로 링거 용액에 3 % 한천으로 채워져 있습니다. 15cm 길이의 튜브를 자르고 화염에 구부린 다음 인슐린 주사기를 사용하여 뜨거운 3 % 한천으로 채워 U 자형 튜브를 만드십시오. 사용할 때까지 링거의 용액에 채워진 한천 다리를 냉장고에 보관하십시오.
- 다음과 같이 20x 링거 원액을 만드십시오 : 증류수 1 L에 NaCl 134.4 g, KCl 2.982 g, CaCl2 5.29 g 및 HEPES 23.83 g (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페라 진 에탄 술폰산)을 첨가하십시오. 1x 링거의 작업 용액의 경우, 용적 플라스크에 링거 원액 200mL(20x)를 증류수 3,800mL에 첨가한다.
- 3 M KCl 용액에 은선을 배치하고 9 V 전지의 양극 단자에 은 전극을 연결하여 전기분해하여 각 실험 전에 염소화 은 전극을 준비한다. 약 3분 후에 AgCl의 고체 갈색 층이 전극 내로 증착된다. 염소화 은도금 은 전극 와이어를 전극 하우징에 넣습니다.
참고: 접지 레퍼런스 및 기록 염소화 전극은 은/은(Ag/AgCl) 전극입니다. - KCl 용액에서 붕규산염 바늘을 제거하십시오. 주사기를 사용하여 전극 바늘의 열린 끝에서 소량의 KCl 용액을 추출하고 KCl 용액을 광유로 대체하십시오. 이것은 물 증발과 바늘 내의 KCl 농도의 변화를 피할 것입니다. 유리 바늘을 염소화 은전극 와이어 위로 밀어 제자리에 조이십시오.
- 전극을 고정하는 좌우 조작기를 사용하여 전극 바늘을 링거 솔루션으로 채워진 녹음 챔버로 안내합니다.
- Vm 및 Ve 오프셋 노브를 제로로 설정한 다음 전극 테스트 버튼을 눌러 각 전극 의 저항을 확인합니다. 저항은 0.5-3 MΩ 사이여야 합니다(화면에서 5-30mV로 직접 읽음). 저항이 범위를 벗어나면 새로운 미세 전극을 사용하여 교체하십시오.
- 녹음 챔버를 신선한 링거의 솔루션으로 채 웁니다. 유리 피펫을 사용하여, 주사되지 않은 난모세포 또는 미세이식된 난모세포를 기록 챔버의 중앙에 놓는다. 난모세포가 현미경 아래에서 명확하게 보이는지 확인하고 동물의 편을 위로 향하게하십시오 (3.4 단계의 참고 사항 참조).
- 전극이 난모세포막에 닿을 때까지 링거의 용액으로 전극을 안내하십시오. 양쪽 전극으로 동물 측의 난모세포막을 부드럽게 관통하고(단계 3.4의 참고 참조) 휴지막 전위를 기록한다. 링거의 솔루션 흐름을 켭니다.
- 난모세포 클램프 증폭기를 사용하여 모드를 전압 클램프 로 변경하고 -80mV의 유지 전압을 설정하십시오. 모니터의 전류는 음수여야 하며, 일반적으로 0~0.4마이크로암페어여야 합니다.
- 새 파일을 만들어 녹음을 파일 > 새로 만들기로 저장> 소프트웨어에 녹화를 저장합니다 . 녹음을 시작하고 디스크에 레코드 > 레코드를 누릅니다. 표시 상자 대화 상자(테스트 이름, 사용된 약물 등)를 사용하여 파일에 관련 정보를 추가합니다.
- 작용제 (예를 들어, GABA, 글루타메이트 또는 카이네이트)를 밸브를 열고 이를 기록 챔버 내로 15초 동안 관류시킴으로써 화학적 자극을 위해 적용한다. 일반적으로 10x의 게인을 사용하여 최대 포인트 수를 플로팅하고 응답을 재구성합니다. 전류가 매우 작 으면 증폭 또는 이득을 증가시켜 평가하고 볼 수 있도록하십시오. 항상 이러한 변경 사항을 기록해 둡니다.
참고 : 관류의 지속 기간은 실험 패러다임에 달려 있습니다. 주요 목표가 최대 진폭을 측정하는 것이라면, 15 초는 GABA 또는 카이네이트의 고원에 대한 피크에 도달하기에 충분할 것입니다. - 항상 솔루션 수준을 모니터링합니다. 링거의 솔루션은 모든 솔루션 사용 사이에 사용되므로 자주 다시 채워야합니다. 녹음이 완료되면 전압 클램프를 OFF 위치로 돌리고 링거의 솔루션 밸브를 끕니다. 난모세포를 제거하십시오. 녹화를 중지하고 파일을 저장합니다. 주입 된 모든 난모세포에 대해이 단계를 반복하십시오.
5. TEVC 녹음 분석
- 녹음 사본을 USB 드라이브에 저장합니다. 거기에서 분석 할 파일을 엽니 다. 열리는 파일에서 녹화를 보고, 표시하고, 측정할 수 있습니다. 가장 일반적인 분석에는 최대 진폭, 활성화 시간, 탈감작 및 반복적 인 응용 프로그램의 런다운이 포함됩니다.
- AMPA 최대 반응 및 GABA 피크 반응을 측정한다. 이러한 측정값을 획득하려면 먼저 커서가 있는 빨간색 선을 찾아 Ringer 응용 프로그램 또는 기준선에서 생성된 전류로 드래그하여 제로 레벨 또는 기준선을 설정합니다.
- 제로 레벨이 설정되면 마우스를 사용하여 녹색 수직 판독 커서를 그래프 트레이서의 원하는 부분으로 드래그하여 응답 측정값을 결정합니다. 원하는 경우 다른 기본 설정 소프트웨어에서 분석할 추적을 내보냅니다.
참고: 제로 수준을 정의할 수 없거나 추적기에 너무 많은 노이즈가 표시된 경우 WinEDR 파일을 오프라인 분석 소프트웨어로 내보내면 노이즈를 줄이기 위해 레벨 기준선을 제공하고 필터를 추가하는 수정이 가능합니다.
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Representative Results
주사 후 몇 시간 이내에 신경 전달 물질 수용체와 이온 채널을 운반하는 시냅스 막이 난모세포 원형질막과 융합되기 시작합니다. 도 1은 제노푸스 난모세포 내로 미세이식된 AMPA 및 GABAA 수용체의 기록을 보여준다. 대부분의 분석을 위해, 샘플 당 두 개 또는 세 개의 난모세포로부터의 반응을 측정하고, 샘플 당 총 여섯 개에서 아홉 개의 난모세포에 대해 서로 다른 개구리의 난모세포의 두세 배치를 사용하여 측정하였다. 이것은 인간 피험자의 큰 집단이 집단 차이를 관찰하기 위해 행해진다. 분석은 간단하며 응답의 진폭을 측정합니다. 이식 된 막의 융합은 편광 된 과정이므로 주사 부위의 선택이 매우 중요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 식물 반구 또는 적도로의 주사는 일관된 결과를 제공하며, 주입 된 모든 난모세포는 수용체를 성공적으로 삽입하고 단봉 분포(22)를 따르는 이온 전류를 생성합니다. 흥미롭게도, 막이 처음에 동물 극에 주입되었을 때, 난모세포 반응은 이모달 분포를 따랐다: 한 그룹의 난모세포는 전혀 또는 매우 낮은 반응을 보인 반면, 다른 그룹은 큰 반응을 보였고, 심지어 식물 극이나 적도에 주입된 난모세포보다 더 컸다. 인간 막이 주입되고 난모세포의 핵 내에 갇혀 있기 때문에 동물 극에 주입 된 난모세포 중 일부가 반응이 낮은지 확인하기 위해 어뢰의 전기 기관에서 분리 된 막과 GABAρ1 서브 유닛을 암호화하는 cDNA를 혼합하여 동물 측의 극에 주입했습니다. 어뢰막으로부터의 니코틴 수용체는 아세틸콜린 23의 관류 동안 빠른 활성화와 빠른 탈감작을 보인 반면, ρ1 서브유닛은 GABA24,25,26,27의 연속 관류 동안 탈감작되지 않는 동종이머 GABAρ1 수용체를 형성한다. 공동 주입 된 샘플이 우연히 세포질이 아닌 핵으로 전달되면 cDNA는 RNA로 전사되어 기능적 GABAρ1 수용체로 번역됩니다. 도 2는 주사가 핵을 겨냥했을 때, 아세틸콜린에 대한 높은 반응을 갖는 난모세포가 GABAρ1 수용체를 발현하지 않았다는 것을 보여준다; 반대로, 아세틸콜린에 대한 반응이 0 또는 낮은 난모세포는 GABA 수용체를 발현한다. 이 실험의 결과는 첫째, 저반응 난모세포에서 막이 우연히 난모세포의 핵에 침착되었음을 나타냅니다. 둘째, 어뢰막을 핵에 주입해도 ρ1 cDNA의 전사를 크게 방해하지 않는다. 몇몇 공동 주사된 난모세포는 아세틸콜린과 GABA에 모두 큰 반응을 보였고, 이는 주사 동안 핵의 파열을 암시한다. 난모세포의 동물 반구 내로 이식된 막의 향상된 삽입은 이종-발현된 신경전달물질 수용체(26,28)의 편광된 국소화를 반영한다. 따라서, 핵을 표적화하지 않고 동물 반구에 주입함으로써, 더 큰 반응을 얻을 수 있다. 이는 수용체 밀도가 낮은 표본, 예를 들어 수용체 수가 적은 알츠하이머병(AD) 조직에서 연구하는 데 중요합니다(그림 3).
그림 1: 난모세포의 대표적인 이온 전류. 인간 시냅스 수용체로부터의 막으로 주입된 난모세포로부터의 이온 전류가 기록되었다. AMPA 수용체는 100 mM 카이네이트로 활성화되었고, GABAA 수용체는 1 mM GABA로 활성화되었다. VH = -80 mV. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 어뢰와 GABAρ1의 공동 주입. 아세틸콜린 수용체가 풍부한 토르페도의 전기 기관으로부터 여과된 막(0.1 μm)을 공동주사하고, GABAρ1 수용체를 암호화하는 cDNA를 동물 극에 공동 주입하여 주로 두 그룹의 난모세포를 생성하였다: 난모세포의 한 그룹(A)은 아세틸콜린(Ach; 1 mM)에 대해 큰 반응을 보였지만 1 μM GABA(전압은 -80 mV로 클램핑됨)에 반응하지 않았다. 그룹 (B)의 난모세포는 ACh에 대한 null 또는 낮은 반응을 보였지만 GABA에 대한 반응은 컸다. (c) 그룹 1 (n = 5 난모세포) 및 그룹 2 (n = 11 난모세포)에서 피크 전류의 평균 ± 표준 오차를 나타낸 그래프. 그룹 2의 한 난모세포는 핵의 파열을 암시하는 큰 GABA 및 ACh 반응을 보였다; 결과적으로 반응의 분포는 막 전류 분포의 평균과 중앙값 (22 nA 대 6 nA)의 차이에 의해 언급 된 바와 같이 낮은 값으로 치우쳐졌다. 이 결과는 저반응 난모세포의 원인 중 하나가 막이 주입되어 난모세포의 핵에 갇히고 있다는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 제노푸스 난모세포에서 세포막의 편광된 삽입. GABA 및 카이네이트 반응은 AD 이외의 뇌 (여성, 74 세, 사후 간격 2.8 h) 및 AD 뇌 (여성, 74 세, 사후 간격 4.5 h)에서 얻은 여과되지 않은 막으로 동물 또는 식물 극에 주입 된 난모세포의 반응입니다. 핵을 표적으로 삼지 않고 동물 극 근처에 주사 된 난모세포는 식물 극에 주입 된 난모세포보다 더 큰 반응을 보였으므로 수용체 수가 매우 적은 조직 샘플을 연구 할 수있었습니다. 식물과 동물 극 사이의 스튜던트 t-검정: **p < 0.01, *** p < 0.001, 막대는 피크 전류의 평균 ± SEM을 나타내고, n=5 난모세포 각 컬럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 뇌의 천연 단백질 복합체 분석은 뇌 장애의 항상성 및 병리학 적 과정을 이해하고 질병을 예방하거나 치료하기위한 치료 전략을 개발하는 데 필요합니다. 따라서, 스냅 냉동 샘플을 함유하는 뇌 은행은 크고 대부분 미개척된 풍부한 생리학적 정보(29,30)의 귀중한 공급원이다. 사후 조직을 사용하는 초기 관심사는 데이터의 해석을 혼란스럽게 할 수있는 mRNA 또는 단백질 분해의 명확한 가능성입니다. 예를 들어, 뇌의 pH는 정량적 실시간-PCR에 의한 mRNA의 정량화와 지속적으로 양의 상관관계를 나타내고, 이러한 상관관계는 병리학(31)과 무관하다. pH의 피험자간 차이는 결과(32)의 해석을 흐릴 수 있는 큰 분산을 갖는 mRNA 정량화의 차이로 이어질 수 있다. 흥미롭게도, pH가 산성화됨에 따라 mRNA 전사체의 더 낮은 정량화에도 불구하고, 상이한 전사체 사이의 공분산은33 유지되어, 병리학적 상태의 신뢰할 수 있는 전사체 프로파일링을 얻기 위한 프레임워크를 제공한다. 중요하게도, mRNA는 고도로 분해가능한 반면, 사후 조직 내의 막횡단 단백질은 분해(34)에 매우 내성이 있다. 실험실에서의 이전 실험은 인간 뇌의 GABA 및 글루타메이트 수용체가 매우 큰 사후 간격35 후에 기능적이라는 것을 입증했습니다. 또한, MSM 방법은 사망 순간의 pH, 고환 상태, mRNA 및 단백질 분해와 같은 잠재적 인 교란 인자가 수용체의 기능에 미치는 영향을 직접 측정 할 수있게하여 데이터의 분석 및 해석에이 정보를 사용하는 방법을 제공합니다.
기술의 수정 및 문제 해결
앞서 언급했듯이, MSM은 전체 막의 원래 이식을 약간 변형시킨 것으로, 이는 학계 및 제약 산업 12,36,37,38,39,40의 많은 실험실에서 널리 검증되고 확인 된 방법입니다. 예를 들어, 수용체의 미세이식은 뇌 영역 선택성12를 나타내는 AMPA 수용체의 TARP 감마-8 선택적 길항제인 엘리릴리의 LY3130481의 개발에 중요하였다. MSM은 시냅토솜 농축 제제를 사용하는 동일한 미세이식 원리를 따른다; 따라서 좋은 시냅토솜 제제를 갖는 것이 중요합니다. 이 절차로 얻은 결과가 매우 일관되고 이온 전류의 진폭이 프로테오믹 실험10에서 시냅스 단백질의 수준과 매우 잘 관련되기 때문에 Syn-Per 방법을 사용합니다. 그러나, 미세이식 또는 MSM은 우수한 결과를 갖는 많은 공급원(예를 들어, 곤충막38,39, 뉴로레마(40))으로부터의 수용체를 연구하도록 적응될 수 있다. 시냅스가 알츠하이머 병과 같이 강하게 영향을 받거나 소량으로 이용 가능한 일부 질환이 있습니다. 이 경우 동물 측에 막을 주입하면 더 큰 전류를 얻는 데 도움이됩니다. 주입 된 단백질의 양을 늘리면 막의 융합과 반응의 크기가 증가합니다. 주입 된 막의 농도와 난모세포의 생존 사이에는 부정적인 상관 관계가 있지만, 주어진 실험 분석을 허용하는 적절한 농도의 막을 찾을 수 있습니다.
MSM의 제한 사항
MSM은 인간 수용체 또는 이온 채널의 연구를 위해 개발된 정량적 방법; 따라서 가용성이 제한된 조직을 연구하는 데 매우 적합합니다. Xenopus 난모세포에는 내인성 글루타메이트 또는 GABA 수용체가 없기 때문에 미세이식 된 난모세포에서 GABA 또는 글루타메이트에 대한 모든 반응은 난모세포의 막과 융합 된 주입 된 수용체에서 비롯됩니다. 그러나 MSM의 중요한 한계는 미세 이식 및 내인성 채널 / 수송체로부터 이온 전류의 분리가 어렵 기 때문에 난모세포에서도 내인성으로 발현되는 이온 채널 또는 수송체에 대한 연구입니다. 내인성 유전자를 침묵시키는 미래의 연구는 이러한 제한에 도움이 될 수 있다.
기존 방법의 중요성은 MSM이 천연 막을 상응하는 단백질 및 수용체와 통합하여 분석을위한보다 생리적 인 환경을 제공한다는 것입니다. 배양된 세포(41)로부터의 신경전달물질 수용체인 AMPA-타입 GluR1, α7-AcChoRs 및 α4β2-AcChoRs에서 관찰된 바와 같이 그들의 천연 막에 있는 수용체의 특성이 난모세포에 이식된 후에 유지된다는 것이 밝혀졌다.
이 기술의 미래 응용은 건강하고 병든 인간 뇌로부터의 배양 및 비배양된 세포 및 조직의 막에서 관심있는 상이한 단백질 및 수용체의 전기생리학적 특성에 대한 연구를 포함한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIA / NIH 보조금 R01AG070255 및 R01AG073133을 AL에 의해 지원되었습니다. 우리는 또한이 원고에 표시된 인간 조직을 제공 한 캘리포니아 어바인 알츠하이머 병 연구 센터 (UCI-ADRC)에 감사드립니다. UCI-ADRC는 NIH/NIA 보조금 P30 AG066519가 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
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