Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Микротрансплантация синаптических мембран для реактивации синаптических рецепторов человека для функциональных исследований

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64024
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

Протокол демонстрирует, что, выполняя микротрансплантацию синаптических мембран в ооциты Xenopus laevis , можно регистрировать последовательные и надежные ответы рецепторов α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты и γ-аминомасляной кислоты.

Abstract

Возбуждающие и ингибирующие ионотропные рецепторы являются основными воротами потоков ионов, определяющих активность синапсов при физиологической нейронной коммуникации. Таким образом, изменения в их изобилии, функции и отношениях с другими синаптическими элементами наблюдались как основной коррелят изменений в функции мозга и когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях и психических расстройствах. Понимание того, как функция возбуждающих и тормозных синаптических рецепторов изменяется болезнью, имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения. Чтобы получить информацию, относящуюся к заболеванию, важно регистрировать электрическую активность рецепторов нейротрансмиттеров, которые остаются функциональными в больном мозге человека. Пока это самый близкий подход к оценке патологических изменений в функции рецепторов. В данной работе представлена методика выполнения микротрансплантации синаптических мембран, которая заключается в реактивации синаптических мембран из замороженной ткани головного мозга человека, содержащей рецепторы человека, путем ее введения и заднего слияния в мембрану ооцитов Xenopus laevis . Протокол также обеспечивает методологическую стратегию получения последовательных и надежных ответов рецепторов α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA) и γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), а также новые подробные методы, которые используются для нормализации и тщательного анализа данных.

Introduction

Нейродегенеративными расстройствами страдает большой процент населения. Хотя их разрушительные последствия хорошо известны, связь между функциональными изменениями рецепторов нейротрансмиттеров, которые имеют решающее значение для функции мозга, и их симптоматикой все еще плохо изучена. Межиндивидуальная изменчивость, хронический характер заболевания и коварное появление симптомов — это лишь некоторые из причин, которые задержали понимание многих заболеваний головного мозга, где химический дисбаланс хорошо задокументирован 1,2. Животные модели генерировали бесценную информацию и расширили наши знания о механизмах, лежащих в основе физиологии и патофизиологии в эволюционно-консервативных системах; однако несколько межвидовых различий между грызунами и людьми исключают прямую экстраполяцию функции рецепторов от животных моделей к человеческому мозгу3. Таким образом, первоначальные усилия по изучению нативных рецепторов человека были разработаны лабораторией Рикардо Миледи с использованием хирургически удаленной ткани и замороженных образцов. В этих первоначальных экспериментах использовались целые мембраны, которые включают нейрональные синаптические и экстрасинаптические рецепторы, а также ненейрональные нейротрансмиттерные рецепторы, и хотя они предоставляют важную информацию о болезненных состояниях, существует опасение, что сочетание рецепторов усложняет интерпретацию данных 4,5,6,7. Важно отметить, что синапсы являются основной мишенью при многих нейродегенеративных расстройствах 8,9; поэтому анализы для проверки функциональных свойств пораженных синапсов имеют основополагающее значение для получения информации о связанных с заболеванием изменениях, влияющих на синаптическую связь. Здесь описана модификация оригинального метода: микротрансплантация синаптических мембран (МСМ), которая фокусируется на физиологической характеристике обогащенных синаптических белковых препаратов и успешно применяется для изучения синаптосом крыс и человека 10,11,12,13,14,15 . С помощью этой методологии можно трансплантировать синаптические рецепторы, которые когда-то работали в человеческом мозге, встроенные в их собственные нативные липиды и в их собственную когорту связанных белков. Более того, поскольку данные МСМ являются количественными, можно использовать эти данные для интеграции с большими протеомными или секвенирующими наборами данных10.

Важно отметить, что многие фармакологические и биофизические анализы синаптических рецепторов проводятся на рекомбинантных белках16,17. Хотя этот подход обеспечивает лучшее понимание структурно-функциональных отношений рецепторов, он не может предоставить информацию о сложных многомерных рецепторных комплексах, обнаруженных в нейронах, и их изменениях при заболевании. Поэтому комбинация нативных и рекомбинантных белков должна обеспечить более комплексный анализ синаптических рецепторов.

Существует множество методов получения синаптосом 10,11,12,13,14,15, которые могут быть скорректированы с учетом требований лаборатории. Протокол начинается с предположения, что синаптосомно-обогащенные препараты были выделены и готовы к переработке для экспериментов по микротрансплантации. В лаборатории используется метод Syn-Per в соответствии с инструкциями производителя. Сделано это из-за высокой воспроизводимости в электрофизиологических экспериментах10,11. Существует также обильная литература, объясняющая, как выделить ооциты Xenopus 18,19, которые также можно приобрести готовыми к инъекции20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования проводятся в соответствии с институциональными руководящими принципами и одобрены институциональным Комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского университета в Ирвине (IACUC-1998-1388) и Медицинским отделением Техасского университета (IACUC-1803024). Височная кора головного мозга без болезни Альцгеймера (AD) (женщина, 74 года, посмертный интервал 2,8 ч) и МОЗГ AD (женщина, 74 года, посмертный интервал 4,5 ч) были предоставлены исследовательским центром болезни Альцгеймера Ирвина Калифорнийского университета (UCI-ADRC). Информированное согласие на донорство мозга было получено UCI-ADRC.

ПРИМЕЧАНИЕ: Нефиксированную ткань головного мозга человека следует рассматривать как источник патогенов, передающихся через кровь (BBP). Соответственно, обучение BBP необходимо перед началом экспериментов. Этот протокол выполняется в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL2) в соответствии с требованиями BSL2. Руководящие принципы и меры предосторожности в лаборатории включают: не допускается употребление пищи или напитков в лаборатории, надлежащая лабораторная практика должна соблюдаться, средства индивидуальной защиты (перчатки, халат, обувь с открытым носком) требуются, и дверь должна быть закрыта в любое время.

1. Препарат микроинъекции ооцитов Xenopus

  1. Чтобы сделать инъекционные иглы, потяните 3,5-дюймовые боросиликатные трубки с помощью съемника микропипетки. После того, как иглы микроинъекции вытянуты, используйте микроскоп и лезвие бритвы, чтобы отрезать достаточно кончика иглы, чтобы можно было выполнить микроинъекцию (обычно между 2-3 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина кончика иглы для разреза может варьироваться.
  2. Приготовьте 1x раствор Барта, добавив 200 мл раствора Barth's Stock Solution (5x) на 800 мл дистиллированной воды. Заполните 24-луночную пластину для культивирования тканей с плоским дном раствором Барта 18 °C 1x.
    1. Подготовьте 5-кратный раствор Барта следующим образом. В 1 л дистиллированной воды добавить 25,71 г NaCl (хлорид натрия), 0,372 г KCl (хлорид калия), 0,301 г CaCl2 (дихлорид кальция), 0,389 г Ca(NO3)2(4H2O) (тетрагидрат нитрата кальция), 1,01 г MgSO4(7H2O) (гептагидрат сульфата магния), 1,008 г NaHCO3 (бикарбонат натрия), и 11,91 г HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота).
  3. Изолируйте ооциты Xenopus, используя протоколы, описанные в18,19 и используя 2-кратный увеличенный стереоскоп, отбирая здоровые на вид ооциты V-VI стадии. Поместите около 10 ооцитов на лунку и используйте одну из скважин для размещения неинъецированных ооцитов, которые будут использоваться в качестве контрольных клеток при выполнении записей.
  4. Достаньте маленькую чашку Петри, высотой 1 см и диаметром 6 см, и поместите внутрь нейлоновую сетку так, чтобы она покрывала дно тарелки. Затем влейте 15 мл 1x раствора Барта, который будет использоваться для выполнения микроинъекций ооцитов.
  5. Поместите наноинжектор вдоль средней линии платформы микроскопа. Поверните магнит в положение Off и медленно переместите наноинжектор в нужное положение, осторожно поддерживая его. Когда наноинжектор правильно расположен, поверните магнит обратно в положение «Полностью включено » и убедитесь, что он надежно закреплен.
  6. Для размера выборки 50,6 нЛ используйте следующие настройки на стороне наноинжектора: 1 - D (вниз), 2 - D, 3 - U (вверх), 4 - D и 5 - U. Поместите кусок самогерметизирующейся термопластиковой или микроцентрифужной крышки трубки на подставку микроскопа, выровняв ее с траекторией наноинжектора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 50 нЛ близко к максимальному количеству вводимого материала, которое цитоплазма может выдержать21.
  7. Заполните инсулиновый шприц примерно половиной его объема минеральным маслом (около 0,5 мл/куб.см). С помощью этого шприца заполните микроинъекционную иглу минеральным маслом. Убедитесь, что на кончике иглы видна видимая шарик с маслом.
  8. Выставить наноинжекторный плунжер минимум на 1-2 см. Сделайте это, удерживая кнопку EMPTY до тех пор, пока плунжер не будет виден на нужной длине. Как только плунжер обнажится, медленно и осторожно поместите заполненную минеральным маслом стеклянную иглу микроинъекционного стекла на плунжер наноинжектора и убедитесь, что она хорошо проходит через черное уплотнительное кольцо сопротивления и останавливается на белом кольце сопротивления. Убедитесь, что в процессе не сгибается плунжер наноинжектора.
  9. Как только игла микроинъекционного стекла будет надежно закреплена и на месте, нажмите EMPTY , чтобы удалить любые потенциальные пузырьки воздуха. Аккуратно, с помощью бумажной салфетки, очистите от избытка минерального масла.

2. Загрузка образца

  1. Готовят синаптосомно-обогащенные препараты (образцы) из интересующей области мозга человека, как описано в 10,11,12,13,14,15, и хранят их в аликвотах около 5 мкл при -80 °C до момента инъекции.
  2. Перед инъекцией перенесите аликвоту на влажный лед и держите ее на льду все время, кроме обработки ультразвуком и извлечения. Количество и типы образцов будут определяться опытным проектом.
  3. Обработайте отобранные образцы ультразвуком 3 раза в ванне с плавающим влажным льдом, чтобы избежать нагревания образца. Используйте 5 с циклов каждый раз, ожидая 1 мин на влажном льду между циклами.
  4. Поместите 1 мкл образца на термопластик. При необходимости сделайте углубление на поверхности перед размещением образца, чтобы предотвратить движение образца.
  5. Используйте ручки манипулятора, удерживающие наноинжектор, чтобы расположить иглу и переместить ее к образцу, который будет заполнен. Как только кончик иглы окажется в образце, нажмите и удерживайте кнопку FILL до тех пор, пока не будет взято достаточное количество образца. Для 10 ооцитов требуется около 0,5 мкл. С помощью ручек переместите иглу наноинжектора обратно в самое высокое положение.

3. Инъекция ооцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартизированные синаптосомальные мембраны коры головного мозга крыс также вводятся во всех экспериментах в набор ооцитов для измерения изменений в способности к слиянию между различными партиями ооцитов.

  1. Поместите выбранные ооциты на маленькую чашку Петри, которая имеет встроенную нейлоновую сетку и раствор Барта (около 10 ооцитов). Расположите ооциты так, чтобы они не находились друг на друге; это будет полезно в процессе инъекции.
  2. Используя ручки на манипуляторе, удерживающем наноинжектор, переместите иглу к ооцитам. Как только игла будет погружена в раствор Барта, используйте ножную педаль для наноинжектора, чтобы убедиться, что игла микроинъекции выпускает образец. Если образец высвобождается, он будет виден из поля зрения микроскопа.
  3. Как только будет уверенно установлено, что образец высвобождается, переходите к микроинъекции ооцита. Если образец не высвобождается, повторите процесс заполнения иглы.
  4. Проникните в яйцеклетку прямо под поверхностью с помощью иглы, не глубже, и используйте ножную педаль для введения образца. Ножная педаль будет издавать звуковой сигнал, когда сэмпл будет выпущен. Подождите около 2-3 с. Если инъекция прошла успешно, клетка будет расширяться. Как только это произойдет, используйте ручки на манипуляторе, чтобы выйти из клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние мембран в ооците является поляризованным процессом; поэтому ооцит следует вводить в животную сторону клетки, предпочтительно выше экватора, с углом иглы к животной стороне, чтобы максимизировать слияние мембран.
  5. Переместите чашку Петри так, чтобы следующая яйцеклетка выровнялась с иглой, и повторяйте процесс до тех пор, пока не будут введены все ооциты в чашке. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет введено желаемое количество ооцитов. Убедитесь, что один лунк ооцитов не вводится для использования в качестве контроля.
  6. После того, как все ооциты были введены, втяните наноинжектор в исходное положение и удалите иглу.

4. Регистрация ионных токов с помощью двухэлектродного зажима напряжения

  1. Чтобы изготовить две иглы электродного зажима электрода (TEVC), потяните за полированные боросиликатные стеклянные трубки длиной 15 см с помощью съемника микропипетки. После завершения вытягивания заполните 3 M KCl с помощью длинных капиллярных игл или, в качестве альтернативы, погрузите и прокипятите иглы в растворе 3 M KCl в течение 15 мин под непрерывным вакуумом. Высокая температура помогает в заполнении электродов и удалении пузырьков воздуха.
    1. Подготовьте раствор для заполнения электрода 3 M KCl, используя KCl в кристаллической форме и деионизированную воду, и тщательно следуя этим шагам, чтобы опорный потенциал электродов не изменялся. Тщательно высушите KCl в духовке в течение 2-3 ч. Используя аналитические весы, тщательно взвесьте 223,68 г KCl. Переложите KCl в стеклянную бутылку объемом 1 л. Используйте этот раствор для хлорирования серебряных электродных проводов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для вытягивания стеклянных электродов поваренную книгу пипетки можно скачать здесь: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. Включите все оборудование, используемое для регистрации ионных токов: основные системы, клапаны раствора, свет микроскопа, системы клапанов, зажим ооцитов и вакуумную систему. Включите настольный компьютер, войдите в WinEDR V3.9.1. и убедитесь, что программа запущена и что значения установки верны, следующим образом: запишите на диск, установите продолжительность записи и очистите параметр симулятора.
    1. Укажите следующие начальные значения настройки усилителя: для секции электрода напряжения (Vm) выключите компенсацию отрицательной мощности (-C); для секции электродов ванны (Im) установите переключатель усиления (диапазон от 0,1 до 10) на 10, а трехпозиционный тумблер, который выбирает множитель усиления (x0,1, x1,0 и x10), на x1,0. Светодиодные индикаторы будут указывать на выбор множителя усиления; для секции зажима выключите селектор режимов зажима, установите для регулятора усиления постоянного тока значение IN, а для регулятора усиления с открытой петлей полной полосы пропускания (диапазон от 0 до 2000) значение около 1200; для команд установите значение 40 мВ и установите отрицательный элемент управления удержанием и множитель масштаба в x2; для электрода тока используйте смещение Ve, чтобы установить нулевую ссылку перед пронзанием яйцеклетки.
    2. Для записи откройте программное обеспечение WinEDR V3.9.1, перейдите в верхнее меню и выберите Файл > Открыть новый файл. Создайте собственную папку и сохраните файл.
    3. Далее в главном меню выберите Запись > Запись на диск. Когда два электрода находятся внутри ооктита, включите звонок в контроллере клапана VC-8 и поверните зажим на Slow в усилителе OC-725C. Затем вернитесь к программному обеспечению WinEDR и выберите Запись в левом верхнем углу экрана.
    4. На диаграмме меток в левом нижнем углу запишите начальный мембранный потенциал и нажмите Enter. Поскольку эксперимент продолжается, вы можете записать название используемых препаратов. После завершения эксперимента выберите Остановить в левом верхнем углу экрана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем программное обеспечение WinEDR или WinWCP для выполнения TEVC, потому что они бесплатны и хорошо подходят для экспериментов, но любое другое доступное программное обеспечение может быть использовано.
  3. Составьте все лекарственные растворы, необходимые для проведения эксперимента (например, ГАМК, Кайнат) и подтвердите, что клапаны раствора работают должным образом, включив и выключив их и наблюдая за смещением защемляющих клапанов.
  4. Заполните трубки, налив соответствующий раствор на шприцевой сосуд, соединенный с трубкой, и наклейте маркировку контроллера клапана для корреляции с трубками раствора. Убедитесь, что поток раствора стабилен, нет пузырьков и что вакуумная система работает должным образом.
  5. Настройте область микроскопа и камеры записи. Поместите агаровые мостики (см. ниже) в соответствующие круглые отверстия за регистрирующей камерой (дистальнее от зоны обработки), соединив колодцы для электродов, используемых в качестве наземного эталона, и регистрирующей камеры. Добавьте рабочий раствор Рингера (1x) в регистрирующую камеру и заземляющие опорные электродные колодцы.
    1. Агаровые мостики представляют собой U-образные боросиликатные трубки, длиной 2-3 см, заполненные 3% агаром в растворе Рингера. Делают-образные трубки, разрезая трубки длиной 15 см, сгибая их на открытом огне, а затем заполняя их горячим 3% агаром с помощью инсулинового шприца. Храните наполненные агаровые мостики в растворе Рингера в холодильнике до использования.
    2. Сделайте 20-кратный раствор Ringer's stock следующим образом: в 1 л дистиллированной воды добавьте 134,4 г NaCl, 2,982 г KCl, 5,29 г CaCl2 и 23,83 г HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота). Для 1x рабочего раствора Ringer в объемной колбе добавьте 200 мл раствора Ringer's stock (20x) до 3 800 мл дистиллированной воды.
  6. Подготавливают хлорированные серебряные электроды перед каждым экспериментом путем электролиза, помещая серебряные провода в раствор 3 M KCl и подключая серебряный электрод к положительной клемме батареи 9 В. Примерно через 3 мин в электрод наносится твердый коричневый слой AgCl. Поместите провода электродов хлорированного серебра в корпус электрода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наземные эталонные и регистрирующие хлорированные электроды представляют собой электроды с хлоридом серебра /серебра (Ag/AgCl).
  7. Удалите боросиликатные иглы из раствора KCl. Используйте шприц для извлечения небольшого количества раствора KCl из открытого конца иглы электрода и замены раствора KCl минеральным маслом; это позволит избежать испарения воды и изменения концентрации KCl в игле. Проведите стеклянной иглой по проволоке хлорированного серебряного электрода и затяните их на место.
  8. Используя правый и левый манипуляторы, удерживающие электроды, направьте иглы электродов в камеру записи, заполненную раствором Рингера.
  9. Проверьте сопротивление каждого электрода, обнулив ручки смещения Vm и Ve, а затем нажав кнопки electrode Test . Сопротивление должно быть в пределах 0,5-3 МОм (непосредственно читается как 5-30 мВ на экране). Если сопротивление находится вне диапазона, замените его с помощью новых микроэлектродов.
  10. Заполните камеру записи свежим раствором Рингера. Используя стеклянную пипетку, поместите неинъецированную или микротрансплантированную яйцеклетку в центр регистрирующей камеры. Убедитесь, что яйцеклетка хорошо видна под микроскопом, животной стороной вверх (см. ПРИМЕЧАНИЕ на шаге 3.4).
  11. Направьте электрод в раствор Рингера до тех пор, пока они не коснутся мембраны ооцитов. Осторожно проткните мембрану ооцитов со стороны животного (см. ПРИМЕЧАНИЕ на этапе 3.4) обоими электродами и запишите мембранный потенциал покоя. Включите поток раствора ringer.
  12. Используя усилитель зажима ооцитов, измените режим на Зажим напряжения и установите удерживающее напряжение -80 мВ. Ток на мониторе должен быть отрицательным, обычно от 0 до 0,4 микроампер.
  13. Создайте новый файл, чтобы сохранить запись как Файл > Новый > Сохранить запись в программном обеспечении. Начните запись, нажмите Запись > Запись на диск. Добавьте соответствующую информацию в файл с помощью диалогового окна метки (имя теста, используемые препараты и т. Д.).
  14. Применяйте агонисты (например, ГАМК, глутамат или каинат) для химической стимуляции, открывая клапаны и перфузировав их в регистрирующую камеру в течение 15 с. Обычно используйте коэффициент усиления в 10 раз, чтобы построить максимальное количество точек и реконструировать ответ. Если токи очень малы, увеличьте усиление или усиление, чтобы они были оценены и видны. Всегда записывайте эти изменения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность перфузии зависит от экспериментальной парадигмы. Если основной целью является измерение максимальной амплитуды, 15 с будет достаточно, чтобы достичь пика для ГАМК или плато для каинате.
  15. Всегда контролируйте уровни решений. Раствор Ringer необходимо будет часто заполнять, так как он используется между всеми видами использования раствора. После завершения записи поверните зажим напряжения в положение OFF и выключите клапан раствора Ringer. Удалить яйцеклетку. Остановите запись и сохраните файл. Повторите эти шаги для всех введенных ооцитов.

5. Анализ записей TEVC

  1. Сохраните копию записей на USB-накопитель. Оттуда откройте нужный файл для анализа. В открывшемся файле запись можно просмотреть, пометить и измерить. Наиболее распространенный анализ включает измерение максимальной амплитуды, времени активации, десенсибилизации и краткого изложения повторяющихся приложений.
  2. Измерьте максимальный отклик AMPA и пиковый отклик ГАМК. Чтобы получить эти измерения, сначала установите нулевой уровень или базовую линию, найдя красную линию с курсором и перетащив ее к току, генерируемому приложением Ringer или базовой линией.
  3. После установления нулевого уровня определите измерения отклика с помощью мыши, чтобы перетащить зеленый вертикальный курсор считывания в нужную часть трассировщика графика. При желании экспортируйте следы для анализа в любое другое предпочтительное программное обеспечение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если нулевой уровень не может быть определен или на трассировщике указано слишком много шума, экспортируйте файл WinEDR в автономное аналитическое программное обеспечение, которое позволит внести изменения для обеспечения базового уровня и добавить фильтры для снижения шума.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В течение нескольких часов после инъекции синаптические мембраны, несущие свои нейромедиаторные рецепторы и ионные каналы, начинают сливаться с плазматической мембраной ооцитов. На рисунке 1 показаны записи рецепторов AMPA и GABAA, микротрансплантированных в ооциты Xenopus. Для большей части анализа ответы от двух или трех ооцитов на образец были измерены с использованием двух или трех партий ооцитов от разных лягушек, в общей сложности от шести до девяти ооцитов на образец. Это делается для большой когорты людей, чтобы наблюдать групповые различия. Анализ прост и измеряет амплитуду ответов. Важно отметить, что слияние пересаженных мембран является поляризованным процессом, поэтому выбор места инъекции очень важен. Инъекция в вегетативное полушарие или в экватор дает последовательные результаты, при этом все введенные ооциты успешно вставляют рецепторы и генерируют ионные токи, которые следуют унимодальному распределению22. Интересно, что когда мембраны были первоначально введены в полюс животных, реакции ооцитов следовали бимодальному распределению: одна группа ооцитов не имела никаких или очень низких ответов, в то время как другая группа имела большие ответы, даже большие, чем у ооцитов, введенных в вегетативный полюс или в экватор. Чтобы определить, имели ли некоторые из ооцитов, введенных в полюс животного, низкие реакции, потому что человеческие мембраны вводились и захватывались в ядре ооцита, смесь мембран, выделенных из электрического органа Torpedo и кДНК, кодирующей субъединицу GABAρ1, была введена в полюс животной стороны. Никотиновые рецепторы из мембран Torpedo показали быструю активацию и быструю десенсибилизацию во время перфузии ацетилхолина23, в то время как субъединица ρ1 образует гомомерные рецепторы GABAρ1, которые не десенсибилизируются при непрерывной перфузии ГАМК 24,25,26,27. Если совместно введенный образец случайно доставлялся в ядро, а не в цитоплазму, то кДНК транскрибировалась бы в РНК и трансформировалась в функциональные рецепторы GABAρ1. На фиг.2 показано, что когда инъекция была направлена в ядро, ооциты с высокими реакциями на ацетилхолин не экспрессировали рецепторы GABAρ1; и наоборот, ооциты с нулевым или низким ответом на ацетилхолин экспрессируют ГАМК-рецепторы. Результаты этого эксперимента указывают, во-первых, на то, что в низкоответственных ооцитах мембраны случайно отложились в ядро ооцита; во-вторых, впрыскивание торпедных мембран в ядро не сильно мешает транскрипции ρ1 кДНК. Несколько совместно введенных ооцитов имели большие реакции как на ацетилхолин, так и на ГАМК, что свидетельствует о разрыве ядра во время инъекции. Усиленное введение трансплантированных мембран в полушарие животного ооцита отражает поляризованную локализацию гетерологично-экспрессированных нейромедиаторных рецепторов 26,28. Поэтому, вводя в полушарие животного без нацеливания на ядро, можно получить более крупные ответы. Это важно для изучения образцов с низкой плотностью рецепторов, например, из ткани болезни Альцгеймера (AD) с низким количеством рецепторов (рисунок 3).

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные ионные токи ооцитов. Регистрировались ионные токи от ооцитов, вводимых мембранами от синаптических рецепторов человека. Рецепторы AMPA были активированы 100 мМ Каината, а рецепторыГАМК А с 1 мМ ГАМК. VH = -80 мВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Совместный впрыск торпеды и GABAρ1. Совместная инъекция фильтрованных мембран (0,1 мкм) из электрического органа Торпедо, богатого ацетилхолиновыми рецепторами, и кДНК, кодирующей рецептор ГАМК1, в полюс животных производила в основном две группы ооцитов на основе их реакций: одна группа ооцитов (А) имела большие ответы на ацетилхолин (Ach; 1 мМ), но не реагировала на 1 мкМ ГАМК (напряжение, зажатое до -80 мВ), и ооциты в группе (В) имели нулевые или низкие ответы на ACh, но большие ответы на ГАМК. (C) График показывает среднее ± стандартной погрешности среднего (SEM) пикового тока в группе 1 (n = 5 ооцитов) и группе 2 (n = 11 ооцитов). Один ооцит в группе 2 имел большие ответы ГАМК и ACh, предполагающие разрыв ядра; следовательно, распределение откликов было искажено до низких значений, о чем свидетельствует разница между средним и медианным распределением мембранного тока (22 нА против 6 нА). Этот результат указывает на то, что одной из причин низких реакционных ооцитов является то, что мембраны вводятся и захватываются в ядро ооцита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Поляризованная вставка клеточных мембран в ооциты Xenopus . ГАМК и кайнатные реакции ооцитов, вводимых в животный или растительный полюса, с нефильтрованными мембранами, полученными из мозга без AD (женщина, 74 года, посмертный интервал 2,8 ч) и AD-мозга (женщина, 74 года, посмертный интервал 4,5 ч). Ооциты, введенные вблизи полюса животных, без нацеливания на ядро, давали большие ответы, чем ооциты, введенные в вегетативный полюс, что позволяло изучать образцы тканей с очень низким количеством рецепторов. T-тест студента между вегетативным и животным полюсами: ** p < 0,01, *** p < 0,001, Бары указывают среднее ± SEM пикового тока, n = 5 ооцитов в каждой колонке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ нативных белковых комплексов из мозга человека необходим для понимания гомеостатических и патологических процессов при заболеваниях головного мозга и разработки терапевтических стратегий профилактики или лечения заболеваний. Таким образом, банки мозга, содержащие замороженные образцы, являются бесценным источником большого и в основном неиспользованного богатства физиологической информации29,30. Первоначальной проблемой использования посмертной ткани является явная возможность деградации мРНК или белка, которая может сбить с толку интерпретацию данных. Например, рН головного мозга последовательно показывает положительную корреляцию с количественной оценкой мРНК методом количественной ПЦР в реальном времени, и эта корреляция не зависит от патологии31. Межсубъектные различия рН могут привести к различиям количественной оценки мРНК с большими дисперсиями, которые могут затмить интерпретацию результатов32. Интересно, что, несмотря на более низкую количественную оценку транскриптов мРНК по мере подкисления рН, ковариации между различными транскриптами поддерживаются33, обеспечивая основу для получения надежного профилирования транскриптома патологических состояний. Важно отметить, что, хотя мРНК является высокоразлагаемой, трансмембранные белки в посмертной ткани очень устойчивы к деградации34. Предыдущие эксперименты в лаборатории продемонстрировали, что ГАМК и глутаматные рецепторы человеческого мозга функционируют после чрезвычайно больших посмертных интервалов35. Кроме того, метод МСМ позволяет непосредственно измерить влияние потенциальных смешивающих факторов, таких как рН в момент смерти, агональное состояние, а также деградацию мРНК и белка непосредственно на функцию рецепторов, обеспечивая тем самым способы использования этой информации при анализе и интерпретации данных.

Модификации и устранение неисправностей техники
Как упоминалось ранее, МСМ является небольшой модификацией первоначальной трансплантации общих мембран, которая является методом, который был широко проверен и подтвержден многими лабораториями в академических кругах и фармацевтической промышленности 12,36,37,38,39,40. Например, микротрансплантация рецепторов сыграла важную роль в разработке LY3130481 от Eli Lilly, который является гамма-8-селективным антагонистом рецепторов AMPA TARP, который показывает селективность области мозга12. МСМ следует тому же принципу микротрансплантации с использованием синаптосомно-обогащенных препаратов; поэтому важно иметь хорошие синаптосомальные препараты. Мы используем метод Syn-Per, потому что результаты, полученные с помощью этой процедуры, очень последовательны, амплитуда ионных токов очень хорошо коррелирует с уровнями синаптических белков в протеомных экспериментах10. Однако микротрансплантация или МСМ могут быть адаптированы для изучения рецепторов из многих источников (например, мембран насекомых38,39, нейролеммы40) с отличными результатами. Есть некоторые расстройства, при которых синапсы сильно страдают, как болезнь Альцгеймера, или доступны в небольших количествах; в этом случае инъекция мембран в животную сторону помогает в получении больших токов. Увеличение количества вводимого белка также увеличивает слияние мембран и размер ответов. Хотя существует отрицательная корреляция между концентрацией вводимых мембран и выживаемостью ооцитов, можно найти подходящую концентрацию мембран, что позволяет проводить данный экспериментальный анализ.

Ограничения МСМ
МСМ – это количественный метод, который был разработан для изучения рецепторов человека или ионных каналов; поэтому он хорошо подходит для изучения тканей с ограниченной доступностью. Поскольку ооциты Xenopus не имеют эндогенных рецепторов глутамата или ГАМК, любой ответ на ГАМК или глутамат в микротрансплантированных ооцитах исходит от введенных рецепторов, которые слились с мембраной ооцитов. Однако важным ограничением МСМ является изучение ионных каналов или транспортеров, которые также эндогенно экспрессируются в ооцитах, так как отделение ионных токов от микротрансплантированных и эндогенных каналов/транспортеров затруднено. Будущие исследования, заглушающие эндогенные гены, могут быть полезны с этим ограничением.

Значение для существующих методов заключается в том, что МСМ включает нативную мембрану с соответствующими белками и рецепторами и, таким образом, обеспечивает более физиологическую среду для анализа. Было обнаружено, что свойства рецепторов в их нативной мембране сохраняются после трансплантации в ооциты, как это наблюдается в нейротрансмиттерных рецепторах AMPA-типа GluR1, α7-AcChoRs и α4β2-AcChoRs из культивируемых клеток41.

Будущие применения методики включают изучение электрофизиологических свойств различных белков и рецепторов, представляющих интерес в мембранах культивируемых и некультивируемых клеток и тканей здорового и больного человеческого мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами NIA/NIH R01AG070255 и R01AG073133 для AL. Мы также благодарим Исследовательский центр болезни Альцгеймера Калифорнийского университета в Ирвине (UCI-ADRC) за предоставление тканей человека, показанных в этой рукописи. UCI-ADRC финансируется грантом NIH/NIA P30 AG066519.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
  3. Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  4. Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
  5. Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
  6. Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
  7. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
  8. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  9. Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
  10. Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
  11. Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
  12. Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
  13. Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
  14. Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
  15. Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
  16. Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
  17. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
  18. Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
  19. Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
  20. Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  22. Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
  23. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  24. Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
  25. Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
  26. Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
  27. Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
  28. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
  29. C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
  30. Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
  31. Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
  32. Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
  33. Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
  34. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  35. Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  36. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  37. Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
  38. Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
  39. Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
  40. Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
  41. Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).

Tags

Неврология Выпуск 185
Микротрансплантация синаптических мембран для реактивации синаптических рецепторов человека для функциональных исследований
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, B., Powell, A., Gutierrez,… More

Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter