Summary
Het protocol toont aan dat door microtransplantatie van synaptische membranen in Xenopus laevis-eicellen uit te voeren, het mogelijk is om consistente en betrouwbare reacties van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionzuur en γ-aminoboterzuurreceptoren vast te leggen.
Abstract
Exciterende en remmende ionotrope receptoren zijn de belangrijkste poorten van ionenfluxen die de activiteit van synapsen bepalen tijdens fysiologische neuronale communicatie. Daarom zijn veranderingen in hun overvloed, functie en relaties met andere synaptische elementen waargenomen als een belangrijke correlatie van veranderingen in de hersenfunctie en cognitieve stoornissen bij neurodegeneratieve ziekten en psychische stoornissen. Begrijpen hoe de functie van exciterende en remmende synaptische receptoren wordt veranderd door ziekte is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van effectieve therapieën. Om ziekterelevante informatie te verkrijgen, is het belangrijk om de elektrische activiteit van neurotransmitterreceptoren vast te leggen die functioneel blijven in het zieke menselijke brein. Tot nu toe is dit de dichtstbijzijnde benadering om pathologische veranderingen in de functie van receptoren te beoordelen. In dit werk wordt een methodologie gepresenteerd om microtransplantatie van synaptische membranen uit te voeren, die bestaat uit het reactiveren van synaptische membranen uit snap bevroren menselijk hersenweefsel met menselijke receptoren, door de injectie en posterieure fusie in het membraan van Xenopus laevis-eicellen . Het protocol biedt ook de methodologische strategie om consistente en betrouwbare reacties van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionzuur (AMPA) en γ-aminoboterzuur (GABA) receptoren te verkrijgen, evenals nieuwe gedetailleerde methoden die worden gebruikt voor normalisatie en rigoureuze gegevensanalyse.
Introduction
Neurodegeneratieve aandoeningen treffen een groot percentage van de bevolking. Hoewel hun verwoestende gevolgen bekend zijn, is het verband tussen de functionele veranderingen van neurotransmitterreceptoren, die van cruciaal belang zijn voor de hersenfunctie, en hun symptomatologie nog steeds slecht begrepen. Interindividuele variabiliteit, chronische aard van de ziekte en sluipenderwijs begin van symptomen zijn slechts enkele van de redenen die het begrip van de vele hersenaandoeningen hebben vertraagd waarbij chemische onevenwichtigheden goed gedocumenteerd zijn 1,2. Diermodellen hebben waardevolle informatie gegenereerd en onze kennis uitgebreid over de mechanismen die ten grondslag liggen aan fysiologie en pathofysiologie in evolutionair geconserveerde systemen; verschillende interspecies verschillen tussen knaagdieren en mensen verhinderen echter de directe extrapolatie van receptorfunctie van diermodellen naar het menselijk brein3. Zo werden de eerste inspanningen om inheemse menselijke receptoren te bestuderen ontwikkeld door het laboratorium van Ricardo Miledi met behulp van chirurgisch verwijderd weefsel en bevroren monsters. Deze eerste experimenten gebruikten hele membranen die neuronale synaptische en extra synaptische receptoren omvatten, evenals niet-neuronale neurotransmitterreceptoren, en hoewel ze belangrijke informatie over zieke toestanden bieden, is er bezorgdheid dat de mix van receptoren de interpretatie van gegevens bemoeilijkt 4,5,6,7. Belangrijk is dat synapsen het belangrijkste doelwit zijn bij veel neurodegeneratieve aandoeningen 8,9; daarom zijn testen om de functionele eigenschappen van aangetaste synapsen te testen van fundamenteel belang om informatie te verkrijgen over ziekterelevante veranderingen die de synaptische communicatie beïnvloeden. Hier wordt een wijziging van de oorspronkelijke methode beschreven: microtransplantatie van synaptische membranen (MSM), die zich richt op de fysiologische karakterisering van verrijkte synaptische eiwitpreparaten en met succes is toegepast om ratten en menselijke synaptosomen te bestuderen 10,11,12,13,14,15 . Met deze methodologie is het mogelijk om synaptische receptoren te transplanteren die ooit in het menselijk brein werkten, ingebed in hun eigen inheemse lipiden en met hun eigen cohort van geassocieerde eiwitten. Omdat MSM-gegevens kwantitatief zijn, is het bovendien mogelijk om deze gegevens te gebruiken om te integreren met grote proteomische of sequencinggegevenssets10.
Het is belangrijk op te merken dat veel farmacologische en biofysische analyses van synaptische receptoren worden uitgevoerd op recombinante eiwitten 16,17. Hoewel deze benadering beter inzicht biedt in de structuur-functierelaties van receptoren, kan het geen informatie geven over complexe multimere receptorcomplexen in neuronen en hun veranderingen in ziekte. Daarom moet een combinatie van inheemse en recombinante eiwitten een uitgebreidere analyse van synaptische receptoren opleveren.
Er zijn veel methoden om synaptosomen 10,11,12,13,14,15 te bereiden die kunnen worden aangepast aan de vereisten van een laboratorium. Het protocol begint met de veronderstelling dat synaptosomaal verrijkte preparaten werden geïsoleerd en klaar zijn om te worden verwerkt voor microtransplantatie-experimenten. In het laboratorium wordt de Syn-Per-methode gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Dit wordt gedaan vanwege de hoge reproduceerbaarheid in elektrofysiologische experimenten10,11. Er is ook overvloedige literatuur die uitlegt hoe Xenopus-eicellen 18,19 kunnen worden geïsoleerd, die ook klaar voor injectie kunnen worden gekocht20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het onderzoek wordt uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de institutionele Animal Care and Use Committee van de University of California Irvine (IACUC-1998-1388) en de University of Texas Medical Branch (IACUC-1803024). Temporale cortex van een niet-Alzheimer ziekte (AD) hersenen (vrouwelijk, 74 jaar oud, postmortaal interval 2,8 uur) en een AD-brein (vrouwelijk, 74 jaar oud, postmortaal interval 4,5 uur) werden verstrekt door het University of California Irvine Alzheimer's disease research center (UCI-ADRC). Geïnformeerde toestemming voor hersendonatie werd verkregen door UCI-ADRC.
OPMERKING: Niet-gefixeerd menselijk hersenweefsel moet worden behandeld als een bron van door bloed overgedragen pathogenen (BBP). Dienovereenkomstig is BBP-training nodig voordat met experimenten wordt begonnen. Dit protocol wordt uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) laboratorium onder BSL2-vereisten. Richtlijnen en voorzorgsmaatregelen binnen het laboratorium zijn onder meer: geen eten of drinken toegestaan in het laboratorium, goede laboratoriumpraktijken moeten worden gevolgd, persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, japon, geen schoenen met open tenen) zijn vereist en de deur moet te allen tijde gesloten zijn.
1. Xenopus oöcyt micro-injectie voorbereiding
- Om injectienaalden te maken, trekt u 3,5 inch borosilicaatbuizen met behulp van een micropipettetrekker. Zodra de microinjectielen zijn getrokken, gebruikt u een microscoop en een scheermesje om voldoende van de punt van de naald af te snijden, zodat micro-injectie kan worden uitgevoerd (meestal tussen 2-3 mm).
OPMERKING: De lengte van de te snijden punt van de naald kan variëren. - Bereid 1x Barth's oplossing door 200 ml Barth's Stock Solution (5x) toe te voegen aan 800 ml gedestilleerd water. Vul een 24-wells, platte bodem weefselkweekplaat met 18 °C 1x Barth's oplossing.
- Bereid 5x Barth's stock oplossing als volgt. Voeg in 1 l gedestilleerd water 25,71 g NaCl (natriumchloride), 0,372 g KCl (kaliumchloride), 0,301 g CaCl2 (calciumdichloride), 0,389 g Ca(NO3)2(4H2O) (calciumnitraattetrahydraat), 1,01 g MgSO4(7H2O) (magnesiumsulfaatheptahydraat), 1,008 g NaHCO3 (natriumbicarbonaat) toe, en 11,91 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur).
- Isoleer Xenopus-eicellen met behulp van de protocollen beschreven in18,19 en met behulp van 2x vergrote stereoscoop, waarbij gezond uitziende, stadium V-VI-eicellen worden geselecteerd. Plaats ongeveer 10 eicellen per put en gebruik een van de putten om niet-geïnjecteerde eicellen te huisvesten om te worden gebruikt als controlecellen bij het uitvoeren van opnames.
- Haal een kleine petrischaal op, 1 cm hoog en 6 cm in diameter, en plaats nylon gaas binnenin zodat het de bodem van de schaal bedekt. Giet vervolgens 15 ml 1x Barth's oplossing om te worden gebruikt voor het uitvoeren van micro-injecties van de eicellen.
- Plaats een nanoinjector langs de middellijn van het microscoopplatform. Draai de magneet naar de uit-positie en verplaats de nanoinjector langzaam naar de gewenste positie terwijl u deze voorzichtig ondersteunt. Wanneer de nanoinjector goed is gepositioneerd, draait u de magneet terug naar de volledig aan-positie en zorgt u ervoor dat deze veilig is.
- Gebruik voor een monstergrootte van 50,6 nL de volgende instellingen aan de zijkant van de nanoinjector: 1 is D (omlaag), 2 is D, 3 is U (omhoog), 4 is D en 5 is U. Plaats een stuk zelfdichtende thermoplastische of microcentrifugebuisdop op de microscoopstandaard en lijn deze uit met het traject van de nanoinjector.
OPMERKING: 50 nL is in de buurt van de maximale hoeveelheid geïnjecteerd materiaal die het cytoplasma kan weerstaan21. - Vul een insulinespuit ongeveer de helft van het volume met minerale olie (ongeveer 0,5 ml / cc). Vul met deze spuit de micro-injectienaald met minerale olie. Zorg ervoor dat een zichtbare oliekraal aan de punt van de naald wordt gezien.
- Stel de nanoinjectorzuiger bloot tot minimaal 1-2 cm. Doe dit door de EMPTY-knop ingedrukt te houden totdat de zuiger op de gewenste lengte zichtbaar is. Zodra de zuiger is blootgesteld, plaatst u langzaam en voorzichtig de met minerale olie gevulde micro-injectieglasnaald op de nanoinjectorzuiger en zorgt u ervoor dat deze goed door de zwarte weerstands-O-ring past en stopt bij de witte weerstandsring. Zorg ervoor dat u de nanoinjectorzuiger niet buigt tijdens het proces.
- Zodra de naald van het microinjectieglas veilig en op zijn plaats is, drukt u op LEEG om eventuele luchtbellen leeg te maken. Reinig voorzichtig, met een papieren zakdoekje, de overtollige minerale olie.
2. Het monster laden
- Bereid synaptosomale verrijkte preparaten (monsters) uit het menselijke hersengebied van belang zoals beschreven in 10,11,12,13,14,15 en bewaar ze in aliquots van ongeveer 5 μL bij -80 °C tot het moment van injectie.
- Breng vóór de injectie de aliquot over op nat ijs en bewaar het te allen tijde op ijs, behalve voor ultrasoonapparaat en ophalen. Het aantal en de soorten monsters worden bepaald door het experimentele ontwerp.
- Soniceer de geselecteerde monsters 3x in een bad met drijvend nat ijs om opwarmen van het monster te voorkomen. Gebruik elke keer cycli van 5 s en wacht 1 minuut op nat ijs tussen de cycli door.
- Plaats 1 μL monster op de thermoplast. Maak indien nodig een inkeping in het oppervlak voordat het monster wordt geplaatst om beweging van het monster te voorkomen.
- Gebruik de knoppen van de manipulator die de nanoinjector vasthoudt om de naald te positioneren en naar het te vullen monster te verplaatsen. Zodra de punt van de naald in het monster zit, houdt u de KNOP FILL ingedrukt totdat er voldoende monster is opgenomen. Ongeveer 0,5 μL is nodig voor 10 eicellen. Beweeg met behulp van de knoppen de naald van de nanoinjector terug naar de hoogste positie.
3. Injecteren van de eicellen
OPMERKING: Gestandaardiseerde synaptosomale membranen van de rattenschors worden ook in alle experimenten geïnjecteerd in een reeks eicellen om veranderingen in fusiecapaciteit tussen verschillende partijen eicellen te meten.
- Plaats geselecteerde eicellen op de kleine petrischaal met het aangebrachte nylon gaas en de oplossing van Barth (ongeveer 10 eicellen). Rangschik eicellen zo dat ze niet op elkaar liggen; dit zal nuttig zijn tijdens het injectieproces.
- Gebruik de knoppen op de manipulator die de nanoinjector vasthoudt en beweeg de naald naar de eicellen. Zodra de naald is ondergedompeld in de Oplossing van de Barth, gebruikt u het voetpedaal voor de nanoinjector om ervoor te zorgen dat de micro-injectienaald het monster vrijgeeft. Als het monster wordt vrijgegeven, is het zichtbaar vanuit de microscoopweergave.
- Zodra met zekerheid is vastgesteld dat het monster wordt vrijgegeven, gaat u verder met het micro-injecteren van de eicel. Als het monster niet wordt vrijgegeven, herhaalt u het proces van het vullen van de naald.
- Penetreer de eicel net onder het oppervlak met de naald, niet dieper, en gebruik het voetpedaal om het monster te injecteren. Het voetpedaal maakt een pieptoon wanneer het sample wordt vrijgegeven. Wacht ongeveer 2-3 s. Als de injectie succesvol was, zal de cel uitzetten. Zodra dit gebeurt, gebruikt u de knoppen op de manipulator om de cel te verlaten.
OPMERKING: Fusie van membranen in de eicel is een gepolariseerd proces; daarom moet de eicel worden geïnjecteerd in de dierlijke kant van de cel, bij voorkeur boven de evenaar, met de hoek van de naald naar de dierlijke kant om de membraanfusie te maximaliseren. - Verplaats de petrischaal zodat de volgende eicel is uitgelijnd met de naald en herhaal het proces totdat alle eicellen in de schaal zijn geïnjecteerd. Herhaal dit proces totdat het gewenste aantal eicellen is geïnjecteerd. Zorg ervoor dat een putje eicellen niet wordt geïnjecteerd om als controle te worden gebruikt.
- Zodra alle eicellen zijn geïnjecteerd, trekt u de nanoinjector terug naar de oorspronkelijke positie en verwijdert u de naald.
4. Registratie van ionenstromen met behulp van een spanningsklem met twee elektroden
- Om twee elektrodespanningsklem (TEVC) elektrodenaalden te maken, trekt u 15 cm lange vuur gepolijste borosilicaatglasbuizen met behulp van de micropipettetrekker. Zodra het trekken is voltooid, vult u met 3 M KCl met behulp van lange capillaire naalden, of als alternatief, dompelt en kookt u de naalden in 3 M KCl-oplossing gedurende 15 minuten onder een continu vacuüm. De hoge temperatuur helpt bij het vullen van de elektroden en het verwijderen van luchtbellen.
- Bereid een 3 M KCl elektrodevuloplossing met behulp van KCl in de kristallijne vorm en gedeïoniseerd water en volg deze stappen zorgvuldig, zodat de referentiepotentiaal van elektroden niet wordt gewijzigd. Droog de KCl voorzichtig in een oven gedurende 2-3 uur. Weeg met behulp van een analytische balans voorzichtig 223,68 g KCl. Breng de KCl over in een glazen fles van 1 L. Gebruik deze oplossing om zilverelektrodedraden te chloreren.
LET OP: Voor het trekken van glazen elektroden is het pipetkookboek hier te downloaden: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
- Bereid een 3 M KCl elektrodevuloplossing met behulp van KCl in de kristallijne vorm en gedeïoniseerd water en volg deze stappen zorgvuldig, zodat de referentiepotentiaal van elektroden niet wordt gewijzigd. Droog de KCl voorzichtig in een oven gedurende 2-3 uur. Weeg met behulp van een analytische balans voorzichtig 223,68 g KCl. Breng de KCl over in een glazen fles van 1 L. Gebruik deze oplossing om zilverelektrodedraden te chloreren.
- Schakel alle apparatuur in die wordt gebruikt voor de registratie van ionenstromen: hoofdsystemen, oplossingskleppen, microscooplicht, klepsystemen, eicelklem en vacuümsysteem. Schakel de desktopcomputer in, meld u aan bij WinEDR V3.9.1. en zorg ervoor dat het programma wordt uitgevoerd en dat de installatiewaarden als volgt correct zijn: opnemen op schijf, opnameduur instellen en de simulatoroptie wissen.
- Geef de volgende initiële instellingswaarden voor de versterker op: schakel voor het gedeelte spanningselektrode (Vm) de negatieve capaciteitscompensatie (-C) uit; voor het gedeelte badelektroden (Im), stelt u de versterkingsschakelaar (bereik van 0,1 tot 10) in op 10 en de schakelaar met drie standen waarmee de versterkingsvermenigvuldigingsfactor (x0,1, x1,0 en x10) op x1,0 wordt geselecteerd. De LED-lampjes geven de selectie van de gain multiplier aan; voor het klemgedeelte, schakel de klemmoduskeuzeschakelaar uit, stel de DC-versterkingsregeling in op IN en de versterkingsregeling volledige bandbreedte open-lus (bereik 0 tot 2000) tot ongeveer 1200; voor commando's, ingesteld op 40mV en de hold controls negatief en schaal multiplier ingesteld op x2; gebruik voor de stroomelektrode de Ve-offset om een nulreferentie vast te stellen voordat de eicel wordt gespietst.
- Als u wilt opnemen, opent u de WinEDR V3.9.1-software, gaat u naar het bovenste menu en selecteert u Bestand > Nieuw bestand openen. Maak uw eigen map en sla het bestand op.
- Selecteer vervolgens in het hoofdmenu Record > Record to Disk. Wanneer de twee elektroden zich in de ooctyet bevinden, schakelt u de beltoon in de VC-8-klepregelaar in en zet u de klem op Langzaam in de OC-725C-versterker. Ga vervolgens terug naar de WinEDR-software en selecteer Record in de linkerbovenhoek van het scherm.
- Noteer in het markeringsdiagram linksonder uw initiële membraanpotentiaal en druk op Enter. Terwijl het experiment doorgaat, kunt u de naam van de gebruikte medicijnen opschrijven. Zodra het experiment is voltooid, selecteert u Stoppen in de linkerbovenhoek van het scherm.
OPMERKING: We gebruiken WinEDR- of WinWCP-software om TEVC uit te voeren, omdat deze gratis en zeer geschikt zijn voor experimenten, maar alle andere software die beschikbaar is, kan worden gebruikt.
- Maak alle medicijnoplossingen die nodig zijn om het experiment uit te voeren (bijv. GABA, Kainate) en bevestig dat de oplossingskleppen goed werken door ze in en uit te schakelen en de verplaatsing van de knijpkleppen te observeren.
- Vul de buizen door de overeenkomstige oplossing op de spuithouder te gieten die op de buis is aangesloten en label de klepregelaar om te correleren met de oplossingsbuizen. Zorg ervoor dat de stroom van de oplossing stabiel is, dat er geen bellen zijn en dat het vacuümsysteem goed werkt.
- Stel het microscoop- en opnamekamergebied in. Plaats de agarbruggen (zie hieronder) in de respectieve cirkelvormige gaten achter de opnamekamer (distale van het hanteringsgebied) en verbind de putten voor de elektroden die als grondreferentie worden gebruikt en de opnamekamer. Voeg de werkoplossing van Ringer (1x) toe aan de opnamekamer en de grondreferentie-elektrodeputten.
- Agarbruggen zijn U-vormige borosilicaatbuizen, 2-3 cm lang, gevuld met 3% agar in ringer's oplossing. Maak U-vormige buizen door 15 cm lange buizen te snijden, ze op het open vuur te buigen en ze vervolgens te vullen met hete 3% agar met behulp van een insulinespuit. Bewaar gevulde agarbruggen in Ringer's oplossing in de koelkast tot gebruik.
- Maak 20x Ringer's stockoplossing als volgt: Voeg in 1 l gedestilleerd water 134,4 g NaCl, 2,982 g KCl, 5,29 g CaCl2 en 23,83 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur) toe. Voeg voor 1x Ringer's werkoplossing, in een volumetrische kolf, 200 ml Ringer's stockoplossing (20x) toe aan 3.800 ml gedestilleerd water.
- Bereid gechloreerde zilverelektroden voorafgaand aan elk experiment voor door elektrolyse door zilverdraden in een 3 M KCl-oplossing te plaatsen en de zilverelektrode aan te sluiten op de positieve pool van een 9 V-batterij. Na ongeveer 3 min wordt een stevige bruine laag AgCl in de elektrode afgezet. Plaats de gechloreerde zilveren elektrodedraden in de behuizing van de elektrode.
OPMERKING: Grondreferentie en opname van gechloreerde elektroden zijn zilver/zilverchloride (Ag/AgCl) elektroden. - Verwijder de borosilicienaalden uit de KCl-oplossing. Gebruik een spuit om een kleine hoeveelheid KCl-oplossing uit het open uiteinde van de elektrodenaald te extraheren en vervang de KCl-oplossing door minerale olie; dit voorkomt waterverdamping en veranderingen in de KCl-concentratie in de naald. Schuif de glazen naald over de gechloreerde zilveren elektrodedraad en draai ze op hun plaats.
- Gebruik de rechter- en linkermanipulatoren die de elektroden vasthouden en leid de elektrodenaalden naar de opnamekamer die is gevuld met Ringer's Solution.
- Controleer de weerstand van elke elektrode door de Vm- en Ve-offsetknoppen op nul te zetten en vervolgens op de elektrodetestknoppen te drukken. De weerstand moet tussen 0,5-3 MΩ liggen (direct gelezen als 5-30 mV in het scherm). Als de weerstand buiten het bereik ligt, vervang dan met behulp van nieuwe micro-elektroden.
- Vul de opnamekamer met verse Ringer's oplossing. Plaats met behulp van een glazen pipet een niet-geïnjecteerde of een microtransplantaat eicel in het midden van de opnamekamer. Zorg ervoor dat de eicel duidelijk zichtbaar is onder de microscoop, met de dierlijke kant naar boven (zie OPMERKING in stap 3.4).
- Leid de elektrode in de oplossing van de Ringer totdat ze het eicelmembraan raken. Doorboort voorzichtig het eicelmembraan aan de dierlijke kant (zie OPMERKING in stap 3.4) met beide elektroden en noteer de rustmembraanpotentiaal. Schakel de oplossingsstroom van de Ringer in.
- Gebruik de eicelklemversterker om de modus in Spanningsklem te veranderen en de houdspanning van -80 mV in te stellen. De stroom op de monitor moet negatief zijn, meestal tussen 0 en 0,4 microampères.
- Maak een nieuw bestand om de opname op te slaan als Bestand > Nieuwe > Sla de opname op de software op. Begin met opnemen, druk op Opnemen > Opnemen op schijf. Voeg relevante informatie toe aan het bestand met behulp van het markeringsvenster (testnaam, gebruikte geneesmiddelen, enz.).
- Breng agonisten (bijv. GABA, glutamaat of kaïnaat) aan voor chemische stimulatie door de kleppen te openen en ze gedurende 15 s in de opnamekamer te perfuseren. Gebruik meestal een versterking van 10x om het maximale aantal punten te plotten en de respons te reconstrueren. Als de stromen erg klein zijn, verhoog dan de versterking of versterking om ze te evalueren en zichtbaar te maken. Noteer deze wijzigingen altijd.
OPMERKING: De duur van de perfusie hangt af van het experimentele paradigma. Als het belangrijkste doel is om de maximale amplitude te meten, is 15 s voldoende om de piek voor GABA of het plateau voor kainate te bereiken. - Bewaak altijd de oplossingsniveaus. De oplossing van Ringer moet regelmatig worden bijgevuld omdat deze tussen alle toepassingen van de oplossing wordt gebruikt. Zodra de opname is voltooid, zet u de spanningsklem in de UIT-positie en schakelt u de oplossingsklep van de Ringer uit. Verwijder de eicel. Stop met opnemen en sla het bestand op. Herhaal deze stappen voor alle geïnjecteerde eicellen.
5. Tevc-opnames analyseren
- Sla een kopie van de opnamen op een USB-station op. Open van daaruit het gewenste bestand dat moet worden geanalyseerd. In het bestand dat wordt geopend, kan de opname worden bekeken, gemarkeerd en gemeten. De meest voorkomende analyse omvat het meten van maximale amplitude, activeringstijd, desensibilisatie en een overzicht van repetitieve toepassingen.
- Meet de maximale AMPA-respons en de GABA-piekrespons. Als u deze metingen wilt verkrijgen, stelt u eerst een nulniveau of basislijn vast door de rode lijn met de cursor te vinden en deze naar de stroom te slepen die wordt gegenereerd door de Ringer-toepassing of basislijn.
- Zodra het nulniveau is vastgesteld, bepaalt u de responsmetingen door met de muis de groene, verticale uitleescursor naar het gewenste deel van de grafiektracer te slepen. Exporteer desgewenst de te analyseren sporen in andere voorkeurssoftware
OPMERKING: Als het nulniveau niet kan worden gedefinieerd of als er te veel ruis op de tracer wordt aangegeven, exporteert u het WinEDR-bestand naar een offline analytische software, die wijzigingen mogelijk maakt om een niveaubasislijn en de toevoeging van filters te bieden om ruis te verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Binnen een paar uur na injectie beginnen de synaptische membranen, die hun neurotransmitterreceptoren en ionkanalen dragen, te fuseren met het plasmamembraan van de eicel. Figuur 1 toont opnames van AMPA- en GABAA-receptoren die zijn gemicrotransplanteerd in Xenopus-eicellen. Voor het grootste deel van de analyse werden de responsen van twee of drie eicellen per monster gemeten, met behulp van twee of drie partijen eicellen van verschillende kikkers, voor een totaal van zes tot negen eicellen per monster. Dit wordt gedaan voor een groot cohort van menselijke proefpersonen om groepsverschillen te observeren. De analyse is eenvoudig en meet de amplitude van reacties. Het is belangrijk op te merken dat de fusie van de getransplanteerde membranen een gepolariseerd proces is, dus selectie van de injectieplaats is erg belangrijk. Injectie in de plantaardige hemisfeer of in de evenaar geeft consistente resultaten, waarbij alle geïnjecteerde eicellen met succes receptoren inbrengen en ionenstromen genereren die een unimodale verdeling volgen22. Interessant is dat wanneer de membranen aanvankelijk in de dierlijke pool werden geïnjecteerd, de oöcytresponsen een bimodale verdeling volgden: de ene groep eicellen had geen of zeer lage reacties, terwijl de andere groep grote responsen had, zelfs groter dan die van eicellen geïnjecteerd in de plantaardige pool of in de evenaar. Om te bepalen of sommige van de in de dierenpool geïnjecteerde eicellen lage responsen hadden omdat de menselijke membranen werden geïnjecteerd en gevangen in de kern van de eicel, werd een mix van membranen geïsoleerd uit het elektrische orgaan van Torpedo en cDNA die coderen voor de GABAρ1-subeenheid geïnjecteerd in de pool van de dierlijke kant. De nicotinereceptoren uit de Torpedo-membranen vertoonden een snelle activering en snelle desensibilisatie tijdens perfusie van acetylcholine23, terwijl de ρ1-subeenheid homomere GABAρ1-receptoren vormt die niet desensibiliseren tijdens continue perfusie van GABA 24,25,26,27. Als het co-geïnjecteerde monster per ongeluk in de kern werd afgeleverd en niet in het cytoplasma, dan zou het cDNA worden getranscribeerd in RNA en vertaald in functionele GABAρ1-receptoren. Figuur 2 laat zien dat wanneer de injectie op de kern was gericht, eicellen met hoge responsen op acetylcholine geen GABAρ1-receptoren tot expressie brachten; omgekeerd, oöcyten met nul of lage respons op acetylcholine uitgedrukt GABA receptoren. De resultaten van dit experiment geven ten eerste aan dat bij oöcyten met een lage respons per ongeluk in de kern van de eicel werden afgezet; ten tweede interfereert de injectie van torpedembranen in de kern niet sterk met de transcriptie van ρ1 cDNA. Een paar co-geïnjecteerde eicellen hadden grote reacties op zowel acetylcholine als GABA, wat wijst op breuk van de kern tijdens de injectie. De verbeterde inbrenging van getransplanteerde membranen in de dierlijke hemisfeer van de eicel weerspiegelt de gepolariseerde lokalisatie van de heterologe neurotransmitterreceptoren 26,28. Daarom is het mogelijk om grotere reacties te verkrijgen door in de dierlijke hemisfeer te injecteren zonder zich op de kern te richten. Dit is belangrijk om monsters met een lage dichtheid van receptoren te bestuderen, bijvoorbeeld van de ziekte van Alzheimer (AD) weefsel met een laag aantal receptoren (figuur 3).
Figuur 1: Representatieve ionenstromen van eicellen. Ionenstromen van eicellen geïnjecteerd met membranen van menselijke synaptische receptoren werden geregistreerd. AMPA-receptoren werden geactiveerd met 100 mM Kainate en GABAA-receptoren met 1 mM GABA. VH = -80 mV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Co-injectie van Torpedo en GABAρ1. Co-injectie van gefilterde membranen (0,1 μm) uit het elektrische orgaan van Torpedo, rijk aan acetylcholinereceptoren, en cDNA-codering voor de GABAρ1-receptor in de dierlijke pool produceerde voornamelijk twee groepen eicellen op basis van hun responsen: één groep eicellen (A) had grote reacties op acetylcholine (Ach; 1 mM) maar geen reacties op 1 μM GABA (spanning geklemd tot -80 mV), en eicellen in groep (B) hadden nul of lage responsen op ACh, maar grote responsen op GABA. (C) Grafiek toont gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van de piekstroom in groep 1 (n = 5 eicellen) en groep 2 (n = 11 eicellen). Eén eicel in groep 2 had grote GABA- en ACh-responsen die wijzen op breuk van de kern; bijgevolg was de verdeling van de responsen scheefgetrokken naar lage waarden, zoals opgemerkt door het verschil tussen gemiddelde en mediaan van de verdeling van de membraanstroom (22 nA vs 6 nA). Dit resultaat geeft aan dat een van de oorzaken van oöcyten met een lage respons is dat de membranen worden geïnjecteerd en gevangen in de kern van de eicel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gepolariseerde inbrenging van celmembranen in Xenopus-eicellen . GABA- en kaïnaatreacties van eicellen geïnjecteerd in de dierlijke of plantaardige polen, met ongefilterde membranen verkregen uit een niet-AD-brein (vrouwelijk, 74 jaar oud, postmortaal interval 2,8 uur) en een AD-brein (vrouwelijk, 74 jaar oud, postmortaal interval 4,5 uur). Eicellen geïnjecteerd in de buurt van de dierlijke pool, zonder zich op de kern te richten, gaven grotere reacties dan eicellen die in de plantaardige pool werden geïnjecteerd, waardoor weefselmonsters met zeer lage aantallen receptoren konden worden bestudeerd. Student's t-test tussen plantaardige en dierlijke polen: ** p < 0,01, *** p < 0,001, Bars geven de gemiddelde ± SEM van piekstroom aan, n = 5 eicellen per kolom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse van inheemse eiwitcomplexen uit menselijke hersenen is nodig om homeostatische en pathologische processen bij hersenaandoeningen te begrijpen en therapeutische strategieën te ontwikkelen om ziekten te voorkomen of te behandelen. Hersenbanken met snap frozen monsters zijn dus een onschatbare bron van een grote en meestal onaangeboorde schat aan fysiologische informatie29,30. Een eerste zorg voor het gebruik van postmortaal weefsel is de duidelijke mogelijkheid van mRNA- of eiwitafbraak die de interpretatie van gegevens kan verstoren. De pH van de hersenen vertoont bijvoorbeeld consequent een positieve correlatie met de kwantificering van mRNA door kwantitatieve real-time-PCR, en deze correlatie is onafhankelijk van de pathologie31. Inter-subject verschillen in pH kunnen leiden tot verschillen in mRNA-kwantificering met grote afwijkingen die de interpretatie van resultaten kunnen verdoezelen32. Interessant is dat, ondanks de lagere kwantificering van mRNA-transcripten naarmate de pH verzuurt, de covarianten tussen de verschillende transcripten worden gehandhaafd33, wat een kader biedt voor het verkrijgen van betrouwbare transcriptoomprofilering van pathologische toestanden. Belangrijk is dat, hoewel mRNA zeer afbreekbaar is, transmembraaneiwitten in het postmortale weefsel zeer resistent zijn tegen afbraak34. Eerdere experimenten in het laboratorium hebben aangetoond dat GABA en glutamaatreceptoren van het menselijk brein functioneel zijn na extreem grote postmortale intervallen35. Bovendien maakt de MSM-methode het mogelijk om de effecten van potentiële verstorende factoren zoals pH op het moment van overlijden, agonale toestand en mRNA- en eiwitafbraak direct op de functie van receptoren te meten, waardoor manieren worden geboden om deze informatie te gebruiken bij de analyse en interpretatie van gegevens.
Wijzigingen en probleemoplossing van de techniek
Zoals eerder vermeld, is de MSM een kleine wijziging van de oorspronkelijke transplantatie van totale membranen, een methode die op grote schaal is gevalideerd en bevestigd door veel laboratoria in academici en de farmaceutische industrie 12,36,37,38,39,40. Microtransplantatie van receptoren was bijvoorbeeld belangrijk bij de ontwikkeling van Eli Lilly's LY3130481, een TARP gamma-8-selectieve antagonist van AMPA-receptoren die de selectiviteit van het hersengebied12 vertoont. MSM volgt hetzelfde microtransplantatieprincipe met behulp van synaptosomale verrijkte preparaten; daarom is het hebben van goede synaptosomale preparaten belangrijk. We gebruiken de Syn-Per-methode omdat de resultaten die met deze procedure worden verkregen zeer consistent zijn en de amplitude van de ionenstromen zeer goed correleert met de niveaus van synaptische eiwitten in proteomische experimenten10. De microtransplantatie of de MSM kan echter worden aangepast om receptoren uit vele bronnen (bijv. Insectenmembranen38,39, neurolemma40) te bestuderen met uitstekende resultaten. Er zijn enkele aandoeningen waarbij synapsen sterk worden aangetast, zoals de ziekte van Alzheimer, of in kleine hoeveelheden beschikbaar zijn; in dit geval helpt injectie van de membranen in de dierlijke kant bij het krijgen van grotere stromen. Het verhogen van de hoeveelheid geïnjecteerd eiwit verhoogt ook de fusie van membranen en de grootte van de reacties. Hoewel er een negatieve correlatie is tussen de concentratie van geïnjecteerde membranen en de overleving van eicellen, is het mogelijk om een geschikte concentratie van membranen te vinden die de gegeven experimentele analyse mogelijk maakt.
Beperkingen van MSM
De MSM is een kwantitatieve methode die is ontwikkeld voor de studie van menselijke receptoren of ionkanalen; daarom is het zeer geschikt om weefsel met beperkte beschikbaarheid te bestuderen. Omdat Xenopus-eicellen geen endogene glutamaat- of GABA-receptoren hebben, komt elke reactie op GABA of glutamaat in microtransplantaten van de geïnjecteerde receptoren die zijn gefuseerd met het membraan van de eicellen. Een belangrijke beperking van MSM is echter de studie van ionkanalen of transporters die ook endogeen tot expressie komen in eicellen, omdat de scheiding van ionenstromen van microtransplantaten en endogene kanalen / transporters moeilijk is. Toekomstige studies die endogene genen uitschakelen, kunnen nuttig zijn bij deze beperking.
Het belang van bestaande methoden is dat MSM het inheemse membraan met de bijbehorende eiwitten en receptoren bevat en dus een meer fysiologische omgeving biedt voor de analyse. Het is gebleken dat de eigenschappen van de receptoren in hun oorspronkelijke membraan behouden blijven na transplantatie naar de eicellen, zoals waargenomen in neurotransmitterreceptoren AMPA-type GluR1, α7-AcChoRs en α4β2-AcChoRs uit gekweekte cellen41.
Toekomstige toepassingen van de techniek omvatten de studie van de elektrofysiologische eigenschappen van verschillende eiwitten en receptoren van belang in de membranen van gekweekte en niet-gekweekte cellen en weefsels van gezonde en zieke menselijke hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIA/NIH subsidies R01AG070255 en R01AG073133 aan AL. We bedanken ook het onderzoekscentrum voor de ziekte van Alzheimer van de Universiteit van Californië (UCI-ADRC) voor het verstrekken van het menselijke weefsel dat in dit manuscript wordt getoond. De UCI-ADRC wordt gefinancierd door NIH / NIA-subsidie P30 AG066519.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
- Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
- Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
- Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
- Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
- Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
- Bae, J. R., Kim, S. H.
- Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
- Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
- Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
- Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
- Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
- Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
- Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
- Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
- Bröer, S.
- Newman, K., Aguero, T., King, M.
- Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M.
- Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
- Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
- Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
- Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
- C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
- Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
- Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
- Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
- Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
- Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
- Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
- Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
- Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
- Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
- Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).
