Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrotransplantation af synaptiske membraner til genaktivering af humane synaptiske receptorer til funktionelle undersøgelser

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64024
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen viser, at ved at udføre mikrotransplantation af synaptiske membraner i Xenopus laevis oocytter er det muligt at registrere konsistente og pålidelige reaktioner af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre og γ-aminosmørsyrereceptorer.

Abstract

Excitatoriske og hæmmende ionotrope receptorer er de vigtigste porte af ionfluxer, der bestemmer aktiviteten af synapser under fysiologisk neuronal kommunikation. Derfor er ændringer i deres overflod, funktion og forhold til andre synaptiske elementer blevet observeret som en vigtig korrelation af ændringer i hjernefunktion og kognitiv svækkelse i neurodegenerative sygdomme og psykiske lidelser. At forstå, hvordan funktionen af excitatoriske og hæmmende synaptiske receptorer ændres af sygdom, er af afgørende betydning for udviklingen af effektive terapier. For at få sygdomsrelevant information er det vigtigt at registrere den elektriske aktivitet af neurotransmitterreceptorer, der forbliver funktionelle i den syge menneskelige hjerne. Indtil videre er dette den nærmeste tilgang til vurdering af patologiske ændringer i receptorernes funktion. I dette arbejde præsenteres en metode til at udføre mikrotransplantation af synaptiske membraner, som består i at reaktivere synaptiske membraner fra snapfrosset humant hjernevæv indeholdende humane receptorer ved injektion og posterior fusion i membranen af Xenopus laevis oocytter. Protokollen giver også den metodologiske strategi for at opnå konsistente og pålidelige reaktioner af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) og γ-aminosmørsyre (GABA) receptorer samt nye detaljerede metoder, der anvendes til normalisering og streng dataanalyse.

Introduction

Neurodegenerative lidelser påvirker en stor procentdel af befolkningen. Selvom deres ødelæggende konsekvenser er velkendte, er forbindelsen mellem de funktionelle ændringer af neurotransmitterreceptorer, som er kritiske for hjernens funktion, og deres symptomatologi stadig dårligt forstået. Interindividuel variation, sygdommens kroniske karakter og snigende symptomdebut er blot nogle af de årsager, der har forsinket forståelsen af de mange hjernesygdomme, hvor kemiske ubalancer er veldokumenterede 1,2. Dyremodeller har genereret uvurderlig information og udvidet vores viden om de mekanismer, der ligger til grund for fysiologi og patofysiologi i evolutionære bevarede systemer; imidlertid udelukker flere interspecies forskelle mellem gnavere og mennesker den direkte ekstrapolering af receptorfunktionen fra dyremodeller til den menneskelige hjerne3. Således blev de indledende bestræbelser på at studere indfødte humane receptorer udviklet af Ricardo Miledis laboratorium ved hjælp af kirurgisk fjernet væv og frosne prøver. Disse indledende eksperimenter anvendte hele membraner, der inkluderer neuronale synaptiske og ekstra synaptiske receptorer samt ikke-neuronale neurotransmitterreceptorer, og selvom de giver vigtige oplysninger om syge tilstande, er der bekymring for, at blandingen af receptorer komplicerer fortolkningen af data 4,5,6,7. Det er vigtigt, at synapser er det vigtigste mål i mange neurodegenerative lidelser 8,9; derfor er assays for at teste de funktionelle egenskaber af berørte synapser grundlæggende for at få information om sygdomsrelevante ændringer, der påvirker synaptisk kommunikation. Her beskrives en modifikation af den oprindelige metode: mikrotransplantation af synaptiske membraner (MSM), der fokuserer på den fysiologiske karakterisering af berigede synaptiske proteinpræparater og med succes er blevet anvendt til at studere rotte- og humane synaptosomer 10,11,12,13,14,15 . Med denne metode er det muligt at transplantere synaptiske receptorer, der engang arbejdede i den menneskelige hjerne, indlejret i deres egne indfødte lipider og med deres egen kohorte af associerede proteiner. Da MSM-data er kvantitative, er det desuden muligt at bruge disse data til at integrere med store proteomiske eller sekventerende datasæt10.

Det er vigtigt at bemærke, at mange farmakologiske og biofysiske analyser af synaptiske receptorer udføres på rekombinante proteiner16,17. Mens denne tilgang giver bedre indsigt i receptorernes struktur-funktionsforhold, kan den ikke give information om komplekse multimere receptorkomplekser, der findes i neuroner og deres ændringer i sygdom. Derfor bør en kombination af indfødte og rekombinante proteiner give en mere omfattende analyse af synaptiske receptorer.

Der er mange metoder til at forberede synaptosomer 10,11,12,13,14,15, som kan justeres til kravene i et laboratorium. Protokollen begynder med antagelsen om, at synaptosomale berigede præparater blev isoleret og er klar til at blive behandlet til mikrotransplantationsforsøg. I laboratoriet anvendes Syn-Per-metoden efter producentens anvisninger. Dette gøres på grund af høj reproducerbarhed i elektrofysiologiske eksperimenter 10,11. Der er også rigelig litteratur, der forklarer, hvordan man isolerer Xenopus oocytter18,19, som også kan købes klar til injektion20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al forskning udføres i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og godkendes af det institutionelle animal care and use committee ved University of California Irvine (IACUC-1998-1388) og University of Texas Medical Branch (IACUC-1803024). Temporal cortex fra en ikke-Alzheimers sygdom (AD) hjerne (kvinde, 74 år gammel, postmortem interval 2,8 h) og en AD-hjerne (kvinde, 74 år gammel, postmortem interval 4,5 h) blev leveret af University of California Irvine Alzheimers sygdom forskningscenter (UCI-ADRC). Informeret samtykke til hjernedonation blev indhentet af UCI-ADRC.

BEMÆRK: Ikke-fikseret humant hjernevæv bør behandles som en kilde til blodbårne patogener (BBP). Derfor er BBP-træning nødvendig, inden eksperimenter påbegyndes. Denne protokol udføres i et laboratorium på biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) under BSL2-kravene. Retningslinjer og forholdsregler i laboratoriet inkluderer: ingen mad eller drikkevarer tilladt i laboratoriet, god laboratoriepraksis skal følges, personlige værnemidler (handsker, kjole, ingen åbne sko) er påkrævet, og døren skal altid lukkes.

1. Xenopus oocyt mikroinjektion forberedelse

  1. For at fremstille injektionsnåle skal du trække 3,5 tommer borosilikatrør ved hjælp af en mikropipette-trækker. Når mikroinjektionsnålene er trukket, skal du bruge et mikroskop og et barberblad til at afskære nok af nålespidsen, så mikroinjektion kan udføres (normalt mellem 2-3 mm).
    BEMÆRK: Længden af nålens spids, der skal skæres, kan variere.
  2. Forbered 1x Barths opløsning ved at tilsætte 200 ml Barths stockopløsning (5x) til 800 ml destilleret vand. Fyld en 24-brønd, fladbundet vævskulturplade med 18 °C 1x Barths opløsning.
    1. Forbered 5x Barths stamopløsning som følger. I 1 liter destilleret vand tilsættes 25,71 g NaCl (natriumchlorid), 0,372 g KCl (kaliumchlorid), 0,301 gCaCl2 (calciumdichlorid), 0,389 g Ca(NO3)2(4H2O) (calciumnitrattetrahydrat), 1,01 g MgSO4(7H2O) (magnesiumsulfatheptahydrat), 1,008 g NaHCO3 (natriumbicarbonat), og 11,91 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsyre).
  3. Isoler Xenopus-oocytter ved hjælp af protokollerne beskrevet i18,19 og ved hjælp af 2x forstørret stereoskop, valg af sunde udseende, trin V-VI-oocytter. Placer ca. 10 oocytter pr. brønd, og brug en af brøndene til at huse ikke-injicerede oocytter, der skal bruges som kontrolceller, når der udføres optagelser.
  4. Hent et lille petriskål, 1 cm højt og 6 cm i diameter, og læg nylonnet indeni, så det dækker bunden af fadet. Hæld derefter 15 ml 1x Barths opløsning, der skal anvendes til udførelse af mikroinjektioner af oocytterne.
  5. Placer en nanoinjektor langs mikroskopplatformens midterlinje. Drej magneten til off-positionen , og flyt langsomt nanoinjektoren til den ønskede position, mens du støtter den forsigtigt. Når nanoinjektoren er korrekt placeret, skal du dreje magneten tilbage til fuld On-position og sørge for, at den er sikker.
  6. For en prøvestørrelse på 50,6 nL skal du bruge følgende indstillinger på siden af nanoinjektoren: 1 er D (ned), 2 er D, 3 er U (op), 4 er D, og 5 er U. Placer et stykke selvforseglende termoplastisk eller mikrocentrifuge rørhætte på mikroskopstativet og juster det med nanoinjektorens bane.
    BEMÆRK: 50 nL er nær den maksimale mængde injiceret materiale, som cytoplasmaet kan modstå21.
  7. Fyld en insulinsprøjte ca. halvdelen af dens volumen med mineralolie (ca. 0,5 ml / cc). Brug denne sprøjte til at fylde mikroinjektionsnålen med mineralolie. Sørg for, at der ses en synlig olieperle ved spidsen af nålen.
  8. Udsæt nanoinjektor stemplet til mindst 1-2 cm. Gør dette ved at holde KNAPPEN TOM nede, indtil stemplet er synligt i den ønskede længde. Når stemplet er blottet, skal du langsomt og forsigtigt placere den mineraloliefyldte mikroinjektionsglasnål på nanoinjektorstemplet og sørge for, at den passer godt gennem den sorte modstands-O-ring og stopper ved den hvide modstandsring. Sørg for ikke at bøje nanoinjektorstemplet i processen.
  9. Når mikroinjektionsglasnålen er sikker og på plads, skal du trykke på EMPTY for at tømme eventuelle luftbobler. Rengør forsigtigt den overskydende mineralolie med et papirvæv.

2. Indlæsning af prøven

  1. Synaptosomale berigede præparater (prøver) fra det humane hjerneområde af interesse som beskrevet i 10,11,12,13,14,15 fremstilles, og de opbevares i alikvoter på ca. 5 μL ved -80 °C indtil injektionstidspunktet.
  2. Før injektion overføres aliquoten til våd is og holder den på is til enhver tid undtagen sonikering og hentning. Antallet og typerne af prøver bestemmes af det eksperimentelle design.
  3. Soniker de udvalgte prøver 3x i et bad med flydende våd is for at undgå opvarmning af prøven. Brug 5 s cyklusser hver gang, vent 1 minut på våd is mellem cyklusser.
  4. 1 μL prøve anbringes på termoplasten. Foretag om nødvendigt en indrykning i overfladen inden prøveplacering for at forhindre bevægelse af prøven.
  5. Brug knapperne på manipulatoren, der holder nanoinjektoren, til at placere nålen og flytte den mod prøven, der skal udfyldes. Når nålespidsen er i prøven, skal du trykke på FILL-knappen og holde den nede, indtil der er taget tilstrækkelig prøve. Ca. 0,5 μL er påkrævet for 10 oocytter. Brug knapperne til at flytte nanoinjektorens nål tilbage til den højeste position.

3. Injektion af oocytterne

BEMÆRK: Standardiserede rotte cortex synaptosomale membraner injiceres også i alle forsøg i et sæt oocytter for at måle ændringer i fusionskapacitet mellem forskellige partier af oocytter.

  1. Læg udvalgte oocytter på den lille petriskål, der har det monterede nylonnet og Barths opløsning (ca. 10 oocytter). Arranger oocytter, så de ikke er oven på hinanden; dette vil være nyttigt under injektionsprocessen.
  2. Brug knapperne på manipulatoren, der holder nanoinjektoren, til at flytte nålen mod oocytterne. Når nålen er nedsænket i Barths opløsning, skal du bruge fodpedalen til nanoinjektoren for at sikre, at mikroinjektionsnålen frigiver prøven. Hvis prøven frigives, vil den være synlig fra mikroskopvisningen.
  3. Når det er sikkert fastslået, at prøven frigives, skal du gå videre til mikroinjektivisering af oocyten. Hvis prøven ikke frigives, gentages processen med at fylde nålen.
  4. Penetrér oocyten lige under overfladen med nålen, ikke dybere, og brug fodpedalen til at injicere prøven. Fodpedalen giver en biplyd, når prøven frigives. Vent ca. 2-3 s. Hvis injektionen var vellykket, udvides cellen. Når dette sker, skal du bruge knapperne på manipulatoren til at forlade cellen.
    BEMÆRK: Fusion af membraner i oocyten er en polariseret proces; derfor bør oocyten injiceres i dyresiden af cellen, helst over ækvator, med nålens vinkel mod dyresiden for at maksimere membranfusion.
  5. Flyt petriskålen, så den næste oocyt er justeret med nålen, og gentag processen, indtil alle oocytter i skålen er injiceret. Gentag denne proces, indtil det ønskede antal oocytter er blevet injiceret. Sørg for, at en brønd af oocytter efterlades ikke-injiceret for at blive brugt som kontrol.
  6. Når alle oocytter er blevet injiceret, skal du trække nanoinjektoren tilbage til sin oprindelige position og fjerne nålen.

4. Registrering af ionstrømme ved hjælp af en klemme med to elektroderspænding

  1. For at fremstille to elektrodespændingsklemmer (TEVC) elektroderyler skal du trække 15 cm lange brandpolerede borosilikatglasrør ved hjælp af mikropipette-trækkeren. Når trækket er afsluttet, fyldes med 3 M KCl ved hjælp af lange kapillærnåle, eller alternativt nedsænkes og koges nålene i 3 M KCl-opløsning i 15 minutter under et kontinuerligt vakuum. Den høje temperatur hjælper med påfyldning af elektroderne og fjernelse af luftbobler.
    1. Der fremstilles en 3 M KCl elektrodefyldningsopløsning ved hjælp af KCl i krystallinsk form og deioniseret vand, og følg disse trin omhyggeligt, så elektrodernes referencepotentiale ikke ændres. Tør KCl forsigtigt i en ovn i 2-3 timer. Brug en analytisk vægt til forsigtigt at veje 223,68 g KCl. Overfør KCl til en 1 L glasflaske. Brug denne opløsning til at klorere sølvelektrodetråde.
      BEMÆRK: Ved træk af glaselektroder kan pipettekogebogen downloades her: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. Tænd for alt udstyr, der bruges til registrering af ionstrømme: hovedsystemer, løsningsventiler, mikroskoplys, ventilsystemer, oocytklemme og vakuumsystem. Tænd for den stationære computer, log ind på WinEDR V3.9.1., og sørg for, at programmet kører, og at opsætningsværdierne er korrekte som følger: Optag til disk, indstil optagelsesvarighed og ryd simulatorindstillingen.
    1. Angiv følgende indledende opsætningsværdier for forstærkeren: For spændingselektrodesektionen (Vm) skal du slukke for den negative kapacitetskompensation (-C); for badeelektroder (Im) sektion, indstil forstærkningsvælgerkontakten (område fra 0,1 til 10) til 10 og vippekontakten med tre positioner, der vælger forstærkningsmultiplikatoren (x0.1, x1.0 og x10), til x1.0. LED-lysene angiver valg af forstærkningsmultiplikator; for klemmesektion skal du slukke for klemmetilstandsvælgeren, indstille DC-forstærkningskontrollen til IN og forstærkningskontrollen med fuld båndbredde åben sløjfe (område 0 til 2000) til omkring 1200; for kommandoer, indstil til 40mV og indstil holdkontrollerne negativ og skalamultiplikator til at være i x2; for strømelektrode skal du bruge Ve-forskydningen til at etablere en nulreference, før du spidder oocyten.
    2. For at optage skal du åbne WinEDR V3.9.1-softwaren, gå til topmenuen og vælge File > Open New File. Opret din egen mappe, og gem filen.
    3. Vælg derefter Optag > Optag til disk i hovedmenuen. Når de to elektroder er inde i ooctyten, skal du tænde ringetonen i VC-8-ventilregulatoren og dreje klemmen til Langsom i OC-725C-forstærkeren. Gå derefter tilbage til WinEDR-softwaren, og vælg Optag øverst til venstre på skærmen.
    4. I markeringsdiagrammet nederst til venstre skal du skrive dit oprindelige membranpotentiale ned og trykke på Enter. Efterhånden som eksperimentet fortsætter, kan du skrive navnet på de stoffer, der bruges. Når eksperimentet er slut, skal du vælge Stop øverst til venstre på skærmen.
      BEMÆRK: Vi bruger WinEDR- eller WinWCP-software til at udføre TEVC, fordi disse er gratis og velegnede til eksperimenter, men enhver anden software, der er tilgængelig, kan bruges.
  3. Find alle de lægemiddelopløsninger, der er nødvendige for at udføre eksperimentet (f.eks. GABA, Kainate), og bekræft, at opløsningsventilerne fungerer korrekt ved at tænde og slukke for dem og observere forskydningen af klemmeventilerne.
  4. Fyld rørene ved at hælde den tilsvarende opløsning på sprøjtebeholderen, der er forbundet med røret, og mærk ventilregulatoren for at korrelere med opløsningsrørene. Sørg for, at strømmen af opløsning er stabil, at der ikke er bobler, og at vakuumsystemet fungerer korrekt.
  5. Indstil mikroskopet og optagekammerområdet. Agarbroerne (se nedenfor) anbringes i de respektive cirkulære huller bag optagekammeret (distal fra håndteringsområdet), hvor brøndene til elektroderne, der anvendes som jordreference, og optagekammeret forbindes. Tilføj Ringers arbejdsløsning (1x) til optagekammeret og jordreferenceelektrodebrøndene.
    1. Agarbroer er U-formede borosilikatrør, 2-3 cm lange, fyldt med 3% agar i Ringes opløsning. Lav U-formede rør ved at skære 15 cm lange rør, bøje dem på åben ild og derefter fylde dem med varm 3% agar ved hjælp af en insulinsprøjte. Opbevar fyldte agarbroer i Ringers opløsning i køleskabet indtil brug.
    2. 20x Ringers stamopløsning fremstilles som følger: I 1 liter destilleret vand tilsættes 134,4 g NaCl, 2,982 g KCl, 5,29 gCaCl2 og 23,83 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsyre). Til 1x Ringers arbejdsløsning tilsættes i en volumetrisk kolbe 200 ml Ringers stamopløsning (20x) til 3.800 ml destilleret vand.
  6. Forbered klorerede sølvelektroder før hvert forsøg ved elektrolyse ved at placere sølvtråde i 3 M KCl-opløsning og forbinde sølvelektroden til den positive terminal på et 9 V batteri. Efter ca. 3 minutter aflejres et fast brunt lag AgCl i elektroden. Anbring de klorerede sølvelektrodetråde i elektrodehuset.
    BEMÆRK: Jordreference og registrering af klorerede elektroder er sølv/ sølvchlorid (Ag / AgCl) elektroder.
  7. Fjern borosilikatnålene fra KCl-opløsningen. Brug en sprøjte til at ekstrahere en lille mængde KCL-opløsning fra den åbne ende af elektrodenålen, og udskift KCL-opløsningen med mineralolie; dette vil forhindre vandfordampning og ændringer i KCl-koncentrationen i nålen. Skub glasnålen over den klorerede sølvelektrodetråd, og stram dem på plads.
  8. Brug højre og venstre manipulatorer, der holder elektroderne, til at føre elektrodenålene ind i optagekammeret, der er fyldt med Ringer's Solution.
  9. Kontroller modstanden for hver elektrode ved at nulstille Vm- og Ve-forskydningsknapperne og derefter trykke på elektrodetestknapperne . Modstanden skal være mellem 0,5-3 MΩ (direkte læst som 5-30 mV på skærmen). Hvis modstanden er uden for området, skal du udskifte med nye mikroelektroder.
  10. Fyld optagekammeret med frisk Ringers løsning. Brug en glaspipette til at placere en ikke-injiceret eller en mikrotransplantet oocyt i midten af optagekammeret. Sørg for, at oocyten er tydeligt synlig under mikroskopet med dyresiden opad (se NOTE i trin 3.4).
  11. Før elektroden ind i ringenes opløsning, indtil de berører oocytmembranen. Gennembor forsigtigt oocytmembranen i dyresiden (se NOTE i trin 3.4) med begge elektroder og registrer hvilemembranpotentialet. Tænd for Ringers løsningsflow.
  12. Brug oocytklemmeforstærkeren til at ændre tilstanden til spændingsklemme og indstil holdespændingen på -80 mV. Strømmen på skærmen skal være negativ, normalt mellem 0 og 0,4 mikroampere.
  13. Opret en ny fil for at gemme optagelsen som File > New > Gem optagelsen på softwaren. Start optagelse, tryk på Optag > Optag til disk. Føj relevante oplysninger til filen ved hjælp af dialogboksen med markering (testnavn, anvendte lægemidler osv.).
  14. Påfør agonister (f.eks. GABA, glutamat eller kainat) til kemisk stimulering ved at åbne ventilerne og perfusere dem ind i optagekammeret i 15 s. Brug normalt en forstærkning på 10x til at plotte det maksimale antal point og rekonstruere svaret. Hvis strømmen er meget lille, skal du øge forstærkningen eller gevinsten, så de kan evalueres og synlige. Vær altid opmærksom på disse ændringer.
    BEMÆRK: Varigheden af perfusionen afhænger af det eksperimentelle paradigme. Hvis hovedmålet er at måle maksimal amplitude, vil 15 s være nok til at nå toppen for GABA eller plateauet for kainat.
  15. Overvåg altid løsningsniveauer. Ringers løsning skal genopfyldes ofte, da den bruges mellem alle opløsningsanvendelser. Når optagelsen er afsluttet, skal du dreje spændingsklemmen til OFF-positionen og slukke for Ringes løsningsventil. Fjern oocyten. Stop optagelsen, og gem filen. Gentag disse trin for alle de injicerede oocytter.

5. Analyse af TEVC-optagelser

  1. Gem en kopi af optagelserne på et USB-drev. Derfra skal du åbne den ønskede fil, der skal analyseres. I den fil, der åbnes, kan optagelsen ses, markeres og måles. Mest almindelige analyse inkluderer måling af maksimal amplitude, aktiveringstid, desensibilisering og gennemgang af gentagne applikationer.
  2. Mål ampa maksimal respons og GABA peak respons. For at erhverve disse målinger skal du først etablere et nulniveau eller en basislinje ved at finde den røde linje med markøren og trække den til den aktuelle, der genereres af Ringer-applikationen eller baseline.
  3. Når nulniveauet er etableret, skal du bestemme responsmålingerne ved at bruge musen til at trække den grønne, lodrette udlæsningsmarkør til den ønskede del af grafsporeren. Hvis det ønskes, skal du eksportere de spor, der skal analyseres i enhver anden foretrukken software
    BEMÆRK: Hvis nulniveauet ikke kan defineres, eller der er angivet for meget støj på sporstoffet, skal du eksportere WinEDR-filen til en offline analytisk software, der giver mulighed for ændringer for at give en niveaubasislinje og tilføjelse af filtre for at reducere støj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inden for få timer efter injektion begynder de synaptiske membraner, der bærer deres neurotransmitterreceptorer og ionkanaler, at smelte sammen med oocytplasmamembranen. Figur 1 viser optagelser af AMPA- og GABAA-receptorer mikrotransplantet til Xenopus-oocytter. For det meste af analysen blev svarene fra to eller tre oocytter pr. prøve målt ved hjælp af to eller tre batcher oocytter fra forskellige frøer, i alt seks til ni oocytter pr. Prøve. Dette gøres for en stor kohorte af forsøgspersoner for at observere gruppeforskelle. Analysen er ligetil og måler amplitude af svar. Det er vigtigt at bemærke, at fusionen af de transplanterede membraner er en polariseret proces, og derfor er udvælgelsen af injektionsstedet meget vigtig. Injektion i den vegetabilske halvkugle eller i ækvator giver ensartede resultater, hvor alle injicerede oocytter med succes indsætter receptorer og genererer ionstrømme, der følger en unimodal fordeling22. Interessant nok, da membranerne oprindeligt blev injiceret i dyrepolen, fulgte oocytreponserne en bimodal fordeling: en gruppe oocytter havde ingen eller meget lave reaktioner, mens den anden gruppe havde store reaktioner, endnu større end dem fra oocytter injiceret i vegetalpolen eller i ækvator. For at afgøre, om nogle af de oocytter, der blev injiceret i dyrepolen, havde lave reaktioner, fordi de menneskelige membraner blev injiceret og fanget i kernen i oocyten, blev en blanding af membraner isoleret fra det elektriske organ i Torpedo og cDNA-kodning for GABAρ1-underenheden injiceret i dyresidens pol. Nikotinreceptorerne fra torpedomembranerne viste en hurtig aktivering og hurtig desensibilisering under perfusion af acetylcholin23, mens ρ1-underenheden danner homomere GABAρ1-receptorer, der ikke desensibiliserer under kontinuerlig perfusion af GABA 24,25,26,27. Hvis den co-injicerede prøve ved et uheld blev leveret i kernen og ikke cytoplasmaet, ville cDNA blive transskriberet til RNA og oversat til funktionelle GABAρ1-receptorer. Figur 2 viser, at når injektionen var rettet mod kernen, udtrykte oocytter med høje reaktioner på acetylcholin ikke GABAρ1-receptorer; omvendt udtrykte oocytter med nul eller lav respons på acetylcholin GABA-receptorer. Resultaterne af dette eksperiment indikerer for det første, at membraner i oocytter med lav respons ved et uheld blev deponeret i oocytens kerne; For det andet forstyrrer injektionen af torpedomembraner i kernen ikke meget transkriptionen af ρ1 cDNA. Et par co-injicerede oocytter havde store reaktioner på både acetylcholin og GABA, hvilket tyder på brud på kernen under injektionen. Den forbedrede indsættelse af transplanterede membraner i oocytens dyrehalvdel afspejler den polariserede lokalisering af de heterologt udtrykte neurotransmitterreceptorer 26,28. Derfor er det muligt at opnå større reaktioner ved at injicere i dyrehalvkuglen uden at målrette kernen. Dette er vigtigt at studere prøver med lav tæthed af receptorer, for eksempel fra Alzheimers sygdom (AD) væv med lavt antal receptorer (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Repræsentative ionstrømme af oocytter. Ionstrømme fra oocytter injiceret med membraner fra humane synaptiske receptorer blev registreret. AMPA-receptorer blev aktiveret med 100 mM Kainat og GABAA-receptorer med 1 mM GABA. VH = -80 mV. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Co-injektion af Torpedo og GABAρ1. Co-injektion af filtrerede membraner (0,1 μm) fra torpedoens elektriske organ, rig på acetylcholinreceptorer, og cDNA-kodning for GABAρ1-receptoren i dyrepolen producerede hovedsageligt to grupper af oocytter baseret på deres reaktioner: en gruppe oocytter (A) havde store reaktioner på acetylcholin (Ach; 1 mM), men ingen reaktioner på 1 μM GABA (spænding fastspændt til -80 mV), og oocytter i gruppe (B) havde nul eller lav respons på ACh, men store reaktioner på GABA. (C) Grafen viser middelværdien ± standardfejl af middelværdien (SEM) af spidsstrømmen i gruppe 1 (n = 5 oocytter) og gruppe 2 (n = 11 oocytter). En oocyt i gruppe 2 havde store GABA- og ACh-reaktioner, der tyder på brud på kernen; Følgelig var fordelingen af responserne skæv til lave værdier, som det fremgår af forskellen mellem middelværdi og median af fordelingen af membranstrøm (22 nA vs 6 nA). Dette resultat indikerer, at en af årsagerne til oocytter med lav respons er, at membranerne injiceres og fanges i oocytens kerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Polariseret indsættelse af cellemembraner i Xenopus oocytter. GABA og kainatresponser af oocytter injiceret i dyret eller vegetabilske poler med ufiltrerede membraner opnået fra en ikke-AD-hjerne (kvinde, 74 år, postmorteminterval 2,8 timer) og en AD-hjerne (kvinde, 74 år, postmorteminterval 4,5 timer). Oocytter injiceret nær dyrepolen uden at målrette kernen gav større reaktioner end oocytter injiceret i vegetabilsk pol, hvilket muliggør undersøgelse af vævsprøver med meget lavt antal receptorer. Elevens t-test mellem vegetabilske og animalske poler: ** p < 0,01, *** p < 0,001, Søjler angiver middelværdi ± SEM af spidsstrøm, n = 5 oocytter hver kolonne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analyse af indfødte proteinkomplekser fra menneskelige hjerner er nødvendig for at forstå homeostatiske og patologiske processer i hjernesygdomme og udvikle terapeutiske strategier til forebyggelse eller behandling af sygdomme. Hjernebanker, der indeholder snapfrosne prøver, er således en uvurderlig kilde til et stort og for det meste uudnyttet væld af fysiologisk information29,30. En indledende bekymring for at bruge postmortemvæv er den klare mulighed for mRNA eller proteinnedbrydning, der kan forvirre fortolkningen af data. For eksempel viser hjernens pH konsekvent en positiv korrelation med kvantificeringen af mRNA ved kvantitativ realtid-PCR, og denne korrelation er uafhængig af patologien31. Forskelle i pH mellem forsøgspersoner kan føre til forskelle i mRNA-kvantificering med store varianser, der kan skjule fortolkningen af resultaterne32. Interessant nok, på trods af den lavere kvantificering af mRNA-transkripter, når pH-syrerne, opretholdes kovarianserne blandt de forskellige transkriptioner33, hvilket giver en ramme for opnåelse af pålidelig transkriptomprofilering af patologiske tilstande. Det er vigtigt, at mens mRNA er meget nedbrydeligt, er transmembranproteiner i postmortemvævet meget modstandsdygtige over for nedbrydning34. Tidligere forsøg i laboratoriet har vist, at GABA- og glutamatreceptorer i den menneskelige hjerne er funktionelle efter ekstremt store postmortem-intervaller35. Desuden giver MSM-metoden mulighed for direkte at måle virkningerne af potentielle forvirrende faktorer som pH i dødsøjeblikket, agonal tilstand og mRNA og proteinnedbrydning direkte på receptorernes funktion, hvilket giver måder at bruge denne information i analysen og fortolkningen af data.

Ændringer og fejlfinding af teknikken
Som tidligere nævnt er MSM en lille ændring af den oprindelige transplantation af samlede membraner, hvilket er en metode, der er blevet bredt valideret og bekræftet af mange laboratorier i akademikere og medicinalindustrien 12,36,37,38,39,40. For eksempel var mikrotransplantation af receptorer vigtig i udviklingen af Eli Lillys LY3130481, som er en TARP gamma-8-selektiv antagonist af AMPA-receptorer, der viser hjerneregionsselektivitet12. MSM følger det samme mikrotransplantationsprincip ved anvendelse af synaptosomale berigede præparater; derfor er det vigtigt at have gode synaptosomale præparater. Vi bruger Syn-Per-metoden, fordi de resultater, der opnås med denne procedure, er meget konsistente, og amplituden af ionstrømmene korrelerer meget godt med niveauerne af synaptiske proteiner i proteomiske eksperimenter10. Imidlertid kan mikrotransplantationen eller MSM tilpasses til at studere receptorer fra mange kilder (f.eks. Insektmembraner38,39, neurolemma40) med fremragende resultater. Der er nogle lidelser, hvor synapser er stærkt påvirket som Alzheimers sygdom, eller er tilgængelige i lave mængder; i dette tilfælde hjælper injektion af membranerne i dyresiden med at få større strømme. Forøgelse af mængden af injiceret protein øger også fusionen af membraner og størrelsen af svarene. Selv om der er en negativ sammenhæng mellem koncentrationen af injicerede membraner og oocytternes overlevelse, er det muligt at finde en passende koncentration af membraner, der muliggør den givne eksperimentelle analyse.

Begrænsninger af MSM
MSM er en kvantitativ metode, der blev udviklet til undersøgelse af humane receptorer eller ionkanaler; derfor er det velegnet til at studere væv med begrænset tilgængelighed. Fordi Xenopus-oocytter ikke har endogene glutamat- eller GABA-receptorer, kommer ethvert respons på GABA eller glutamat i mikrotransplantede oocytter fra de injicerede receptorer, der smeltede sammen med oocytternes membran. En vigtig begrænsning af MSM er imidlertid undersøgelsen af ionkanaler eller transportører, der også endogent udtrykkes i oocytter, da adskillelsen af ionstrømme fra mikrotransplantede og endogene kanaler / transportører er vanskelig. Fremtidige undersøgelser, der dæmper endogene gener, kan være nyttige med denne begrænsning.

Betydningen for eksisterende metoder er, at MSM inkorporerer den oprindelige membran med dens tilsvarende proteiner og receptorer og dermed giver et mere fysiologisk miljø for analysen. Det har vist sig, at egenskaberne af receptorerne i deres oprindelige membran bevares efter transplantation til oocytterne, som observeret i neurotransmitterreceptorer AMPA-type GluR1, α7-AcChoRs og α4β2-AcChoRs fra dyrkede celler41.

Fremtidige anvendelser af teknikken omfatter undersøgelsen af de elektrofysiologiske egenskaber af forskellige proteiner og receptorer af interesse i membranerne i dyrkede og ikke-dyrkede celler og væv fra sunde og syge menneskelige hjerner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIA/NIH-tilskud R01AG070255 og R01AG073133 til AL. Vi takker også University of California Irvine Alzheimers sygdomsforskningscenter (UCI-ADRC) for at levere det humane væv, der er vist i dette manuskript. UCI-ADRC er finansieret af NIH/NIA-tilskud P30 AG066519.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
  3. Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  4. Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
  5. Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
  6. Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
  7. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
  8. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  9. Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
  10. Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
  11. Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
  12. Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
  13. Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
  14. Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
  15. Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
  16. Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
  17. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
  18. Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
  19. Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
  20. Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  22. Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
  23. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  24. Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
  25. Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
  26. Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
  27. Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
  28. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
  29. C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
  30. Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
  31. Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
  32. Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
  33. Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
  34. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  35. Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  36. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  37. Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
  38. Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
  39. Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
  40. Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
  41. Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).

Tags

Neurovidenskab udgave 185
Mikrotransplantation af synaptiske membraner til genaktivering af humane synaptiske receptorer til funktionelle undersøgelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, B., Powell, A., Gutierrez,… More

Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter