Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrotransplantasjon av synaptiske membraner for å reaktivere humane synaptiske reseptorer for funksjonelle studier

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64024
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen viser at ved å utføre mikrotransplantasjon av synaptiske membraner i Xenopus laevis oocytter, er det mulig å registrere konsistente og pålitelige responser av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid og γ-aminosmørsyre reseptorer.

Abstract

Eksitatoriske og hemmende ionotrope reseptorer er de viktigste portene til ionflukser som bestemmer aktiviteten til synapser under fysiologisk nevronkommunikasjon. Derfor har endringer i deres overflod, funksjon og forhold til andre synaptiske elementer blitt observert som en stor korrelasjon av endringer i hjernefunksjon og kognitiv svikt i nevrodegenerative sykdommer og psykiske lidelser. Å forstå hvordan funksjonen til eksitatoriske og hemmende synaptiske reseptorer endres av sykdom, er av avgjørende betydning for utviklingen av effektive terapier. For å få sykdomsrelevant informasjon er det viktig å registrere den elektriske aktiviteten til nevrotransmitterreseptorer som forblir funksjonelle i den syke menneskelige hjernen. Så langt er dette den nærmeste tilnærmingen til å vurdere patologiske endringer i reseptorens funksjon. I dette arbeidet presenteres en metodikk for å utføre mikrotransplantasjon av synaptiske membraner, som består av reaktivering av synaptiske membraner fra snapfrossen humant hjernevev som inneholder menneskelige reseptorer, ved injeksjon og bakre fusjon i membranen til Xenopus laevis oocytter. Protokollen gir også den metodologiske strategien for å oppnå konsistente og pålitelige responser av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) og γ-aminosmørsyre (GABA) reseptorer, samt nye detaljerte metoder som brukes til normalisering og streng dataanalyse.

Introduction

Nevrodegenerative lidelser påvirker en stor prosentandel av befolkningen. Selv om deres ødeleggende konsekvenser er velkjente, er koblingen mellom de funksjonelle endringene av nevrotransmitterreseptorer, som er kritiske for hjernefunksjonen, og symptomatologien deres fortsatt dårlig forstått. Inter-individuell variasjon, kronisk natur av sykdommen, og lumsk utbrudd av symptomer er bare noen av grunnene som har forsinket forståelsen av de mange hjernesykdommer der kjemiske ubalanser er godt dokumentert 1,2. Dyremodeller har generert uvurderlig informasjon og utvidet vår kunnskap om mekanismene underliggende fysiologi og patofysiologi i evolusjonære bevarte systemer; Imidlertid utelukker flere interspecies forskjeller mellom gnagere og mennesker direkte ekstrapolering av reseptorfunksjon fra dyremodeller til den menneskelige hjerne3. Dermed ble innledende innsats for å studere innfødte menneskelige reseptorer utviklet av Ricardo Miledis laboratorium ved hjelp av kirurgisk fjernet vev og frosne prøver. Disse første eksperimentene brukte hele membraner som inkluderer nevronal synaptiske og ekstra synaptiske reseptorer samt ikke-nevronale nevrotransmitterreseptorer, og selv om de gir viktig informasjon om syke tilstander, er det en bekymring for at blandingen av reseptorer kompliserer tolkningen av data 4,5,6,7. Viktigst, synapser er hovedmålet i mange nevrodegenerative lidelser 8,9; Derfor er analyser for å teste de funksjonelle egenskapene til berørte synapser grunnleggende for å få informasjon om sykdomsrelevante endringer som påvirker synaptisk kommunikasjon. Her er en modifikasjon av den opprinnelige metoden beskrevet: mikrotransplantasjon av synaptiske membraner (MSM), som fokuserer på fysiologisk karakterisering av berikede synaptiske proteinpreparater og har blitt brukt til å studere rotte og menneskelige synaptosomer 10,11,12,13,14,15 . Med denne metodikken er det mulig å transplantere synaptiske reseptorer som en gang jobbet i den menneskelige hjerne, innebygd i sine egne innfødte lipider og med sin egen kohort av tilknyttede proteiner. Fordi MSM-data er kvantitative, er det dessuten mulig å bruke disse dataene til å integrere med store proteomiske datasett eller sekvenseringsdatasett10.

Det er viktig å merke seg at mange farmakologiske og biofysiske analyser av synaptiske reseptorer gjøres på rekombinante proteiner 16,17. Selv om denne tilnærmingen gir bedre innsikt i strukturfunksjonsforholdene til reseptorer, kan den ikke gi informasjon om komplekse multimeriske reseptorkomplekser som finnes i nevroner og deres endringer i sykdom. Derfor bør en kombinasjon av innfødte og rekombinante proteiner gi en mer omfattende analyse av synaptiske reseptorer.

Det er mange metoder for å forberede synaptosomer 10,11,12,13,14,15 som kan justeres for kravene til et laboratorium. Protokollen begynner med antagelsen om at synaptosomale berikede preparater ble isolert og er klare til å bli behandlet for mikrotransplantasjonsforsøk. I laboratoriet brukes Syn-Per-metoden i henhold til produsentens instruksjoner. Dette gjøres på grunn av høy reproduserbarhet i elektrofysiologiske eksperimenter10,11. Det er også rikelig litteratur som forklarer hvordan man isolerer Xenopus oocytter18,19, som også kan kjøpes klar til injeksjon20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All forskning utføres i samsvar med institusjonelle retningslinjer og godkjennes av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen ved University of California Irvine (IACUC-1998-1388) og University of Texas Medical Branch (IACUC-1803024). Temporal cortex fra en ikke-Alzheimers sykdom (AD) hjerne (kvinne, 74 år gammel, postmortem intervall 2,8 h) og en AD-hjerne (kvinne, 74 år gammel, postmortem intervall 4,5 h) ble gitt av University of California Irvine Alzheimers sykdomsforskningssenter (UCI-ADRC). Informert samtykke til hjernedonasjon ble innhentet av UCI-ADRC.

MERK: Uløst humant hjernevev bør behandles som en kilde til blodbårne patogener (BBP). Følgelig er BBP-trening nødvendig før du starter eksperimenter. Denne protokollen utføres i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) laboratorium under BSL2-krav. Retningslinjer og forholdsregler i laboratoriet inkluderer: ingen mat eller drikke tillatt i laboratoriet, god laboratoriepraksis må følges, personlig verneutstyr (hansker, kjole, ingen åpne sko) er nødvendig, og døren må lukkes til enhver tid.

1. Xenopus oocytt mikroinjeksjon forberedelse

  1. For å lage injeksjonsnåler, trekk 3,5 tommer borosilikatrør ved hjelp av en mikropipettetrekker. Når mikroinjeksjonsnålene er trukket, bruk et mikroskop og et barberblad for å kutte av nok av nålens spiss slik at mikroinjeksjon kan utføres (vanligvis mellom 2-3 mm).
    MERK: Lengden på nålens spiss som skal kuttes kan variere.
  2. Forbered 1x Barths løsning ved å tilsette 200 ml Barths lagerløsning (5x) til 800 ml destillert vann. Fyll en 24-brønns, flat bunnvevskulturplate med 18 °C 1x Barths oppløsning.
    1. Forbered 5x Barths lagerløsning som følger. I 1 L destillert vann, tilsett 25,71 g NaCl (natriumklorid), 0,372 g KCl (kaliumklorid), 0,301 g CaCl2 (kalsiumdiklorid), 0,389 g Ca(NO3)3) 2(4H2O) (kalsiumnitrattetrahydrat), 1,01 g MgSO4(7H2O) (magnesiumsulfat heptahydrat), 1,008 g NaHCO3 (natriumbikarbonat), og 11,91 g HEPES (4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre).
  3. Isoler Xenopus oocytter ved hjelp av protokollene beskrevet i 18,19 og bruk 2x forstørret stereoskop, velge sunt utseende, scene V-VI oocytter. Plasser ca. 10 oocytter per brønn og bruk en av brønnene til å huse ikke-injiserte oocytter som skal brukes som kontrollceller ved opptak.
  4. Hent en liten Petri-tallerken, 1 cm høy og 6 cm i diameter, og legg Nylonnett inni slik at det dekker bunnen av parabolen. Hell deretter 15 ml av 1x Barths løsning som skal brukes til å utføre mikroinjeksjoner av oocyttene.
  5. Plasser en nanoinjektor langs midtlinjen på mikroskopplattformen. Vri magneten til av-stilling og flytt nanoinjektoren langsomt til ønsket posisjon mens du støtter den forsiktig. Når nanoinjektoren er riktig plassert, vrir du magneten tilbake til full på-stilling og sørger for at den er sikker.
  6. For en prøvestørrelse på 50,6 nL, bruk følgende innstillinger på siden av nanoinjektoren: 1 er D (ned), 2 er D, 3 er U (opp), 4 er D, og 5 er U. Plasser et stykke selvforseglingstermoplastisk, eller mikrocentrifugerørhette, på mikroskopstativet, og juster det med banen til nanoinjektoren.
    MERK: 50 nL er nær den maksimale mengden injisert materiale som cytoplasma tåler21.
  7. Fyll opp en insulinsprøyte omtrent halvparten av volumet med mineralolje (ca. 0,5 ml/cc). Bruk denne sprøyten til å fylle mikroinjeksjonsnålen med mineralolje. Pass på at en synlig perle av olje ses på spissen av nålen.
  8. Utsett nanoinjektorstempeet til minimum 1-2 cm. Gjør dette ved å holde inne EMPTY-knappen til stempelet er synlig i ønsket lengde. Når stempelet er eksponert, plasserer du langsomt og forsiktig den mineraloljefylte mikroinjeksjonsglassnålen på nanoinjektorstempelen, og sørg for at den passer godt gjennom O-ringen med svart motstand og stopper ved den hvite motstandsringen. Pass på at nanoinjektorstempeet ikke bøyes i prosessen.
  9. Når mikroinjeksjonsglassnålen er sikret og på plass, trykker du på EMPTY for å annullere eventuelle luftbobler. Forsiktig, med et papirvev, rengjør overflødig mineralolje.

2. Laster inn prøven

  1. Forbered synaptosomale berikede preparater (prøver) fra den menneskelige hjerneregionen av interesse som beskrevet i 10,11,12,13,14,15, og lagre dem i aliquots på ca 5 μL ved -80 °C til injeksjonstidspunktet.
  2. Før injeksjon, overfør aliquot til våt is og hold den på is til enhver tid bortsett fra sonikering og gjenfinning. Antall og typer prøver vil bli bestemt av eksperimentell design.
  3. Soniker de valgte prøvene 3x i et bad med flytende våtis for å unngå oppvarming av prøven. Bruk 5 s sykluser hver gang, venter 1 min på våt is mellom sykluser.
  4. Plasser 1 μL prøve på termoplasten. Gjør om nødvendig et innrykk i overflaten før prøveplassering for å forhindre bevegelse av prøven.
  5. Bruk knottene på manipulatoren som holder nanoinjektoren til å plassere nålen og flytte den mot prøven som skal fylles. Når nålespissen er i prøven, trykker du på og holder inne FYLL-knappen til det tas nok prøve. Omtrent 0,5 μL kreves for 10 oocytter. Bruk knottene til å flytte nanoinjektorens nål tilbake til høyeste posisjon.

3. Injisere oocyttene

MERK: Standardiserte synaptosommembraner av rottebark injiseres også i alle eksperimenter i et sett med oocytter for å måle endringer i fusjonskapasitet mellom forskjellige partier med oocytter.

  1. Plasser utvalgte oocytter på den lille Petri-retten som har det monterte nylonnettet og Barths løsning (ca. 10 oocytter). Ordne oocytter slik at de ikke er oppå hverandre; dette vil være nyttig under injeksjonsprosessen.
  2. Bruk knottene på manipulatoren som holder nanoinjektoren, og beveg nålen mot oocyttene. Når nålen er nedsenket i Barths løsning, bruk fotpedalen til nanoinjektoren for å sikre at mikroinjeksjonsnålen slipper prøven. Hvis prøven slippes, vil den være synlig fra mikroskopvisningen.
  3. Når det er trygt fastslått at prøven blir utgitt, gå videre til mikroinjecting oocyte. Hvis prøven ikke frigjøres, gjenta prosessen med å fylle nålen.
  4. Penetrer oocytten like under overflaten med nålen, ikke dypere, og bruk fotpedalen til å injisere prøven. Fotpedalen vil lage en pipelyd når prøven slippes. Vent ca 2-3 s. Hvis injeksjonen var vellykket, vil cellen utvide seg. Når dette skjer, bruk knottene på manipulatoren for å gå ut av cellen.
    MERK: Fusjon av membraner i oocytten er en polarisert prosess; Derfor bør oocytten injiseres i dyresiden av cellen, helst over ekvator, med nålens vinkel mot dyresiden for å maksimere membranfusjonen.
  5. Flytt Petri-parabolen slik at neste oocytt er på linje med nålen og gjenta prosessen til alle oocytter i parabolen er injisert. Gjenta denne prosessen til ønsket antall oocytter er injisert. Pass på at en brønn med oocytter ikke injiseres for å brukes som kontroll.
  6. Når alle oocytter er injisert, trekk nanoinjektoren tilbake til sin opprinnelige posisjon og fjern nålen.

4. Registrering av ionstrømmer ved hjelp av en to elektrodespenningsklemme

  1. For å lage to elektrodespenningsklemme (TEVC) elektrodenåler, trekk 15 cm lange brannpolerte borosilikatglassrør ved hjelp av mikropipettetrekkeren. Når trekkingen er fullført, fyll med 3 M KCl ved hjelp av lange kapillærnåler, eller alternativt senk og kok nålene i 3 M KCl-oppløsning i 15 minutter under et kontinuerlig vakuum. Den høye temperaturen hjelper til med fylling av elektroder og fjerning av luftbobler.
    1. Forbered en 3 M KCl elektrodefyllingsløsning ved å bruke KCl i krystallinsk form og deionisert vann, og følg disse trinnene nøye slik at referansepotensialet til elektroder ikke endres. Tørk KCl forsiktig i en ovn i 2-3 timer. Bruk en analytisk balanse og vei forsiktig 223,68 g KCl. Overfør KCl til en 1 L glassflaske. Bruk denne løsningen til å klorere sølvelektrodeledninger.
      MERK: For å trekke glasselektroder kan pipettekokeboken lastes ned her: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. Slå på alt utstyr som brukes til registrering av ionstrømmer: hovedsystemer, løsningsventiler, mikroskoplys, ventilsystemer, oocyttklemme og vakuumsystem. Slå på den stasjonære PCen, logg på WinEDR V3.9.1., og kontroller at programmet kjører, og at oppsettsverdiene er riktige som følger: ta opp til disk, angi innspillingsvarighet og fjern simulatoralternativet.
    1. Angi følgende innledende oppsettsverdier for forsterkeren: for spenningselektrodedelen (VM) slår du av kompensasjonen for negativ kapasitet (-C); for badekarelektroder (Im)-delen, still inn forsterkningsvelgerbryteren (område fra 0,1 til 10) ved 10, og vekslebryteren med tre posisjoner som velger forsterkningsmultiplikatoren (x0,1, x1,0 og x10), ved x1,0. LED-lysene vil indikere forsterkningsmultiplikatorvalget; for klemmeseksjon, slå av klemmemodusvelgeren, sett DC-forsterkningskontrollen til IN, og forsterkningskontrollen med full båndbredde åpen sløyfe (område 0 til 2000) til rundt 1200; for kommandoer, sett til 40mV og sett hold-kontrollene negative og skalamultiplikatoren til å være i x2; for strømelektrode, bruk Ve-forskyvningen til å opprette en nullreferanse før du impalerer oocytten.
    2. Hvis du vil spille inn, åpner du WinEDR V3.9.1-programvaren, går til den øverste menyen og velger Fil > Åpne ny fil. Opprett din egen mappe, og lagre filen.
    3. Velg deretter Spill inn > Spill inn på disk på hovedmenyen. Når de to elektrodene er inne i ooctytten, slår du på ringetonen i VC-8-ventilregulatoren og vrir klemmen til Langsom i OC-725C-forsterkeren. Gå deretter tilbake til WinEDR-programvaren og velg Record øverst til venstre på skjermen.
    4. Skriv ned det opprinnelige membranpotensialet nederst til venstre i merkediagrammet nederst til venstre, og trykk Enter. Etter hvert som eksperimentet fortsetter, kan du skrive ned navnet på stoffene som brukes. Når eksperimentet er over, velger du Stopp øverst til venstre på skjermen.
      MERK: Vi bruker WinEDR- eller WinWCP-programvare for å utføre TEVC fordi disse er gratis og godt egnet for eksperimenter, men all annen programvare som er tilgjengelig kan brukes.
  3. Utgjør alle legemiddelløsningene som trengs for å utføre eksperimentet (f.eks. GABA, Kainate) og bekrefte at løsningsventilene fungerer som de skal ved å slå dem av og på og observere forskyvningen av klemmeventilene.
  4. Fyll rørene ved å helle den tilsvarende oppløsningen på sprøytebeholderen som er koblet til røret og merk ventilregulatoren for å korrelere med løsningsrørene. Forsikre deg om at strømmen av løsningen er jevn, det er ingen bobler og at vakuumsystemet fungerer som det skal.
  5. Sett opp mikroskopet og opptakskammerområdet. Plasser agarbroene (se nedenfor) i de respektive sirkulære hullene bak opptakskammeret (distalt fra håndteringsområdet), og koble brønnene til elektrodene som brukes som bakkereferanse og opptakskammeret. Tilsett Ringers arbeidsløsning (1x) i opptakskammeret og jordreferanseelektrodebrønnene.
    1. Agarbroer er U-formede borosilikatrør, 2-3 cm lange, fylt med 3% agar i Ringers løsning. Lag U-formede rør ved å kutte 15 cm lange rør, bøye dem på åpen flamme, og fyll dem deretter med varm 3% agar ved hjelp av en insulinsprøyte. Oppbevar fylte agarbroer i Ringers løsning i kjøleskapet til bruk.
    2. Lag 20x Ringers lagerløsning som følger: I 1 L destillert vann, tilsett 134,4 g NaCl, 2,982 g KCl, 5,29 g CaCl2 og 23,83 g HEPES (4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfesulf syre). For 1x Ringers arbeidsløsning, i en volumetrisk kolbe, tilsett 200 ml Ringers lagerløsning (20x) til 3800 ml destillert vann.
  6. Forbered klorerte sølvelektroder før hvert eksperiment ved elektrolyse ved å plassere sølvtråder i 3 M KCl-løsning og koble sølvelektroden til den positive terminalen til et 9 V-batteri. Etter ca 3 min deponeres et solid brunt lag av AgCl i elektroden. Plasser de klorerte sølvelektrodetrådene i elektrodehuset.
    MERK: Jordreferanse og opptak av klorerte elektroder er sølv/sølvklorid (Ag/AgCl)-elektroder.
  7. Fjern borosilikatnålene fra KCl-oppløsningen. Bruk en sprøyte til å trekke ut en liten mengde KCl-løsning fra den åpne enden av elektrodenålen og erstatt KCl-løsningen med mineralolje; Dette vil unngå vannfordampning og endringer i KCl konsentrasjon i nålen. Skyv glassnålen over den klorerte sølvelektrodetråden og stram dem på plass.
  8. Bruk høyre og venstre manipulatorer som holder elektrodene, før elektrodenålene inn i opptakskammeret som er fylt med Ringer's Solution.
  9. Kontroller motstanden til hver elektrode ved å nullstille VM- og Ve-offset-knottene og trykk deretter på Elektrodetest-knappene . Motstanden skal være mellom 0,5-3 MΩ (direkte lest som 5-30 mV på skjermen). Hvis motstanden er utenfor området, bytt ut med nye mikroelektroder.
  10. Fyll opptakskammeret med fersk Ringers løsning. Bruk en glasspipette, plasser en ikke-injisert eller en mikrotransplantet oocytt i midten av opptakskammeret. Påse at oocytten er godt synlig under mikroskopet, med dyresiden opp (se MERKNAD i trinn 3.4).
  11. Før elektroden inn i Ringers løsning til de berører oocyttmembranen. Gjennombor forsiktig oocytmembranen i dyresiden (se MERKNAD i trinn 3.4) med begge elektrodene og registrer hvilemembranpotensialet. Slå på ringetonens løsningsflyt.
  12. Bruk oocyttklemmeforsterkeren til å endre modusen til spenningsklemmen og still inn holdespenningen på -80 mV. Strømmen på skjermen skal være negativ, vanligvis mellom 0 og 0,4 mikroampere.
  13. Opprett en ny fil for å lagre innspillingen som Fil > Ny > Lagre innspillingen på programvaren. Start innspillingen, trykk Spill inn > Spill inn på disk. Legg til relevant informasjon i filen ved hjelp av dialogboksen Fortegn boks (testnavn, brukte legemidler osv.).
  14. Påfør agonister (f.eks. GABA, glutamat eller kainate) for kjemisk stimulering ved å åpne ventilene og parfymere dem inn i opptakskammeret i 15 s. Bruk vanligvis en gevinst på 10x for å plotte maksimalt antall poeng og rekonstruere svaret. Hvis strømmene er svært små, øker du forsterkningen, eller får, for at de skal bli evaluert og synlige. Noter deg alltid disse endringene.
    MERK: Varigheten av perfusjonen avhenger av det eksperimentelle paradigmet. Hvis hovedmålet er å måle maksimal amplitude, vil 15 s være nok til å nå toppen for GABA eller platået for kainate.
  15. Overvåk alltid løsningsnivåer. Ringers løsning må etterfylles ofte, da den brukes mellom alle løsningsbruk. Når registreringen er fullført, vrir du spenningsklemmen til AV-stilling og slår av Ringeventilen. Fjern oocytten. Stopp innspillingen og lagre filen. Gjenta disse trinnene for alle injiserte oocytter.

5. Analysere TEVC-opptak

  1. Lagre en kopi av opptakene på en USB-stasjon. Derfra åpner du ønsket fil som skal analyseres. I filen som åpnes, kan innspillingen vises, merkes og måles. Den vanligste analysen inkluderer måling av maksimal amplitude, aktiveringstid, desensibilisering og nedkjøring av repeterende applikasjoner.
  2. Mål AMPA maksimal respons og GABA-toppresponsen. Hvis du vil hente disse målingene, må du først opprette et nullnivå eller en grunnlinje ved å finne den røde linjen med markøren og dra den til gjeldende generert av Ringer-programmet eller grunnlinjen.
  3. Når nullnivået er opprettet, bestemmer du svarmålene ved å bruke musen til å dra den grønne, loddrette avlesningsmarkøren til ønsket del av grafsporeren. Hvis ønskelig, eksporter sporene som skal analyseres i annen foretrukket programvare
    MERK: Hvis nullnivået ikke kan defineres eller det er for mye støy angitt på traceren, eksporterer du WinEDR-filen til en offline analytisk programvare, som gjør det mulig for modifikasjoner å gi en nivågrunnlinje og tillegg av filtre for å redusere støy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Innen få timer etter injeksjon begynner de synaptiske membranene, som bærer sine nevrotransmitterreseptorer og ionkanaler, å smelte sammen med oocyttplasmamembranen. Figur 1 viser opptak av AMPA- og GABAA-reseptorer mikrotransplantet til Xenopus oocytter. For det meste av analysen ble svarene fra to eller tre oocytter per prøve målt ved hjelp av to eller tre partier oocytter fra forskjellige frosker, totalt seks til ni oocytter per prøve. Dette gjøres for en stor kohort av mennesker for å observere gruppeforskjeller. Analysen er enkel og måler amplitude av svar. Det er viktig å merke seg at sammensmeltingen av de transplanterte membranene er en polarisert prosess, og dermed er valg av injeksjonsstedet svært viktig. Injeksjon i den vegetale halvkule eller i ekvator gir konsistente resultater, med alle injiserte oocytter vellykket sette inn reseptorer og generere ionstrømmer som følger en unimodal distribusjon22. Interessant nok, da membranene først ble injisert i dyrestangen, fulgte oocyttresponsene en bimodal fordeling: en gruppe oocytter hadde ingen eller svært lave svar mens den andre gruppen hadde store svar, enda større enn de fra oocytter injisert i vegetalstangen eller i ekvator. For å avgjøre om noen av oocyttene som ble injisert i dyrestangen hadde lave responser fordi de menneskelige membranene ble injisert og fanget i kjernen av oocytten, ble en blanding av membraner isolert fra det elektriske organet torpedo og cDNA-koding for GABAρ1-underenheten injisert i dyrets side. De nikotiniske reseptorene fra torpedomembranene viste en rask aktivering og rask desensibilisering under perfusjon av acetylkolin23, mens ρ1-underenheten danner homomeriske GABAρ1-reseptorer som ikke desensibiliseres under kontinuerlig perfusjon av GABA 24,25,26,27. Hvis den co-injiserte prøven ved et uhell ble levert inn i kjernen og ikke cytoplasma, ville cDNA bli transkribert til RNA og oversatt til funksjonelle GABAρ1-reseptorer. Figur 2 viser at når injeksjonen var rettet mot kjernen, uttrykte ikke oocytter med høye responser på acetylkolin GABAρ1-reseptorer; derimot uttrykte oocytter med null eller lav respons på acetylkolin GABA-reseptorer. Resultatene av dette eksperimentet indikerer først at i lavrespons oocytter ble membraner ved et uhell avsatt i kjernen av oocytten; For det andre forstyrrer injeksjonen av torpedomembraner i kjernen ikke i stor grad transkripsjonen av ρ1 cDNA. Noen få co-injiserte oocytter hadde store responser på både acetylkolin og GABA, noe som tyder på brudd i kjernen under injeksjonen. Den forbedrede innsettingen av transplanterte membraner i dyrets halvkule av oocytten speiler den polariserte lokaliseringen av de heterologt uttrykte nevrotransmitterreseptorene 26,28. Derfor, ved å injisere i dyrehalvøya uten å målrette kjernen, er det mulig å oppnå større svar. Dette er viktig for å studere prøver med lav tetthet av reseptorer, for eksempel fra Alzheimers sykdom (AD) vev med lavt antall reseptorer (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Representative ionstrømmer av oocytter. Ionstrømmer fra oocytter injisert med membraner fra humane synaptiske reseptorer ble registrert. AMPA reseptorer ble aktivert med 100 mM Kainate, og GABAA reseptorer med 1 mM GABA. VH = -80 mV. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Samtidig injeksjon av Torpedo og GABAρ1. Samtidig injeksjon av filtrerte membraner (0,1 μm) fra torpedoens elektriske organ, rik på acetylkolinreseptorer, og cDNA-koding for GABAρ1-reseptoren i dyrepolen produserte hovedsakelig to grupper av oocytter basert på deres svar: en gruppe oocytter (A) hadde store responser på acetylkolin (Ach; 1 mM), men ingen respons på 1 μM GABA (spenning klemt til -80 mV), men ingen respons på 1 μM GABA (spenning klemt til -80 mV), men ingen respons på 1 μM GABA (spenning klemt til -80 mV), men ingen respons på 1 μM GABA (spenning klemt til -80 mV), men ingen respons på 1 μM GABA (spenning klemt til -80 mV), men ingen respons på 1 μM GABA (spenning klemt til -80 mV), men ingen respons på 1 μM GABA (spenning klemt til -80 mV), men ingen respons på 1 μM GABA (spenning klemt til -80 mV), men ingen respons på 1 μM GABA (spenning klemt til -80 mV), men ingen respons og oocytter i gruppe (B) hadde null eller lave svar på ACh, men store svar på GABA. (C) Graf viser gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittlig (SEM) av toppstrøm i gruppe 1 (n = 5 oocytter) og gruppe 2 (n = 11 oocytter). En oocytt i gruppe 2 hadde store GABA- og ACh-svar som tyder på brudd i kjernen; Følgelig ble fordelingen av svarene skjevt til lave verdier, som nevnt av forskjellen mellom gjennomsnitt og median for fordelingen av membranstrøm (22 nA vs . 6 nA). Dette resultatet indikerer at en av årsakene til lavrespons oocytter er at membranene injiseres og fanges inn i kjernen av oocytten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Polarisert innsetting av cellemembraner i Xenopus oocytter. GABA og kainate responser av oocytter injisert i dyret eller vegetal poler, med ufiltrerte membraner hentet fra en ikke-AD hjerne (kvinne, 74 år gammel, postmortem intervall 2,8 h) og en AD-hjerne (kvinne, 74 år gammel, postmortem intervall 4,5 h). Oocytter injisert nær dyrestangen, uten å målrette kjernen, ga større svar enn oocytter injisert i vegetalstangen, og tillot dermed studiet av vevsprøver med svært lavt antall reseptorer. Studentens t-test mellom vegetal- og dyrestenger: ** p < 0,01, *** p < 0,001, Barer indikerer gjennomsnittlig ± SEM av toppstrøm, n = 5 oocytter hver kolonne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analyse av innfødte proteinkomplekser fra menneskelige hjerner er nødvendig for å forstå homeostatiske og patologiske prosesser i hjernesykdommer og utvikle terapeutiske strategier for å forebygge eller behandle sykdommer. Dermed er hjernebanker som inneholder snap frosne prøver en uvurderlig kilde til en stor og for det meste uutnyttet rikdom av fysiologisk informasjon29,30. En første bekymring for å bruke postmortem vev er den klare muligheten for mRNA eller protein nedbrytning som kan forvirre tolkningen av data. For eksempel viser hjernens pH konsekvent en positiv sammenheng med kvantifiseringen av mRNA ved kvantitativ sanntid-PCR, og denne korrelasjonen er uavhengig av patologien31. Inter-subjektforskjeller av pH kan føre til forskjeller i mRNA-kvantifisering med store varianser som kan skjule tolkningen av resultatene32. Interessant nok, til tross for lavere kvantifisering av mRNA-transkripsjoner som pH syrer, opprettholdes kovariansene blant de forskjellige transkripsjonene33, noe som gir et rammeverk for å oppnå pålitelig transkripsjonsprofilering av patologiske tilstander. Viktig, mens mRNA er svært nedbrytbart, er transmembranproteiner i postmortemvevet svært motstandsdyktige mot nedbrytning34. Tidligere eksperimenter i laboratoriet har vist at GABA og glutamatreseptorer i den menneskelige hjerne er funksjonelle etter ekstremt store postmortem intervaller35. Videre gjør MSM-metoden det mulig å måle effekten av potensielle forvirrende faktorer som pH i dødsøyeblikk, smertetilstand og mRNA og proteinforringelse direkte på reseptorenes funksjon, og dermed gi måter å bruke denne informasjonen i analyse og tolkning av data.

Modifikasjoner og feilsøking av teknikken
Som nevnt tidligere er MSM en liten modifikasjon av den opprinnelige transplantasjonen av totale membraner, som er en metode som har blitt mye validert og bekreftet av mange laboratorier i akademikere og farmasøytisk industri 12,36,37,38,39,40. For eksempel var mikrotransplantasjon av reseptorer viktig i utviklingen av Eli Lillys LY3130481, som er en TARP gamma-8-selektiv antagonist av AMPA-reseptorer som viser hjerneregion selectivity12. MSM følger det samme mikrotransplantasjonsprinsippet ved hjelp av synaptosomale berikede preparater; Derfor er det viktig å ha gode synaptosomale preparater. Vi bruker Syn-Per-metoden fordi resultatene som oppnås med denne prosedyren er svært konsistente og amplituden til ionstrømmene korrelerer veldig godt med nivåene av synaptiske proteiner i proteomiske eksperimenter10. Imidlertid kan mikrotransplantasjonen eller MSM tilpasses for å studere reseptorer fra mange kilder (f.eks. insektmembraner38,39, neurolemma40) med gode resultater. Det er noen lidelser der synapser er sterkt påvirket som Alzheimers sykdom, eller er tilgjengelige i lave mengder; I dette tilfellet bidrar injeksjon av membranene i dyresiden til å få større strømmer. Å øke mengden protein injisert øker også sammensmeltingen av membraner og størrelsen på responsene. Selv om det er en negativ sammenheng mellom konsentrasjonen av membraner injisert og overlevelsen av oocytter, er det mulig å finne en passende konsentrasjon av membraner som tillater den gitte eksperimentelle analysen.

Begrensninger ved MSM
MSM er en kvantitativ metode som ble utviklet for studiet av menneskelige reseptorer eller ionkanaler; Derfor er det godt egnet til å studere vev med begrenset tilgjengelighet. Fordi Xenopus oocytter ikke har endogene glutamat- eller GABA-reseptorer, kommer enhver respons på GABA eller glutamat i mikrotransplantede oocytter fra de injiserte reseptorene som smeltet sammen med membranen til oocyttene. En viktig begrensning av MSM er imidlertid studiet av ionkanaler eller transportører som også er endogenet uttrykt i oocytter, da separasjon av ionstrømmer fra mikrotransplantede og endogene kanaler / transportører er vanskelig. Fremtidige studier som silencing endogene gener kan være nyttig med denne begrensningen.

Betydningen for eksisterende metoder er at MSM inkorporerer den innfødte membranen med sine tilsvarende proteiner og reseptorer, og dermed gir et mer fysiologisk miljø for analysen. Det har blitt funnet at egenskapene til reseptorene i deres opprinnelige membran beholdes etter transplantasjon til oocyttene, som observert i nevrotransmitterreseptorer AMPA-type GluR1, α7-AcChoRs og α4β2-AcChoRs fra dyrkede celler41.

Fremtidige anvendelser av teknikken inkluderer studiet av de elektrofysiologiske egenskapene til forskjellige proteiner og reseptorer av interesse for membranene til dyrkede og ikke-dyrkede celler og vev fra sunne og syke menneskelige hjerner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIA/NIH tilskudd R01AG070255 og R01AG073133 til AL. Vi takker også University of California Irvine Alzheimers sykdomsforskningssenter (UCI-ADRC) for å ha gitt det menneskelige vevet som vises i dette manuskriptet. UCI-ADRC er finansiert av NIH/NIA grant P30 AG066519.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
  3. Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  4. Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
  5. Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
  6. Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
  7. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
  8. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  9. Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
  10. Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
  11. Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
  12. Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
  13. Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
  14. Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
  15. Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
  16. Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
  17. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
  18. Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
  19. Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
  20. Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  22. Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
  23. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  24. Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
  25. Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
  26. Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
  27. Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
  28. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
  29. C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
  30. Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
  31. Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
  32. Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
  33. Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
  34. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  35. Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  36. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  37. Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
  38. Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
  39. Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
  40. Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
  41. Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).

Tags

Nevrovitenskap utgave 185
Mikrotransplantasjon av synaptiske membraner for å reaktivere humane synaptiske reseptorer for funksjonelle studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, B., Powell, A., Gutierrez,… More

Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter