Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التجديد الظهاري المعوي استجابة للإشعاع المؤين

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

الجهاز الهضمي هو واحد من أكثر الأعضاء حساسية للإصابة عند علاجات السرطان الإشعاعية. إنه في نفس الوقت نظام عضوي يتمتع بواحدة من أعلى قدرات التجدد بعد مثل هذه الإهانات. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة القدرة التجديدية للظهارة المعوية.

Abstract

تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة واحدة من الخلايا ولكنها تحتوي على أنواع متعددة من الخلايا المتمايزة نهائيا ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الانتشار النشط للخلايا الجذعية المعوية الموجودة في الجزء السفلي من الخبايا المعوية. ومع ذلك ، خلال أحداث الإصابة المعوية الحادة ، تخضع هذه الخلايا الجذعية المعوية النشطة لموت الخلايا. تشعيع جاما هو علاج لسرطان القولون والمستقيم يستخدم على نطاق واسع ، والذي ، على الرغم من فعاليته العلاجية ، له تأثير جانبي يتمثل في استنفاد تجمع الخلايا الجذعية النشط. في الواقع ، يعاني المرضى في كثير من الأحيان من متلازمة الإشعاع المعدي المعوي أثناء خضوعهم للعلاج الإشعاعي ، ويرجع ذلك جزئيا إلى نضوب الخلايا الجذعية النشطة. يؤدي فقدان الخلايا الجذعية المعوية النشطة في الخبايا المعوية إلى تنشيط مجموعة من الخلايا الجذعية المعوية الاحتياطية الهادئة عادة ويؤدي إلى إلغاء تمايز الخلايا الأولية الإفرازية والخلايا المعوية. إن لم يكن لهذه الخلايا ، فإن ظهارة الأمعاء ستفتقر إلى القدرة على التعافي من العلاج الإشعاعي وغيرها من الإهانات الأنسجة الرئيسية. تسمح التطورات الجديدة في تقنيات تتبع النسب بتتبع تنشيط الخلايا وتمايزها وهجرتها أثناء التجديد وقد تم استخدامها بنجاح لدراسة ذلك في القناة الهضمية. تهدف هذه الدراسة إلى تصوير طريقة لتحليل الخلايا داخل ظهارة الأمعاء للفأر بعد الإصابة الإشعاعية.

Introduction

ستغطي ظهارة الأمعاء البشرية سطح نصف ملعب كرة الريشة تقريبا إذا تم وضعها بشكل مسطح تماما1. بدلا من ذلك ، يتم ضغط طبقة الخلية المفردة هذه التي تفصل البشر عن محتويات أمعائهم في سلسلة من الإسقاطات الشبيهة بالأصابع ، والزغابات ، والمسافات البادئة ، وهي خبايا تزيد من مساحة سطح الأمعاء. تتمايز خلايا الظهارة على طول محور الزغابات المشفرة. تتكون الزغابات بشكل أساسي من الخلايا المعوية الممتصة للمغذيات ، والخلايا الكأسية المفرزة للمخاط ، وخلايا الغدد الصماء المعوية المنتجة للهرمونات ، بينما تتكون الخبايا بشكل أساسي من خلايا بانيث المنتجة للدفاع ، والخلايا الجذعية النشطة والاحتياطية ، والخلايا السلفية2،3،4،5. علاوة على ذلك ، فإن الاتصال ثنائي الاتجاه الذي تمتلكه هذه الخلايا مع الخلايا اللحمية والخلايا المناعية للمقصورة الوسيطة الأساسية والميكروبات في التجويف يولد شبكة معقدة من التفاعلات التي تحافظ على توازن الأمعاء وهي ضرورية للتعافي بعد الإصابة6،7،8.

ظهارة الأمعاء هي أسرع الأنسجة ذاتية التجدد في جسم الإنسان ، بمعدل دوران 2-6 أيام9،10،11. أثناء الاتزان الداخلي ، تنقسم الخلايا الجذعية النشطة في قاعدة الخبايا المعوية (الخلايا العمودية ذات القاعدة القبية) ، والتي تتميز بالتعبير عن مستقبلات البروتين G المقترنة 5 (LGR5) الغنية بالليوسين المحتوية على التكرار ، بسرعة وتوفر الخلايا السلفية التي تتمايز إلى جميع السلالات الظهارية المعوية الأخرى. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع معدل الانقسام ، فإن الخلايا الجذعية النشطة وأسلافها المباشرين حساسون بشكل خاص لإصابة أشعة جاما ويخضعون لموت الخلايا المبرمج بعد التشعيع5،12،13،14. عند فقدانها ، تخضع الخلايا الجذعية الاحتياطية والخلايا غير الجذعية (السكان الفرعي للأسلاف وبعض الخلايا المتمايزة نهائيا) داخل الخبايا المعوية للتنشيط وتجديد حجرة القبو القاعدية ، والتي يمكنها بعد ذلك إعادة تكوين مجموعات خلايا الزغابات ، وبالتالي تجديد ظهارة الأمعاء15. باستخدام تقنيات تتبع النسب ، أثبتت مجموعات بحثية متعددة أن الخلايا الجذعية الاحتياطية (الهادئة) قادرة على دعم التجدد عند فقدان الخلايا الجذعية النشطة13،16،17،18،19،20،21،22. تتميز هذه الخلايا بوجود جين البروتين المركب متعدد المشبك 1 (Bmi1) ، وجين النسخ العكسي تيلوميراز الفأر (mTert) ، و Hop homeobox (Hopx) ، وجين البروتين المتكرر الغني بالليوسين 1 (Lrig1). بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الخلايا غير الجذعية قادرة على تجديد الخبايا المعوية عند الإصابة 23،24،25،26،27،28،29،30،31. على وجه الخصوص ، فقد ثبت أن أسلاف الخلايا الإفرازية والخلايا المعوية تخضع لفك التمايز عند الإصابة ، والعودة إلى الخلايا الشبيهة بالجذعية ، ودعم تجديد ظهارة الأمعاء. حددت الدراسات الحديثة الخلايا التي تعبر عن علامات متعددة تمتلك القدرة على اكتساب خصائص تشبه الساق عند الإصابة (مثل DLL + و ATOH1 + و PROX1 + و MIST1 + و DCLK1 +) 32،33،34،35،36. والمثير للدهشة أن Yu et al. أظهر أنه حتى خلايا Paneth الناضجة (LYZ +) يمكن أن تساهم في تجديد الأمعاء37. علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى التسبب في موت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية المعوية وتعطيل وظيفة الحاجز الظهاري ، يؤدي التشعيع إلى dysbiosis من النباتات المعوية ، وتنشيط الخلايا المناعية وبدء استجابة مؤيدة للالتهابات ، وتفعيل الخلايا الوسيطة واللحمية38,39.

يعد إشعاع جاما أداة علاجية قيمة في علاج السرطان ، خاصة بالنسبة لأورام القولون والمستقيم40. ومع ذلك ، يؤثر التشعيع بشكل كبير على التوازن المعوي عن طريق إحداث تلف في الخلايا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. يسبب التعرض للإشعاع اضطرابات متعددة تبطئ تعافي المريض وتتميز بإصابة الغشاء المخاطي والالتهاب في المرحلة الحادة والإسهال وسلس البول والنزيف وآلام البطن على المدى الطويل. يشار إلى هذه المجموعة من المظاهر باسم سمية الإشعاع المعدي المعوي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يظهر تطور التليف عبر الفم و / أو التصلب الوعائي الناجم عن الإشعاع بعد سنوات فقط من العلاج38,41. بالتزامن مع الإصابة نفسها ، يحفز الإشعاع استجابة إصلاح في الخلايا المعوية التي تنشط مسارات الإشارات المسؤولة عن بدء التجديد وتنظيمه42. يمكن أن ينشأ مرض الأمعاء الدقيقة الناجم عن الإشعاع من العلاج الإشعاعي للحوض أو البطن المقدم إلى أعضاء أخرى (مثل عنق الرحم والبروستاتا والبنكرياس والمستقيم)41،43،44،45،46. وبالتالي ، فإن إصابة التشعيع المعوي هي مشكلة سريرية كبيرة ، ومن المرجح أن يؤدي الفهم الأفضل للفيزيولوجيا المرضية الناتجة إلى تعزيز تطوير التدخلات للتخفيف من مضاعفات الجهاز الهضمي المرتبطة بالعلاج الإشعاعي. هناك تقنيات أخرى تسمح بالتحقيق في الغرض التجديدي لظهارة الأمعاء بصرف النظر عن الإشعاع. تم تطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا والكيميائية لدراسة الالتهاب والتجديد بعدذلك 47. كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) يحفز التهاب في الأمعاء ويؤدي إلى تطوير خصائص مماثلة لتلك الخاصة بمرض التهاب الأمعاء48. يمكن أن يؤدي الجمع بين علاج DSS والمركب المؤيد للسرطان azoxymethane (AOM) إلى تطور السرطان المرتبط بالتهاب القولون48,49. الإصابة الناجمة عن نقص التروية هي طريقة أخرى تستخدم لدراسة الإمكانات التجديدية للظهارة المعوية. هذه التقنية تتطلب الخبرة والمعرفة الجراحية50. علاوة على ذلك ، تسبب التقنيات المذكورة أعلاه أنواعا مختلفة من الإصابات عن الإشعاع وقد تؤدي إلى إشراك آليات مختلفة للتجديد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه النماذج تستغرق وقتا طويلا ، في حين أن تقنية الإشعاع قصيرة إلى حد ما. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طرق في المختبر باستخدام enteroids والقولون المتولدة من الأمعاء والقولون في تركيبة مع إصابة الإشعاع لدراسة آليات تجديد الأمعاء51,52. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات لا تلخص بشكل كامل العضو الذي نمذجته53,54.

ويتضمن البروتوكول المقدم وصفا لنموذج الفئران لإصابة أشعة غاما بالاقتران مع نموذج جيني يسمح بعد معالجة عقار تاموكسيفين بتتبع السلالات الناشئة عن تجمعات الخلايا الجذعية الاحتياطية (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). يستخدم هذا النموذج تشعيع الجسم الكلي 12 جراي ، مما يؤدي إلى إصابة معوية كبيرة بما يكفي لتنشيط الخلايا الجذعية الاحتياطية مع السماح بالتحقيق اللاحق في القدرة على التجدد المعوي في غضون 7 أيام من الإصابة55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إيواء جميع الفئران في قسم الموارد الحيوانية المختبرية (DLAR) في جامعة ستوني بروك. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة ستوني بروك (IACUC) على جميع الدراسات والإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية. أجريت التجارب التي شملت مواضيع حيوانية بدقة وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيوانات المعتمد (IACUC # 245094).

ملاحظة: تم الحصول على سلالات الماوس B6 ؛ 129-Bmi1 tm1 (cre / ERT) Mrc / J (Bmi1-Cre ER) و B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sortm1 (EYFP) Cos / J (Rosa26eYFP) تجاريا (انظر جدول المواد) وتم عبورها للحصول على Bmi1-Cre ER ؛ Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) الفئران ، كما هو موضح سابقا56،57،58.

1. إسكان Bmi1-Cre ER ؛ Rosa26 eYFP الفئران

  1. احتفظ بالفئران في منشأة حيوانية عند درجة حرارة تتراوح بين 68-72 درجة فهرنهايت ورطوبة تتراوح بين 30-70٪ ، في دورة ضوء / مظلمة مدتها 12 ساعة / 12 ساعة ، مع الماء والطعام العادي حسب اللطف.
  2. قبل التجارب ، تأكد من الأنماط الجينية للفئران باستخدام تقنية التنميط الجيني PCR القياسية57,58.

2. تحضير الحيوانات والمواد

  1. نقل الفئران إلى غرفة السكن التجريبي قبل 7 أيام على الأقل من أي تجربة للسماح للفئران بالتأقلم.
  2. تطابق الحيوانات التجريبية والضابطة حسب الجنس والعمر.
  3. إخضاع الحيوانات الضابطة لإعادة التركيب بوساطة الكري الناجم عن عقار تاموكسيفين ولكن ليس للإشعاع (العلاج الوهمي ، 0 غراي) مع ضمان تلقي التجارب حقن عقار تاموكسيفين وتعرضها لإشعاع جاما.
  4. تحضير محلول تاموكسيفين. إعادة تعليق مسحوق تاموكسيفين في زيت الذرة المعقم بتركيز 30 ملغم / مل. Sonicate لمدة 3 دقائق في دورات 30 ثانية ON و 30 s OFF بسعة 60٪ ثم قم بالتدوير في الظلام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). يمكن تجميد محلول تاموكسيفين عند -20 درجة مئوية ولكن لا تجمده / تذوبه أكثر من مرة. على نحو مفضل ، قم بإعداد حل جديد في كل مرة ولا تقم بتخزينه.
    ملاحظة: عقار تاموكسيفين حساس للضوء. لفه بورق القصدير أثناء دوران درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: تاموكسيفين مادة يحتمل أن تكون خطرة: المخاطر الصحية (GHS08) والمخاطر البيئية (GHS09).
  5. تحضير محلول مخزون 5-إيثينيل -2 ′-ديوكسييوريدين (EdU). أعد تعليق مسحوق EdU في 1/5 من الحجم الكلي لثنائي ميثيل سلفوكسيد المعقم (DMSO) وأضف ببطء 4/5 المتبقية من الحجم الكلي للمياه المعقمة فائقة النقاء. عندما يذوب تماما ، القسمة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    تنبيه: 5-إيثينيل-2′-ديوكيوريدين (EdU) وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) من المواد الخطرة المحتملة: المخاطر الصحية (H340 و H631 و H227 و H315 و H319 على التوالي). قد يسبب EdU عيوبا وراثية ويشتبه في أنه يضر بالخصوبة أو الأطفال الذين لم يولدوا بعد ، ويمكن أن يسبب DMSO تهيج الجلد والعين.
  6. تحضير الكواشف لجمع الأنسجة وتثبيتها: قم بتخفيف الإيثانول لتحضير محلول مائي بنسبة 70٪ ، وقم بتبريد DPBS إلى 4 درجات مئوية ، وقم بإعداد المخزن المؤقت المثبت ل Bouin المعدل (50٪ إيثانول و 5٪ حمض الخليك في H2O المقطر) و 10٪ فورمالين مخزن.
    تنبيه: الكحول الإيثيلي مادة يحتمل أن تكون خطرة: المخاطر الصحية (H225-H319) ، القابلة للاشتعال (GHS02) ، وتسبب السمية الحادة (GHS07). حمض الخليك هو مادة خطرة محتملة: المخاطر الصحية (H226-H314) ، القابلة للاشتعال (GHS02) ، والمسببة للتآكل (GHS05). الفورمالين مادة يحتمل أن تكون خطرة: المخاطر الصحية (H350 ، H315 ، H317 ، H318 ، H370) ، والتآكل. قد يسبب الفورمالين السرطان وتهيج الجلد والعين وتلف الأعضاء وتفاعلات حساسية الجلد.
  7. قم بإعداد المعدات اللازمة للقتل الرحيم وفقا لطريقة معتمدة (غرفة CO2 ، على سبيل المثال) ، ومجموعة تشريح الفئران (مقص ، ملقط) ، وأطباق بتري ، وإبرة تزويج 16 جيجا متصلة بحقنة سعة 10 مل لطرد الأمعاء ، وأشرطة نسيجية.

3. تشعيع غاما لكامل الجسم (TBI) وجمع الأنسجة

  1. قبل يومين من التعرض لأشعة غاما ، قم بحقن التجارب بجرعة واحدة من عقار تاموكسيفين للحث على إعادة التركيب بوساطة Cre وتتبع نسب خلية BMI1 / EYFP + . وزن كل وحساب جرعة 40 ملغم / كغم من وزن الجسم من عقار تاموكسيفين المعاد تعليقه في زيت الذرة. تطهير منطقة البطن مع 70 ٪ من الإيثانول وتطبيق عقار تاموكسيفين داخل الصفاق باستخدام إبرة 27G تعلق على حقنة 1 مل.
  2. راقب الحيوانات لمدة 48 ساعة التالية لاستبعاد سمية عقار تاموكسيفين المحتملة.
  3. نقل الفئران إلى غرفة التشعيع كما هو محدد من قبل المؤسسة المحلية.
  4. احسب وقت التعرض للإشعاع الصادر عن مصدر 137Cs وفقا لمعدل الجرعة الدقيق الحالي. على سبيل المثال ، إذا كان معدل الجرعة الحالي يساوي 75.9 راد / دقيقة (0.759 جراي دقيقة −1 = 75.9 cGy m − 1) ، يتم حساب وقت التعرض بالدقائق على أنه الجرعة المطلوبة / 0.759. لتشعيع الحيوانات بجرعة 12 Gy TBI ، يكون وقت التعرض ~ 15.81 دقيقة (15 دقيقة و 48 ثانية).
  5. تطهير غرفة العينة في مشع جاما بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪ ؛ ضع حصيرة الامتصاص والحيوانات داخل غرفة العينة.
    ملاحظة: يجب وضع الحيوانات المعالجة بالخدع في غرفة التشعيع ولكن لا تتعرض لإشعاع جاما.
  6. ضع الغطاء وأغلق الغرفة.
  7. قم ببرمجة جهاز تشعيع جاما لتعريض الحيوانات ل 12 جراي TBI.
    1. قم بتشغيل الجهاز عن طريق تحويل المفتاح إلى وضع START.
    2. أدخل رقم المشغل باستخدام لوحة مفاتيح رقمية وقم بالتأكيد بالضغط على ENTER.
    3. أدخل رقم PIN باستخدام لوحة مفاتيح رقمية وقم بالتأكيد بالضغط على ENTER.
    4. اضغط 1 للحصول على خيارات.
    5. اضغط 1 لإعدادات المؤقت.
    6. اضغط 1 لوقت التشعيع.
    7. أدخل إعداد المؤقت للدورة التالية باستخدام لوحة مفاتيح رقمية (تنسيق hh: mm: ss) وقم بالتأكيد بالضغط على ENTER.
    8. قم بتأكيد الإعدادات مرة أخرى بالضغط على ENTER.
    9. ارجع إلى القائمة الرئيسية بالضغط على CLEAR 2x.
    10. اضغط على START لبدء التعرض.
  8. اترك الغرفة لوقت التعرض النشط. سيتوقف الجهاز تلقائيا بعد انقضاء الوقت المحدد مسبقا وسيبدأ في إصدار صفير.
    تنبيه: السيزيوم 137 (137درجة مئوية) مادة خطرة قاتلة (المخاطر الصحية: H314). يمكن أن يسبب التعرض الخارجي لكميات كبيرة من 137درجة مئوية حروقا ومرضا إشعاعيا حادا وحتى الموت.
  9. قم بإيقاف تشغيل الجهاز عن طريق تحويل المفتاح إلى وضع STOP.
  10. افتح غرفة العينة ، وانزع الغطاء ، وانقل الحيوانات مرة أخرى إلى القفص ، وقم بتطهير غرفة العينة بمحلول إيثانول بنسبة 70٪.
  11. نقل الحيوانات مرة أخرى إلى غرفة السكن التقليدية ومراقبة حالتها بعد العلاج.
  12. راقب وزن الحيوانات كل يوم والقتل الرحيم على الفور (على الرغم من النقطة الزمنية المخطط لها) إذا لوحظت أي أعراض لتغير الرفاه أو الضيق أو فقدان الوزن الذي يتجاوز 15٪ من وزن الجسم الأولي.
  13. قبل ثلاث ساعات من القتل الرحيم المخطط له تطهير منطقة البطن ، وباستخدام حقنة الأنسولين 28G ، حقن الفئران مع 100 ميكرولتر من محلول مخزون EdU (تدار داخل الصفاق).
  14. اجمع الأمعاء القريبة عند 0 ساعة و 3 ساعات و 6 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة و 168 ساعة بعد التشعيع.
    1. أداء القتل الرحيم CO2 وفقا لمعايير المؤسسة المنزلية.
      تنبيه: ثاني أكسيد الكربون مادة خطرة (H280). يحتوي على غاز تحت الضغط ؛ قد تنفجر إذا تم تسخينها. قد يحل محل الأكسجين ويسبب الاختناق السريع.
    2. بعد ذلك ، قم بتشريح الجزء القريب من الأمعاء الدقيقة ، وإزالة الأنسجة المرفقة ، وتدفقها باستخدام DPBS البارد باستخدام إبرة تغذية مستقيمة 16 جم متصلة بحقنة سعة 10 مل ، والإصلاح باستخدام المخزن المؤقت المثبت المعدل ل Bouin باستخدام إبرة تغذية مستقيمة 16 جم متصلة بحقنة سعة 10 مل ، وقطعها طوليا ، ولف الأمعاء القريبة باستخدام تقنية Swiss roll كما هو موضح سابقا59.
  15. ضع الأنسجة في كاسيت نسيجي واتركها لمدة 24-48 ساعة في درجة حرارة الغرفة في وعاء يحتوي على 10٪ من الفورمالين المخزن مؤقتا. يجب أن يكون حجم الفورمالين كافيا لتغطية الكاسيتات النسيجية بالكامل. عندما ينقضي وقت الحضانة ، باستخدام ملقط ، قم بنقل الكاسيتات النسيجية إلى الحاوية المملوءة بالإيثانول بنسبة 70٪. ثم ، تابع تضمين البارافين الأنسجة.
    ملاحظة: تم إجراء تضمين بارافين الأنسجة بواسطة المختبر الأساسي لعلم الأنسجة البحثي في جامعة ستوني بروك. يمكن إيقاف الإجراء هنا ، ويمكن تخزين كتل البارافين في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: الفورمالين مادة يحتمل أن تكون خطرة: المخاطر الصحية (H350 ، H315 ، H317 ، H318 ، H370) ، وتآكل. قد يسبب الفورمالين السرطان وتهيج الجلد والعين وتلف الأعضاء وتفاعلات حساسية الجلد.

4. التحليل النسيجي

  1. قم بتبريد الكاسيتات النسيجية التي تحتوي على عينات الأنسجة المضمنة في البارافين عن طريق وضعها على الجليد لمدة 1 ساعة على الأقل. باستخدام microtome ، قم بإعداد أقسام بسمك 5 ميكرومتر للتلطيخ. يجب تقطيع كل نسيج أفقيا لتغطية العينة المدرفلة بأكملها.
    1. بعد قطع كتلة البارافين ، انقل أقسام الأنسجة إلى حمام مائي دافئ حتى 45 درجة مئوية وضع الأقسام على شرائح مشحونة. اترك الشرائح على رف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة حتى تجف.
      ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء هنا ، ويمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة.
  2. ضعي الشرائح في حامل منزلق واخبزيها في فرن على حرارة 65 درجة مئوية طوال الليل. يمكن خبز الشرائح لفترة أقصر ، 1-2 ساعة. ومع ذلك ، لا ينصح بهذا في حالة الشرائح المقطوعة حديثا (أقل من 1 شهر).
    ملاحظة: ضع مجموعة تلطيخ الشريحة اليدوية تحت الغطاء الكيميائي وقم بإجراء عمليات الحضانة باستخدام الزيلين والإيثانول والهيماتوكسيلين تحت الغطاء الكيميائي.
  3. في اليوم التالي ، قم بتبريد الشرائح عن طريق وضعها في حامل منزلق أسفل الغطاء الكيميائي لمدة 10 دقائق.
  4. قم بإزالة المناديل عن طريق وضع حامل الشريحة في وعاء مملوء ب 100٪ زيلين لمدة 3 دقائق. كرر الحضانة باستخدام زيلين طازج 100٪.
    ملاحظة: من تلك اللحظة ، تأكد من بقاء العينات رطبة في جميع الأوقات.
    تنبيه: الزيلين مادة خطرة محتملة: قابلة للاشتعال (GHS02) ، تسبب سمية حادة (GHS07) ، ومخاطر صحية (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). الآثار الخطرة المحتملة هي أنه قاتل إذا ابتلع أو دخل الشعب الهوائية ويمكن أن يسبب تهيج الجلد والعين والجهاز التنفسي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤثر على الوظائف الحركية عن طريق التسبب في النعاس أو الدوخة ويسبب تلف الأعضاء في حالة التعرض لفترات طويلة أو متكررة.
  5. إعادة ترطيب المقاطع في تدرج الإيثانول عن طريق وضع حامل الشريحة بالتتابع في حاويات مملوءة بالمحاليل التالية: 100٪ إيثانول ، 2 دقيقة ؛ 95٪ إيثانول ، 2 دقيقة ؛ 70٪ إيثانول ، 2 دقيقة.
  6. انقل حامل الشريحة إلى الحاوية المملوءة بالماء المقطر واشطفها بالماء المقطر الجاري لمدة 2 دقيقة.
  7. ضع حامل الشريحة في وعاء مملوء بمحلول الهيماتوكسيلين ، وصمة عار لمدة 5 دقائق (تحت الغطاء الكيميائي).
  8. انقل حامل الشريحة إلى الحاوية المملوءة بماء الصنبور واشطفه بماء الصنبور الجاري حتى يتحول تلطيخ الهيماتوكسيلين إلى اللون الأزرق ، عادة بعد 2 دقيقة.
  9. انقل حامل الشريحة إلى الحاوية المملوءة بمحلول كربونات الليثيوم بنسبة 5٪ (وزن / حجم). تراجع 10x.
    تنبيه: كربونات الليثيوم مادة خطرة محتملة: تسبب سمية حادة (GHS07) ، ومخاطر صحية (H302 - H319). إنه ضار إذا تم ابتلاعه ، وضار عند ملامسته للجلد ، ويسبب تهيجا خطيرا للعين.
  10. انقل حامل الشريحة إلى الحاوية المملوءة بالماء المقطر واشطفها بالماء المقطر الجاري لمدة 2 دقيقة.
  11. ضع حامل الشريحة في وعاء مملوء باليوزين والبقع لمدة 5 دقائق.
  12. انقل حامل الشريحة إلى الحاوية المملوءة بنسبة 70٪ من الإيثانول واشطفها لفترة وجيزة (10 ثوان).
  13. قم بتجفيف الأقسام عن طريق وضع حامل الشريحة بالتتابع في الحاويات المملوءة بمحاليل تدرج الإيثانول: 95٪ إيثانول ، 5 انخفاضات ؛ 100 ٪ الإيثانول ، 5 انخفاضات.
  14. قم بإزالة الشرائح عن طريق وضع حامل الشريحة في الحاوية المملوءة بالزيلين بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق. كرر الحضانة باستخدام زيلين طازج 100٪.
  15. أخرج الشريحة من الحامل ، وجفف المنطقة المحيطة بالأنسجة باستخدام منشفة ورقية ، واعتمادا على حجم العينة ، أضف قطرة واحدة أو اثنتين من وسيط التثبيت القائم على الزيلين على سطح العينة. قم بالتركيب عن طريق وضع غطاء برفق أعلى الشريحة الزجاجية (احرص على عدم ترك أي فقاعات هواء). اضغط برفق إذا لزم الأمر. يجب تغطية سطح الزجاج بالكامل وإغلاقه.
  16. جفف الشرائح بتركها تحت الغطاء الكيميائي طوال الليل. عادة ، يصلب وسيط التركيب في أقل من 24 ساعة. للتأكد من جفاف الشرائح ، يمكن عمل شريحة عينة. باستخدام شريحة فارغة ، ضع قطرة من وسط التثبيت واتركها تحت الغطاء الكيميائي طوال الليل. في اليوم التالي ، المس القطرة وتحقق مما إذا كانت صلبة.
  17. عندما تجف الشرائح ، قم بتحليل أنسجة الأنسجة باستخدام مجهر ضوئي أو مجهر أكثر تقدما مع قناة مجال مشرقة.
    1. ضع شريحة مجهرية على المسرح ، وحرك حتى تصبح العينة في وسط مجال الرؤية ، واضبط التركيز باستخدام مقبض التركيز ، واستخدم عدسة هدف تكبير 10x و / أو 20x لتحليل الأنسجة مقارنة بأنسجة التحكم (مشععة وهمية).
    2. إذا كان المجهر مزودا بكاميرا ، فالتقط صورا أيضا.
      ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء هنا ؛ يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة وتحليلها لاحقا. لا تبقي الشرائح أطول من 30 يوما لأن البقعة تتلاشى ببطء.

5. تلطيخ المناعي

  1. قم بتبريد الكاسيتات النسيجية التي تحتوي على عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين عن طريق وضعها على الثلج لمدة 1 ساعة على الأقل. باستخدام microtome ، قم بإعداد أقسام بسمك 5 ميكرومتر للتلطيخ. يجب تقطيع كل نسيج أفقيا لتغطية العينة المدرفلة بأكملها.
    1. بعد قطع كتلة البارافين ، انقل أقسام الأنسجة إلى حمام مائي دافئ إلى 45 درجة مئوية وضع الأقسام على شرائح مشحونة. اترك الشرائح على رف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة حتى تجف.
      ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء هنا ، ويمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة.
  2. ضعي الشرائح في حامل منزلق واخبزيها في فرن على حرارة 65 درجة مئوية طوال الليل. يمكن خبز الشرائح لفترة أقصر ، 1-2 ساعة. ومع ذلك ، هذا غير مستحسن في حالة قطع الشرائح الطازجة (قبل أقل من 1 شهر).
    ملاحظة: ضع مجموعة تلطيخ الشريحة اليدوية أسفل الغطاء الكيميائي وقم بإجراء عمليات الحضانة باستخدام الزيلين والإيثانول و H2O2 / الميثانول تحت الغطاء الكيميائي.
  3. في اليوم التالي ، قم بتبريد الشرائح عن طريق وضعها في حامل منزلق أسفل الغطاء الكيميائي لمدة 10 دقائق.
  4. قم بإزالة المناديل عن طريق وضع حامل الشريحة في وعاء مملوء ب 100٪ زيلين لمدة 3 دقائق. كرر الحضانة باستخدام زيلين طازج 100٪.
    ملاحظة: من تلك اللحظة ، تأكد من بقاء العينات رطبة في جميع الأوقات.
  5. إخماد البيروكسيديز الداخلي عن طريق احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في حاوية مملوءة بمحلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 2٪ في الميثانول تحت الغطاء الكيميائي.
    تنبيه: كحول الميثيل مادة يحتمل أن تكون خطرة: المخاطر الصحية (H225-H301 ، H311 ، H331-H370) ، قابلة للاشتعال (GHS02) ، وتسبب سمية حادة (عن طريق الفم ، الجلد ، الاستنشاق) (GHS08). بيروكسيد الهيدروجين مادة يحتمل أن تكون خطرة: تآكل (GHS05) ويسبب سمية حادة (GHS07).
  6. أعد ترطيب المقاطع في تدرج الإيثانول عن طريق وضع حامل الشريحة بالتتابع في حاويات مملوءة بالمحاليل التالية: 100٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 95٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 70٪ إيثانول ، 3 دقائق.
  7. انقل حامل الشريحة إلى وعاء مملوء بالماء المقطر واشطفه بالماء المقطر الجاري لمدة 2 دقيقة.
  8. لاسترداد المستضدات ، انقل حامل الشريحة إلى وعاء به 250 مل من محلول العازلة للسيترات (10 مللي متر سترات الصوديوم ، 0.05٪ توين -20 ، درجة الحموضة 6.0) واطهيه على حرارة 110 درجة مئوية لمدة 10 دقائق باستخدام غرفة إزالة الغطاء.
  9. انقل الحاوية بأكملها إلى الغرفة الباردة واتركها تبرد تدريجيا على مدار 30 دقيقة.
  10. بعد 30 دقيقة ، استبدل محلول السيترات العازل بالماء المقطر واشطفه بالماء المقطر الجاري حتى تتم إزالة جميع قطع البارافين العائمة.
  11. أخرج الشرائح من الحامل (واحدة تلو الأخرى) ، واضغط على منشفة ورقية ، وجفف المنطقة المحيطة بالعينة بعناية بمنشفة ورقية. ارسم شكلا مغلقا حول العينة باستخدام قلم يوفر حاجزا كارها للماء (قلم PAP). ضع في غرفة مرطبة.
  12. كتلة مع 5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في TBS-Tween عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المحلول على سطح العينة. تأكد من عدم وجود تسرب. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة لمدة 30 دقيقة.
  13. قم بإزالة محلول الحجب عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية. ضع مرة أخرى في غرفة مرطبة. أضف 100 ميكرولتر من التركيز المناسب للأجسام المضادة الأولية المعاد تعليقها في مخزن مؤقت مانع واحتضانها عند 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف طوال الليل. بالنسبة لمؤشر كتلة الجسم 1 / EYFP ، استخدم الدجاج المضاد ل GFP (التخفيف 1: 500) ؛ بالنسبة إلى Ki-67 ، استخدم الأرنب المضاد ل Ki-67 (التخفيف 1: 200).
  14. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ؛ ضع الشرائح في حامل منزلق وانقلها إلى الحاوية المملوءة ب TBS-Tween. اغسل الشرائح بالهز لمدة 5 دقائق. كرر 3x. في كل مرة ، استخدم جزءا جديدا من المخزن المؤقت TBS-Tween.
  15. أخرج الشرائح من الحامل (واحدة تلو الأخرى) ، وقم بإزالة محلول الغسيل الزائد عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ، وضعها في غرفة مرطبة. أضف 100 ميكرولتر من التركيز المناسب للأجسام المضادة الثانوية المعاد تعليقها في مخزن مؤقت مانع ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يجب أن تترافق الأجسام المضادة الثانوية مع الفلوروفور. بالنسبة لمؤشر كتلة الجسم 1 / EYFP ، استخدم حمار مضاد للدجاج Alexa Fluor 647 (التخفيف 1: 500) ؛ بالنسبة إلى Ki-67 ، استخدم الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 488 (التخفيف 1: 500).
  16. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ؛ ضع الشرائح في حامل منزلق وانقلها إلى الحاوية المملوءة ب TBS-Tween. اغسل الشرائح بالهز لمدة 5 دقائق. كرر 3x. في كل مرة ، استخدم جزءا جديدا من المخزن المؤقت TBS-Tween.
  17. أخرج الشرائح من الحامل (واحدة تلو الأخرى) ، وقم بإزالة محلول الغسيل الزائد عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ، وضعها في غرفة مرطبة. أضف 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ EdU المحضر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدام Alexa Fluor 555 fluorophore.
  18. قم بإزالة محلول EdU عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ؛ ضع الشرائح في حامل منزلق وانقلها إلى الحاوية المملوءة ب TBS-Tween. اغسل الشرائح بالهز لمدة 5 دقائق. كرر 2x. في كل مرة ، استخدم جزءا جديدا من المخزن المؤقت TBS-Tween.
  19. أخرج الشرائح من الحامل (واحدة تلو الأخرى) ؛ قم بإزالة محلول الغسيل الزائد عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ووضعها في غرفة مرطبة. قم بإجراء تلطيخ Hoechst 33258 المضاد بإضافة 100 ميكرولتر من محلول Hoechst 33258 (التخفيف 1: 1000 في TBS-Tween) على سطح العينة. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  20. قم بإزالة محلول Hoechst 33258 عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ؛ ضع الشرائح في حامل منزلق وانقلها إلى حاوية مملوءة ب TBS-Tween. اغسل الشرائح بالهز لمدة 5 دقائق.
  21. أخرج الشريحة من حامل الشريحة ، وجفف المنطقة المحيطة بالأنسجة باستخدام منشفة ورقية ، واعتمادا على حجم العينة ، أضف قطرة واحدة أو اثنتين من وسيط التثبيت المائي على سطح العينة. قم بالتركيب عن طريق وضع غطاء برفق أعلى الشريحة الزجاجية (احرص على عدم ترك أي فقاعات هواء). اضغط برفق إذا لزم الأمر. يجب تغطية سطح الزجاج بالكامل وإغلاقه.
  22. جفف الشرائح بتركها في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. عادة ، تصلب وسائط التركيب في أقل من 24 ساعة. للتأكد من جفاف الشرائح ، يمكن عمل شريحة عينة. استخدم شريحة فارغة ؛ ضع قطرة من وسط التثبيت واتركها تحت الغطاء الكيميائي طوال الليل. في اليوم التالي ، المس القطرة وتحقق مما إذا كانت صلبة.
  23. عندما تجف الشرائح ، يمكن تحليل الأنسجة الملطخة باستخدام مجهر مضان مجهز بمرشحات الطول الموجي للانبعاث مما يسمح بتصور تلطيخ Ki-67 و EdU و BMI1 / EYFP (535 نانومتر و 646 نانومتر و 700 نانومتر على التوالي).
  24. ضع شريحة مجهر على المسرح ، وحرك حتى تصبح العينة في وسط مجال الرؤية ، واضبط التركيز باستخدام مقبض التركيز ، واستخدم عدسة هدف التكبير 10x و / أو 20x لتحليل التلوين مقارنة بأنسجة التحكم (مشععة وهمية). إذا كان المجهر مزودا بكاميرا ، فيمكن التقاط الصور أيضا. التقط صورا لكل قناة على حدة وادمجها لاحقا.
    ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء هنا ؛ يمكن تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية وتحليلها لاحقا. لا تبقي الشرائح أطول من 14 يوما لأن البقع تتلاشى ببطء.

6. تلطيخ TUNEL

  1. قم بتبريد الكاسيتات النسيجية التي تحتوي على عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين عن طريق وضعها على الثلج لمدة 1 ساعة على الأقل. باستخدام microtome ، قم بإعداد أقسام بسمك 5 ميكرومتر للتلطيخ. يجب تقطيع كل نسيج أفقيا لتغطية العينة المدرفلة بأكملها.
    1. بعد قطع كتلة البارافين ، انقل أقسام الأنسجة إلى حمام مائي دافئ حتى 45 درجة مئوية وضع الأقسام على شرائح مشحونة. اترك الشرائح على رف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة حتى تجف.
      ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء هنا ، ويمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة.
  2. ضعي الشرائح في حامل منزلق واخبزيها في فرن على حرارة 65 درجة مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: يمكن خبز الشرائح لفترة أقصر ، 1-2 ساعة. ومع ذلك ، لا ينصح في حالة قطع الشرائح الطازجة (قبل أقل من 1 شهر). ضع مجموعة تلطيخ الشرائح اليدوية تحت الغطاء الكيميائي وقم بإجراء عمليات الحضانة باستخدام الزيلين والإيثانول تحت الغطاء الكيميائي.
  3. في اليوم التالي ، قم بتبريد الشرائح عن طريق وضعها في حامل منزلق أسفل الغطاء الكيميائي لمدة 10 دقائق.
  4. قم بإزالة المناديل عن طريق وضع حامل الشرائح في وعاء مملوء بزيلين 100٪ لمدة 3 دقائق. كرر الحضانة باستخدام زيلين طازج 100٪.
    ملاحظة: من هذه النقطة ، تأكد من إبقاء العينات رطبة في جميع الأوقات.
  5. أعد ترطيب المقاطع في تدرج الإيثانول عن طريق وضع حامل الشرائح بالتتابع في حاويات مملوءة بالمحاليل التالية: 100٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 95٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 90٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 80٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 70٪ إيثانول ، 3 دقائق.
  6. انقل حامل الشريحة إلى وعاء مملوء بالماء المقطر واشطفه بالماء المقطر الجاري لمدة 1 دقيقة.
  7. أخرج الشرائح من الحامل (واحدة تلو الأخرى) ، واضغط على منشفة ورقية ، وجفف المنطقة المحيطة بالعينة بعناية بمنشفة ورقية. ارسم شكلا مغلقا حول العينة باستخدام قلم يوفر حاجزا كارها للماء (قلم PAP). ضع في غرفة مرطبة.
  8. احتضان مع البروتين الخالي من DNase K. أضف 100 ميكرولتر من محلول البروتين K الخالي من DNase (التخفيف 1:25 في DPBS) على سطح العينة داخل الحاجز الكارهة للماء. احتضان في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة لمدة 15 دقيقة.
    تنبيه: Proteinase K مادة يحتمل أن تكون خطرة: المخاطر الصحية (H315 - H319 - H334).
  9. قم بإزالة محلول البروتيناز K عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ؛ ضع الشرائح في حامل شرائح وانقلها إلى الحاوية المملوءة ب DPBS. اغسل الشرائح بالهز لمدة 5 دقائق. كرر 2x. في كل مرة ، استخدم جزءا جديدا من DPBS.
  10. تحضير خليط تفاعل TUNEL: امزج محلول الملصق (1x) مع محلول الإنزيم (10x). ماصة جيدا.
  11. أخرج الشرائح من الحامل (واحدة تلو الأخرى) ؛ قم بإزالة محلول الغسيل الزائد عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ووضعها في غرفة مرطبة. أضف 50 ميكرولتر من خليط تفاعل TUNEL على سطح العينة واحتضانها في الظلام عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة لمدة 60 دقيقة. للحصول على عنصر تحكم سلبي ، استخدم محلول التسمية فقط (بدون TdT).
  12. قم بإزالة محلول TUNEL عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ؛ ضع الشرائح في حامل شرائح وانقلها إلى حاوية مملوءة ب DPBS. اغسل الشرائح بالهز لمدة 5 دقائق. كرر 2x. في كل مرة ، استخدم جزءا جديدا من DPBS.
  13. أخرج الشرائح من الحامل (واحدة تلو الأخرى) ؛ قم بإزالة محلول الغسيل الزائد عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ووضعها في غرفة مرطبة. قم بإجراء تلطيخ Hoechst 33258 المضاد بإضافة 100 ميكرولتر من محلول Hoechst 33258 (التخفيف 1: 1000 في TBS-Tween) على سطح العينة. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  14. قم بإزالة محلول Hoechst 33258 عن طريق النقر على الشريحة الزجاجية على منشفة ورقية ؛ ضع الشرائح في حامل شرائح وانقلها إلى الحاوية المملوءة ب DPBS. اغسل الشرائح بالهز لمدة 5 دقائق.
  15. أخرج الشريحة من حامل الشريحة ؛ جفف المنطقة المحيطة بالأنسجة باستخدام منشفة ورقية ، واعتمادا على حجم العينة ، أضف قطرة واحدة أو اثنتين من وسيط التثبيت المائي على سطح العينة. قم بالتركيب عن طريق وضع غطاء برفق أعلى الشريحة الزجاجية (احرص على عدم ترك أي فقاعات هواء). اضغط برفق إذا لزم الأمر. يجب تغطية سطح الزجاج بالكامل وإغلاقه.
  16. جفف الشرائح بتركها في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. عادة ، يصلب وسيط التركيب في أقل من 24 ساعة. للتأكد من جفاف الشرائح ، يمكن عمل شريحة عينة. ضع قطرة من وسط التثبيت واتركها في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. في اليوم التالي ، المس القطرة وتحقق مما إذا كانت صلبة.
  17. عندما تجف الشرائح ، يمكن تحليل الأنسجة الملطخة باستخدام مجهر مضان مزود بمرشحات الطول الموجي للانبعاث مما يسمح بتصور تلطيخ TUNEL (535 نانومتر).
  18. ضع شريحة مجهر على المسرح ، وحرك حتى تصبح العينة في وسط مجال الرؤية ، واضبط التركيز باستخدام مقبض التركيز ، واستخدم عدسة هدف تكبير 10x و / أو 20x لتحليل التلوين مقارنة بأنسجة التحكم (مشععة وهمية). إذا كان المجهر مزودا بكاميرا ، فيمكن التقاط الصور أيضا. التقط صورا لكل قناة على حدة وادمجها لاحقا.
    ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء هنا ؛ يمكن تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية وتحليلها لاحقا. لا تبقي الشرائح أطول من 14 يوما لأن البقع تتلاشى ببطء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح استخدام تشعيع الجسم الكلي 12 جراي (TBI) بالاشتراك مع تتبع النسب الوراثية للفئران بإجراء تحليل شامل لعواقب الإصابة الإشعاعية في الأمعاء. للبدء ، Bmi1-CreER ؛ تلقت فئران Rosa26eYFP حقنة واحدة من عقار تاموكسيفين ، مما يؤدي إلى تعزيز تعبير البروتين الفلوري الأصفر (EYFP) داخل مجموعة الخلايا الجذعية الاحتياطية Bmi1 + . بعد يومين من حقن عقار تاموكسيفين ، خضعت الفئران للإشعاع أو التشعيع الوهمي. قبل ثلاث ساعات من القتل الرحيم ، تم حقن الفئران ب EdU. بعد القتل الرحيم ، تم جمع عينات الأمعاء الدقيقة للتحليل في 0 ساعة و 3 ساعات و 6 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة و 7 أيام بعد التشعيع. توضح صور الهيماتوكسيلين والإيوزين التمثيلية (H&E) (الشكل 1) من الدورة الزمنية المذكورة أعلاه استجابة ظهارة الأمعاء للإصابة. النقطة الزمنية 0 h توضح ظهارة الأمعاء الاستتبابية (الشكل 1) ؛ يتبع ذلك مرحلة موت الخلايا المبرمج التي تتميز بفقدان الخلايا داخل مقصورات القبو بين 3 ساعات و 48 ساعة (الشكل 1). ثم يتبع مرحلة التجدد ، حيث يمكن العثور على خلايا تكاثرية عالية تملأ الخبايا بين 72 ساعة و 96 ساعة (الشكل 1). أخيرا ، يؤدي هذا إلى مرحلة التطبيع ، ممثلة هنا بالنقطة الزمنية 7 أيام (الشكل 1).

يوضح الشكل 2 التغيرات في الحالة التكاثرية لخلايا القبو المعوية التي تم تقييمها من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي ل EdU (علامة الخلايا في المرحلة S) و Ki-67 (علامة الخلايا في مراحل G1 و S و G2 / M) ، بينما يشير تتبع النسب (خلايا EYFP +) إلى الخلايا الناشئة من الخلايا الجذعية الاحتياطية Bmi1 +. أثناء التوازن (الشكل 2 ، 0 h sham) ، تقتصر الخلايا الإيجابية Bmi1 + المميزة بتعبير EYFP على موضع +4- +6 داخل الخبايا. خلال مرحلة موت الخلايا المبرمج (24 ساعة و 48 ساعة) ، ينخفض عدد الخلايا الإيجابية EYFP (الشكل 2). تتميز مرحلة التجدد (72 ساعة و 96 ساعة) بخلايا إيجابية Bmi1 + سريعة التكاثر وأسلافها (الشكل 2) ؛ بحلول 7 أيام بعد التشعيع ، أدى المزيد من الانتشار والهجرة إلى تجديد خلايا سرداب الأمعاء واستعادة سلامة ظهارة الأمعاء (الشكل 2).

في الفئران المشععة الوهمية (التحكم) ، تلطخ EdU و Ki-67 الخلايا التكاثرية السلبية EYFP للخبايا المعوية ، وهي نموذجية للتوازن المعوي الطبيعي ، وتمتد من الخلايا الجذعية النشطة عبر منطقة تضخيم العبور (الشكل 2). يتسبب الضرر الإشعاعي في فقدان الخلايا التكاثرية للغاية خلال مرحلة موت الخلايا المبرمج ، كما يتضح من تقليل تلطيخ EdU و Ki-67 (الشكل 2). يؤدي تنشيط الخلايا الجذعية الاحتياطية (في هذا المثال ، الخلايا الإيجابية التي تحمل علامة EYFP Bmi1 + ) وتكاثرها إلى زيادة في الخلايا الإيجابية EdU و Ki-67 مرئية بوضوح عند 72 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة ، حيث تتكون الخبايا بشكل حصري تقريبا من خلايا ملطخة بالاشتراك مع EYFP و EdU و Ki-67. مستويات الانتشار المرصودة تطبيع 7 أيام بعد الإصابة (الشكل 2).

من أجل توضيح موت الخلايا المبرمج الناجم عن الضرر الإشعاعي ، تم إجراء تلطيخ TUNEL ، وتم تضمين الصور التمثيلية في الشكل 3. أثناء الاتزان الداخلي (الشكل 3) ، يخضع عدد قليل من الخلايا لموت الخلايا المبرمج ، وهو نموذجي للدوران الظهاري المعوي السريع عادة. يمكن ملاحظة زيادة واضحة في تلطيخ TUNEL في وقت متأخر من مرحلة موت الخلايا المبرمج (24 ساعة و 48 ساعة) بعد التشعيع (الشكل 3). خلال مرحلة التجدد ، يتناقص تلطيخ TUNEL بشكل مطرد داخل الخبايا المتجددة ويكون غائبا تقريبا مرة أخرى عندما يتم تطبيع الخبايا (الشكل 3). يصف البروتوكول المقدم طريقة تلطيخ مناعي بسيطة وسهلة الاستخدام باستخدام مجموعة مباشرة ومستخدمة على نطاق واسع من تقنيات وضع العلامات (TUNEL ، EdU ، Ki-67 ، EYFP) قادرة على تقديم نظرة ثاقبة لسلوك الخلايا المعوية بعد الإصابة (هنا ، التشعيع). يمكن استخدام هذا النهج لدراسة الآليات التي تنظم عمليات التجدد في ظهارة الأمعاء في ظروف محددة. سيؤدي استخدام هذا النهج وما شابهه إلى إلقاء الضوء على عمليات التجدد البديلة بعد الإهانات المعوية المختلفة ، علاوة على ذلك ، سيسمح بالتحقيق في الاستراتيجيات العلاجية للوقاية من فقدان وظيفة الحاجز.

Figure 1
الشكل 1: صور تمثيلية لمقاطع ملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) من أنسجة الأمعاء الدقيقة بعد دورة زمنية بعد تشعيع الجسم بالكامل. Bmi1-CreER ؛ تلقت الفئران Rosa26eYFP جرعة واحدة من عقار تاموكسيفين قبل يومين من تشعيع 12 جراي لكامل الجسم أو تشعيع وهمي. تم التضحية بالفئران ، وتم جمع أنسجة الأمعاء الدقيقة في النقاط الزمنية المشار إليها في الشكل. تم التقاط جميع الصور بتكبير 10x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور تمثيلية للتلطيخ المناعي لأقسام الأمعاء الدقيقة بعد التشعيع. Bmi1-CreER ؛ تلقت الفئران Rosa26eYFP جرعة واحدة من عقار تاموكسيفين قبل يومين من تشعيع 12 جراي لكامل الجسم أو تشعيع وهمي. تم التضحية بالفئران ، وتم جمع أنسجة الأمعاء الدقيقة في النقاط الزمنية المشار إليها في الشكل. تم تلطيخ أقسام الأنسجة ب EdU لتمييز الخلايا في المرحلة S (الوردي) ومع Ki-67 لتمييز الخلايا في مراحل G0 و S و G2 / M (صفراء). يشير EYFP (الأخضر) إلى خلايا Bmi1 + وأسلافها ويوضح تتبع النسب. تم تلطيخ الأقسام بشكل أكبر باستخدام DAPI (الأزرق) لتصور النوى. يتم عرض البيانات كصور مدمجة عند تكبير 10x وإدخالات من البقع الفردية عند تكبير 20x (نشأت هذه الصور من صور 10x). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور تمثيلية لتلطيخ TUNEL المناعي لأقسام الأمعاء الدقيقة عند التشعيع. Bmi1-CreER ؛ تلقت الفئران Rosa26eYFP جرعة واحدة من عقار تاموكسيفين قبل يومين من تشعيع 12 جراي لكامل الجسم أو تشعيع وهمي. تم التضحية بالفئران ، وتم جمع أنسجة الأمعاء الدقيقة في النقاط الزمنية المشار إليها في الشكل. TUNEL (أحمر) بقع الخلايا المبرمج. تم تلطيخ هذه الصور ب DAPI (أزرق) لتصور النوى. تم التقاط الصور المعروضة بتكبير 20x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار للإصابة الإشعاعية. يسمح بالتحليل الدقيق للتغيرات في ظهارة الأمعاء على مدار 7 أيام بعد الإصابة. الأهم من ذلك ، أن النقاط الزمنية المختارة تعكس المراحل الحاسمة من الإصابة وتتميز بتغيرات مميزة في الأمعاء (الإصابة ، موت الخلايا المبرمج ، التجديد ، ومراحل التطبيع)60. تم إنشاء هذا النموذج من التشعيع وتقييمه بعناية ، مما يدل على مظهر مناسب للإصابة لتقليد تلك التي يعاني منها المرضى الذين يخضعون للعلاج الإشعاعي61. يخضع أكثر من نصف مرضى سرطان القولون والمستقيم وسرطان أمراض النساء للعلاج الإشعاعي البطني40،62،63. على الرغم من الطرق المتقدمة لاستهداف العلاج الإشعاعي ، يعاني المرضى من تشعيع الأنسجة المعوية السليمة ، والتي تنتج فيزيولوجيا مرضية مشابهة جدا لتلك التي لوحظت مع نموذج تشعيع الجسم الكلي المقدم هنا. لذلك ، يمكن لنموذج الإشعاع الموصوف هنا أن يعالج تداعيات التعرض العرضي للإشعاع للمرضى و / أو العاملين في المجال الطبي ، وبالتالي فهو حيوي لصحة الإنسان.

Bmi1-CreER ؛ يحمل نموذج الفئران Rosa26eYFP Cre المستحث بعقار تاموكسيفين تحت التحكم النسخي لمروج الفأر Bmi1 (الجين الورمي للإصبع الدائري متعدد المشط Bmi1). بالإضافة إلى ذلك ، تحمل هذه الفئران تسلسل R26-stop-EYFP ، حيث يحيط بكودون STOP جوانب loxP متبوعا بجين البروتين الفلوري الأصفر المحسن (EYFP) الذي يتم إدخاله في موضع Gt (ROSA) 26Sor. يتم حظر تعبير EYFP بواسطة تسلسل STOP محاط ب loxP في المنبع ولكن يمكن تنشيطه عن طريق عمليات الحذف المستهدفة التي يسببها عقار تاموكسيفين ، بوساطة Cre ، مما يسمح بتتبع النسب للخلايا المعبرة عن Bmi1 ، وهي مجموعة فرعية احتياطية خاصة بالخلايا الجذعية لخلايا التشفير. بروتوكول الإشعاع بالاشتراك مع Bmi1-CreER ؛ تم استخدام نموذج الفئران Rosa26eYFP سابقا لدراسة دور عوامل النسخ في تنظيم تجديد الأمعاء18,56. تظهر النتائج التمثيلية المعروضة في الشكل 1 إلى الشكل 3 نتائج مماثلة لتلك المعروضة في المنشورات الحديثة 18,56.

من الجدير بالذكر ، Bmi1-CreER ؛ فئران Rosa26eYFP ليست سوى واحدة من العديد من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا المستخدمة لدراسة تجديد الأمعاء. تم دمج نماذج تتبع سلالة الفئران الأخرى مع الإشعاع لتوضيح أدوار خلايا ومسارات معينة في القدرة التجديدية لظهارة الأمعاء18،26،32،33،34،35،36،37،56،64،65،66،67 . تم تصميم هذه النماذج للتحقيق في دور مجموعات مختلفة من الخلايا الجذعية المحجوزة ، واستكشاف سلائف السلالات الإفرازية والمعوية ، ودراسة وظيفة جينات معينة داخل كل مجموعة فرعية من الخلايا الظهارية المعوية. ستساعد النتائج المجمعة من هذه التحقيقات على توسيع فهم القدرة التجديدية لظهارة الأمعاء.

الأهم من ذلك ، مع تعديلات طفيفة ، يجب أن تسمح هذه التقنية بالتحقيق في العلاقات بين الجراثيم ومجموعات الخلايا الظهارية واللحمية والمناعية المختلفة عند الإصابة الإشعاعية. سيسمح إدخال نماذج حيوانية متميزة لتتبع النسب بدراسة السلوك في الوقت الفعلي وتفاعل المجموعات الفرعية المختلفة للخلايا بعد الإصابة. بدلا من ذلك ، يمكن استبدال تلطيخ الأنسجة بتسلسل الحمض النووي الريبي ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، أو فرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACS) ، أو التحليل البروتيني لاستخلاص المزيد من المعرفة المتعمقة حول دور سلالات خلايا معينة أثناء تجديد الأمعاء بعد الإصابة68,69. يمكن استخدام نموذج الإصابة هذا لاختبار طرق العلاج الجديدة التي تهدف إلى تقليل الآثار الجانبية للإشعاع ، وتقصير وقت الشفاء ، وتحسين جودة رعاية المرضى70. على الرغم من أن نموذج الإشعاع الموصوف هنا يمكن أن يكون بمثابة أداة مفيدة لدراسة تجديد ظهارة الأمعاء ، إلا أنه يحتوي أيضا على العديد من القيود. تؤدي جرعة الإشعاع للجسم بالكامل دائما إلى متلازمة المكونة للدم اللاحقة ، والتي تعيق التحقيق في تجديد الأمعاء. يمكن تجنب ذلك عن طريق زرع نخاع العظم. علاوة على ذلك ، قد يؤدي التعديل على بروتوكول إصابة البطن فقط إلى تحسين بعض الآثار الجانبية للإشعاع71. ومع ذلك ، يتطلب هذا النموذج خطوات إضافية قد تؤثر على استجابة الأمعاء للإصابة (مثل التخدير). بالمناسبة ، ينتج إشعاع البطن متلازمة الجهاز الهضمي التي يسببها الإشعاع (RIGS) دون متلازمة المكونة للدم ، والتي تختلف عن تشعيع الجسم بالكامل (WBI) ، حيث ينتج WBI أعراض الجهاز الهضمي المماثلة ولكنه يتضمن فقدانا جزئيا لوظيفة المكونة للدم بعد الإصابة71,72.

وتجدر الإشارة إلى أن النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا مثل تلك الموصوفة في هذا البروتوكول متطورة وتسمح بتتبع نسب خلايا معينة. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج ، على الرغم من أنها مفيدة للغاية ، تتطلب جهدا إضافيا للحفاظ عليها. من الصعب إنشاء نماذج حيوانية محورة وراثيا تسمح بحذف الجينات المشروطة ، وقد لا يتم حذفها في الوقت المناسب عند الإصابة بسهولة. علاوة على ذلك ، تسمح معظم النماذج المعدلة وراثيا فقط بالحذف المشروط أو تعطيل الجين محل الاهتمام ولكنها غير قابلة للحث ، وبالتالي فهي غير قادرة على استعادة وظيفة الجينات وقد تعيق الدراسات. علاوة على ذلك ، تتطلب النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا عادة العلاج بمواد كيميائية إضافية (مثل عقار تاموكسيفين ، دوكسيسيكلين) لتحقيق تعطيل أو الإفراط في التعبير عن الجين محل الاهتمام. قد تؤدي العلاجات بهذه المواد ، إلى حد ما ، إلى تغيير استجابة ظهارة الأمعاء أو إضافة إلى شدة الإصابة 73،74،75،76. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إدخال تحريض تتبع النسب بواسطة عقار تاموكسيفين بالقرب من وقت الإصابة الإشعاعية لتحسين وضع العلامات على الخلايا المشاركة في التجديد (على سبيل المثال ، 6-24 ساعة قبل الإصابة). وبالتالي ، من الممكن استبدال نموذج معدل وراثيا بفئران من النوع البري ومجموعة من تلطيخ IF (على سبيل المثال ، Ki-67 و PCNA و EdU و TUNEL و Caspase 3). يسمح هذا النموذج بتحليل القدرة التجديدية للأمعاء ، على الرغم من أنه لا يسمح بدراسة مجموعة فرعية محددة من الخلايا.

يحتوي البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة على عدة خطوات حاسمة. من الأهمية بمكان ضمان استخدام الفئران السليمة للتجارب ، لأنها ستتعرض للإشعاع والعلاج بالمواد الكيميائية. إذا تم إجراء تجارب مع مجموعات مختلفة من الفئران على بعد أيام أو أسابيع أو أشهر ، فمن الممارسات الجيدة الالتزام بنفس الجدول الزمني ، على سبيل المثال ، حقن عقار تاموكسيفين في نفس الوقت من اليوم. يجب أن تتم عملية التشعيع على الفور ، ويجب إعادة الفئران إلى أقفاصها الأصلية على الفور. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد توفير الطعام المخفف والكثير من الماء في تخفيف بعض الآثار الضارة للإشعاع. يقترح تقنية اللفة السويسرية للسماح بإجراء تحليل شامل للأنسجة المعوية59. هذه التقنية ليست تافهة ، ويجب إجراء اختبارات مسبقة لضمان تحقيق جودة لا تشوبها شائبة للأنسجة للتلطيخ. يجب إعداد جميع الحلول لتجارب الفئران وتلطيخها طازجة وتخزينها في ظل ظروف مناسبة. عند العمل مع الأجسام المضادة ، من المهم اختبار الشرائح باستخدام عناصر تحكم إيجابية وسلبية ، وإذا أمكن ، استخدام الأجسام المضادة بنفس رقم الكتالوج ورقم اللوت. يجب تخزين شرائح التألق المناعي عند 4 درجات مئوية وتصويرها في غضون 1 أسبوع من التحضير. قد يؤدي التخزين المطول ، حتى عند -20 درجة مئوية ، إلى فقدان الإشارة. يمكن تخزين شرائح H&E في درجة حرارة الغرفة حيث لا يوجد قلق من فقدان استقرار الفلوروفور.

باختصار ، نموذج الإصابة الإشعاعية لتتبع النسب المقدم هنا هو نموذج قابل للتكرار ومناسب لتتبع مصير الخلايا المعوية بعد الإهانة ويمكن دمجه مع نماذج الفئران المتنوعة والتقنيات الجزيئية لتحسين فهم الفيزيولوجيا المرضية لظهارة الأمعاء. يمكن أن تؤدي نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية والخلوية التي تحكم تجديد ظهارة الأمعاء إلى تطوير علاجات جديدة وتدخلات علاجية مفيدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يرغب المؤلفون في الاعتراف بمركز أبحاث الأنسجة في مركز ستوني بروك للسرطان للحصول على مساعدة الخبراء في إعداد عينات الأنسجة وقسم الموارد الحيوانية المختبرية في جامعة ستوني بروك للمساعدة في رعاية الحيوانات والتعامل معها. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة DK124342 الممنوحة ل Agnieszka B. Bialkowska و DK052230 للدكتور فنسنت دبليو يانغ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Tags

علم الأحياء، العدد 185،
التجديد الظهاري المعوي استجابة للإشعاع المؤين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb,… More

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter