Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Intestinal epitelregenerering som reaktion på ioniserende bestråling

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

Mave-tarmkanalen er et af de mest følsomme organer for skade ved stråleterapeutiske kræftbehandlinger. Det er samtidig et organsystem med en af de højeste regenerative kapaciteter efter sådanne fornærmelser. Den præsenterede protokol beskriver en effektiv metode til at studere tarmepithelets regenerative kapacitet.

Abstract

Tarmepitelet består af et enkelt lag af celler, men indeholder flere typer terminalt differentierede celler, som genereres ved aktiv spredning af intestinale stamceller placeret i bunden af tarmkrypter. Under tilfælde af akut tarmskade gennemgår disse aktive tarmstamceller imidlertid celledød. Gammabestråling er en meget anvendt kolorektal cancerbehandling, som, selvom den er terapeutisk effektiv, har den bivirkning, at den nedbryder den aktive stamcellepulje. Faktisk oplever patienter ofte gastrointestinalt strålingssyndrom, mens de gennemgår strålebehandling, delvis på grund af aktiv stamcelleudtømning. Tabet af aktive tarmstamceller i tarmkrypter aktiverer en pulje af typisk hvilende reserve intestinale stamceller og inducerer dedifferentiering af sekretoriske og enterocytprecursorceller. Hvis ikke for disse celler, ville tarmepitelet mangle evnen til at komme sig efter strålebehandling og andre sådanne store vævsfornærmelser. Nye fremskridt inden for afstamningssporingsteknologier muliggør sporing af aktivering, differentiering og migration af celler under regenerering og er med succes blevet anvendt til at studere dette i tarmen. Denne undersøgelse har til formål at skildre en metode til analyse af celler i musens tarmepitel efter strålingsskade.

Introduction

Det menneskelige tarmepitel ville dække omtrent overfladen af en halv badmintonbane, hvis den blev placeret helt fladt1. I stedet komprimeres dette enkelt cellelag, der adskiller mennesker fra indholdet af deres tarme, til en række fingerlignende fremspring, villi og fordybninger, krypter, der maksimerer tarmens overfladeareal. Cellerne i epitelet differentierer langs en krypt-villusakse. Villus består primært af næringsstofabsorberende enterocytter, slimudskillende bægerceller og de hormonproducerende enteroendokrine celler, mens krypterne primært består af defensinproducerende Paneth-celler, aktive og reservestamceller og stamceller 2,3,4,5. Desuden genererer den tovejskommunikation, disse celler har med stromale og immunceller i det underliggende mesenkymale rum og lumens mikrobiota, et komplekst netværk af interaktioner, der opretholder tarmhomeostase og er afgørende for genopretning efter skade 6,7,8.

Tarmepitelet er det hurtigst selvfornyende væv i menneskekroppen med en omsætningshastighed på 2-6 dage 9,10,11. Under homeostase deler aktive stamceller i bunden af tarmkrypter (kryptbasesøjleceller), der er kendetegnet ved ekspressionen af leucinrige gentagne holdige G-proteinkoblede receptor 5 (LGR5), hurtigt og tilvejebringer stamceller, der adskiller sig i alle andre intestinale epitellinjer. På grund af deres høje mitotiske hastighed er aktive stamceller og deres umiddelbare forfædre imidlertid særligt følsomme over for gammastrålingsskader og gennemgår apoptose efter bestråling 5,12,13,14. Efter deres tab gennemgår reservestamceller og ikke-stamceller (subpopulation af forfædre og nogle terminalt differentierede celler) i tarmkrypter aktivering og genopfylder basalkryptrummet, som derefter kan rekonstituere cellepopulationer af villi og dermed regenerere tarmepitelet15. Ved hjælp af afstamningssporingsteknikker har flere forskergrupper vist, at reservestamceller (hvilende) er i stand til at understøtte regenerering ved tab af aktive stamceller 13,16,17,18,19,20,21,22. Disse celler er karakteriseret ved tilstedeværelsen af polycomb kompleks protein 1 onkogen (Bmi1), mus telomerase revers transkriptase gen (mTert), Hop homeobox (Hopx) og leucin-rige gentage protein 1 gen (Lrig1). Derudover har det vist sig, at ikke-stamceller er i stand til at genopbygge tarmkrypter ved skade 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Det har især vist sig, at forfædre til sekretoriske celler og enterocytter gennemgår dedifferentiering ved skade, vender tilbage til stamlignende celler og understøtter regenerering af tarmepitelet. Nylige undersøgelser har identificeret celler, der udtrykker flere markører, der har kapacitet til at erhverve stammelignende egenskaber ved skade (såsom DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Overraskende viste Yu et al., at selv modne Paneth-celler (LYZ +) kan bidrage til intestinal regenerering37. Ud over at forårsage apoptose af intestinale epitelceller og forstyrre epitelbarrierefunktionen resulterer bestråling desuden i dysbiose af tarmfloraen, immuncelleaktivering og initiering af et proinflammatorisk respons samt aktivering af mesenkymale og stromale celler38,39.

Gammastråling er et værdifuldt terapeutisk værktøj i kræftbehandling, især for kolorektal tumorer40. Bestråling påvirker imidlertid signifikant intestinal homeostase ved at fremkalde skade på cellerne, hvilket fører til apoptose. Strålingseksponering forårsager flere forstyrrelser, der bremser patientens opsving og er præget af slimhindeskade og betændelse i den akutte fase og diarré, inkontinens, blødning og mavesmerter på lang sigt. Denne panoply af manifestationer kaldes gastrointestinal strålingstoksicitet. Derudover kan strålingsinduceret progression af transmural fibrose og/eller vaskulær sklerose først manifestere sig år efter behandlingen38,41. Samtidig med selve skaden inducerer stråling et reparationsrespons i tarmceller, der aktiverer signalveje, der er ansvarlige for at initiere og orkestrere regenerering42. Strålingsinduceret tyndtarmssygdom kan stamme fra bækken- eller abdominal strålebehandling, der leveres til andre organer (såsom livmoderhalsen, prostata, bugspytkirtel, endetarm)41,43,44,45,46. Tarmbestrålingsskader er således et væsentligt klinisk problem, og en bedre forståelse af den resulterende patofysiologi vil sandsynligvis fremme udviklingen af interventioner til lindring af gastrointestinale komplikationer forbundet med strålebehandling. Der er andre teknikker, der gør det muligt at undersøge det regenerative formål med tarmepitelet bortset fra stråling. Transgene og kemiske murinmodeller til undersøgelse af inflammation og regenerering derefter er blevet udviklet47. Dextran natriumsulfat (DSS) inducerer betændelse i tarmen og fører til udvikling af egenskaber svarende til inflammatoriske tarmsygdomme48. En kombination af DSS-behandling med den pro-kræftfremkaldende forbindelse azoxymethan (AOM) kan resultere i udvikling af colitis-associeret cancer48,49. Iskæmi reperfusionsinduceret skade er en anden metode, der anvendes til at studere det regenerative potentiale i tarmepitelet. Denne teknik kræver erfaring og kirurgisk viden50. Desuden forårsager ovennævnte teknikker andre typer skader end stråling og kan føre til involvering af forskellige regenereringsmekanismer. Derudover er disse modeller tidskrævende, mens strålingsteknikken er ret kort. For nylig er in vitro-metoder, der anvender enteroider og colonoider genereret fra tarm og tyktarm, blevet anvendt i kombination med strålingsskade til at studere mekanismerne for intestinal regenerering51,52. Disse teknikker rekapitulerer imidlertid ikke fuldt ud det organ, de modellerer53,54.

Den fremlagte protokol indeholder beskrivelsen af en murinmodel af gammastrålingsskade i kombination med en genetisk model, der efter tamoxifenbehandling muliggør sporing af slægter, der stammer fra reservestamcellepopulationen (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Denne model anvender en 12 Gy totalkropsbestråling, som inducerer signifikant nok tarmskade til at aktivere reservestamceller, mens den stadig giver mulighed for efterfølgende undersøgelse af tarmregenerativ kapacitet inden for 7 dage efter skade55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus blev anbragt i Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) ved Stony Brook University. Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkendte alle undersøgelser og procedurer, der involverede dyreforsøgspersoner. Forsøg med dyr blev udført i nøje overensstemmelse med den godkendte dyrehåndteringsprotokol (IACUC # 245094).

BEMÆRK: Musstammer B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) og B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) blev kommercielt fremstillet (se materialetabel) og krydset for at opnå Bmi1-Cre ER; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) mus, som beskrevet tidligere56,57,58.

1. Boliger til Bmi1-Cre ER; Rosa26 eYFP-mus

  1. Opbevar musene i et dyreanlæg ved en temperatur fra 68-72 ° F og fugtighed fra 30-70% i en 12 h / 12 timers lys / mørk cyklus med vand og normal chow ad libitum.
  2. Før forsøgene bekræftes musegenotyper ved hjælp af en standard PCR-genotypeteknik57,58.

2. Tilberedning af dyr og materialer

  1. Overfør mus til forsøgsrummet mindst 7 dage før ethvert forsøg for at lade musene akklimatisere.
  2. Match forsøgs- og kontroldyr efter køn og alder.
  3. Udsæt kontroldyrene for tamoxifen-induceret Cre-medieret rekombination, men ikke for bestråling (skinbehandling, 0 Gy), samtidig med at det sikres, at forsøgsdyrene får tamoxifeninjektionen og udsættes for gammabestråling.
  4. Forbered tamoxifenopløsningen. Tamoxifenpulver resuspenderes i steril majsolie i en koncentration på 30 mg/ml. Sonikere i 3 minutter i cyklusser på 30 s ON og 30 s OFF med 60% amplitude og drej derefter i mørke i 1 time ved stuetemperatur (RT). Tamoxifenopløsning kan fryses ved -20 °C, men frys/tø den ikke op mere end én gang. Forbered helst en frisk opløsning hver gang og opbevar den ikke.
    BEMÆRK: Tamoxifen er lysfølsom. Pak det ind med stanniol under stuetemperatur.
    FORSIGTIG: Tamoxifen er et potentielt farligt stof: Sundhedsfare (GHS08) og miljøfare (GHS09).
  5. Forbered 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) stamopløsning. Resuspender EdU-pulver i 1/5 af det totale volumen sterilt dimethylsulfoxid (DMSO) og tilsæt langsomt de resterende 4/5 af det samlede volumen sterilt ultrarent vand. Når den er helt opløst, alikvote og opbevares ved -20 °C.
    FORSIGTIG: 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) og dimethylsulfoxid (DMSO) er potentielt farlige stoffer: Sundhedsfare (henholdsvis H340 og H631 og H227, H315 og H319). EdU kan forårsage genetiske defekter og mistænkes for at skade fertiliteten eller ufødte børn, og DMSO kan forårsage hud- og øjenirritation.
  6. Forbered reagenser til vævsopsamling og fiksering: fortyndet ethanol til fremstilling af en 70% vandopløsning, afkøl DPBS til 4 ° C, og fremsæt modificeret Bouins fikseringsbuffer (50% ethanol og 5% eddikesyre i destilleret H2O) og 10% bufret formalin.
    FORSIGTIG: Ethylalkohol er et potentielt farligt stof: Sundhedsfare (H225-H319), brandfarlig (GHS02) og forårsager akut toksicitet (GHS07). Eddikesyre er et potentielt farligt stof: sundhedsfare (H226-H314), brandfarlig (GHS02) og ætsende (GHS05). Formalin er et potentielt farligt stof: sundhedsfare (H350, H315, H317, H318, H370) og ætsende. Formalin kan forårsage kræft, hud- og øjenirritation, organskader og allergiske hudreaktioner.
  7. Forbered det nødvendige udstyr til eutanasi i henhold til en godkendt metode (f.eks. CO2 -kammer), et musedissektionssæt (saks, tang), petriskåle, en 16 G sondekanyle fastgjort til en 10 ml sprøjte til skylning af tarmene og histologiske kassetter.

3. Gammabestråling i hele kroppen (TBI) og vævsindsamling

  1. To dage før gammabestråling injiceres forsøgsdyrene med en enkelt dosis tamoxifen for at inducere Cre-medieret rekombination og BMI1/EYFP+ celleafdækning. Hvert dyr vejes, og der beregnes en dosis på 40 mg/kg legemsvægt tamoxifen opslæmmet i majsolie. Desinficer abdominalområdet med 70% ethanol og administrer tamoxifen intraperitonealt ved hjælp af en 27G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte.
  2. Overhold dyr i de følgende 48 timer for at udelukke potentiel tamoxifentoksicitet.
  3. Overfør musene til bestrålingsrummet som angivet af den lokale institution.
  4. Beregn den bestrålingseksponeringstid, der frigives af 137Cs-kilden i henhold til den aktuelle nøjagtige dosishastighed. For eksempel, hvis den aktuelle dosishastighed er lig med 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), beregnes eksponeringstiden i minutter som den ønskede dosis/0,759. For at bestråle dyrene til en dosis på 12 Gy TBI er eksponeringstiden ~15,81 min (15 min og 48 s).
  5. Prøvekammeret i gammabestrålingsanlægget desinficeres med 70 % ethanolopløsning. Den absorberende måtte og dyrene anbringes inde i prøvekammeret.
    BEMÆRK: Skambehandlede dyr skal anbringes i bestrålingsrummet, men ikke udsættes for gammabestråling.
  6. Placer låget og luk kammeret.
  7. Programmér gammabestråleren til at udsætte dyr for 12 Gy TBI.
    1. Tænd maskinen ved at dreje nøglen i positionen START.
    2. Indtast operatørnummeret ved hjælp af et numerisk tastatur, og bekræft ved at trykke på ENTER.
    3. Indtast PIN-koden ved hjælp af et numerisk tastatur, og bekræft ved at trykke på ENTER.
    4. Tryk på 1 for valgmuligheder.
    5. Tryk på 1 for timerindstillinger.
    6. Tryk på 1 for bestrålingstid.
    7. Indtast timerindstillingen for det næste program ved hjælp af et numerisk tastatur (hh:mm:ss-format), og bekræft ved at trykke på ENTER.
    8. Bekræft indstillingerne igen ved at trykke på ENTER.
    9. Gå tilbage til startmenuen ved at trykke på CLEAR 2x.
    10. Tryk på START for at starte eksponeringen.
  8. Forlad rummet til tidspunktet for aktiv eksponering. Maskinen stopper automatisk, når den forudindstillede tid er gået, og begynder at bippe.
    FORSIGTIG: Cæsium-137 (137Cs) er et dødbringende farligt stof (sundhedsfare: H314). Ekstern eksponering for store mængder 137Cs kan forårsage forbrændinger, akut strålingssygdom og endda død.
  9. Sluk for maskinen ved at dreje nøglen i STOP-position.
  10. Åbn prøvekammeret, tag låget af, overfør dyrene tilbage til buret, og desinficer prøvekammeret med 70% ethanolopløsning.
  11. Overfør dyrene tilbage til det konventionelle staldrum og observer deres tilstand efter behandlingen.
  12. Overvåg dyrenes vægt hver dag og aflive dem straks (på trods af det planlagte tidspunkt), hvis der observeres symptomer på ændret trivsel, nød eller vægttab, der overstiger 15% af startvægten.
  13. Tre timer før den planlagte eutanasi desinficeres abdominalområdet, og ved hjælp af en 28G insulinsprøjte injiceres musene med 100 μL EdU-stamopløsning (administreret intraperitonealt).
  14. Opsaml proksimale tarme ved 0 timer, 3 timer, 6 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 168 timer efter bestråling.
    1. Udfør CO2 eutanasi i henhold til hjemmeinstitutionens standarder.
      FORSIGTIG: Kuldioxid er et farligt stof (H280). Indeholder gas under tryk; kan eksplodere ved opvarmning. Kan fortrænge ilt og forårsage hurtig kvælning.
    2. Derefter dissekeres den proksimale del af tyndtarmen, fjern fastgjort væv, skyl med kold DPBS ved hjælp af en 16 G lige fodringsnål fastgjort til en 10 ml sprøjte, fiks med modificeret Bouins fikseringsbuffer ved hjælp af en 16 G lige fodringsnål fastgjort til en 10 ml sprøjte, skær åben i længderetningen og rul de proksimale tarme ved hjælp af schweizerrulleteknikken som beskrevet tidligere59.
  15. Anbring vævene i en histologisk kassette og lad dem stå i 24-48 timer ved stuetemperatur i en beholder med 10% bufret formalin. Volumenet af formalin skal være tilstrækkeligt til fuldt ud at dække de histologiske kassetter. Når inkubationstiden går, overføres de histologiske kassetter ved hjælp af tang til beholderen fyldt med 70% ethanol. Fortsæt derefter med vævsparaffinindlejring.
    BEMÆRK: Indlejring af vævspaffin blev udført af Research Histology Core Laboratory ved Stony Brook University. Proceduren kan stoppes her, og paraffinblokke kan opbevares ved stuetemperatur.
    FORSIGTIG: Formalin er et potentielt farligt stof: Sundhedsfare (H350, H315, H317, H318, H370) og ætsende. Formalin kan forårsage kræft, hud- og øjenirritation, organskader og allergiske hudreaktioner.

4. Histologisk analyse

  1. De histologiske kassetter indeholdende de paraffinindlejrede vævsprøver afkøles ved at lægge dem på is i mindst 1 time. Brug et mikrotomt til at forberede 5 μm tykke sektioner til farvning. Hvert væv skæres vandret for at dække hele den rullede prøve.
    1. Efter skæring af paraffinblokken overføres vævssektionerne til et vandbad opvarmet til 45 °C og placeres på ladede dias. Lad diasene stå på et stativ natten over ved stuetemperatur for at tørre.
      BEMÆRK: Proceduren kan stoppes her, og diasene kan opbevares ved stuetemperatur.
  2. Læg diasene i en diasholder og bages i en 65 °C ovn natten over. Rutsjebanerne kan bages i kortere tid, 1-2 timer. Dette er dog ikke tilrådeligt i tilfælde af friske (mindre end 1 måned gamle) skårne dias.
    BEMÆRK: Placer det manuelle glidefarvningssæt under den kemiske hætte, og udfør inkubationerne med xylen, ethanol og hæmatoxylin under den kemiske hætte.
  3. Næste dag afkøles diasene ved at placere dem i en glideholder under kemikaliehætten i 10 minutter.
  4. Afparaffiniser vævene ved at placere diasholderen i en beholder fyldt med 100% xylen i 3 min. Gentag inkubation med frisk 100% xylen.
    BEMÆRK: Fra det øjeblik skal du sørge for, at prøverne altid holdes våde.
    FORSIGTIG: Xylen er et potentielt farligt stof: brandfarligt (GHS02), der forårsager akut toksicitet (GHS07) og en sundhedsfare (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). De potentielle farlige virkninger er, at det er dødeligt, hvis det sluges eller kommer ind i luftvejene og kan forårsage hud-, øjen- og åndedrætsirritation. Derudover kan det påvirke motoriske funktioner ved at forårsage døsighed eller svimmelhed og forårsage organskader i tilfælde af langvarig eller gentagen eksponering.
  5. Rehydrering af sektioner i en ethanolgradient ved at placere glideholderen sekventielt i beholdere fyldt med følgende opløsninger: 100% ethanol, 2 min; 95% ethanol, 2 min; 70% ethanol, 2 min.
  6. Overfør glideholderen til beholderen fyldt med destilleret vand og skyl i rindende destilleret vand i 2 min.
  7. Anbring glideholderen i en beholder fyldt med hæmatoxylinopløsning, og pletter i 5 minutter (under den kemiske hætte).
  8. Overfør glideholderen til beholderen fyldt med ledningsvand og skyl i rindende ledningsvand, indtil hæmatopoxyninfarvningen bliver blålig, typisk efter 2 min.
  9. Overfør glideholderen til beholderen fyldt med 5% (w / v) lithiumcarbonatopløsning. Dyp 10x.
    FORSIGTIG: Lithiumcarbonat er et potentielt farligt stof, der forårsager akut toksicitet (GHS07) og en sundhedsfare (H302 - H319). Det er skadeligt ved indtagelse, skadeligt i kontakt med huden og forårsager alvorlig øjenirritation.
  10. Overfør glideholderen til beholderen fyldt med destilleret vand og skyl i rindende destilleret vand i 2 min.
  11. Læg glideholderen i en beholder fyldt med eosin og pletter i 5 min.
  12. Overfør glideholderen til beholderen fyldt med 70% ethanol og skyl kort (10 s).
  13. Dehydrer sektionerne ved at placere glideholderen sekventielt i beholderne fyldt med ethanolgradientopløsninger: 95% ethanol, 5 dips; 100% ethanol, 5 dips.
  14. Ryd gliderne ved at placere glideholderen i beholderen fyldt med 100% xylen i 3 min. Gentag inkubation med frisk 100% xylen.
  15. Tag diaset ud af stativet, tør området omkring vævene ved hjælp af et papirhåndklæde, og afhængigt af prøvens størrelse tilsættes en dråbe eller to xylenbaseret monteringsmedium på overfladen af prøven. Monter ved forsigtigt at placere en dæksel oven på glasglasset (pas på ikke at efterlade luftbobler). Tryk forsigtigt, hvis det er nødvendigt. Hele overfladen af glasset skal dækkes og forsegles.
  16. Tør gliderne ved at lade dem stå under kemikaliehætten natten over. Typisk størkner monteringsmediet på mindre end 24 timer. For at sikre, at diasene er tørre, kan der laves et prøvebillede. Brug et tomt dias til at placere en dråbe af monteringsmediet og lade det stå under kemikaliehætten natten over. Den næste dag skal du trykke på dråben og kontrollere, om den er størknet.
  17. Når diasene tørrer ud, skal du analysere vævets histologi ved hjælp af et lysmikroskop eller et mere avanceret mikroskop med en lys feltkanal.
    1. Placer et mikroskopglas på scenen, flyt, indtil prøven er i midten af synsfeltet, juster fokus ved hjælp af fokusknappen, og brug en 10x og / eller 20x forstørrelsesobjektivobjektiv til at analysere histologien sammenlignet med kontrolvæv (bestrålet skinke).
    2. Hvis mikroskopet er udstyret med et kamera, skal du også tage billeder.
      BEMÆRK: Proceduren kan stoppes her; Objektbillederne kan opbevares ved stuetemperatur og analyseres senere. Opbevar ikke lysbillederne længere end 30 dage, da farvningen langsomt falmer væk.

5. Immunofluorescensfarvning

  1. De histologiske kassetter indeholdende paraffinindlejrede vævsprøver afkøles ved at lægge dem på is i mindst 1 time. Brug et mikrotomt til at forberede 5 μm tykke sektioner til farvning. Hvert væv skæres vandret for at dække hele den rullede prøve.
    1. Efter skæring af paraffinblokken overføres vævssektionerne til et vandbad opvarmet til 45 °C og placeres på ladede dias. Lad diasene stå på et stativ natten over ved stuetemperatur for at tørre.
      BEMÆRK: Proceduren kan stoppes her, og diasene kan opbevares ved stuetemperatur.
  2. Læg diasene i en diasholder og bages i en 65 °C ovn natten over. Rutsjebanerne kan bages i kortere tid, 1-2 timer. Dette er dog ikke tilrådeligt i tilfælde af friske (mindre end 1 måned siden) skårne dias.
    BEMÆRK: Placer det manuelle glidefarvningssæt under den kemiske hætte, og udfør inkubationerne med xylen, ethanol og H 2O2 / methanol under den kemiske hætte.
  3. Næste dag afkøles diasene ved at placere dem i en glideholder under kemikaliehætten i 10 minutter.
  4. Afparaffiniser vævene ved at placere diasholderen i en beholder fyldt med 100% xylen i 3 min. Gentag inkubation med frisk 100% xylen.
    BEMÆRK: Fra det øjeblik skal du sørge for, at prøverne altid holdes våde.
  5. Sluk endogen peroxidase ved at inkubere objektglassene i 30 minutter i en beholder fyldt med 2% hydrogenperoxidopløsning i methanol under den kemiske hætte.
    FORSIGTIG: Methylalkohol er et potentielt farligt stof: Sundhedsfare (H225-H301, H311, H331-H370), brandfarlig (GHS02) og forårsager akut toksicitet (oral, dermal, indånding) (GHS08). Hydrogenperoxid er et potentielt farligt stof: ætsende (GHS05) og forårsager akut toksicitet (GHS07).
  6. Rehydrer sektionerne i en ethanolgradient ved at placere glideholderen sekventielt i beholdere fyldt med følgende opløsninger: 100% ethanol, 3 min; 95% ethanol, 3 min; 70% ethanol, 3 min.
  7. Overfør glideholderen til en beholder fyldt med destilleret vand og skyl i rindende destilleret vand i 2 min.
  8. For at hente antigenerne overføres diasholderen til en beholder med 250 ml citratbufferopløsning (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) og koges ved 110 °C i 10 minutter ved hjælp af et afklædningskammer.
  9. Overfør hele beholderen til kølerummet og lad gradvis afkøling i løbet af 30 min.
  10. Efter 30 minutter udskiftes citratbufferopløsningen med destilleret vand og skylles i rindende destilleret vand, indtil alle flydende paraffinstykker er fjernet.
  11. Tag lysbillederne ud af holderen (en ad gangen), tryk på et køkkenrulle, og tør forsigtigt området omkring prøven med et papirhåndklæde. Tegn en lukket form omkring prøven ved hjælp af en pen, der giver en hydrofob barriere (PAP-pen). Anbring i et befugtet kammer.
  12. Der fyldes med 5% bovint serumalbumin (BSA) i TBS-Tween ved tilsætning af 200 μL af opløsningen på overfladen af en prøve. Sørg for, at der ikke er lækage. Der inkuberes ved 37 °C i et befugtet kammer i 30 minutter.
  13. Fjern blokeringsopløsningen ved at banke glasglasset på et køkkenrulle. Anbring tilbage i et befugtet kammer. Der tilsættes 100 μL af den passende koncentration af de primære antistoffer, der er resuspenderet i en blokerende buffer, og der inkuberes ved 4 °C med let vuggen natten over. Til BMI1/EYFP skal du bruge anti-GFP til kylling (fortynding 1:500); til Ki-67 skal du bruge kanin anti-Ki-67 (fortynding 1:200).
  14. Fjern antistofopløsningen ved at banke glasglasset på et papirhåndklæde; læg diasene i en diasholder og overfør dem til beholderen fyldt med TBS-Tween. Vask diasene med omrystning i 5 min. Gentag 3x. Brug hver gang en frisk portion TBS-Tween-buffer.
  15. Tag gliderne ud af holderen (en ad gangen), fjern overskydende vaskeopløsning ved at banke glasglasset på et køkkenrulle, og læg dem i et befugtet kammer. Der tilsættes 100 μl af den passende koncentration af sekundære antistoffer, der er resuspenderet i en blokerende buffer, og der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Sekundære antistoffer bør konjugeres med en fluorofor. Til BMI1/EYFP skal du bruge æsel anti-kylling Alexa Fluor 647 (fortynding 1:500); til Ki-67 skal du bruge ged anti-kanin Alexa Fluor 488 (fortynding 1:500).
  16. Fjern antistofopløsningen ved at banke glasglasset på et papirhåndklæde; læg diasene i en diasholder og overfør dem til beholderen fyldt med TBS-Tween. Vask diasene med omrystning i 5 min. Gentag 3x. Brug hver gang en frisk portion TBS-Tween-buffer.
  17. Tag gliderne ud af holderen (en ad gangen), fjern overskydende vaskeopløsning ved at banke glasglasset på et køkkenrulle, og læg dem i et befugtet kammer. Tilsæt 100 μL af EdU-farvningsopløsningen, der er fremstillet i henhold til producentens anvisninger og ved hjælp af Alexa Fluor 555 fluorofor.
  18. Fjern EdU-opløsningen ved at banke glasobjektglasset på et papirhåndklæde; læg diasene i en diasholder og overfør dem til beholderen fyldt med TBS-Tween. Vask diasene med omrystning i 5 min. Gentag 2x. Brug hver gang en frisk portion TBS-Tween-buffer.
  19. Tag lysbillederne ud af holderen (en ad gangen); Fjern overskydende vaskeopløsning ved at banke glasglasset på et køkkenrulle og læg det i et befugtet kammer. Hoechst 33258 modfarvning foretages ved at tilsætte 100 μL Hoechst 33258-opløsningen (fortynding 1:1000 i TBS-Tween) på prøvens overflade. Inkuber i mørke ved stuetemperatur i 5 min.
  20. Hoechst 33258-opløsningen fjernes ved at banke glasglasset på et køkkenrulle. læg diasene i en diasholder og overfør dem til en beholder fyldt med TBS-Tween. Vask rutsjebanerne med omrystning i 5 min.
  21. Tag diaset ud af diasholderen, tør området omkring vævene ved hjælp af et papirhåndklæde, og afhængigt af prøvens størrelse tilsættes en dråbe eller to vandbaseret monteringsmedium på overfladen af prøven. Monter ved forsigtigt at placere en dæksel oven på glasglasset (pas på ikke at efterlade luftbobler). Tryk forsigtigt, hvis det er nødvendigt. Hele overfladen af glasset skal dækkes og forsegles.
  22. Tør diasene ved at lade dem stå i mørke ved stuetemperatur natten over. Typisk størkner monteringsmediet på mindre end 24 timer. For at sikre, at diasene er tørre, kan der laves et prøvebillede. Brug et tomt dias; Anbring en dråbe af monteringsmediet og lad det stå under kemikaliehætten natten over. Den næste dag skal du trykke på dråben og kontrollere, om den er størknet.
  23. Når diasene tørrer ud, kan farvede væv analyseres ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med emissionsbølgelængdefiltre, der muliggør visualisering af Ki-67, EdU og BMI1 / EYFP-farvning (henholdsvis 535 nm, 646 nm og 700 nm).
  24. Placer et mikroskopglas på scenen, flyt, indtil prøven er i midten af synsfeltet, juster fokus ved hjælp af fokusknappen, og brug objektivobjektivet 10x og / eller 20x forstørrelsesobjektiv til at analysere farvningen sammenlignet med kontrolvæv (bestrålet skinke). Hvis mikroskopet er udstyret med et kamera, kan der også tages billeder. Tag billeder for hver kanal separat, og flet senere.
    BEMÆRK: Proceduren kan stoppes her; diasene kan opbevares ved 4 °C og analyseres senere. Opbevar ikke lysbillederne længere end 14 dage, da farvningen langsomt falmer væk.

6. TUNEL farvning

  1. De histologiske kassetter indeholdende paraffinindlejrede vævsprøver afkøles ved at lægge dem på is i mindst 1 time. Brug et mikrotomt til at forberede 5 μm tykke sektioner til farvning. Hvert væv skæres vandret for at dække hele den rullede prøve.
    1. Efter skæring af paraffinblokken overføres vævssektionerne til et vandbad opvarmet til 45 °C og placeres på ladede dias. Lad diasene stå på et stativ natten over ved stuetemperatur for at tørre.
      BEMÆRK: Proceduren kan stoppes her, og diasene kan opbevares ved stuetemperatur.
  2. Læg diasene i en diasholder og bages i en 65 °C ovn natten over.
    OBS: Rutsjebanerne kan bages i kortere tid, 1-2 timer. Det er dog ikke tilrådeligt i tilfælde af friske (mindre end 1 måned siden) skårne dias. Anbring det manuelle diasfarvningssæt under den kemiske hætte, og udfør inkubationerne med xylen og ethanol under den kemiske hætte.
  3. Næste dag afkøles diasene ved at placere dem i en glideholder under kemikaliehætten i 10 minutter.
  4. Afparaffiniser vævene ved at placere diasholderen i en beholder fyldt med 100% xylen i 3 min. Gentag inkubation med frisk 100% xylen.
    BEMÆRK: Fra dette tidspunkt skal du sørge for, at prøverne altid holdes våde.
  5. Sektionerne rehydreres i en ethanolgradient ved at placere glideholderen sekventielt i beholdere fyldt med følgende opløsninger: 100% ethanol, 3 min; 95% ethanol, 3 min; 90% ethanol, 3 min; 80% ethanol, 3 min; 70% ethanol, 3 min.
  6. Overfør glideholderen til en beholder fyldt med destilleret vand og skyl i rindende destilleret vand i 1 min.
  7. Tag lysbillederne ud af holderen (en ad gangen), tryk på et køkkenrulle, og tør forsigtigt området omkring prøven med et papirhåndklæde. Tegn en lukket form omkring prøven ved hjælp af en pen, der giver en hydrofob barriere (PAP-pen). Anbring i et befugtet kammer.
  8. Der inkuberes med DNasefri proteinase K. Der tilsættes 100 μL DNasefri proteinase K-opløsning (fortynding 1:25 i DPBS) på overfladen af prøven inden for den hydrofobe barriere. Inkuberes ved stuetemperatur i et befugtet kammer i 15 min.
    FORSIGTIG: Proteinase K er et potentielt farligt stof: Sundhedsfare (H315 - H319 - H334).
  9. Fjern proteinase K-opløsningen ved at banke glasglasset på et papirhåndklæde; læg diasene i en diasholder, og overfør dem til beholderen fyldt med DPBS. Vask diasene med omrystning i 5 min. Gentag 2x. Brug hver gang en frisk portion DPBS.
  10. Forbered TUNEL-reaktionsblandingen: Bland etiketopløsning (1x) med enzymopløsning (10x). Pipette godt.
  11. Tag lysbillederne ud af holderen (en ad gangen); Fjern overskydende vaskeopløsning ved at banke glasglasset på et køkkenrulle og læg det i et befugtet kammer. Der tilsættes 50 μL TUNEL reaktionsblanding på prøvens overflade, og der inkuberes mørkt ved 37 °C i et befugtet kammer i 60 minutter. For en negativ kontrol skal du kun bruge etiketopløsning (uden TdT).
  12. Fjern TUNEL-opløsningen ved at banke glasglasset på et køkkenrulle; læg diasene i en diasholder, og overfør dem til en beholder fyldt med DPBS. Vask diasene med omrystning i 5 min. Gentag 2x. Brug hver gang en frisk portion DPBS.
  13. Tag lysbillederne ud af holderen (en ad gangen); Fjern overskydende vaskeopløsning ved at banke glasglasset på et køkkenrulle og læg det i et befugtet kammer. Hoechst 33258 modfarvning foretages ved at tilsætte 100 μL Hoechst 33258-opløsningen (fortynding 1:1000 i TBS-Tween) på prøvens overflade. Inkuber i mørke ved stuetemperatur i 5 min.
  14. Hoechst 33258-opløsningen fjernes ved at banke glasglasset på et køkkenrulle. læg diasene i en diasholder, og overfør dem til beholderen fyldt med DPBS. Vask rutsjebanerne med omrystning i 5 min.
  15. Tag diaset ud af diasholderen; Tør området omkring vævene med et papirhåndklæde, og afhængigt af prøvens størrelse tilsættes en dråbe eller to vandbaseret monteringsmedium på prøvens overflade. Monter ved forsigtigt at placere en dæksel oven på glasglasset (pas på ikke at efterlade luftbobler). Tryk forsigtigt, hvis det er nødvendigt. Hele overfladen af glasset skal dækkes og forsegles.
  16. Tør diasene ved at lade dem stå i mørke ved stuetemperatur natten over. Typisk størkner monteringsmediet på mindre end 24 timer. For at sikre, at diasene er tørre, kan der laves et prøvebillede. Anbring en dråbe af monteringsmediet og lad det stå i mørke ved stuetemperatur natten over. Den næste dag skal du trykke på dråben og kontrollere, om den er størknet.
  17. Når diasene tørrer ud, kan farvet væv analyseres ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med emissionsbølgelængdefiltre, der muliggør visualisering af TUNEL-farvning (535 nm).
  18. Placer et mikroskopglas på scenen, flyt, indtil prøven er i midten af synsfeltet, juster fokus ved hjælp af fokusknappen, og brug en 10x og / eller 20x forstørrelsesobjektivlinse til at analysere farvningen sammenlignet med kontrolvæv (bestrålet skinke). Hvis mikroskopet er udstyret med et kamera, kan der også tages billeder. Tag billeder for hver kanal separat, og flet senere.
    BEMÆRK: Proceduren kan stoppes her; dias kan opbevares ved 4 °C og analyseres senere. Opbevar ikke lysbillederne længere end 14 dage, da farvningen langsomt falmer væk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Anvendelsen af 12 Gy totalkropsbestråling (TBI) i kombination med sporing af murin genetisk afstamning muliggør en grundig analyse af konsekvenserne af strålingsskader i tarmen. For at starte, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus modtog en enkelt tamoxifeninjektion, som inducerer forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) ekspression inden for en Bmi1+ reservestamcellepopulation. To dage efter tamoxifeninjektionen gennemgik musene bestråling eller skinbestråling. Tre timer før eutanasi blev musene injiceret med EdU. Efter eutanasi blev tyndtarmsprøver indsamlet til analyse 0 timer, 3 timer, 6 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 7 dage efter bestråling. Repræsentative hæmatoxylin- og eosinbilleder (H&E) (figur 1) fra det førnævnte tidsforløb illustrerer tarmepitelets reaktion på skade. Tidspunktet 0 timer er illustrativt for homeostatisk tarmepitel (figur 1); dette efterfølges af den apoptotiske fase - karakteriseret ved et tab af celler i kryptrum mellem 3 timer og 48 timer (figur 1). Derefter følger den regenerative fase, hvor stærkt proliferative celler kan findes befolke krypterne mellem 72 timer og 96 timer (figur 1). Endelig fører dette til normaliseringsfasen, her repræsenteret ved 7-dages tidspunktet (figur 1).

Figur 2 illustrerer ændringer i den proliferative status for tarmkryptceller vurderet ved immunofluorescerende farvning af EdU (markør for celler i S-fase) og Ki-67 (markør for celler i G1-, S- og G2/M-faser), mens afstamningssporing (EYFP+-celler) markerer celler, der stammer fra Bmi1+-reservestamceller. Under homeostase (figur 2, 0 h humbug) er de Bmi1+-positive celler, der er markeret med ekspressionen af EYFP, begrænset til +4-+6-positionen i krypter. I den apoptotiske fase (24 timer og 48 timer) falder antallet af EYFP-positive celler (figur 2). Den regenerative fase (72 timer og 96 timer) er kendetegnet ved hurtigt prolifererende Bmi1+-positive celler og deres forfædre (figur 2); 7 dage efter bestråling har yderligere spredning og migration genopfyldt tarmkryptcellerne og genoprettet tarmepitelintegriteten (figur 2).

I shambestrålede mus (kontrol) pletter EdU og Ki-67 EYFP-negative proliferative celler i tarmkrypterne, typisk for normal tarmhomeostase, der strækker sig fra aktive stamceller gennem transitforstærkende zone (figur 2). Strålingsskader forårsager tab af stærkt proliferative celler under den apoptotiske fase, som vist ved reduktionen af EdU- og Ki-67-farvning (figur 2). Aktiveringen af reservestamceller (i dette eksempel markerede EYFP Bmi1+ positive celler) og deres spredning resulterer i en stigning i EdU- og Ki-67-positive celler, der er tydeligt synlige ved 72 timer og 96 timer efter skade, hvor krypter næsten udelukkende består af celler, der er farvet sammen med EYFP, EdU og Ki-67. De observerede niveauer af spredning normaliseres 7 dage efter skaden (figur 2).

For at illustrere apoptose forårsaget af strålingsskader blev TUNEL-farvning udført, og repræsentative billeder er inkluderet i figur 3. Under homeostase (figur 3) gennemgår få celler apoptose, typisk for den normalt hurtige intestinale epitelomsætning. En klar stigning i TUNEL-farvning kan observeres sent i den apoptotiske fase (24 timer og 48 timer) efter bestråling (figur 3). I den regenerative fase falder TUNEL-farvning støt inden for de regenererende krypter og er igen næsten fraværende, når krypterne er normaliseret (figur 3). Den præsenterede protokol beskriver en enkel og tilgængelig immunofluorescerende farvningsmetode ved hjælp af en ligetil og udbredt kombination af mærkningsteknikker (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP), der er i stand til at give indsigt i tarmcellernes adfærd efter skade (her bestråling). Denne tilgang kan anvendes til at studere de mekanismer, der regulerer regenerative processer i tarmepitelet under specifikke omstændigheder. Anvendelse af denne og lignende tilgange vil belyse alternative regenerative processer efter forskellige intestinale fornærmelser og yderligere vil muliggøre undersøgelse af terapeutiske strategier til forebyggelse af tab af barrierefunktion.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative billeder af hæmatoxylin og eosin (H&E)-farvede sektioner af tyndtarmsvæv efter et tidsforløb efter total kropsbestråling. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus fik en dosis tamoxifen 2 dage før 12 Gy helkropsbestråling eller skinbestråling. Mus blev ofret, og tyndtarmvæv blev indsamlet på tidspunkter, der er angivet i figuren. Alle billeder blev taget med 10x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder af immunfluorescerende farvning af tyndtarmssektioner efter bestråling. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus fik en dosis tamoxifen 2 dage før 12 Gy helkropsbestråling eller skinbestråling. Mus blev ofret, og tyndtarmvæv blev indsamlet på tidspunkter, der er angivet i figuren. Vævssektioner blev farvet med EdU for at markere celler i S-fase (lyserød) og med Ki-67 for at markere celler i G0-, S- og G2 / M-faser (gul). EYFP (grøn) markerer Bmi1+ -celler og deres forfædre og demonstrerer slægtssporing. Sektionerne blev yderligere modfarvet med DAPI (blå) for at visualisere kerner. Dataene vises som flettede billeder ved 10x forstørrelse og indsatser af individuelle pletter ved 20x forstørrelse (disse stammer fra 10x billeder). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative billeder af immunofluorescerende TUNEL-farvning af tyndtarmssektioner ved bestråling. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus fik en dosis tamoxifen 2 dage før 12 Gy helkropsbestråling eller skinbestråling. Mus blev ofret, og tyndtarmvæv blev indsamlet på tidspunkter, der er angivet i figuren. TUNEL (rød) pletter apoptotiske celler. Disse billeder blev modfarvet med DAPI (blå) for at visualisere kerner. De viste billeder blev taget med 20x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en robust og reproducerbar strålingsskademodel. Det giver mulighed for præcis analyse af ændringerne i tarmepitelet i løbet af 7 dage efter skaden. Det er vigtigt, at de valgte tidspunkter afspejler afgørende stadier af skade og er kendetegnet ved tydelige ændringer i tarmen (skade, apoptose, regenerering og normaliseringsfaser)60. Denne bestrålingsmodel er blevet fastlagt og omhyggeligt vurderet, hvilket viser en passende manifestation af efterligningsskade som den, patienter i strålebehandling oplever61. Mere end halvdelen af patienter med kolorektal cancer og gynækologiske kræftformer gennemgår abdominal strålebehandling 40,62,63. På trods af avancerede metoder til målretning af strålebehandling oplever patienter bestråling af sundt tarmvæv, hvilket producerer patofysiologi, der meget ligner den, der observeres med den samlede kropsbestrålingsmodel, der præsenteres her. Derfor kan den heri beskrevne strålingsmodel potentielt afhjælpe følgerne af utilsigtet strålingseksponering af patienter og/eller medicinsk personale og er derfor afgørende for menneskers sundhed.

Bmi1-CreER; Rosa26eYFP mus model bærer tamoxifen-inducerbar Cre under transkriptionel kontrol af musen Bmi1 (Bmi1 polycomb ringfinger onkogen) promotor. Derudover bærer disse mus en R26-stop-EYFP-sekvens, hvor STOP-kodonet flankeres af loxP-sider efterfulgt af Enhanced Yellow Fluorescent Protein-genet (EYFP) indsat i Gt(ROSA)26Sor-locus. Ekspressionen af EYFP blokeres af en opstrøms loxP-flankeret STOP-sekvens, men kan aktiveres af tamoxifen-inducerede, Cre-medierede målrettede deletioner, der muliggør afstamningssporing af Bmi1-ekspressive celler, en reservestamcellespecifik underpopulation af kryptceller. Strålingsprotokollen i kombination med Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-musemodellen er tidligere blevet anvendt til at studere transkriptionsfaktorernes rolle i reguleringen af tarmregenerering 18,56. De repræsentative resultater i figur 1 til figur 3 viser resultater, der ligner dem, der er præsenteret i nyere publikationer18,56.

Bemærk, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus er kun en af flere transgene dyremodeller, der anvendes til at studere tarmregenerering. Andre murine afstamningssporingsmodeller er blevet kombineret med stråling for at demonstrere specifikke cellers og vejes roller i tarmepithelets regenerative kapacitet 18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,65,66,67 . Disse modeller er designet til at undersøge rollen af forskellige populationer af reserverede stamceller, udforske forløberne for sekretoriske og enterocytlinjer og studere funktionen af specifikke gener inden for hver underpopulation af tarmepitelcellerne. Kombinerede resultater fra disse undersøgelser vil bidrage til at udvide forståelsen af tarmepithelets regenerative evne.

Det er vigtigt, at denne teknik med mindre ændringer giver mulighed for undersøgelse af forholdet mellem mikrobiota og forskellige epitel-, stromale og immuncellepopulationer ved strålingsskade. Introduktion af forskellige afstamningssporingsdyremodeller vil muliggøre undersøgelse af realtidsadfærd og interaktion mellem forskellige underpopulationer af celler efter skade. Alternativt kan farvning af væv erstattes af RNA-sekventering, enkeltcelle RNA-sekventering, fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) eller proteomisk analyse for at få mere dybdegående viden om rollen som specifikke cellelinjer under tarmregenerering efter skade68,69. Denne skademodel kunne bruges til at teste nye behandlingsmetoder, der har til formål at minimere bivirkningerne af bestråling, forkorte restitutionstiden og forbedre kvaliteten af patientplejen70. Selvom strålingsmodellen beskrevet her kan tjene som et nyttigt værktøj til at studere regenerering af tarmepitelet, har det også flere begrænsninger. Den samlede kropsstrålingsdosis resulterer altid i efterfølgende hæmatopoietisk syndrom, hvilket forhindrer undersøgelsen af tarmregenerering. Dette kan afværges ved knoglemarvstransplantation. Endvidere kan ændringen af en protokol for skade udelukkende på abdominal potentielt forbedre nogle af bivirkningerne af bestrålingen71. Denne model kræver dog yderligere trin, der kan påvirke tarmrespons på skaden (f.eks. Anæstesi). I øvrigt producerer abdominal stråling strålingsinduceret gastrointestinalt syndrom (RIGS) uden hæmatopoietisk syndrom, der adskiller sig fra helkropsbestråling (WBI), idet WBI producerer lignende GI-symptomologi, men inkluderer delvis tab af hæmatopoietisk funktion efter skade71,72.

Det skal bemærkes, at genetisk manipulerede dyremodeller som dem, der er beskrevet i denne protokol, er sofistikerede og giver mulighed for afstamningssporing af specifikke celler. Disse modeller, selvom de er meget gavnlige, kræver imidlertid yderligere indsats for at vedligeholde. Transgene dyremodeller, der tillader betingede gendeletioner, er vanskelige at generere, og deres rettidige sletning ved skade opnås muligvis ikke let. Desuden tillader de fleste transgene modeller kun en betinget deletion eller inaktivering af et gen af interesse, men er ikke inducerbare og er derfor ude af stand til at genoprette genfunktionen og kan hæmme undersøgelserne. Desuden kræver transgene dyremodeller normalt behandling med yderligere kemikalier (fx tamoxifen, doxycyclin) for at opnå inaktivering eller overekspression af genet af interesse. Behandlinger med disse stoffer kan til en vis grad ændre tarmepitelets respons eller øge sværhedsgraden af skaden 73,74,75,76. Derudover kan induktion af afstamningssporing af tamoxifen introduceres tættere på tidspunktet for strålingsskade for at forbedre mærkningen af de celler, der er involveret i regenerering (f.eks. 6-24 timer før skade). Det er således muligt at erstatte en transgen model med vildtypemus og en kombination af IF-farvning (f.eks. Ki-67, PCNA, EdU, TUNEL, Caspase 3). Denne model gør det muligt at analysere tarmens regenerative kapacitet, selv om den ikke tillader undersøgelse af en specifik delpopulation af cellerne.

Protokollen beskrevet i dette manuskript har flere afgørende trin. Det er yderst vigtigt at sikre, at sunde mus bruges til forsøg, da de vil blive udsat for stråling og behandling med kemikalier. Hvis eksperimenter med forskellige musegrupper udføres med dage, uger eller måneder fra hinanden, er det god praksis at overholde den samme tidslinje, fx tamoxifeninjektioner på samme tidspunkt af dagen. Bestrålingsprocessen skal udføres omgående, og mus skal straks returneres til deres oprindelige bure. Derudover kan blødgøret mad og masser af vand bidrage til at forbedre nogle af de negative virkninger af stråling. Schweizerrulleteknikken foreslås for at muliggøre omfattende analyse af tarmvævet59. Denne teknik er ikke triviel, og forudgående prøver skal udføres for at sikre, at der opnås upåklagelig kvalitet af vævet til farvning. Alle opløsninger til museforsøg og farvning skal tilberedes frisk og opbevares under passende forhold. Når du arbejder med antistoffer, er det vigtigt at teste dias ved hjælp af positive og negative kontroller og om muligt bruge antistoffer med samme katalognummer og lotnummer. Immunofluorescensglas skal opbevares ved 4 °C og afbildes inden for 1 uge efter tilberedning. Langvarig opbevaring, selv ved -20 °C, kan medføre tab af signal. H&E-dias kan opbevares ved stuetemperatur, da der ikke er nogen bekymring for tab af fluoroforstabilitet.

Sammenfattende er den afstamningssporende strålingsskademodel, der præsenteres her, en reproducerbar og relevant model til sporing af tarmcelleskæbne efter fornærmelse og kan kombineres med forskellige murinmodeller og molekylære teknikker for at forbedre forståelsen af patofysiologien i tarmepitelet. Indsigt i de molekylære og cellulære mekanismer, der styrer intestinal epitelregenerering, kan føre til udvikling af nye behandlinger og gavnlige terapeutiske interventioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende Stony Brook Cancer Center Histology Research Core for eksperthjælp med forberedelse af vævsprøver og Division of Laboratory Animal Resources ved Stony Brook University for hjælp til dyrepleje og håndtering. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health DK124342 tildelt Agnieszka B. Bialkowska og DK052230 til Dr. Vincent W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Tags

Biologi nr. 185
Intestinal epitelregenerering som reaktion på ioniserende bestråling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb,… More

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter