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Biology

Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

Der Magen-Darm-Trakt ist eines der empfindlichsten Organe für Verletzungen bei strahlentherapeutischen Krebsbehandlungen. Es ist gleichzeitig ein Organsystem mit einer der höchsten Regenerationskapazitäten nach solchen Beleidigungen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Untersuchung der Regenerationsfähigkeit des Darmepithels.

Abstract

Das Darmepithel besteht aus einer einzigen Zellschicht, enthält jedoch mehrere Arten von terminal differenzierten Zellen, die durch die aktive Proliferation von Darmstammzellen am Boden von Darmkrypten erzeugt werden. Bei einer akuten Darmschädigung kommt es jedoch zu einem Zelltod dieser aktiven Darmstammzellen. Die Gammabestrahlung ist eine weit verbreitete Behandlung von Darmkrebs, die zwar therapeutisch wirksam ist, aber den Nebeneffekt hat, dass der aktive Stammzellpool erschöpft ist. In der Tat kommt es häufig zu einem gastrointestinalen Strahlensyndrom, während sie sich einer Strahlentherapie unterziehen, was zum Teil auf einen aktiven Stammzellabbau zurückzuführen ist. Der Verlust aktiver intestinaler Stammzellen in intestinalen Krypten aktiviert einen Pool von typischerweise ruhenden intestinalen Reservestammzellen und induziert eine Dedifferenzierung von sekretorischen und enterozytenartigen Vorläuferzellen. Ohne diese Zellen wäre das Darmepithel nicht in der Lage, sich von einer Strahlentherapie und anderen schweren Gewebeverletzungen zu erholen. Neue Fortschritte in der Abstammungsverfolgung ermöglichen es, die Aktivierung, Differenzierung und Migration von Zellen während der Regeneration zu verfolgen und wurden erfolgreich eingesetzt, um dies im Darm zu untersuchen. Ziel dieser Arbeit ist es, eine Methode zur Analyse von Zellen im Darmepithel der Maus nach Strahlenschädigung darzustellen.

Introduction

Das menschliche Darmepithel würde ungefähr die Oberfläche eines halben Badmintonfeldes bedecken, wenn es vollständig flach platziert würde1. Stattdessen wird diese einzelne Zellschicht, die den Menschen vom Inhalt seines Darms trennt, zu einer Reihe von fingerartigen Fortsätzen, Zotten und Vertiefungen, Krypten, verdichtet, die die Oberfläche des Darms maximieren. Die Zellen des Epithels differenzieren sich entlang einer Krypten-Zotten-Achse. Die Zotten bestehen hauptsächlich aus nährstoffabsorbierenden Enterozyten, schleimabsondernden Becherzellen und den hormonproduzierenden enteroendokrinen Zellen, während die Krypten hauptsächlich aus Defensin-produzierenden Paneth-Zellen, aktiven und Reserve-Stammzellen sowie Vorläuferzellen bestehen 2,3,4,5. Darüber hinaus erzeugen die bidirektionale Kommunikation dieser Zellen mit den Stroma- und Immunzellen des darunter liegenden mesenchymalen Kompartiments und der Mikrobiota des Lumens ein komplexes Netzwerk von Interaktionen, das die Darmhomöostase aufrechterhält und für die Genesung nach Verletzungen entscheidend ist 6,7,8.

Das Darmepithel ist das sich am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im menschlichen Körper, mit einer Umsatzrate von 2-6 Tagen 9,10,11. Während der Homöostase teilen sich aktive Stammzellen an der Basis von Darmkrypten (kryptenbasensäulenförmige Zellen), die durch die Expression des Leucin-reichen, wiederholungshaltigen G-Protein-gekoppelten Rezeptors 5 (LGR5) gekennzeichnet sind, schnell und liefern Vorläuferzellen, die sich in alle anderen intestinalen Epithellinien differenzieren. Aufgrund ihrer hohen Mitoserate reagieren aktive Stammzellen und ihre unmittelbaren Vorläuferzellen jedoch besonders empfindlich auf Schäden durch Gammastrahlung und unterliegen nachBestrahlung einer Apoptose 5,12,13,14. Nach ihrem Verlust werden Reservestammzellen und Nicht-Stammzellen (Subpopulationen von Vorläuferzellen und einige terminal differenzierte Zellen) in Darmkrypten aktiviert und füllen das basale Kryptenkompartiment wieder auf, das dann Zellpopulationen der Zotten rekonstituieren und so das Darmepithel regenerieren kann15. Mehrere Forschungsgruppen haben gezeigt, dass Reservestammzellen (ruhende Stammzellen) in der Lage sind, die Regeneration nach dem Verlust aktiver Stammzellen zu unterstützen 13,16,17,18,19,20,21,22. Diese Zellen zeichnen sich durch das Vorhandensein des Polycomb-Komplex-Protein-1-Onkogens (Bmi1), des Maus-Telomerase-Reverse-Transkriptase-Gens (mTert), der Hopfen-Homöobox (Hopx) und des Leucin-reichen Repeat-Protein-1-Gens (Lrig1) aus. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Nicht-Stammzellen in der Lage sind, Darmkrypten bei einer Verletzung wieder aufzufüllen 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass Vorläuferzellen von sekretorischen Zellen und Enterozyten bei einer Verletzung eine Dedifferenzierung erfahren, zu stammähnlichen Zellen zurückkehren und die Regeneration des Darmepithels unterstützen. Neuere Studien haben Zellen identifiziert, die mehrere Marker exprimieren, die die Fähigkeit besitzen, bei einer Verletzung stammähnliche Eigenschaften zu erwerben (z. B. DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Überraschenderweise zeigten Yu et al., dass auch reife Paneth-Zellen (LYZ+) zur Darmregeneration beitragen können37. Darüber hinaus führt die Bestrahlung nicht nur zur Apoptose von Darmepithelzellen und zur Störung der epithelialen Barrierefunktion, sondern auch zu einer Dysbiose der Darmflora, zur Aktivierung von Immunzellen und zur Initiierung einer entzündungsfördernden Reaktion sowie zur Aktivierung von mesenchymalen und stromalen Zellen38,39.

Gammastrahlung ist ein wertvolles therapeutisches Mittel in der Krebsbehandlung, insbesondere bei Darmtumoren40. Die Bestrahlung beeinträchtigt jedoch die Darmhomöostase erheblich, indem sie die Zellen schädigt, was zu Apoptose führt. Die Strahlenbelastung verursacht mehrere Störungen, die die Genesung eines Patienten verlangsamen, und ist gekennzeichnet durch Schleimhautverletzungen und Entzündungen in der akuten Phase und langfristig durch Durchfall, Inkontinenz, Blutungen und Bauchschmerzen. Diese Vielzahl von Erscheinungsformen wird als gastrointestinale Strahlentoxizität bezeichnet. Darüber hinaus kann sich das strahleninduzierte Fortschreiten der transmuralen Fibrose und/oder vaskulären Sklerose erst Jahre nach der Behandlung manifestieren38,41. Gleichzeitig mit der Verletzung selbst induziert die Strahlung in den Darmzellen eine Reparaturreaktion, die Signalwege aktiviert, die für die Initiierung und Orchestrierung der Regeneration verantwortlich sind42. Eine strahleninduzierte Dünndarmerkrankung kann durch eine Strahlentherapie des Beckens oder des Abdomens mit anderen Organen (wie Gebärmutterhals, Prostata, Bauchspeicheldrüse, Rektum) verursacht werden41,43,44,45,46. Darmbestrahlungsschäden sind daher ein bedeutendes klinisches Problem, und ein besseres Verständnis der daraus resultierenden Pathophysiologie wird wahrscheinlich die Entwicklung von Interventionen zur Linderung der mit der Strahlentherapie verbundenen gastrointestinalen Komplikationen vorantreiben. Neben der Bestrahlung gibt es noch andere Techniken, die es ermöglichen, den regenerativen Zweck des Darmepithels zu untersuchen. Es wurden transgene und chemische Mausmodelle entwickelt, um Entzündungen und die anschließende Regeneration zu untersuchen47. Dextran-Natriumsulfat (DSS) induziert Entzündungen im Darm und führt zur Entwicklung von Merkmalen, die denen einer entzündlichen Darmerkrankung ähneln48. Eine Kombination der DSS-Behandlung mit dem prokarzinogenen Wirkstoff Azoxymethan (AOM) kann zur Entwicklung von Kolitis-assoziiertem Krebs führen48,49. Die Ischämie-Reperfusions-induzierte Schädigung ist eine weitere Methode, um das regenerative Potenzial des Darmepithels zu untersuchen. Diese Technik erfordert Erfahrung und chirurgische Kenntnisse50. Darüber hinaus verursachen die oben genannten Techniken andere Arten von Verletzungen als Strahlung und können dazu führen, dass andere Regenerationsmechanismen beteiligt sind. Darüber hinaus sind diese Modelle zeitaufwändig, während die Bestrahlungstechnik relativ kurz ist. In jüngster Zeit wurden In-vitro-Methoden unter Verwendung von Enteroiden und Kolonoiden, die aus dem Darm und dem Dickdarm erzeugt wurden, in Kombination mit Strahlenschäden eingesetzt, um die Mechanismen der Darmregeneration zu untersuchen51,52. Diese Techniken rekapitulieren jedoch nicht vollständig das Organ, das sie modellieren53,54.

Das vorgestellte Protokoll beinhaltet die Beschreibung eines murinen Modells der Gammastrahlenschädigung in Kombination mit einem genetischen Modell, das nach einer Tamoxifenbehandlung die Rückverfolgung von Abstammungslinien aus der Reservestammzellpopulation ermöglicht (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Dieses Modell verwendet eine 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung, die eine ausreichend signifikante Darmschädigung induziert, um Reservestammzellen zu aktivieren, während gleichzeitig die anschließende Untersuchung der intestinalen Regenerationsfähigkeit innerhalb von 7 Tagen nach der Verletzung ermöglichtwird 55.

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Protocol

Alle Mäuse wurden in der Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) der Stony Brook University untergebracht. Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stony Brook University genehmigte alle Studien und Verfahren mit Tierversuchen. Versuche mit Tieren wurden streng in Übereinstimmung mit dem genehmigten Tierhandhabungsprotokoll (IACUC #245094) durchgeführt.

ANMERKUNG: Die Mausstämme B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) und B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) und gekreuzt, um Bmi1-Cre ER zu erhalten; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) Mäuse, wie zuvor beschrieben56,57,58.

1. Gehäuse von Bmi1-CRE ER; Rosa26 eYFP-Mäuse

  1. Halten Sie die Mäuse in einer Tieranlage bei einer Temperatur zwischen 68 und 72 °F und einer Luftfeuchtigkeit von 30 bis 70 % in einem 12 h / 12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit Wasser und normalem Chow ad libitum.
  2. Vor den Experimenten werden die Genotypen der Mäuse mit einer Standard-PCR-Genotypisierungstechnik bestätigt57,58.

2. Vorbereitung der Tiere und Materialien

  1. Bringen Sie die Mäuse mindestens 7 Tage vor jedem Experiment in den Versuchsraum, damit sich die Mäuse akklimatisieren können.
  2. Ordnen Sie Versuchs- und Kontrolltiere nach Geschlecht und Alter zu.
  3. Die Kontrolltiere werden einer Tamoxifen-induzierten Cre-vermittelten Rekombination, aber nicht einer Bestrahlung unterzogen (Scheinbehandlung, 0 Gy), wobei darauf geachtet wird, dass die Versuchstiere die Tamoxifen-Injektion erhalten und einer Gammabestrahlung ausgesetzt werden.
  4. Bereiten Sie die Tamoxifenlösung vor. Tamoxifenpulver in sterilem Maiskeimöl in einer Konzentration von 30 mg/ml resuspendieren. Beschallen Sie 3 Minuten lang in Zyklen von 30 s EIN und 30 s AUS mit 60 % Amplitude und drehen Sie dann 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln. Tamoxifen-Lösung kann bei −20 °C eingefroren werden, aber frieren/tauen Sie sie nicht mehr als einmal ein. Bereiten Sie vorzugsweise jedes Mal eine frische Lösung zu und lagern Sie sie nicht.
    HINWEIS: Tamoxifen ist lichtempfindlich. Wickeln Sie es während der Drehung bei Raumtemperatur mit Alufolie ein.
    ACHTUNG: Tamoxifen ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefahr (GHS08) und Umweltgefahr (GHS09).
  5. 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU)-Stammlösung herstellen. Resuspendieren Sie EdU-Pulver in 1/5 des Gesamtvolumens an sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) und fügen Sie langsam die restlichen 4/5 des Gesamtvolumens des sterilen Reinstwassers hinzu. Nach vollständiger Auflösung aliquotieren und bei −20 °C lagern.
    ACHTUNG: 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU) und Dimethylsulfoxid (DMSO) sind potenziell gefährliche Substanzen: Gesundheitsgefährdend (H340 und H631 bzw. H227, H315 und H319). EdU kann genetische Defekte verursachen und steht im Verdacht, die Fruchtbarkeit oder ungeborene Kinder zu schädigen, und DMSO kann Haut- und Augenreizungen verursachen.
  6. Bereiten Sie Reagenzien für die Gewebeentnahme und -fixierung vor: Verdünnen Sie Ethanol, um eine 70%ige Wasserlösung herzustellen, kühlen Sie DPBS auf 4 °C ab und bereiten Sie modifizierten Bouin-Fixierpuffer (50 % Ethanol und 5 % Essigsäure in destilliertemH2O) und 10 % gepuffertes Formalin vor.
    ACHTUNG: Ethylalkohol ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefährdend (H225-H319), brennbar (GHS02) und verursacht akute Toxizität (GHS07). Essigsäure ist ein potenziell gefährlicher Stoff: gesundheitsgefährdend (H226-H314), brennbar (GHS02) und ätzend (GHS05). Formalin ist ein potenziell gefährlicher Stoff: gesundheitsgefährdend (H350, H315, H317, H318, H370) und ätzend. Formalin kann Krebs, Haut- und Augenreizungen, Organschäden und allergische Hautreaktionen verursachen.
  7. Bereiten Sie die für die Euthanasie erforderlichen Geräte nach einer zugelassenen Methode vor (z. B. CO2 -Kammer), ein Mäusepräparationsset (Schere, Pinzette), Petrischalen und eine 16-G-Sondennadel an einer 10-ml-Spritze zum Spülen des Darms und histologische Kassetten.

3. Ganzkörper-Gammabestrahlung (SHT) und Gewebeentnahme

  1. Zwei Tage vor der Gammabestrahlung injizieren Sie den Versuchstieren eine Einzeldosis Tamoxifen, um eine Cre-vermittelte Rekombination und BMI1/EYFP+ -Zelllinienverfolgung zu induzieren. Wiegen Sie jedes Tier und berechnen Sie eine Dosis von 40 mg/kg Körpergewicht von Tamoxifen, das in Maisöl resuspendiert wurde. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70%igem Ethanol und verabreichen Sie Tamoxifen intraperitoneal mit einer 27G-Nadel, die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist.
  2. Beobachten Sie die Tiere in den folgenden 48 Stunden, um eine mögliche Tamoxifen-Toxizität auszuschließen.
  3. Bringen Sie die Mäuse in den Bestrahlungsraum, wie von der örtlichen Einrichtung angegeben.
  4. Berechnen Sie die Bestrahlungszeit, die von der 137Cs-Quelle freigesetzt wird, entsprechend der aktuellen Exaktordosisleistung. Wenn z. B. die aktuelle Dosisleistung 75,9 rad/min (0,759 Gy min− 1 = 75,9 cGy m−1) beträgt, wird die Expositionszeit in Minuten als die gewünschte Dosis/0,759 berechnet. Um die Tiere mit einer Dosis von 12 Gy TBI zu bestrahlen, beträgt die Belichtungszeit ~15,81 min (15 min und 48 s).
  5. Desinfizieren Sie die Probenkammer im Gammastrahler mit 70%iger Ethanollösung. Legen Sie die absorbierende Matte und die Tiere in die Probenkammer.
    HINWEIS: Mit Scheinbehandlung behandelte Tiere sollten in den Bestrahlungsraum gebracht, aber nicht der Gammastrahlung ausgesetzt werden.
  6. Setzen Sie den Deckel auf und schließen Sie die Kammer.
  7. Programmieren Sie den Gammastrahler so, dass die Tiere 12 Gy TBI ausgesetzt werden.
    1. Schalten Sie die Maschine ein, indem Sie den Schlüssel in die Position START drehen.
    2. Geben Sie die Bedienernummer über eine numerische Tastatur ein und bestätigen Sie mit ENTER.
    3. Geben Sie die PIN-Nummer über eine numerische Tastatur ein und bestätigen Sie mit ENTER.
    4. Drücken Sie 1 , um Optionen anzuzeigen.
    5. Drücken Sie 1 für die Timer-Einstellungen.
    6. Drücken Sie 1 für die Bestrahlungszeit.
    7. Geben Sie die Timer-Einstellung für den nächsten Zyklus über eine numerische Tastatur (hh:mm:ss-Format) ein und bestätigen Sie mit ENTER.
    8. Bestätigen Sie die Einstellungen noch einmal mit ENTER.
    9. Kehren Sie zum Home-Menü zurück, indem Sie 2x auf CLEAR drücken.
    10. Drücken Sie START, um die Belichtung zu starten.
  8. Verlassen Sie den Raum für die Zeit der aktiven Exposition. Das Gerät stoppt automatisch nach Ablauf der voreingestellten Zeit und beginnt zu piepen.
    ACHTUNG: Cäsium-137 (137Cs) ist ein tödlicher Gefahrstoff (Gesundheitsgefahr: H314). Die äußere Exposition gegenüber großen Mengen von 137Cs kann zu Verbrennungen, akuter Strahlenkrankheit und sogar zum Tod führen.
  9. Schalten Sie die Maschine aus, indem Sie den Schlüssel in die Position STOP drehen.
  10. Öffnen Sie die Probenkammer, nehmen Sie den Deckel ab, setzen Sie die Tiere zurück in den Käfig und desinfizieren Sie die Probenkammer mit 70%iger Ethanollösung.
  11. Bringen Sie die Tiere zurück in den konventionellen Stallraum und beobachten Sie ihren Zustand nach der Behandlung.
  12. Überwachen Sie das Gewicht der Tiere jeden Tag und schläfern Sie sie sofort (trotz des geplanten Zeitpunkts) ein, wenn Symptome eines veränderten Wohlbefindens, einer Belastung oder eines Gewichtsverlusts von mehr als 15 % des Ausgangskörpergewichts beobachtet werden.
  13. Drei Stunden vor der geplanten Euthanasie wird der Bauchbereich desinfiziert und den Mäusen mit einer 28G-Insulinspritze 100 μl EdU-Stammlösung injiziert (intraperitoneal verabreicht).
  14. Entnahme des proximalen Darms um 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 168 h nach der Bestrahlung.
    1. Führen Sie die CO2 - Euthanasie nach den Standards der Heimateinrichtung durch.
      ACHTUNG: Kohlendioxid ist ein gefährlicher Stoff (H280). Enthält Gas unter Druck; kann explodieren, wenn es erhitzt wird. Kann Sauerstoff verdrängen und schnelles Ersticken verursachen.
    2. Dann wird der proximale Teil des Dünndarms dispräpariert, das anhaftende Gewebe entfernt, mit einer 16-G-Nadel, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist, mit kaltem DPBS gespült, mit einer modifizierten Bouin-Fixierpuffer unter Verwendung einer 16-G-Injektionsnadel fixiert, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist, in Längsrichtung aufgeschnitten und den proximalen Darm mit der Swiss-Roll-Technik wie zuvor beschrieben gerollt59.
  15. Legen Sie das Gewebe in eine histologische Kassette und lassen Sie es 24-48 h bei Raumtemperatur in einem Behälter mit 10% gepuffertem Formalin stehen. Das Volumen des Formalins sollte ausreichen, um die histologischen Kassetten vollständig abzudecken. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die histologischen Kassetten mit einer Pinzette in den mit 70%igem Ethanol gefüllten Behälter übertragen. Fahren Sie dann mit der Einbettung von Gewebeparaffin fort.
    HINWEIS: Die Einbettung von Gewebeparaffin wurde vom Research Histology Core Laboratory an der Stony Brook University durchgeführt. Hier kann der Vorgang gestoppt und Paraffinblöcke bei Raumtemperatur gelagert werden.
    VORSICHT: Formalin ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefährdend (H350, H315, H317, H318, H370) und ätzend. Formalin kann Krebs, Haut- und Augenreizungen, Organschäden und allergische Hautreaktionen verursachen.

4. Histologische Analyse

  1. Kühlen Sie die histologischen Kassetten mit den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben ab, indem Sie sie mindestens 1 h lang auf Eis legen. Bereiten Sie mit einem Mikrotom 5 μm dicke Schnitte für die Färbung vor. Jedes Gewebe sollte horizontal geschnitten werden, um die gesamte gerollte Probe zu bedecken.
    1. Nach dem Schneiden des Paraffinblocks werden die Gewebeschnitte in ein auf 45 °C erwärmtes Wasserbad überführt und auf beladene Objektträger gelegt. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden, und die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Die Objektträger in einen Objektträgerhalter legen und über Nacht bei 65 °C backen. Die Folien können kürzer gebacken werden, 1-2 h. Dies ist jedoch bei frisch (weniger als 1 Monat alten) geschnittenen Objektträgern nicht ratsam.
    Anmerkungen: Legen Sie das manuelle Objektträger-Färbeset unter die chemische Haube und führen Sie die Inkubationen mit Xylol, Ethanol und Hämatoxylin unter der chemischen Haube durch.
  3. Kühlen Sie die Objektträger am nächsten Tag ab, indem Sie sie für 10 Minuten in einen Objektträgerhalter unter der chemischen Haube legen.
  4. Entparaffinieren Sie die Taschentücher, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in einen mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
    Anmerkungen: Stellen Sie von diesem Moment an sicher, dass die Proben jederzeit feucht gehalten werden.
    ACHTUNG: Xylol ist ein potenziell gefährlicher Stoff: brennbar (GHS02), akut toxisch (GHS07) und gesundheitsgefährdend (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Die potenziell gefährlichen Auswirkungen sind, dass es tödlich ist, wenn es verschluckt wird oder in die Atemwege gelangt, und Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen kann. Darüber hinaus kann es die motorischen Funktionen beeinträchtigen, indem es Schläfrigkeit oder Schwindel verursacht, und bei längerer oder wiederholter Exposition Organschäden verursachen.
  5. Rehydrieren Sie Schnitte in einem Ethanolgradienten, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in Behälter legen, die mit den folgenden Lösungen gefüllt sind: 100% Ethanol, 2 min; 95% Ethanol, 2 min; 70% Ethanol, 2 Min.
  6. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 2 Minuten lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
  7. Legen Sie den Objektträgerhalter in einen mit Hämatoxylinlösung gefüllten Behälter und färben Sie ihn 5 Minuten lang (unter der chemischen Haube).
  8. Setzen Sie den Objektträgerhalter in den mit Leitungswasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn unter fließendem Leitungswasser aus, bis sich die Hämatoxylinfärbung bläulich verfärbt, typischerweise nach 2 Minuten.
  9. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den Behälter, der mit 5%iger (w/v) Lithiumcarbonatlösung gefüllt ist. 10x eintauchen.
    ACHTUNG: Lithiumcarbonat ist eine potenziell gefährliche Substanz, die akute Toxizität (GHS07) und eine Gesundheitsgefahr (H302 - H319) verursacht. Es ist schädlich, wenn es verschluckt wird, schädlich bei Kontakt mit der Haut und verursacht schwere Augenreizungen.
  10. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 2 Minuten lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
  11. Legen Sie den Objektträgerhalter in einen mit Eosin gefüllten Behälter und färben Sie ihn 5 Minuten lang.
  12. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den mit 70%igem Ethanol gefüllten Behälter und spülen Sie ihn kurz aus (10 s).
  13. Entwässern Sie die Abschnitte, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in die mit Ethanol-Gradientenlösungen gefüllten Behälter legen: 95% Ethanol, 5 Dips; 100% Ethanol, 5 Dips.
  14. Reinigen Sie die Objektträger, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in den mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
  15. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Gestell, trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einem Papiertuch ab und geben Sie je nach Größe der Probe ein oder zwei Tropfen Eindeckmittel auf Xylolbasis auf die Oberfläche der Probe. Montieren Sie, indem Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger legen (achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen). Bei Bedarf leicht drücken. Die gesamte Oberfläche des Glases sollte abgedeckt und versiegelt sein.
  16. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie über Nacht unter der chemischen Haube lassen. In der Regel verfestigt sich das Eindeckmedium in weniger als 24 h. Um sicherzustellen, dass die Objektträger trocken sind, kann ein Probeobjektträger angefertigt werden. Geben Sie mit einem leeren Objektträger einen Tropfen des Eindeckmediums hinein und lassen Sie es über Nacht unter der Chemikalienhaube stehen. Berühren Sie am nächsten Tag den Tropfen und prüfen Sie, ob er erstarrt ist.
  17. Wenn die Objektträger ausgetrocknet sind, analysieren Sie die Histologie des Gewebes mit einem Lichtmikroskop oder einem fortschrittlicheren Mikroskop mit Hellfeldkanal.
    1. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch, bewegen Sie sich, bis sich die Probe in der Mitte des Sichtfelds befindet, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein und verwenden Sie eine Objektivlinse mit 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung, um die Histologie im Vergleich zu Kontrollgeweben (scheinbestrahlt) zu analysieren.
    2. Wenn das Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist, nehmen Sie auch Bilder auf.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert und später analysiert werden. Bewahren Sie die Objektträger nicht länger als 30 Tage auf, da die Färbung langsam verblasst.

5. Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Kühlen Sie die histologischen Kassetten mit paraffineingebetteten Gewebeproben ab, indem Sie sie mindestens 1 h lang auf Eis legen. Bereiten Sie mit einem Mikrotom 5 μm dicke Schnitte für die Färbung vor. Jedes Gewebe sollte horizontal geschnitten werden, um die gesamte gerollte Probe zu bedecken.
    1. Nach dem Schneiden des Paraffinblocks werden die Gewebeschnitte in ein auf 45 °C erwärmtes Wasserbad überführt und auf beladene Objektträger gelegt. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden, und die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Die Objektträger in einen Objektträgerhalter legen und über Nacht bei 65 °C backen. Die Folien können kürzer gebacken werden, 1-2 h. Dies ist jedoch bei frisch (weniger als 1 Monat) geschnittenen Objektträgern nicht ratsam.
    Anmerkungen: Legen Sie das manuelle Objektträger-Färbeset unter die chemische Haube und führen Sie die Inkubationen mit Xylol, Ethanol undH2O2/Methanol unter der chemischen Haube durch.
  3. Kühlen Sie die Objektträger am nächsten Tag ab, indem Sie sie für 10 Minuten in einen Objektträgerhalter unter der chemischen Haube legen.
  4. Entparaffinieren Sie die Taschentücher, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in einen mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
    Anmerkungen: Stellen Sie von diesem Moment an sicher, dass die Proben jederzeit feucht gehalten werden.
  5. Beenden Sie die endogene Peroxidase, indem Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einem mit 2%iger Wasserstoffperoxidlösung in Methanol gefüllten Behälter unter der chemischen Haube inkubieren.
    VORSICHT: Methylalkohol ist eine potenziell gefährliche Substanz: Gesundheitsgefährdend (H225-H301, H311, H331-H370), brennbar (GHS02) und verursacht akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ) (GHS08). Wasserstoffperoxid ist ein potenziell gefährlicher Stoff: ätzend (GHS05) und verursacht akute Toxizität (GHS07).
  6. Rehydrieren Sie die Schnitte in einem Ethanolgradienten, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in Behälter legen, die mit den folgenden Lösungen gefüllt sind: 100% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 70% Ethanol, 3 Min.
  7. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in einen mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 2 Minuten lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
  8. Um die Antigene zu gewinnen, überführen Sie den Objektträgerhalter in einen Behälter mit 250 ml Citrat-Pufferlösung (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % Tween-20, pH 6,0) und kochen Sie ihn 10 Minuten lang bei 110 °C in einer Enttarnungskammer.
  9. Den gesamten Behälter in den Kühlraum stellen und im Laufe von 30 Minuten allmählich abkühlen lassen.
  10. Ersetzen Sie nach 30 Minuten die Citratpufferlösung durch destilliertes Wasser und spülen Sie sie unter fließendem destilliertem Wasser ab, bis alle schwimmenden Paraffinstücke entfernt sind.
  11. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus dem Halter, klopfen Sie auf ein Papiertuch und trocknen Sie den Bereich um die Probe vorsichtig mit einem Papiertuch ab. Zeichnen Sie eine geschlossene Form um die Probe herum mit einem Stift, der eine hydrophobe Barriere bietet (PAP-Stift). In eine befeuchtete Kammer geben.
  12. Blockieren Sie mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in TBS-Tween, indem Sie 200 μl der Lösung auf die Oberfläche einer Probe geben. Stellen Sie sicher, dass keine Leckagen vorhanden sind. Bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer für 30 min inkubieren.
  13. Entfernen Sie die blockierende Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Wieder in eine befeuchtete Kammer geben. 100 μl der entsprechenden Konzentration der Primärantikörper in einem Blockierungspuffer resuspendieren und bei 4 °C unter leichtem Schaukeln über Nacht inkubieren. Verwenden Sie für BMI1/EYFP Hühnchen-Anti-GFP (Verdünnung 1:500); Verwenden Sie für Ki-67 Kaninchen-Anti-Ki-67 (Verdünnung 1:200).
  14. Entfernen Sie die Antikörperlösung, indem Sie mit dem Objektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 3x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion TBS-Tween-Puffer.
  15. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus der Halterung, entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen, und legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer. Fügen Sie 100 μl der entsprechenden Konzentration an Sekundärantikörpern hinzu, die in einem Blockierungspuffer resuspendiert wurden, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C. Sekundäre Antikörper sollten mit einem Fluorophor konjugiert werden. Verwenden Sie für BMI1/EYFP das Esel-Anti-Huhn Alexa Fluor 647 (Verdünnung 1:500); Verwenden Sie für Ki-67 Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:500).
  16. Entfernen Sie die Antikörperlösung, indem Sie mit dem Objektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 3x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion TBS-Tween-Puffer.
  17. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus der Halterung, entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen, und legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer. Fügen Sie 100 μl der EdU-Färbelösung hinzu, die gemäß den Anweisungen des Herstellers und unter Verwendung des Fluorophors Alexa Fluor 555 hergestellt wurde.
  18. Entfernen Sie die EdU-Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion TBS-Tween-Puffer.
  19. Nehmen Sie die Dias aus der Halterung (eine nach der anderen); Entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasschieber auf ein Papiertuch klopfen und in eine befeuchtete Kammer geben. Führen Sie eine Hoechst 33258-Gegenfärbung durch, indem Sie 100 μl der Hoechst 33258-Lösung (Verdünnung 1:1000 in TBS-Tween) auf die Oberfläche der Probe geben. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
  20. Entfernen Sie die Lösung Hoechst 33258, indem Sie mit dem Objektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in einen mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang unter Schütteln.
  21. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Objektträgerhalter, trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einem Papiertuch ab und geben Sie je nach Größe der Probe ein oder zwei Tropfen Eindeckmedium auf Aquabasis auf die Oberfläche der Probe. Montieren Sie, indem Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger legen (achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen). Bei Bedarf leicht drücken. Die gesamte Oberfläche des Glases sollte abgedeckt und versiegelt sein.
  22. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln liegen lassen. In der Regel verfestigt sich das Eindeckmedium in weniger als 24 Stunden. Um sicherzustellen, dass die Objektträger trocken sind, kann ein Probeobjektträger angefertigt werden. Verwenden Sie eine leere Folie. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums hinein und lassen Sie es über Nacht unter der Chemikalienhaube stehen. Berühren Sie am nächsten Tag den Tropfen und prüfen Sie, ob er erstarrt ist.
  23. Wenn die Objektträger austrocknen, kann das gefärbte Gewebe mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert werden, das mit Emissionswellenlängenfiltern ausgestattet ist, die die Visualisierung von Ki-67-, EdU- und BMI1/EYFP-Färbungen (535 nm, 646 nm bzw. 700 nm) ermöglichen.
  24. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch, bewegen Sie sich, bis sich die Probe in der Mitte des Sichtfelds befindet, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein und verwenden Sie die Objektivlinse mit 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung, um die Färbung im Vergleich zu Kontrollgewebe (scheinbestrahlt) zu analysieren. Wenn das Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist, können auch Bilder aufgenommen werden. Nehmen Sie Bilder für jeden Kanal separat auf und fügen Sie sie später zusammen.
    HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Die Objektträger können bei 4 °C gelagert und später analysiert werden. Bewahren Sie die Objektträger nicht länger als 14 Tage auf, da die Färbung langsam verblasst.

6. TUNEL-Färbung

  1. Kühlen Sie die histologischen Kassetten mit paraffineingebetteten Gewebeproben ab, indem Sie sie mindestens 1 h lang auf Eis legen. Bereiten Sie mit einem Mikrotom 5 μm dicke Schnitte für die Färbung vor. Jedes Gewebe sollte horizontal geschnitten werden, um die gesamte gerollte Probe zu bedecken.
    1. Nach dem Schneiden des Paraffinblocks werden die Gewebeschnitte in ein auf 45 °C erwärmtes Wasserbad überführt und auf beladene Objektträger gelegt. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden, und die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Die Objektträger in einen Objektträgerhalter legen und über Nacht bei 65 °C backen.
    HINWEIS: Die Folien können kürzer gebacken werden, 1-2 Stunden. Bei frisch (weniger als 1 Monat) geschnittenen Objektträgern ist es jedoch nicht ratsam. Legen Sie das manuelle Objektträger-Färbeset unter die Chemikalienhaube und führen Sie die Inkubationen mit Xylol und Ethanol unter der Chemikalienhaube durch.
  3. Kühlen Sie die Objektträger am nächsten Tag ab, indem Sie sie für 10 Minuten in einen Objektträgerhalter unter der chemischen Haube legen.
  4. Entparaffinieren Sie das Gewebe, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in einen mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
    Anmerkungen: Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass die Proben jederzeit feucht gehalten werden.
  5. Rehydrieren Sie die Schnitte in einem Ethanolgradienten, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in Behälter legen, die mit den folgenden Lösungen gefüllt sind: 100% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 90% Ethanol, 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 70% Ethanol, 3 Min.
  6. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in einen mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 1 Minute lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
  7. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus dem Halter, klopfen Sie auf ein Papiertuch und trocknen Sie den Bereich um die Probe vorsichtig mit einem Papiertuch ab. Zeichnen Sie eine geschlossene Form um die Probe herum mit einem Stift, der eine hydrophobe Barriere bietet (PAP-Stift). In eine befeuchtete Kammer geben.
  8. Inkubation mit DNase-freier Proteinase K. 100 μl der DNase-freien Proteinase-K-Lösung (Verdünnung 1:25 in DPBS) auf die Oberfläche der Probe innerhalb der hydrophoben Barriere. Bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer 15 Minuten inkubieren.
    ACHTUNG: Proteinase K ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefährdend (H315 - H319 - H334).
  9. Entfernen Sie die Proteinase-K-Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit DPBS gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion DPBS.
  10. Bereiten Sie das TUNEL-Reaktionsgemisch vor: Mischen Sie die Etikettenlösung (1x) mit der Enzymlösung (10x). Gut pipettieren.
  11. Nehmen Sie die Dias aus der Halterung (eine nach der anderen); Entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasschieber auf ein Papiertuch klopfen und in eine befeuchtete Kammer geben. 50 μl TUNEL-Reaktionsgemisch auf die Oberfläche der Probe geben und im Dunkeln bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer 60 min inkubieren. Verwenden Sie für eine Negativkontrolle nur die Etikettenlösung (ohne TdT).
  12. Entfernen Sie die TUNEL-Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in einen mit DPBS gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion DPBS.
  13. Nehmen Sie die Dias aus der Halterung (eine nach der anderen); Entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasschieber auf ein Papiertuch klopfen und in eine befeuchtete Kammer geben. Führen Sie eine Hoechst 33258-Gegenfärbung durch, indem Sie 100 μl der Hoechst 33258-Lösung (Verdünnung 1:1000 in TBS-Tween) auf die Oberfläche der Probe geben. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
  14. Entfernen Sie die Lösung Hoechst 33258, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit DPBS gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang unter Schütteln.
  15. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Diahalter. Trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einem Papiertuch ab und geben Sie je nach Größe der Probe ein oder zwei Tropfen Eindeckmedium auf Aquabasis auf die Oberfläche der Probe. Montieren Sie, indem Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger legen (achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen). Bei Bedarf leicht drücken. Die gesamte Oberfläche des Glases sollte abgedeckt und versiegelt sein.
  16. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln liegen lassen. In der Regel verfestigt sich das Eindeckmedium in weniger als 24 h. Um sicherzustellen, dass die Objektträger trocken sind, kann ein Probeobjektträger angefertigt werden. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums hinein und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Berühren Sie am nächsten Tag den Tropfen und prüfen Sie, ob er erstarrt ist.
  17. Wenn die Objektträger austrocknen, kann das gefärbte Gewebe mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert werden, das mit Emissionswellenlängenfiltern ausgestattet ist, die die Visualisierung der TUNEL-Färbung (535 nm) ermöglichen.
  18. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch, bewegen Sie sich, bis sich die Probe in der Mitte des Sichtfelds befindet, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein und verwenden Sie eine Objektivlinse mit 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung, um die Färbung im Vergleich zu Kontrollgewebe (scheinbestrahlt) zu analysieren. Wenn das Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist, können auch Bilder aufgenommen werden. Nehmen Sie Bilder für jeden Kanal separat auf und fügen Sie sie später zusammen.
    HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Objektträger können bei 4 °C gelagert und später analysiert werden. Bewahren Sie die Objektträger nicht länger als 14 Tage auf, da die Färbung langsam verblasst.

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Representative Results

Die Verwendung der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung (SHT) in Kombination mit der genetischen Abstammungsverfolgung von Mäusen ermöglicht eine gründliche Analyse der Folgen von Strahlenschäden im Darm. Um zu beginnen, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine einzige Tamoxifen-Injektion, die eine verstärkte Expression des gelb fluoreszierenden Proteins (EYFP) innerhalb einer Bmi1+ -Reservestammzellpopulation induziert. Zwei Tage nach der Tamoxifen-Injektion wurden die Mäuse einer Bestrahlung oder Scheinbestrahlung unterzogen. Drei Stunden vor der Euthanasie wurde den Mäusen EdU injiziert. Nach der Euthanasie wurden Dünndarmproben zur Analyse um 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 7 Tage nach der Bestrahlung entnommen. Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Bilder (H&E) (Abbildung 1) aus dem oben genannten Zeitverlauf veranschaulichen die Reaktion des Darmepithels auf eine Verletzung. Der 0-h-Zeitpunkt veranschaulicht das homöostatische Darmepithel (Abbildung 1); Darauf folgt die apoptotische Phase, die durch einen Zellverlust in Kryptenkompartimenten zwischen 3 h und 48 h gekennzeichnet ist (Abbildung 1). Dann folgt die regenerative Phase, in der hochproliferative Zellen die Krypten zwischen 72 h und 96 h besiedeln (Abbildung 1). Dies führt schließlich zur Normalisierungsphase, die hier durch den 7-Tage-Zeitpunkt dargestellt wird (Abbildung 1).

Abbildung 2 zeigt Veränderungen im proliferativen Status von intestinalen Kryptenzellen, die durch Immunfluoreszenzfärbung von EdU (Marker von Zellen in der S-Phase) und Ki-67 (Marker von Zellen in G1-, S- und G2/M-Phasen) bewertet wurden, während Lineage Tracing (EYFP+-Zellen) Zellen markiert, die von Bmi1+-Reservestammzellen stammen. Während der Homöostase (Abbildung 2, 0 h Schein) sind die Bmi1+-positiven Zellen, die durch die Expression von EYFP markiert sind, auf die +4-+6-Position innerhalb der Krypten beschränkt. Während der apoptotischen Phase (24 h und 48 h) nimmt die Anzahl der EYFP-positiven Zellen ab (Abbildung 2). Die regenerative Phase (72 h und 96 h) ist durch schnell proliferierende Bmi1+-positive Zellen und deren Vorläuferzellen gekennzeichnet (Abbildung 2); 7 Tage nach der Bestrahlung haben weitere Proliferation und Migration die Darmkryptenzellen wieder aufgefüllt und die Integrität des Darmepithels wiederhergestellt (Abbildung 2).

In scheinbestrahlten Mäusen (Kontrolle) färben EdU und Ki-67 EYFP-negative proliferative Zellen der intestinalen Krypten, die typisch für eine normale intestinale Homöostase sind und sich von aktiven Stammzellen über die transitamplifizierende Zone erstrecken (Abbildung 2). Strahlenschäden führen zu einem Verlust hochproliferativer Zellen während der apoptotischen Phase, wie die Reduktion der EdU- und Ki-67-Färbung zeigt (Abbildung 2). Die Aktivierung von Reservestammzellen (in diesem Beispiel EYFP-markierte Bmi1+ -positive Zellen) und ihre Proliferation führen zu einem Anstieg von EdU- und Ki-67-positiven Zellen, die 72 h und 96 h nach der Verletzung deutlich sichtbar sind, wobei die Krypten fast ausschließlich aus Zellen bestehen, die mit EYFP, EdU und Ki-67 co-gefärbt wurden. Die beobachteten Proliferationswerte normalisieren sich 7 Tage nach der Verletzung (Abbildung 2).

Um die durch Strahlenschäden verursachte Apoptose zu veranschaulichen, wurde eine TUNEL-Färbung durchgeführt, und repräsentative Bilder sind in Abbildung 3 enthalten. Während der Homöostase (Abbildung 3) durchlaufen nur wenige Zellen Apoptose, was typisch für den normalerweise schnellen Darmepithelumsatz ist. Eine deutliche Zunahme der TUNEL-Färbung ist spät in der apoptotischen Phase (24 h und 48 h) nach der Bestrahlung zu beobachten (Abbildung 3). Während der Regenerationsphase nimmt die TUNEL-Färbung in den regenerierenden Krypten stetig ab und ist nach Normalisierung der Krypten wieder nahezu nicht mehr vorhanden (Abbildung 3). Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache und zugängliche Immunfluoreszenz-Färbemethode, die eine einfache und weit verbreitete Kombination von Markierungstechniken (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP) verwendet, die in der Lage ist, Einblicke in das Verhalten von Darmzellen nach einer Verletzung (hier Bestrahlung) zu geben. Mit diesem Ansatz können die Mechanismen untersucht werden, die regenerative Prozesse im Darmepithel unter bestimmten Bedingungen regulieren. Mit diesem und ähnlichen Ansätzen sollen alternative Regenerationsprozesse nach verschiedenen intestinalen Insultationen beleuchtet und therapeutische Strategien zur Verhinderung des Verlusts der Barrierefunktion untersucht werden.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Hämatoxylin und Eosin (H&E)-gefärbten Schnitten von Dünndarmgewebe nach einem zeitlichen Verlauf nach Ganzkörperbestrahlung. Bmi1-CREER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine Dosis Tamoxifen 2 Tage vor der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung oder Scheinbestrahlung. Mäuse wurden geopfert und Dünndarmgewebe zu den in der Abbildung angegebenen Zeitpunkten gesammelt. Alle Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Bilder der Immunfluoreszenzfärbung von Dünndarmschnitten nach Bestrahlung. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine Dosis Tamoxifen 2 Tage vor der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung oder Scheinbestrahlung. Mäuse wurden geopfert und Dünndarmgewebe zu den in der Abbildung angegebenen Zeitpunkten gesammelt. Die Gewebeschnitte wurden mit EdU gefärbt, um Zellen in der S-Phase (rosa) und mit Ki-67 zu markieren, um Zellen in den Phasen G0, S und G2/M (gelb) zu markieren. EYFP (grün) markiert Bmi1+ -Zellen und ihre Vorläuferzellen und demonstriert die Rückverfolgung der Abstammungslinie. Die Schnitte wurden zusätzlich mit DAPI (blau) gegengefärbt, um die Kerne sichtbar zu machen. Die Daten werden als zusammengefügte Bilder bei 10-facher Vergrößerung und Einschübe einzelner Flecken bei 20-facher Vergrößerung angezeigt (diese stammen aus 10-fachen Bildern). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Bilder der immunfluoreszierenden TUNEL-Färbung von Dünndarmschnitten nach Bestrahlung. Bmi1-CREER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine Dosis Tamoxifen 2 Tage vor der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung oder Scheinbestrahlung. Mäuse wurden geopfert und Dünndarmgewebe zu den in der Abbildung angegebenen Zeitpunkten gesammelt. TUNEL (rot) färbt apoptotische Zellen. Diese Bilder wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt, um Kerne sichtbar zu machen. Die gezeigten Bilder wurden mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares Strahlenverletzungsmodell. Es ermöglicht die genaue Analyse der Veränderungen des Darmepithels im Verlauf von 7 Tagen nach der Verletzung. Wichtig ist, dass die ausgewählten Zeitpunkte entscheidende Stadien der Verletzung widerspiegeln und durch deutliche Veränderungen des Darms (Verletzungs-, Apoptose-, Regenerations- und Normalisierungsphasen) gekennzeichnet sind60. Dieses Bestrahlungsmodell wurde etabliert und sorgfältig bewertet und zeigt eine geeignete Erscheinungsform der Verletzung, die die von Patienten nachahmt, die sich einer Strahlentherapie unterziehen61. Mehr als die Hälfte der Patientinnen mit Darmkrebs und gynäkologischen Krebserkrankungen unterziehen sich einer abdominalen Strahlentherapie 40,62,63. Trotz fortschrittlicher Methoden zur gezielten Strahlentherapie kommt es bei den Patienten zu einer Bestrahlung von gesundem Darmgewebe, was zu einer Pathophysiologie führt, die derjenigen sehr ähnlich ist, die mit dem hier vorgestellten Ganzkörperbestrahlungsmodell beobachtet wurde. Daher kann das hier beschriebene Strahlenmodell potenziell die Auswirkungen einer unbeabsichtigten Strahlenexposition von Patienten und/oder medizinischem Personal berücksichtigen und ist daher für die menschliche Gesundheit von entscheidender Bedeutung.

Der Bmi1-CREER; Das Rosa26eYFP-Mausmodell trägt Tamoxifen-induzierbares Cre unter der transkriptionellen Kontrolle des Bmi1-Promotors (Bmi1 polycomb ring finger oncogene) der Maus. Zusätzlich tragen diese Mäuse eine R26-stop-EYFP-Sequenz, bei der das STOP-Codon von loxP-Seiten flankiert wird, gefolgt von dem Enhanced Yellow Fluorescent Protein Gen (EYFP), das in den Gt(ROSA)26Sor-Locus eingefügt wird. Die Expression von EYFP wird durch eine vorgeschaltete loxP-flankierte STOP-Sequenz blockiert, kann aber durch Tamoxifen-induzierte, Cre-vermittelte gezielte Deletionen aktiviert werden, was die Rückverfolgung von Bmi1-exprimierenden Zellen, einer Reservestammzell-spezifischen Subpopulation von Kryptenzellen, ermöglicht. Das Bestrahlungsprotokoll in Kombination mit dem Bmi1-CreER; DaseYFP-Mausmodell von Rosa26 wurde bereits verwendet, um die Rolle von Transkriptionsfaktoren bei der Regulierung der intestinalen Regeneration zu untersuchen18,56. Die in den Abbildungen 1 bis 3 dargestellten repräsentativen Ergebnisse zeigen ähnliche Ergebnisse wie in neueren Veröffentlichungen18,56.

Bemerkenswert ist, dass Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-Mäuse sind nur eines von mehreren transgenen Tiermodellen, die zur Untersuchung der Darmregeneration eingesetzt werden. Andere Modelle zur Rückverfolgung muriner Abstammungslinien wurden mit Strahlung kombiniert, um die Rolle spezifischer Zellen und Signalwege bei der Regenerationsfähigkeit des Darmepithels zu demonstrieren 18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,65,66,67 . Diese Modelle wurden entwickelt, um die Rolle verschiedener Populationen reservierter Stammzellen zu untersuchen, die Vorläufer von Sekretions- und Enterozytenlinien zu erforschen und die Funktion spezifischer Gene innerhalb jeder Subpopulation der Darmepithelzellen zu untersuchen. Die kombinierten Ergebnisse dieser Untersuchungen werden dazu beitragen, das Verständnis der Regenerationsfähigkeit des Darmepithels zu erweitern.

Wichtig ist, dass diese Technik mit geringfügigen Modifikationen die Untersuchung der Beziehungen zwischen Mikrobiota und verschiedenen Epithel-, Stroma- und Immunzellpopulationen nach Strahlenschäden ermöglichen sollte. Die Einführung verschiedener Tiermodelle zur Rückverfolgung von Abstammungslinien wird die Untersuchung des Echtzeitverhaltens und der Interaktion verschiedener Subpopulationen von Zellen nach einer Verletzung ermöglichen. Alternativ könnte die Färbung von Geweben durch RNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder Proteomanalyse ersetzt werden, um tiefere Kenntnisse über die Rolle spezifischer Zelllinien bei der Darmregeneration nach einer Verletzung zu erlangen68,69. Dieses Verletzungsmodell könnte verwendet werden, um neue Behandlungsmodalitäten zu testen, die die Nebenwirkungen der Bestrahlung minimieren, die Genesungszeit verkürzen und die Qualität der Patientenversorgung verbessern sollen70. Obwohl das hier beschriebene Strahlungsmodell als nützliches Werkzeug dienen kann, um die Regeneration des Darmepithels zu untersuchen, weist es auch einige Einschränkungen auf. Die Ganzkörperstrahlendosis führt unweigerlich zu einem anschließenden hämatopoetischen Syndrom, das die Untersuchung der Darmregeneration behindert. Dies kann durch eine Knochenmarktransplantation abgewendet werden. Ferner kann die Modifikation eines Protokolls für reine Bauchverletzungen möglicherweise einige der Nebenwirkungen der Bestrahlunglindern 71. Dieses Modell erfordert jedoch zusätzliche Schritte, die die Reaktion des Darms auf die Verletzung beeinflussen können (z. B. Anästhesie). Übrigens führt die abdominale Bestrahlung zu einem strahleninduzierten gastrointestinalen Syndrom (RIGS) ohne hämatopoetisches Syndrom, was sich von der Ganzkörperbestrahlung (WBI) dadurch unterscheidet, dass die WBI eine ähnliche gastrointestinale Symptomatik hervorruft, aber einen teilweisen Verlust der hämatopoetischen Funktion nach einer Verletzung beinhaltet71,72.

Bemerkenswert ist, dass gentechnisch veränderte Tiermodelle, wie sie in diesem Protokoll beschrieben werden, ausgeklügelt sind und die Rückverfolgung der Abstammungslinie bestimmter Zellen ermöglichen. Diese Modelle sind zwar sehr vorteilhaft, erfordern jedoch zusätzlichen Aufwand für die Wartung. Transgene Tiermodelle, die bedingte Gendeletionen ermöglichen, sind schwer zu generieren, und ihre rechtzeitige Deletion bei Verletzung ist möglicherweise nicht leicht zu bewerkstelligen. Darüber hinaus erlauben die meisten transgenen Modelle nur eine bedingte Deletion oder Inaktivierung eines Gens von Interesse, sind aber nicht induzierbar und daher nicht in der Lage, die Genfunktion wiederherzustellen, und können die Studien behindern. Darüber hinaus erfordern transgene Tiermodelle in der Regel eine Behandlung mit zusätzlichen Chemikalien (z. B. Tamoxifen, Doxycyclin), um eine Inaktivierung oder Überexpression des interessierenden Gens zu erreichen. Behandlungen mit diesen Substanzen können bis zu einem gewissen Grad die Reaktion des Darmepithels verändern oder die Schwere der Verletzung erhöhen 73,74,75,76. Darüber hinaus kann die Induktion der Linienverfolgung durch Tamoxifen näher am Zeitpunkt der Strahlenschädigung eingeführt werden, um die Markierung der an der Regeneration beteiligten Zellen zu verbessern (z. B. 6-24 Stunden vor der Verletzung). Somit ist es möglich, ein transgenes Modell durch Wildtyp-Mäuse und eine Kombination aus IF-Färbung (z.B. Ki-67, PCNA, EdU, TUNEL, Caspase 3) zu ersetzen. Dieses Modell ermöglicht die Analyse der Regenerationsfähigkeit des Darms, obwohl es nicht die Untersuchung einer bestimmten Subpopulation der Zellen erlaubt.

Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll besteht aus mehreren entscheidenden Schritten. Es ist von größter Wichtigkeit, sicherzustellen, dass gesunde Mäuse für Experimente verwendet werden, da sie Strahlung und Behandlung mit Chemikalien ausgesetzt sind. Wenn Experimente mit verschiedenen Mäusegruppen im Abstand von Tagen, Wochen oder Monaten durchgeführt werden, empfiehlt es sich, den gleichen Zeitplan einzuhalten, z. B. Tamoxifen-Injektionen zur gleichen Tageszeit. Der Bestrahlungsprozess sollte zeitnah durchgeführt werden, und die Mäuse sollten sofort in ihre ursprünglichen Käfige zurückgebracht werden. Darüber hinaus kann die Bereitstellung von weicher Nahrung und viel Wasser dazu beitragen, einige der nachteiligen Auswirkungen der Strahlung zu mildern. Die Swiss-Roll-Technik wird vorgeschlagen, um eine umfassende Analyse des Darmgewebeszu ermöglichen 59. Diese Technik ist nicht trivial, und es sollten vorherige Versuche durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass eine einwandfreie Qualität des Gewebes für die Färbung erreicht wird. Alle Lösungen für Mäuseexperimente und Färbungen sollten frisch zubereitet und unter geeigneten Bedingungen gelagert werden. Bei der Arbeit mit Antikörpern ist es wichtig, Objektträger mit Positiv- und Negativkontrollen zu testen und, wenn möglich, Antikörper mit gleicher Katalognummer und Chargennummer zu verwenden. Immunfluoreszenz-Objektträger sollten bei 4 °C gelagert und innerhalb von 1 Woche nach der Präparation abgebildet werden. Bei längerer Lagerung, auch bei −20 °C, kann es zu Signalverlusten kommen. H&E-Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden, da kein Verlust der Fluorophorstabilität zu befürchten ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte Modell der Strahlenschädigung ein reproduzierbares und relevantes Modell zur Verfolgung des Schicksals von Darmzellen nach einem Insult ist und mit verschiedenen Mausmodellen und molekularen Techniken kombiniert werden kann, um das Verständnis der Pathophysiologie des Darmepithels zu verbessern. Einblicke in die molekularen und zellulären Mechanismen, die die Regeneration des Darmepithels steuern, könnten zur Entwicklung neuer Therapien und nützlicher therapeutischer Interventionen führen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren danken dem Stony Brook Cancer Center Histology Research Core für die fachkundige Unterstützung bei der Vorbereitung von Gewebeproben und der Abteilung für Labortierressourcen an der Stony Brook University für die Unterstützung bei der Pflege und Handhabung der Tiere. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health DK124342 unterstützt, die an Agnieszka B. Bialkowska und DK052230 an Dr. Vincent W. Yang vergeben wurden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
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Biologie Heft 185
Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung
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Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

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