Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Intestinal epitelial regenerering som respons på ioniserende bestråling

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

Mage-tarmkanalen er et av de mest følsomme organene for skade ved radioterapeutisk kreftbehandling. Det er samtidig et organsystem med en av de høyeste regenerative kapasitetene etter slike fornærmelser. Den presenterte protokollen beskriver en effektiv metode for å studere regenerativ kapasitet i tarmepitelet.

Abstract

Tarmepitelet består av et enkelt lag av celler, men inneholder likevel flere typer terminalt differensierte celler, som genereres ved aktiv spredning av intestinale stamceller som ligger i bunnen av tarmkryptene. Under hendelser med akutt tarmskade gjennomgår imidlertid disse aktive intestinale stamcellene celledød. Gammabestråling er en mye brukt kolorektal kreftbehandling, som, selv om den er terapeutisk effektiv, har bivirkningen av å tømme det aktive stamcellebassenget. Faktisk opplever pasienter ofte gastrointestinalt strålingssyndrom mens de gjennomgår strålebehandling, delvis på grunn av aktiv stamcelleuttømming. Tapet av aktive intestinale stamceller i tarmkrypter aktiverer et basseng av typisk hvilende reserve intestinale stamceller og induserer dedifferensiering av sekretoriske og enterocyttforløperceller. Hvis ikke for disse cellene, ville tarmepitelet mangle evnen til å gjenopprette fra strålebehandling og andre slike store vevsfornærmelser. Nye fremskritt innen avstamningssporingsteknologier tillater sporing av aktivering, differensiering og migrasjon av celler under regenerering og har blitt brukt til å studere dette i tarmen. Denne studien tar sikte på å skildre en metode for analyse av celler i musens tarmepitel etter strålingsskade.

Introduction

Det menneskelige tarmepitelet ville dekke omtrent overflaten av en halv badmintonbane hvis det ble plassert helt flatt1. I stedet komprimeres dette enkeltcellelaget som skiller mennesker fra innholdet i tarmen til en serie fingerlignende fremspring, villi og innrykk, krypter som maksimerer tarmens overflateareal. Cellene i epitelet skiller seg langs en krypt-villus-akse. Villus består primært av næringsabsorberende enterocytter, slimutskillende begerceller og de hormonproduserende enteroendokrine cellene, mens kryptene primært består av defensinproduserende Paneth-celler, aktive og reservestamceller og stamceller 2,3,4,5. Videre genererer den toveis kommunikasjonen disse cellene har med stromale og immunceller i det underliggende mesenkymale rommet og mikrobiota av lumen et komplekst nettverk av interaksjoner som opprettholder tarmhomeostase og er kritisk for utvinning etter skade 6,7,8.

Tarmepitelet er det raskest selvfornyende vevet i menneskekroppen, med en omsetningshastighet på 2-6 dager 9,10,11. Under homeostase deler aktive stamceller ved basen av tarmkrypter (kryptbasesøyleceller), preget av ekspresjonen av leucinrik repetisjonsholdig G-proteinkoblet reseptor 5 (LGR5), raskt og gir stamceller som differensierer i alle andre tarmepitellinjer. På grunn av deres høye mitotiske hastighet er imidlertid aktive stamceller og deres umiddelbare forfedre spesielt følsomme for gammastrålingsskade og gjennomgår apoptose etter bestråling 5,12,13,14. Ved tapet gjennomgår reservestamceller og ikke-stamceller (subpopulasjon av forfedre og noen terminalt differensierte celler) i tarmkrypter aktivering og fyller opp det basale kryptrommet, som deretter kan rekonstituere cellepopulasjoner av villi og dermed regenerere tarmepitelet15. Ved hjelp av avstamningssporingsteknikker har flere forskningsgrupper vist at reservestamceller (hvilende) er i stand til å støtte regenerering ved tap av aktive stamceller 13,16,17,18,19,20,21,22. Disse cellene er karakterisert ved tilstedeværelsen av polycomb kompleks protein 1 onkogen (Bmi1), mus telomerase revers transkriptase gen (mTert), Hop homeobox (Hopx) og leucinrikt repetisjonsprotein 1 gen (Lrig1). I tillegg har det vist seg at ikke-stamceller er i stand til å fylle tarmkrypter ved skade 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Spesielt har det vist seg at forfedre til sekretoriske celler og enterocytter gjennomgår dedifferensiering ved skade, går tilbake til stamlignende celler og støtter regenerering av tarmepitelet. Nylige studier har identifisert celler som uttrykker flere markører som har kapasitet til å skaffe seg stammelignende egenskaper ved skade (for eksempel DLL +, ATOH1 +, PROX1 +, MIST1 +, DCLK1 +) 32,33,34,35,36. Overraskende nok viste Yu et al. at selv modne Paneth-celler (LYZ +) kan bidra til intestinal regenerering37. Videre, i tillegg til å forårsake apoptose av tarmepitelceller og forstyrre epitelbarrierefunksjonen, resulterer bestråling i dysbiose av tarmfloraen, immuncelleaktivering og initiering av en proinflammatorisk respons, og aktivering av mesenkymale og stromale celler38,39.

Gammastråling er et verdifullt terapeutisk verktøy i kreftbehandling, spesielt så for kolorektal svulster40. Imidlertid påvirker bestråling signifikant intestinal homeostase ved å indusere skade på cellene, noe som fører til apoptose. Strålingseksponering forårsaker flere forstyrrelser som reduserer pasientens utvinning og er preget av slimhinneskade og betennelse i den akutte fasen og diaré, inkontinens, blødning og magesmerter på lang sikt. Denne panoply av manifestasjoner er referert til som gastrointestinal stråling toksisitet. I tillegg kan stråleindusert progresjon av transmural fibrose og / eller vaskulær sklerose bare manifestere år etter behandlingen 38,41. Samtidig med selve skaden induserer stråling en reparasjonsrespons i tarmceller som aktiverer signalveier som er ansvarlige for å initiere og orkestrere regenerering42. Stråleindusert tarmsykdom kan stamme fra strålebehandling av bekken eller buk gitt til andre organer (som livmorhals, prostata, bukspyttkjertel, endetarm)41,43,44,45,46. Tarmbestrålingsskade er dermed et betydelig klinisk problem, og en bedre forståelse av den resulterende patofysiologien vil sannsynligvis fremme utviklingen av tiltak for å lindre gastrointestinale komplikasjoner forbundet med strålebehandling. Det finnes andre teknikker som gjør det mulig å undersøke det regenerative formålet med tarmepitelet bortsett fra stråling. Transgene og kjemiske murinmodeller for å studere inflammasjon og regenerering deretter er utviklet47. Dextran natriumsulfat (DSS) induserer betennelse i tarmen og fører til utvikling av egenskaper som ligner på inflammatorisk tarmsykdom48. En kombinasjon av DSS-behandling med den kreftfremkallende forbindelsen azoksymetan (AOM) kan resultere i utvikling av kolittassosiert kreft48,49. Iskemi reperfusjonsindusert skade er en annen metode som brukes til å studere det regenerative potensialet i tarmepitelet. Denne teknikken krever erfaring og kirurgisk kunnskap50. Videre forårsaker de nevnte teknikkene forskjellige typer skader enn stråling og kan føre til involvering av forskjellige regenereringsmekanismer. I tillegg er disse modellene tidkrevende, mens strålingsteknikken er ganske kort. Nylig har in vitro-metoder som benytter enteroider og kolonoider generert fra tarm og tykktarm blitt brukt i kombinasjon med strålingsskade for å studere mekanismene for intestinal regenerering51,52. Disse teknikkene rekapitulerer imidlertid ikke fullt ut orgelet de modellerer53,54.

Protokollen som presenteres inkluderer beskrivelsen av en murinmodell for gammastrålingsskade i kombinasjon med en genetisk modell som etter tamoksifenbehandling tillater sporing av linjer som stammer fra reservestamcellepopulasjonen (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Denne modellen benytter en 12 Gy helkroppsbestråling, som induserer betydelig nok tarmskade til å aktivere reservestamceller, samtidig som den tillater den påfølgende undersøkelsen av intestinal regenerativ evne innen 7 dager etter skade55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle musene ble plassert i Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) ved Stony Brook University. Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkjente alle studier og prosedyrer som involverte dyreforsøk. Eksperimenter som involverte dyr ble utført strengt i samsvar med den godkjente dyrehåndteringsprotokollen (IACUC #245094).

MERK: Musestammer B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) og B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) ble kommersielt innhentet (se materialfortegnelse) og krysset for å oppnå Bmi1-Cre ER; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) mus, som beskrevet tidligere56,57,58.

1. Bolig av Bmi1-Cre ER; Rosa26 eYFP-mus

  1. Hold musene i et dyreanlegg ved en temperatur fra 68-72 ° F og fuktighet fra 30-70%, i en 12 h / 12 h lys / mørk syklus, med vann og normal chow ad libitum.
  2. Før forsøkene, bekreft musens genotyper ved hjelp av en standard PCR-genotypingsteknikk57,58.

2. Forberedelse av dyr og materialer

  1. Overfør mus til det eksperimentelle boligrommet minst 7 dager før eksperimentering for å la musene akklimatisere seg.
  2. Match eksperimentelle og kontrolldyr etter kjønn og alder.
  3. Utsette kontrolldyrene for tamoksifenindusert Cre-mediert rekombinasjon, men ikke for bestråling (narrebehandling, 0 Gy), samtidig som forsøksdyrene får tamoksifeninjeksjonen og utsettes for gammabestråling.
  4. Forbered tamoxifen-oppløsningen. Suspender tamoksifenpulver i steril maisolje i en konsentrasjon på 30 mg / ml. Sonikere i 3 minutter i sykluser på 30 s ON og 30 s OFF med 60% amplitude og roter deretter i mørket i 1 time ved romtemperatur (RT). Tamoxifenoppløsning kan fryses ved -20 °C, men ikke frys/tine den mer enn én gang. Forbered helst en ny løsning hver gang og ikke lagre den.
    MERK: Tamoxifen er lysfølsom. Pakk den inn med tinnfolie under rotasjon av romtemperatur.
    FORSIKTIG: Tamoxifen er et potensielt farlig stoff: Helsefare (GHS08) og miljøfare (GHS09).
  5. Forbered 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) stamløsning. Resuspender EdU-pulver i 1/5 av det totale volumet av sterilt dimetylsulfoksid (DMSO) og tilsett sakte de resterende 4/5 av det totale volumet av sterilt ultrarent vann. Når den er helt oppløst, alikot og oppbevares ved -20 °C.
    FORSIKTIG: 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) og dimetylsulfoksid (DMSO) er potensielt farlige stoffer: Helsefare (H340 og H631, og H227, H315 og H319, henholdsvis). EdU kan forårsake genetiske defekter og mistenkes for å skade fruktbarheten eller ufødte barn, og DMSO kan forårsake hud- og øyeirritasjon.
  6. Forbered reagenser for vevsinnsamling og fiksering: fortynnet etanol for å fremstille en 70% vannløsning, avkjøl DPBS til 4 ° C, og fremstill modifisert Bouins fiksative buffer (50% etanol og 5% eddiksyre i destillert H2O) og 10% bufret formalin.
    FORSIKTIG: Etylalkohol er et potensielt farlig stoff: Helsefare (H225-H319), brannfarlig (GHS02), og forårsaker akutt toksisitet (GHS07). Eddiksyre er et potensielt farlig stoff: Helsefare (H226-H314), brannfarlig (GHS02) og etsende (GHS05). Formalin er et potensielt farlig stoff: Helsefare (H350, H315, H317, H318, H370) og etsende. Formalin kan forårsake kreft, hud- og øyeirritasjon, skade på organer og allergiske hudreaksjoner.
  7. Forbered utstyret som er nødvendig for eutanasi i henhold til en godkjent metode (for eksempel CO2 -kammer), et musdisseksjonssett (saks, tang), petriskåler, en 16 G gavage nål festet til en 10 ml sprøyte for å skylle tarmene, og histologiske kassetter.

3. Gammabestråling (TBI) og vevsoppsamling

  1. To dager før gammabestrålingseksponering injiseres forsøksdyrene med en enkeltdose tamoksifen for å indusere Cre-mediert rekombinasjon og BMI1/EYFP+ cellelinagesporing. Vei hvert dyr og beregne en dose på 40 mg / kg kroppsvekt av tamoxifen resuspendert i maisolje. Desinfiser mageområdet med 70% etanol og administrer tamoksifen intraperitonealt ved hjelp av en 27G nål festet til en 1 ml sprøyte.
  2. Observer dyr i de følgende 48 timene for å utelukke potensiell tamoksifentoksisitet.
  3. Overfør musene til bestrålingsrommet som spesifisert av den lokale institusjonen.
  4. Beregn bestrålingseksponeringstiden utgitt av 137Cs-kilden i henhold til gjeldende eksactordosehastighet. For eksempel, hvis den nåværende dosehastigheten er lik 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), beregnes eksponeringstiden i minutter som ønsket dose/0,759. For å bestråle dyrene til en dose på 12 Gy TBI, er eksponeringstiden ~15,81 min (15 min og 48 s).
  5. Desinfiser prøvekammeret i gamma bestråleren med 70% etanoloppløsning; Plasser den absorberende matten og dyrene inne i prøvekammeret.
    MERK: Sham-behandlede dyr skal plasseres i bestrålingsrommet, men ikke utsettes for gammabestråling.
  6. Plasser lokket og lukk kammeret.
  7. Programmer gammabestråleren til å eksponere dyr for 12 Gy TBI.
    1. Slå på maskinen ved å vri nøkkelen i START-posisjon.
    2. Skriv inn operatørnummeret ved hjelp av et numerisk tastatur og bekreft ved å trykke ENTER.
    3. Skriv inn PIN-koden ved hjelp av et numerisk tastatur og bekreft ved å trykke ENTER.
    4. Trykk 1 for alternativer.
    5. Trykk 1 for timerinnstillinger.
    6. Trykk 1 for bestrålingstid.
    7. Angi tidtakerinnstillingen for neste syklus ved hjelp av et numerisk tastatur (hh:mm:ss-format) og bekreft ved å trykke ENTER.
    8. Bekreft innstillingene en gang til ved å trykke ENTER.
    9. Gå tilbake til startmenyen ved å trykke på CLEAR 2x.
    10. Trykk på START for å starte eksponeringen.
  8. La rommet stå for tidspunktet for aktiv eksponering. Maskinen stopper automatisk etter at den forhåndsinnstilte tiden har gått og begynner å pipe.
    FORSIKTIG: Cesium-137 (137Cs) er et dødelig farlig stoff (helsefare: H314). Ekstern eksponering for store mengder 137Cs kan forårsake brannskader, akutt strålingssykdom og til og med død.
  9. Slå av maskinen ved å vri nøkkelen i STOPP-posisjon.
  10. Åpne prøvekammeret, ta av lokket, overfør dyrene tilbake til buret og desinfiser prøvekammeret med 70% etanolløsning.
  11. Overfør dyrene tilbake til det konvensjonelle boligrommet og observer tilstanden etter behandling.
  12. Overvåk dyrenes vekt hver dag og avlive dem umiddelbart (til tross for det planlagte tidspunktet) hvis det observeres symptomer på endret velvære, nød eller vekttap som overstiger 15% av startvekten.
  13. Tre timer før planlagt eutanasi desinfiseres bukområdet og bruk en 28G insulinsprøyte til å injisere musene med 100 mikrol EdU stamløsning (administrert intraperitonealt).
  14. Samle proksimale tarmer ved 0 timer, 3 timer, 6 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 168 timer etter bestråling.
    1. Utføre CO2 -eutanasi i henhold til hjemmeinstitusjonens standarder.
      FORSIKTIG: Karbondioksid er et farlig stoff (H280). Inneholder gass under trykk; kan eksplodere ved oppvarming. Kan fortrenge oksygen og forårsake rask kvelning.
    2. Dissekere deretter den proksimale delen av tynntarmen, fjern festet vev, skyll med kald DPBS ved hjelp av en 16 G rett fôringsnål festet til en 10 ml sprøyte, fest med modifisert Bouins fikserende buffer ved hjelp av en 16 G rett fôringsnål festet til en 10 ml sprøyte, kutt åpen i lengderetningen, og rull de proksimale tarmene ved hjelp av sveitsisk rulleteknikk som beskrevet tidligere59.
  15. Plasser vevet i en histologisk kassett og la det stå i 24-48 timer ved romtemperatur i en beholder med 10% bufret formalin. Formalinvolumet skal være tilstrekkelig til å dekke de histologiske kassettene fullt ut. Når inkubasjonstiden går, overfører du de histologiske kassettene til beholderen fylt med 70% etanol ved hjelp av tang. Fortsett deretter med vevsparafininnbygging.
    MERK: Vevsparafininnstøping ble utført av Research Histology Core Laboratory ved Stony Brook University. Prosedyren kan stoppes her, og parafinblokker kan lagres ved romtemperatur.
    FORSIKTIG: Formalin er et potensielt farlig stoff: Helsefare (H350, H315, H317, H318, H370) og etsende. Formalin kan forårsake kreft, hud- og øyeirritasjon, skade på organer og allergiske hudreaksjoner.

4. Histologisk analyse

  1. Kjøl ned de histologiske kassettene som inneholder de parafin-innebygde vevsprøvene ved å plassere dem på is i minst 1 time. Bruk en mikrotom, klargjør 5 μm tykke seksjoner for farging. Hvert vev skal skives horisontalt for å dekke hele valset prøve.
    1. Etter å ha kuttet parafinblokken, overfør vevsseksjonene til et vannbad oppvarmet til 45 °C og legg seksjonene på ladede sklier. La lysbildene stå på et stativ over natten ved romtemperatur for å tørke.
      MERK: Prosedyren kan stoppes her, og lysbildene kan lagres i romtemperatur.
  2. Legg skliene i en glideholder og stek i 65 °C ovn over natten. Lysbildene kan bakes i kortere tid, 1-2 timer. Dette er imidlertid ikke tilrådelig når det gjelder ferske (mindre enn 1 måned gamle) kuttede lysbilder.
    MERK: Plasser det manuelle lysbildefargingssettet under den kjemiske hetten og utfør inkubasjonene med xylen, etanol og hematoksylin under den kjemiske hetten.
  3. Neste dag kjøler du ned lysbildene ved å plassere dem i en skyveholder under kjemikaliehetten i 10 minutter.
  4. Deparaffiniser vevet ved å plassere glideholderen i en beholder fylt med 100% xylen i 3 minutter. Gjenta inkubasjon med fersk 100% xylen.
    NOTAT: Fra det øyeblikket, sørg for at prøvene holdes våte til enhver tid.
    FORSIKTIG: Xylen er et potensielt farlig stoff: brannfarlig (GHS02), forårsaker akutt toksisitet (GHS07) og en helsefare (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). De potensielle farlige effektene er at det er dødelig ved svelging eller kommer inn i luftveiene og kan forårsake hud-, øye- og luftveisirritasjon. I tillegg kan det påvirke motoriske funksjoner ved å forårsake døsighet eller svimmelhet og forårsake organskade ved langvarig eller gjentatt eksponering.
  5. Rehydrer seksjoner i en etanolgradient ved å plassere glideholderen sekvensielt i beholdere fylt med følgende løsninger: 100% etanol, 2 min; 95% etanol, 2 min; 70% etanol, 2 min.
  6. Overfør glideholderen til beholderen fylt med destillert vann og skyll i rennende destillert vann i 2 minutter.
  7. Plasser glideholderen i en beholder fylt med hematoksylinoppløsning, og flekk i 5 minutter (under kjemisk hette).
  8. Overfør glideholderen til beholderen fylt med vann fra springen og skyll i rennende vann fra springen til hematoksylinfargingen blir blåaktig, vanligvis etter 2 minutter.
  9. Overfør glideholderen til beholderen fylt med 5 % (w/v) litiumkarbonatoppløsning. Dypp 10x.
    FORSIKTIG: Litiumkarbonat er et potensielt farlig stoff: forårsaker akutt toksisitet (GHS07), og en helsefare (H302 - H319). Det er skadelig ved svelging, skadelig i kontakt med huden, og forårsaker alvorlig øyeirritasjon.
  10. Overfør glideholderen til beholderen fylt med destillert vann og skyll i rennende destillert vann i 2 minutter.
  11. Plasser glideholderen i en beholder fylt med eosin og beis i 5 minutter.
  12. Overfør glideholderen til beholderen fylt med 70% etanol og skyll kort (10 s).
  13. Dehydrer seksjonene ved å plassere glideholderen sekvensielt i beholderne fylt med etanolgradientløsninger: 95% etanol, 5 dips; 100% etanol, 5 dips.
  14. Fjern lysbildene ved å plassere glideholderen i beholderen fylt med 100% xylen i 3 minutter. Gjenta inkubasjon med fersk 100% xylen.
  15. Ta lysbildet ut av stativet, tørk området rundt vevet ved hjelp av et papirhåndkle, og avhengig av størrelsen på prøven, legg til en dråpe eller to xylenbasert monteringsmedium på overflaten av prøven. Monter ved forsiktig å plassere en dekselslip på toppen av glassglasset (vær forsiktig så du ikke etterlater luftbobler). Trykk forsiktig om nødvendig. Hele overflaten av glasset skal dekkes og forsegles.
  16. Tørk lysbildene ved å la dem ligge under kjemikaliehetten over natten. Vanligvis stivner monteringsmediet på mindre enn 24 timer. For å sikre at lysbildene er tørre, kan det lages et prøvelysbilde. Bruk et tomt lysbilde, plasser en dråpe av monteringsmediet og la det ligge under kjemikaliehetten over natten. Neste dag, trykk på dråpen og sjekk om den er størknet.
  17. Når lysbildene tørker ut, analyser histologien til vevet ved hjelp av et lysmikroskop eller et mer avansert mikroskop med en lys feltkanal.
    1. Plasser et mikroskoplysbilde på scenen, flytt til prøven er i midten av synsfeltet, juster fokus ved hjelp av fokusknappen, og bruk en 10x og / eller 20x forstørrelse objektivlinse for å analysere histologien i forhold til kontrollvev (sham bestrålt).
    2. Hvis mikroskopet er utstyrt med et kamera, ta bilder også.
      MERK: Prosedyren kan stoppes her; Lysbildene kan lagres ved romtemperatur og analyseres senere. Ikke hold lysbildene lenger enn 30 dager, da flekkene sakte tones bort.

5. Farging av immunfluorescens

  1. Kjøl ned de histologiske kassettene som inneholder parafin-innebygde vevsprøver ved å plassere dem på is i minst 1 time. Bruk en mikrotom, klargjør 5 μm tykke seksjoner for farging. Hvert vev skal skives horisontalt for å dekke hele valset prøve.
    1. Etter å ha kuttet parafinblokken, overfør vevsseksjonene til et vannbad oppvarmet til 45 °C og legg seksjonene på ladede sklier. La lysbildene stå på et stativ over natten ved romtemperatur for å tørke.
      MERK: Prosedyren kan stoppes her, og lysbildene kan lagres i romtemperatur.
  2. Legg skliene i en glideholder og stek i 65 °C ovn over natten. Lysbildene kan bakes i kortere tid, 1-2 timer. Dette er imidlertid ikke tilrådelig når det gjelder ferske (mindre enn 1 måned siden) kuttede lysbilder.
    MERK: Plasser det manuelle lysbildefargingssettet under den kjemiske hetten og utfør inkubasjonene med xylen, etanol og H2 O2 / metanol under den kjemiske hetten.
  3. Neste dag kjøler du ned lysbildene ved å plassere dem i en skyveholder under kjemikaliehetten i 10 minutter.
  4. Deparaffiniser vevet ved å plassere glideholderen i en beholder fylt med 100% xylen i 3 minutter. Gjenta inkubasjon med fersk 100% xylen.
    NOTAT: Fra det øyeblikket, sørg for at prøvene holdes våte til enhver tid.
  5. Slukk endogen peroksidase ved å inkubere lysbildene i 30 minutter i en beholder fylt med 2% hydrogenperoksidoppløsning i metanol under kjemisk hette.
    FORSIKTIG: Metylalkohol er et potensielt farlig stoff: Helsefare (H225-H301, H311, H331-H370), brannfarlig (GHS02), og forårsaker akutt toksisitet (oral, dermal, innånding) (GHS08). Hydrogenperoksid er et potensielt farlig stoff: etsende (GHS05) og forårsaker akutt toksisitet (GHS07).
  6. Rehydrer seksjonene i en etanolgradient ved å plassere glideholderen sekvensielt i beholdere fylt med følgende løsninger: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 70% etanol, 3 min.
  7. Overfør glideholderen til en beholder fylt med destillert vann og skyll i rennende destillert vann i 2 minutter.
  8. For å hente antigenene, overfør glideholderen til en beholder med 250 ml citratbufferløsning (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) og kok ved 110 ° C i 10 minutter ved hjelp av et decloaking kammer.
  9. Overfør hele beholderen til kjølerommet og la den gradvis kjøle seg ned i løpet av 30 minutter.
  10. Etter 30 minutter, erstatt citratbufferløsningen med destillert vann og skyll i rennende destillert vann til alle flytende parafinbiter er fjernet.
  11. Ta lysbildene ut av holderen (en om gangen), trykk på et papirhåndkle og tørk området rundt prøven forsiktig med et papirhåndkle. Tegn en lukket form rundt prøven ved hjelp av en penn som gir en hydrofob barriere (PAP-penn). Plasser i et fuktet kammer.
  12. Blokker med 5% bovint serumalbumin (BSA) i TBS-Tween ved å tilsette 200 μL av løsningen på overflaten av en prøve. Forsikre deg om at det ikke er lekkasje. Inkuber ved 37 °C i et fuktet kammer i 30 minutter.
  13. Fjern blokkeringsløsningen ved å trykke på glasslysbildet på et papirhåndkle. Plasser tilbake i et fuktet kammer. Tilsett 100 μL av den passende konsentrasjonen av de primære antistoffene resuspendert i en blokkerende buffer og inkuber ved 4 °C med forsiktig gynging over natten. For BMI1 / EYFP, bruk kylling anti-GFP (fortynning 1:500); for Ki-67, bruk kanin anti-Ki-67 (fortynning 1:200).
  14. Fjern antistoffoppløsningen ved å trykke på glassglasset på et papirhåndkle; plasser lysbildene i en glideholder og overfør til beholderen fylt med TBS-Tween. Vask lysbildene med risting i 5 min. Gjenta 3x. Bruk hver gang en ny porsjon TBS-Tween-buffer.
  15. Ta lysbildene ut av holderen (en om gangen), fjern overflødig vaskeløsning ved å banke glassglasset på et papirhåndkle og plasser i et fuktet kammer. Tilsett 100 μL av passende konsentrasjon av sekundære antistoffer resuspendert i en blokkerende buffer, og inkuber ved 37 °C i 30 minutter. Sekundære antistoffer bør konjugeres med en fluorofor. For BMI1 / EYFP, bruk esel anti-kylling Alexa Fluor 647 (fortynning 1:500); for Ki-67, bruk geit anti-kanin Alexa Fluor 488 (fortynning 1:500).
  16. Fjern antistoffoppløsningen ved å trykke på glassglasset på et papirhåndkle; plasser lysbildene i en glideholder og overfør til beholderen fylt med TBS-Tween. Vask lysbildene med risting i 5 min. Gjenta 3x. Bruk hver gang en ny porsjon TBS-Tween-buffer.
  17. Ta lysbildene ut av holderen (en om gangen), fjern overflødig vaskeløsning ved å banke glassglasset på et papirhåndkle og plasser i et fuktet kammer. Tilsett 100 μL av EdU-fargeløsningen fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner og bruk Alexa Fluor 555 fluorofor.
  18. Fjern EdU-løsningen ved å trykke på glassglasset på et papirhåndkle; plasser lysbildene i en glideholder og overfør til beholderen fylt med TBS-Tween. Vask lysbildene med risting i 5 min. Gjenta 2x. Bruk hver gang en ny porsjon TBS-Tween-buffer.
  19. Ta lysbildene ut av holderen (en om gangen); Fjern overflødig vaskeoppløsning ved å banke glassglasset på et papirhåndkle og sett i et fuktet kammer. Utfør Hoechst 33258 motfarging ved å tilsette 100 μL av Hoechst 33258-løsningen (fortynning 1:1000 i TBS-Tween) på overflaten av prøven. Inkuber i mørket ved romtemperatur i 5 minutter.
  20. Fjern Hoechst 33258-løsningen ved å trykke på glassglasset på et papirhåndkle; plasser lysbildene i en glideholder og overfør til en beholder fylt med TBS-Tween. Vask lysbildene med risting i 5 min.
  21. Ta lysbildet ut av glideholderen, tørk området rundt vevet ved hjelp av et papirhåndkle, og avhengig av størrelsen på prøven, legg til en dråpe eller to vannbasert monteringsmedium på overflaten av prøven. Monter ved forsiktig å plassere en dekselslip på toppen av glassglasset (vær forsiktig så du ikke etterlater luftbobler). Trykk forsiktig om nødvendig. Hele overflaten av glasset skal dekkes og forsegles.
  22. Tørk lysbildene ved å la dem stå i mørket ved romtemperatur over natten. Vanligvis stivner monteringsmediet på mindre enn 24 timer. For å sikre at lysbildene er tørre, kan det lages et prøvelysbilde. Bruk et tomt lysbilde; Plasser en dråpe av monteringsmediet og la det ligge under kjemikaliehetten over natten. Neste dag, trykk på dråpen og sjekk om den er størknet.
  23. Når lysbildene tørker ut, kan farget vev analyseres ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med utslippsbølgelengdefiltre som tillater visualisering av Ki-67, EdU og BMI1 / EYFP-farging (henholdsvis 535 nm, 646 nm og 700 nm).
  24. Plasser et lysbilde med mikroskop på scenen, beveg deg til prøven er i midten av synsfeltet, juster fokuset ved hjelp av fokusknappen, og bruk objektivlinsen på 10x og/eller 20x forstørrelse til å analysere fargingen i forhold til kontrollvev (bestrålt svindel). Hvis mikroskopet er utstyrt med et kamera, kan bilder også tas. Ta bilder for hver kanal separat og slå sammen senere.
    MERK: Prosedyren kan stoppes her; lysbildene kan lagres ved 4 °C og analyseres senere. Ikke hold lysbildene lenger enn 14 dager, da flekkene sakte tones bort.

6. TUNEL farging

  1. Kjøl ned de histologiske kassettene som inneholder parafin-innebygde vevsprøver ved å plassere dem på is i minst 1 time. Bruk en mikrotom, klargjør 5 μm tykke seksjoner for farging. Hvert vev skal skives horisontalt for å dekke hele valset prøve.
    1. Etter å ha kuttet parafinblokken, overfør vevsseksjonene til et vannbad oppvarmet til 45 °C og legg seksjonene på ladede sklier. La lysbildene stå på et stativ over natten ved romtemperatur for å tørke.
      MERK: Prosedyren kan stoppes her, og lysbildene kan lagres i romtemperatur.
  2. Legg skliene i en glideholder og stek i 65 °C ovn over natten.
    NOTAT: Lysbildene kan bakes i kortere tid, 1-2 timer. Det er imidlertid ikke tilrådelig når det gjelder ferske (mindre enn 1 måned siden) kuttede lysbilder. Plasser det manuelle skyvefargingssettet under kjemikaliehetten og utfør inkubasjonene med xylen og etanol under kjemikaliehetten.
  3. Neste dag kjøler du ned lysbildene ved å plassere dem i en skyveholder under kjemikaliehetten i 10 minutter.
  4. Deparaffiniser vevet ved å plassere lysbildeholderen i en beholder fylt med 100% xylen i 3 minutter. Gjenta inkubasjon med fersk 100% xylen.
    MERK: Fra dette punktet, sørg for at prøvene holdes våte til enhver tid.
  5. Rehydrer seksjonene i en etanolgradient ved å plassere lysbildeholderen sekvensielt i beholdere fylt med følgende løsninger: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 90% etanol, 3 min; 80% etanol, 3 min; 70% etanol, 3 min.
  6. Overfør glideholderen til en beholder fylt med destillert vann og skyll i rennende destillert vann i 1 min.
  7. Ta lysbildene ut av holderen (en om gangen), trykk på et papirhåndkle og tørk området rundt prøven forsiktig med et papirhåndkle. Tegn en lukket form rundt prøven ved hjelp av en penn som gir en hydrofob barriere (PAP-penn). Plasser i et fuktet kammer.
  8. Inkuber med DNase-fri proteinase K. Tilsett 100 μL av den DNase-frie proteinase K-løsningen (fortynning 1:25 i DPBS) på overflaten av prøven innenfor den hydrofobe barrieren. Inkuber ved romtemperatur i et fuktet kammer i 15 minutter.
    FORSIKTIG: Proteinase K er et potensielt farlig stoff: Helsefare (H315 - H319 - H334).
  9. Fjern proteinase K-løsningen ved å trykke på glassglasset på et papirhåndkle; plasser lysbildene i en glideholder og overfør til beholderen fylt med DPBS. Vask lysbildene med risting i 5 min. Gjenta 2x. Bruk hver gang en ny porsjon DPBS.
  10. Forbered TUNEL reaksjonsblandingen: Bland etikettløsning (1x) med enzymoppløsning (10x). Pipette godt.
  11. Ta lysbildene ut av holderen (en om gangen); Fjern overflødig vaskeoppløsning ved å banke glassglasset på et papirhåndkle og sett i et fuktet kammer. Tilsett 50 mikrol TUNEL reaksjonsblanding på overflaten av prøven og inkuber i mørket ved 37 °C i et fuktet kammer i 60 minutter. For en negativ kontroll, bruk bare etikettløsning (uten TdT).
  12. Fjern TUNEL-løsningen ved å banke glasslysbildet på et papirhåndkle; plasser lysbildene i en glideholder og overfør til en beholder fylt med DPBS. Vask lysbildene med risting i 5 min. Gjenta 2x. Bruk hver gang en ny porsjon DPBS.
  13. Ta lysbildene ut av holderen (en om gangen); Fjern overflødig vaskeoppløsning ved å banke glassglasset på et papirhåndkle og sett i et fuktet kammer. Utfør Hoechst 33258 motfarging ved å tilsette 100 μL av Hoechst 33258-løsningen (fortynning 1:1000 i TBS-Tween) på overflaten av prøven. Inkuber i mørket ved romtemperatur i 5 minutter.
  14. Fjern Hoechst 33258-løsningen ved å trykke på glasslysbildet på et papirhåndkle; plasser lysbildene i en glideholder og overfør til beholderen fylt med DPBS. Vask lysbildene med risting i 5 min.
  15. Ta lysbildet ut av glideholderen; Tørk området rundt vevet ved hjelp av et papirhåndkle, og avhengig av størrelsen på prøven, tilsett en dråpe eller to vannbasert monteringsmedium på overflaten av prøven. Monter ved forsiktig å plassere en dekselslip på toppen av glassglasset (vær forsiktig så du ikke etterlater luftbobler). Trykk forsiktig om nødvendig. Hele overflaten av glasset skal dekkes og forsegles.
  16. Tørk lysbildene ved å la dem stå i mørket ved romtemperatur over natten. Vanligvis stivner monteringsmediet på mindre enn 24 timer. For å sikre at lysbildene er tørre, kan det lages et prøvelysbilde. Plasser en dråpe av monteringsmediet og la stå i mørket ved romtemperatur over natten. Neste dag, trykk på dråpen og sjekk om den er størknet.
  17. Når lysbildene tørker ut, kan farget vev analyseres ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med emisjonsbølgelengdefiltre som tillater visualisering av TUNEL-farging (535 nm).
  18. Plasser et lysbilde i mikroskop på scenen, beveg deg til prøven er i midten av synsfeltet, juster fokus ved hjelp av fokusknappen, og bruk en objektivlinse med 10x og/eller 20x forstørrelse for å analysere fargingen i forhold til kontrollvev (bestrålt svindel). Hvis mikroskopet er utstyrt med et kamera, kan bilder også tas. Ta bilder for hver kanal separat og slå sammen senere.
    MERK: Prosedyren kan stoppes her; Lysbilder kan lagres ved 4 °C og analyseres senere. Ikke hold lysbildene lenger enn 14 dager, da flekkene sakte tones bort.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruk av 12 Gy helkroppsbestråling (TBI) i kombinasjon med genetisk avstamningssporing muliggjør en grundig analyse av konsekvenser av stråleskade i tarmen. For å starte, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus mottok en enkelt tamoxifen-injeksjon, som induserer forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) -uttrykk i en Bmi1 + reserve stamcellepopulasjon. To dager etter tamoxifen-injeksjonen gjennomgikk musene bestråling eller skambestråling. Tre timer før avlivning ble musene injisert med EdU. Etter eutanasi ble det tatt tynntarmsprøver for analyse ved 0 timer, 3 timer, 6 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 7 dager etter bestråling. Representative hematoksylin- og eosinbilder (H&E) (figur 1) fra nevnte tidsforløp illustrerer tarmepitelresponsen på skade. Tidspunktet 0 t er illustrerende for homeostatisk tarmepitel (figur 1); Dette etterfølges av den apoptotiske fasen - karakterisert ved tap av celler i kryptrom mellom 3 timer og 48 timer (figur 1). Deretter følger den regenerative fasen, hvor man kan finne svært proliferative celler som fyller kryptene mellom 72 timer og 96 timer (figur 1). Til slutt fører dette til normaliseringsfasen, her representert ved 7-dagerstidspunktet (figur 1).

Figur 2 illustrerer endringer i proliferativ status for tarmkryptceller vurdert ved immunfluorescerende farging av EdU (markør for celler i S-fase) og Ki-67 (markør for celler i G1-, S- og G2/M-faser), mens avstamningssporing (EYFP+-celler) markerer celler som stammer fra Bmi1+ reservestamceller. Under homeostase (figur 2, 0 h humbug) er de Bmi1+-positive cellene merket ved ekspresjon av EYFP begrenset til +4-+6-posisjonen i krypter. Under den apoptotiske fasen (24 timer og 48 timer) reduseres EYFP-positive celler i antall (figur 2). Den regenerative fasen (72 timer og 96 timer) kjennetegnes av raskt prolifererende Bmi1+-positive celler og deres forfedre (figur 2); 7 dager etter bestrålingen har videre spredning og migrasjon fylt opp tarmkryptcellene og gjenopprettet integriteten til tarmepitelet (figur 2).

Hos humbugbestrålte mus (kontroll) flekker EdU og Ki-67 EYFP-negative proliferative celler i tarmkryptene, typisk for normal intestinal homeostase, som strekker seg fra aktive stamceller gjennom transittforsterkende sone (figur 2). Stråleskader fører til tap av svært proliferative celler i apoptotisk fase, noe reduksjonen av EdU- og Ki-67-farging viser (figur 2). Aktiveringen av reservestamceller (i dette eksemplet merket EYFP merket Bmi1 + positive celler) og deres spredning resulterer i en økning i EdU og Ki-67 positive celler tydelig synlige ved 72 timer og 96 timer etter skade, hvor krypter består nesten utelukkende av celler farget med EYFP, EdU og Ki-67. De observerte nivåene av spredning normaliseres 7 dager etter skade (figur 2).

For å illustrere apoptose forårsaket av stråleskader er det utført TUNEL-farging, og representative bilder er inkludert i figur 3. Ved homeostase (figur 3) er det få celler som gjennomgår apoptose, typisk for normalt rask intestinal epitelomsetning. En klar økning i TUNEL-farging kan observeres sent i den apoptotiske fasen (24 timer og 48 timer) etter bestråling (figur 3). Under den regenerative fasen reduseres TUNEL-fargingen jevnt og trutt i de regenererende kryptene og er igjen nesten fraværende når kryptene har normalisert seg (figur 3). Den presenterte protokollen beskriver en enkel og tilnærmet immunfluorescerende fargemetode ved hjelp av en enkel og mye brukt kombinasjon av merkingsteknikker (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP) som er i stand til å gi innsikt i oppførselen til tarmceller etter skade (her bestråling). Denne tilnærmingen kan brukes til å studere mekanismene som regulerer regenerative prosesser i tarmepitelet under spesifikke omstendigheter. Bruk av denne og lignende tilnærminger vil belyse alternative regenerative prosesser etter forskjellige intestinale fornærmelser og videre tillate undersøkelse av terapeutiske strategier for å forhindre tap av barrierefunksjon.

Figure 1
Figur 1 Representative bilder av hematoksylin og eosin (H&E)-fargede snitt av tynntarmsvev etter et tidsforløp etter helkroppsbestråling. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus fikk én dose tamoksifen 2 dager før 12 Gy helkroppsbestråling eller narrebestråling. Mus ble ofret, og tynntarmsvev ble samlet på tidspunkter angitt i figuren. Alle bildene ble tatt med 10x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Representative bilder av immunfluorescerende farging av tynntarmssnitt etter bestråling. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus fikk én dose tamoksifen 2 dager før 12 Gy helkroppsbestråling eller narrebestråling. Mus ble ofret, og tynntarmsvev ble samlet på tidspunkter angitt i figuren. Vevssnitt ble farget med EdU for å markere celler i S-fase (rosa) og med Ki-67 for å markere celler i G0-, S- og G2/M-faser (gul). EYFP (grønn) markerer Bmi1+-celler og deres forfedre og demonstrerer avstamningssporing. Seksjonene ble videre motfarget med DAPI (blå) for å visualisere kjerner. Dataene vises som sammenslåtte bilder ved 10x forstørrelse og innsatser av individuelle flekker ved 20x forstørrelse (disse stammer fra 10x bilder). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Representative bilder av immunfluorescerende TUNEL-farging av tynntarmssnitt ved bestråling. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus fikk én dose tamoksifen 2 dager før 12 Gy helkroppsbestråling eller narrebestråling. Mus ble ofret, og tynntarmsvev ble samlet på tidspunkter angitt i figuren. TUNEL (rød) flekker apoptotiske celler. Disse bildene ble kontrafarget med DAPI (blå) for å visualisere kjerner. Bildene som vises er tatt med 20x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en robust og reproduserbar stråleskademodell. Det muliggjør presis analyse av endringene i tarmepitelet i løpet av 7 dager etter skaden. Det er viktig at de valgte tidspunktene gjenspeiler viktige stadier av skade og er preget av tydelige endringer i tarmen (skade-, apoptose-, regenererings- og normaliseringsfaser)60. Denne bestrålingsmodellen er etablert og nøye vurdert, og demonstrerer en egnet manifestasjon av skade for å etterligne den som oppleves av pasienter som gjennomgår strålebehandling61. Mer enn halvparten av pasientene med kolorektal kreft og gynekologisk kreft gjennomgår abdominal strålebehandling 40,62,63. Til tross for avanserte metoder for å målrette strålebehandling, opplever pasienter bestråling av friskt tarmvev, noe som gir patofysiologi som ligner den som er observert med totalkroppsbestrålingsmodellen presentert her. Derfor kan strålingsmodellen beskrevet her potensielt adressere konsekvensene av utilsiktet strålingseksponering av pasienter og / eller medisinsk personell, og er derfor avgjørende for menneskers helse.

Bmi1-CreER; Rosa26eYFP musmodell bærer tamoxifen-induserbar Cre under transkripsjonskontroll av musen Bmi1 (Bmi1 polycomb ringfinger onkogen) promotor. I tillegg bærer disse musene en R26-stop-EYFP-sekvens, hvor STOP-kodonet er flankert av loksP-sider etterfulgt av Enhanced Yellow Fluorescent Protein-genet (EYFP) satt inn i Gt(ROSA)26Sor-lokuset. Ekspresjonen av EYFP blokkeres av en oppstrøms loksP-flankert STOP-sekvens, men kan aktiveres ved tamoxifen-induserte, Cre-medierte målrettede delesjoner, noe som tillater avstamningssporing av Bmi1-uttrykkende celler, en reservestamcellespesifikk subpopulasjon av kryptceller. Strålingsprotokollen i kombinasjon med Bmi1-CreER; Rosa26eYFP musmodell har blitt brukt tidligere for å studere rollen som transkripsjonsfaktorer i regulering av tarmregenerering18,56. De representative resultatene presentert i figur 1 til figur 3 viser resultater tilsvarende de som er presentert i nyere publikasjoner18,56.

Verdt å merke seg, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus er bare en av flere transgene dyremodeller som brukes til å studere tarmregenerering. Andre murine avstamningssporingsmodeller har blitt kombinert med stråling for å demonstrere rollene til spesifikke celler og veier i den regenerative kapasiteten til tarmepitelet 18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,65,66,67 . Disse modellene er utformet for å undersøke rollen til forskjellige populasjoner av reserverte stamceller, utforske forløperne til sekretoriske og enterocyttlinjer, og studere funksjonen til spesifikke gener innenfor hver underpopulasjon av tarmepitelcellene. Kombinerte resultater fra disse undersøkelsene vil bidra til å utvide forståelsen av tarmepitelets regenerative evne.

Det er viktig at med mindre modifikasjoner, bør denne teknikken tillate undersøkelse av forholdet mellom mikrobiota og forskjellige epitel-, stromal- og immuncellepopulasjoner ved strålingsskade. Innføring av distinkte avstamningssporende dyremodeller vil tillate studier av sanntidsadferd og samspillet mellom ulike underpopulasjoner av celler etter skade. Alternativt kan farging av vev erstattes av RNA-sekvensering, enkeltcelle RNA-sekvensering, fluorescensaktivert cellesortering (FACS) eller proteomisk analyse for å skaffe mer inngående kunnskap om rollen til spesifikke cellelinjer under tarmregenerering etter skade68,69. Denne skademodellen kan brukes til å teste nye behandlingsmodaliteter som er ment å minimere bivirkningene av bestråling, forkorte restitusjonstiden og forbedre kvaliteten på pasientbehandlingen70. Selv om strålingsmodellen beskrevet her kan tjene som et nyttig verktøy for å studere regenerering av tarmepitelet, har den også flere begrensninger. Den totale stråledosen resulterer alltid i påfølgende hematopoietisk syndrom, noe som hindrer undersøkelsen av intestinal regenerering. Dette kan avverges ved benmargstransplantasjon. Videre kan endringen av en abdominal-only skadeprotokoll potensielt forbedre noen av bivirkningene av bestrålingen71. Denne modellen krever imidlertid ytterligere trinn som kan påvirke tarmresponsen på skaden (f.eks. Anestesi). For øvrig produserer abdominal stråling strålingsindusert gastrointestinalt syndrom (RIGS) uten hematopoietisk syndrom, forskjellig fra helkroppsbestråling (WBI), ved at WBI produserer lignende GI-symptomologi, men inkluderer delvis tap av hematopoietisk funksjon etter skade71,72.

Merk at genetisk konstruerte dyremodeller som de som er beskrevet i denne protokollen, er sofistikerte og tillater avstamningssporing av spesifikke celler. Imidlertid krever disse modellene, selv om de er svært fordelaktige, ekstra innsats for å opprettholde. Transgene dyremodeller som tillater betingede gendelesjoner er vanskelige å generere, og deres rettidig sletting ved skade kan ikke lett oppnås. Videre tillater de fleste transgene modeller bare en betinget sletting eller inaktivering av et gen av interesse, men er ikke induserbare og er derfor ikke i stand til å gjenopprette genfunksjonen og kan hindre studiene. Videre krever transgene dyremodeller vanligvis behandling med ytterligere kjemikalier (f.eks. tamoksifen, doksycyklin) for å oppnå inaktivering eller overekspresjon av genet av interesse. Behandlinger med disse stoffene kan til en viss grad endre responsen til tarmepitelet eller øke alvorlighetsgraden av skaden 73,74,75,76. I tillegg kan induksjon av avstamningssporing av tamoksifen innføres nærmere tidspunktet for strålingsskade for å forbedre merkingen av cellene som er involvert i regenerering (f.eks. 6-24 timer før skade). Dermed er det mulig å erstatte en transgen modell med villtypemus og en kombinasjon av IF-farging (f.eks. Ki-67, PCNA, EdU, TUNEL, Caspase 3). Denne modellen tillater analyse av tarmens regenerative kapasitet, selv om den ikke tillater studier av en bestemt underpopulasjon av cellene.

Protokollen beskrevet i dette manuskriptet har flere avgjørende trinn. Det er av største betydning å sikre at friske mus brukes til eksperimentering, da de vil bli utsatt for stråling og behandling med kjemikalier. Hvis eksperimenter med forskjellige musgrupper utføres dager, uker eller måneder fra hverandre, er det god praksis å følge samme tidslinje, for eksempel tamoxifen-injeksjoner på samme tid på dagen. Bestrålingsprosessen bør gjøres raskt, og mus bør returneres til sine opprinnelige bur med en gang. I tillegg kan det å gi myknet mat og rikelig med vann bidra til å forbedre noen av de negative effektene av stråling. Den sveitsiske rulleteknikken foreslås for å muliggjøre omfattende analyse av tarmvevet59. Denne teknikken er ikke triviell, og tidligere tryouts bør gjøres for å sikre at upåklagelig kvalitet på vevet for farging oppnås. Alle løsninger for musforsøk og farging bør tilberedes ferskt og oppbevares under passende forhold. Når du arbeider med antistoffer, er det viktig å teste lysbilder ved hjelp av positive og negative kontroller og, om mulig, bruke antistoffer med samme katalognummer og partinummer. Lysstoffslysbilder bør oppbevares ved 4 °C og avbildes innen 1 uke etter tilberedning. Langvarig lagring, selv ved -20 °C, kan føre til tap av signal. H&E-lysbilder kan lagres ved romtemperatur, da det ikke er noen bekymring for tap av fluoroforstabilitet.

Oppsummert er linjesporende strålingsskademodell presentert her en reproduserbar og relevant modell for å spore tarmcelleskjebne etter fornærmelse og kan kombineres med ulike murinmodeller og molekylære teknikker for å forbedre forståelsen av patofysiologien til tarmepitelet. Innsikt i de molekylære og cellulære mekanismene som styrer regenerering av tarmepitel kan føre til utvikling av nye behandlinger og nyttige terapeutiske intervensjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne Stony Brook Cancer Center Histology Research Core for eksperthjelp med vevsprøvepreparering og Divisjon for laboratoriedyrressurser ved Stony Brook University for hjelp med dyrepleie og håndtering. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health DK124342 tildelt Agnieszka B. Bialkowska og DK052230 til Dr. Vincent W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Tags

Biologi utgave 185
Intestinal epitelial regenerering som respons på ioniserende bestråling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb,… More

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter