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Biology

आयनीकरण विकिरण के जवाब में आंतों के उपकला पुनर्जनन

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट रेडियोथेरेप्यूटिक कैंसर उपचार पर चोट के लिए सबसे संवेदनशील अंगों में से एक है। यह एक साथ एक अंग प्रणाली है जिसमें इस तरह के अपमान के बाद उच्चतम पुनर्योजी क्षमताओं में से एक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आंतों के उपकला की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है।

Abstract

आंतों के उपकला में कोशिकाओं की एक एकल परत होती है, फिर भी इसमें कई प्रकार की टर्मिनल विभेदित कोशिकाएं होती हैं, जो आंतों के क्रिप्ट के तल पर स्थित आंतों की स्टेम कोशिकाओं के सक्रिय प्रसार से उत्पन्न होती हैं। हालांकि, तीव्र आंतों की चोट की घटनाओं के दौरान, ये सक्रिय आंतों की स्टेम कोशिकाएं कोशिका मृत्यु से गुजरती हैं। गामा विकिरण एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला कोलोरेक्टल कैंसर उपचार है, जो चिकित्सीय रूप से प्रभावोत्पादक होने के बावजूद, सक्रिय स्टेम सेल पूल को कम करने का दुष्प्रभाव है। दरअसल, सक्रिय स्टेम सेल की कमी के कारण रेडियोथेरेपी से गुजरते समय रोगियों को अक्सर गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकिरण सिंड्रोम का अनुभव होता है। आंतों के क्रिप्ट्स में सक्रिय आंतों की स्टेम कोशिकाओं का नुकसान आमतौर पर क्विसेंट रिजर्व आंतों की स्टेम कोशिकाओं के एक पूल को सक्रिय करता है और स्रावी और एंटरोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं के विघटन को प्रेरित करता है। यदि इन कोशिकाओं के लिए नहीं, तो आंतों के उपकला में रेडियोथेरेपी और ऐसे अन्य प्रमुख ऊतक अपमान से उबरने की क्षमता की कमी होगी। वंश-अनुरेखण प्रौद्योगिकियों में नई प्रगति पुनर्जनन के दौरान कोशिकाओं के सक्रियण, भेदभाव और प्रवास की ट्रैकिंग की अनुमति देती है और आंत में इसका अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित की गई है। इस अध्ययन का उद्देश्य विकिरण की चोट के बाद माउस आंतों के उपकला के भीतर कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक विधि को चित्रित करना है।

Introduction

मानव आंतों के उपकला आधे बैडमिंटन कोर्ट की सतह को कवर करेंगे यदि पूरी तरह से सपाट1 रखा जाए। इसके बजाय, मनुष्यों को उनके गले की सामग्री से अलग करने वाली इस एकल कोशिका परत को उंगली जैसे अनुमानों, विली और इंडेंटेशन, क्रिप्ट्स की एक श्रृंखला में कॉम्पैक्ट किया जाता है जो आंतों के सतह क्षेत्र को अधिकतम करते हैं। एपिथेलियम की कोशिकाएं एक क्रिप्ट-विलस अक्ष के साथ अंतर करती हैं। विलस में मुख्य रूप से पोषक तत्वों को अवशोषित करने वाले एंटरोसाइट्स, बलगम-स्रावित गोब्लेट कोशिकाएं और हार्मोन-उत्पादक एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं होती हैं, जबकि क्रिप्ट्स में मुख्य रूप से डेफेंसिन-उत्पादक पनेथ कोशिकाएं, सक्रिय और आरक्षित स्टेम कोशिकाएं और पूर्वज कोशिकाएं 2,3,4,5 होती हैं। इसके अलावा, अंतर्निहित मेसेनकाइमल डिब्बे के स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ इन कोशिकाओं का द्वि-दिशात्मक संचार होता है और लुमेन का माइक्रोबायोटा बातचीत का एक जटिल नेटवर्क उत्पन्न करता है जो आंत होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है और चोट 6,7,8 के बाद वसूली के लिए महत्वपूर्ण है।

आंतों का एपिथेलियम मानव शरीर में सबसे तेजी से स्व-नवीनीकृत ऊतक है, जिसमें 2-6 दिनों की कारोबार दर 9,10,11 है। होमियोस्टैसिस के दौरान, आंतों के क्रिप्ट्स (क्रिप्ट बेस कॉलमर कोशिकाओं) के आधार पर सक्रिय स्टेम कोशिकाएं, ल्यूसीन युक्त रिपीट-युक्त जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर 5 (एलजीआर 5) की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित होती हैं, तेजी से विभाजित होती हैं और पूर्वज कोशिकाओं को प्रदान करती हैं जो अन्य सभी आंतों के उपकला वंशों में अंतर करती हैं। हालांकि, उनकी उच्च माइटोटिक दर के कारण, सक्रिय स्टेम कोशिकाएं और उनके तत्काल पूर्वज गामा-विकिरण की चोट के प्रति विशेष रूप से संवेदनशील होते हैं और विकिरण 5,12,13,14 के बाद एपोप्टोसिस से गुजरते हैं। उनके नुकसान पर, आंतों के क्रिप्ट के भीतर आरक्षित स्टेम सेल और गैर-स्टेम सेल (पूर्वजों और कुछ टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं की उप-जनसंख्या) सक्रियण से गुजरते हैं और बेसल क्रिप्ट कम्पार्टमेंट को फिर से भरते हैं, जो तब विली की सेल आबादी का पुनर्गठन कर सकते हैं और इस प्रकार, आंतों के उपकला15 को पुनर्जीवित कर सकते हैं। वंश अनुरेखण तकनीकों का उपयोग करते हुए, कई शोध समूहों ने प्रदर्शित किया है कि आरक्षित (क्विसेंट) स्टेम कोशिकाएं सक्रिय स्टेम कोशिकाओं 13,16,17,18,19,20,21,22 के नुकसान पर पुनर्जनन का समर्थन करने में सक्षम हैं। इन कोशिकाओं को पॉलीकॉम्ब कॉम्प्लेक्स प्रोटीन 1 ऑन्कोजीन (बीएमआई 1), माउस टेलोमेरेज़ रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस जीन (एमटीआरटी), हॉप होमोबॉक्स (हॉपक्स), और ल्यूसीन युक्त रिपीट प्रोटीन 1 जीन (एलआरआईजी 1) की उपस्थिति की विशेषता है। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि गैर-स्टेम कोशिकाएं चोट 23,24,25,26,27,28,29,30,31 पर आंतों के क्रिप्ट को फिर से भरने में सक्षम हैं। विशेष रूप से, यह दिखाया गया है कि स्रावी कोशिकाओं और एंटरोसाइट्स के पूर्वज चोट लगने पर डिडिफरेंटेशन से गुजरते हैं, स्टेम जैसी कोशिकाओं में वापस आ जाते हैं, और आंतों के उपकला के उत्थान का समर्थन करते हैं। हाल के अध्ययनों ने कई मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की पहचान की है जो चोट पर स्टेम जैसी विशेषताओं को प्राप्त करने की क्षमता रखते हैं (जैसे डीएलएल +, एटीओएच 1 +, प्रोएक्स 1 +, एमआईएसटी 1 +, डीसीएलके 1 +) 3 2,33,34,35,36। आश्चर्यजनक रूप से, यू एट अल ने दिखाया कि यहां तक कि परिपक्व पनेथ कोशिकाएं (एलवाईजेड +) आंतों के पुनर्जनन में योगदान कर सकतीहैं। इसके अलावा, आंतों के उपकला कोशिकाओं के एपोप्टोसिस और उपकला बाधा समारोह को बाधित करने के अलावा, विकिरण के परिणामस्वरूप आंत वनस्पतियों का डिस्बिओसिस, प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण और एक प्रो-भड़काऊ प्रतिक्रिया की शुरुआत, और मेसेनकाइमल और स्ट्रोमल कोशिकाओं की सक्रियता38,39 होती है।

गामा विकिरण कैंसर के उपचार में एक मूल्यवान चिकित्सीय उपकरण है, खासकर कोलोरेक्टल ट्यूमर40 के लिए। हालांकि, विकिरण कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाकर आंतों के होमियोस्टैसिस को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है, जिससे एपोप्टोसिस होता है। विकिरण जोखिम कई गड़बड़ियों का कारण बनता है जो रोगी की वसूली को धीमा कर देता है और तीव्र चरण में म्यूकोसल चोट और सूजन और दस्त, असंयम, रक्तस्राव और पेट दर्द द्वारा चिह्नित होता है। अभिव्यक्तियों के इस पैनोपली को गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकिरण विषाक्तता के रूप में जाना जाता है। इसके अतिरिक्त, ट्रांसम्यूरल फाइब्रोसिस और / या संवहनी स्क्लेरोसिस की विकिरण-प्रेरित प्रगति केवल उपचार38,41 के बाद ही प्रकट हो सकती है। चोट के साथ-साथ, विकिरण आंतों की कोशिकाओं में एक मरम्मत प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है जो पुनर्जनन शुरू करने और व्यवस्थित करने के लिए जिम्मेदार सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करताहै। विकिरण-प्रेरित छोटे आंत्र रोग अन्य अंगों (जैसे गर्भाशय ग्रीवा, प्रोस्टेट, अग्न्याशय, मलाशय) को प्रदान की गई पैल्विक या पेट रेडियोथेरेपी से उत्पन्न हो सकते हैं 41,43,44,45,46। आंतों के विकिरण की चोट, इस प्रकार, एक महत्वपूर्ण नैदानिक मुद्दा है, और परिणामस्वरूप पैथोफिज़ियोलॉजी की बेहतर समझ रेडियोथेरेपी से जुड़ी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल जटिलताओं को कम करने के लिए हस्तक्षेप के विकास को आगे बढ़ाने की संभावना है। अन्य तकनीकें हैं जो विकिरण के अलावा आंतों के उपकला के पुनर्योजी उद्देश्य की जांच करने की अनुमति देती हैं। सूजन और उसके बाद पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक और रासायनिक मुराइन मॉडल विकसितकिए गए हैं। डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट (डीएसएस) आंत में सूजन को प्रेरित करता है और सूजन आंत्र रोग के समान विशेषताओं के विकास की ओर जाताहै। प्रो-कार्सिनोजेनिक यौगिक एज़ोक्सीमेथेन (एओएम) के साथ डीएसएस उपचार के संयोजन के परिणामस्वरूप कोलाइटिस से जुड़े कैंसर48,49 का विकास हो सकता है। इस्केमिया रीपरफ्यूजन-प्रेरित चोट आंतों के उपकला की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए नियोजित एक और विधि है। इस तकनीक के लिए अनुभव और शल्य चिकित्सा ज्ञान की आवश्यकता होतीहै। इसके अलावा, उपरोक्त तकनीकें विकिरण की तुलना में विभिन्न प्रकार की चोट का कारण बनती हैं और पुनर्जनन के विभिन्न तंत्रों की भागीदारी का कारण बन सकती हैं। इसके अलावा, ये मॉडल समय लेने वाले हैं, जबकि विकिरण तकनीक काफी संक्षिप्त है। हाल ही में, आंत और बृहदान्त्र से उत्पन्न एंटरोइड्स और कोलोनोइड्स का उपयोग करने वाले इन विट्रो तरीकों का उपयोग आंतों के पुनर्जनन51,52 के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकिरण की चोट के साथ संयोजन में किया गया है। हालांकि, ये तकनीकें53,54 मॉडल के अंग को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करती हैं।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एक आनुवंशिक मॉडल के साथ संयोजन में गामा-विकिरण चोट के एक मुराइन मॉडल का विवरण शामिल है, जो टैमोक्सीफेन उपचार के बाद, आरक्षित स्टेम सेल आबादी (बीएमआई 1-सीआरई ईआर) से उत्पन्न वंशावली का पता लगाने की अनुमति देताहै। Rosa26eYFP)। यह मॉडल 12 Gy कुल-शरीर विकिरण का उपयोग करता है, जो आरक्षित स्टेम कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण आंतों की चोट को प्रेरित करता है, जबकि अभी भी चोट के 7 दिनों के भीतर आंतों की पुनर्योजी क्षमता की बाद की जांच की अनुमतिदेता है।

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Protocol

सभी चूहों को स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधन प्रभाग (डीएलएआर) में रखा गया था। स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) ने पशु विषयों से जुड़े सभी अध्ययनों और प्रक्रियाओं को मंजूरी दी। पशु विषयों से जुड़े प्रयोगों को अनुमोदित पशु हैंडलिंग प्रोटोकॉल (आईएसीयूसी # 245094) के अनुसार सख्ती से आयोजित किया गया था।

नोट: माउस उपभेदों B6;129-Bmi1tm1 (cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-CreER) और B6.129X1-Gt (ROSA)26Sortm1 (EYFP) Cos/J (Rosa26eYFP) व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए गए थे (सामग्री की तालिका देखें) और Bmi1-CreER प्राप्त करने के लिए पार किया गया; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) चूहे, जैसा कि पहले वर्णित 56,57,58 है।

1. बीएमआई 1-सीआरई ईआर का आवास; Rosa26 eYFP चूहों

  1. चूहों को 68-72 डिग्री फ़ारेनहाइट के तापमान और 30-70% तक आर्द्रता पर एक पशु सुविधा में रखें, 12 घंटे / 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र में, पानी और सामान्य चाउ एड लिबिटम के साथ।
  2. प्रयोगों से पहले, एक मानक पीसीआर जीनोटाइपिंग तकनीक57,58 का उपयोग करके चूहों के जीनोटाइप की पुष्टि करें।

2. जानवरों और सामग्रियों की तैयारी

  1. चूहों को अनुकूलन करने के लिए किसी भी प्रयोग से कम से कम 7 दिन पहले प्रयोगात्मक आवास कक्ष में चूहों को स्थानांतरित करें।
  2. लिंग और उम्र के अनुसार प्रयोगात्मक और नियंत्रण जानवरों का मिलान करें।
  3. नियंत्रण जानवरों को टैमोक्सीफेन-प्रेरित क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन के अधीन करें, लेकिन विकिरण (शाम उपचार, 0 जीवाई) के अधीन नहीं, जबकि यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रयोगात्मक जानवरों को टैमोक्सीफेन इंजेक्शन प्राप्त होता है और गामा विकिरण के संपर्क में आते हैं।
  4. टैमोक्सीफेन समाधान तैयार करें। 30 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर बाँझ मकई के तेल में टैमोक्सीफेन पाउडर को पुन: निलंबित करें। 60% आयाम के साथ 30 s ON और 30 s ऑफ के चक्रों में 3 मिनट के लिए सोनिकेट करें और फिर कमरे के तापमान (RT) पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में घुमाएं। टैमोक्सीफेन समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हो सकते हैं लेकिन इसे एक से अधिक बार फ्रीज / पिघलाएं नहीं। अधिमानतः, हर बार एक ताजा समाधान तैयार करें और इसे स्टोर न करें।
    नोट: टैमोक्सीफेन प्रकाश संवेदनशील है। कमरे के तापमान रोटेशन के दौरान इसे टिन पन्नी के साथ लपेटें।
    चेतावनी: टैमोक्सीफेन एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: स्वास्थ्य खतरा (जीएचएस 08) और पर्यावरण खतरा (जीएचएस 09)।
  5. 5-एथिनाइल-2'-डीऑक्स्यूरिडाइन (ईडीयू) स्टॉक समाधान तैयार करें। बाँझ डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) की कुल मात्रा के 1/5 में ईडीयू पाउडर को फिर से निलंबित करें और धीरे-धीरे बाँझ अल्ट्राप्योर पानी की कुल मात्रा का शेष 4/5 जोड़ें। जब पूरी तरह से घुल जाता है, तो एलिकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    चेतावनी: 5-एथिनिल -2'-डीऑक्सीयूरिडिन (ईडीयू) और डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) संभावित खतरनाक पदार्थ हैं: स्वास्थ्य खतरा (एच 340 और एच 631, और एच 227, एच 315, और एच 31 9, क्रमशः)। ईडीयू आनुवंशिक दोष पैदा कर सकता है और प्रजनन क्षमता या अजन्मे बच्चों को नुकसान पहुंचाने का संदेह है, और डीएमएसओ त्वचा और आंखों में जलन पैदा कर सकता है।
  6. ऊतक संग्रह और निर्धारण के लिए अभिकर्मकों को तैयार करें: 70% पानी का घोल तैयार करने के लिए इथेनॉल को पतला करें, डीपीबीएस को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, और संशोधित बौइन के फिक्सेटिव बफर (आसुत एच2ओ में 50% इथेनॉल और 5% एसिटिक एसिड) और 10% बफर फॉर्मेलिन तैयार करें।
    चेतावनी: एथिल अल्कोहल एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: स्वास्थ्य खतरा (एच 225-एच 31 9), ज्वलनशील (जीएचएस 02), और तीव्र विषाक्तता (जीएचएस 07) का कारण बनता है। एसिटिक एसिड एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: स्वास्थ्य खतरा (एच 226-एच 314), ज्वलनशील (जीएचएस 02), और संक्षारक (जीएचएस 05)। फॉर्मेलिन एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: स्वास्थ्य खतरा (एच 350, एच 315, एच 317, एच 318, एच 370), और संक्षारक। फॉर्मेलिन कैंसर, त्वचा और आंखों की जलन, अंगों को नुकसान और एलर्जी त्वचा प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकता है।
  7. इच्छामृत्यु के लिए आवश्यक उपकरण एक अनुमोदित विधि (उदाहरण के लिए सीओ2 कक्ष), एक चूहों विच्छेदन किट (कैंची, फोर्स), पेट्री व्यंजन, आंतों को फ्लश करने के लिए 10 एमएल सिरिंज से जुड़ी 16 ग्राम गैवेज सुई और हिस्टोलॉजिकल कैसेट तैयार करें।

3. कुल-शरीर गामा विकिरण (टीबीआई) और ऊतक संग्रह

  1. गामा-विकिरण जोखिम से दो दिन पहले, क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन और बीएमआई 1 / ईवाईएफपी + सेल लिनेज ट्रेसिंग को प्रेरित करने के लिए टैमोक्सीफेन की एकल खुराक के साथ प्रयोगात्मक जानवरों को इंजेक्ट करें। प्रत्येक जानवर का वजन करें और मकई के तेल में पुन: निलंबित टैमोक्सीफेन के शरीर के वजन के 40 मिलीग्राम / किलोग्राम की खुराक की गणना करें। 70% इथेनॉल के साथ पेट के क्षेत्र को कीटाणुरहित करें और 1 एमएल सिरिंज से जुड़ी 27 जी सुई का उपयोग करके टैमोक्सीफेन इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करें।
  2. संभावित टैमोक्सीफेन विषाक्तता को बाहर करने के लिए निम्नलिखित 48 घंटे के लिए जानवरों का निरीक्षण करें।
  3. स्थानीय संस्था द्वारा निर्दिष्ट विकिरण कक्ष में चूहों को स्थानांतरित करें।
  4. वर्तमान सटीक खुराक दर के अनुसार 137सीएस स्रोत द्वारा जारी विकिरण जोखिम समय की गणना करें। उदाहरण के लिए, यदि वर्तमान खुराक दर 75.9 रैड/मिनट (0.759 Gy min-1 = 75.9 cGy m-1) के बराबर है, तो मिनटों में एक्सपोजर के समय की गणना वांछित खुराक/0.759 के रूप में की जाती है। जानवरों को 12 Gy TBI की खुराक के लिए विकिरणित करने के लिए, एक्सपोजर समय ~ 15.81 मिनट (15 मिनट और 48 सेकंड) है।
  5. 70% इथेनॉल समाधान के साथ गामा इरेडिएटर में नमूना कक्ष को कीटाणुरहित करें; नमूना कक्ष के अंदर शोषक चटाई और जानवरों को रखें।
    नोट: शाम-उपचारित जानवरों को विकिरण कक्ष में रखा जाना चाहिए लेकिन गामा विकिरण के संपर्क में नहीं आना चाहिए।
  6. ढक्कन रखें और कक्ष बंद करें।
  7. जानवरों को 12 Gy TBI के संपर्क में लाने के लिए गामा इरेडिएटर प्रोग्राम करें।
    1. कुंजी को स्टार्ट स्थिति में बदलकर मशीन चालू करें।
    2. एक संख्यात्मक कुंजीपटल का उपयोग करके ऑपरेटर नंबर दर्ज करें और ENTER दबाकर पुष्टि करें।
    3. एक संख्यात्मक कुंजीपटल का उपयोग करके पिन नंबर दर्ज करें और ENTER दबाकर पुष्टि करें।
    4. विकल्पों के लिए 1 दबाएँ.
    5. टाइमर सेटिंग्स के लिए 1 दबाएँ।
    6. विकिरण समय के लिए 1 दबाएं।
    7. एक संख्यात्मक कुंजीपटल (hh:mm:ss स्वरूप) का उपयोग करके अगले चक्र के लिए टाइमर सेटिंग दर्ज करें और ENTER दबाकर पुष्टि करें.
    8. ENTER दबाकर सेटिंग्स की एक बार फिर पुष्टि करें.
    9. CLEAR 2x दबाकर होम मेनू पर वापस जाएं।
    10. एक्सपोजर शुरू करने के लिए स्टार्ट दबाएं।
  8. सक्रिय एक्सपोजर के समय के लिए कमरे को छोड़ दें। मशीन पूर्व निर्धारित समय बीतने के बाद स्वचालित रूप से बंद हो जाएगी और बीपिंग शुरू कर देगी।
    चेतावनी: सीज़ियम -137 (137सीएस) एक घातक खतरनाक पदार्थ है (स्वास्थ्य खतरा: एच 314)। 137सी की बड़ी मात्रा के बाहरी संपर्क में जलने, तीव्र विकिरण बीमारी और यहां तक कि मौत का कारण बन सकता है।
  9. कुंजी को STOP स्थिति में बदलकर मशीन को बंद करें।
  10. नमूना कक्ष खोलें, ढक्कन उतारें, जानवरों को पिंजरे में वापस स्थानांतरित करें, और 70% इथेनॉल समाधान के साथ नमूना कक्ष को कीटाणुरहित करें।
  11. जानवरों को पारंपरिक आवास कक्ष में वापस स्थानांतरित करें और उपचार के बाद उनकी स्थिति का निरीक्षण करें।
  12. हर दिन जानवरों के वजन की निगरानी करें और उन्हें तुरंत (नियोजित समय बिंदु के बावजूद) इच्छामृत्यु दें यदि शरीर के शुरुआती वजन के 15% से अधिक परिवर्तित कल्याण, संकट या वजन घटाने के कोई लक्षण देखे जाते हैं।
  13. नियोजित इच्छामृत्यु से तीन घंटे पहले पेट के क्षेत्र को कीटाणुरहित करें और, 28 जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके, चूहों को ईडीयू स्टॉक समाधान (इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित) के 100 μL के साथ इंजेक्ट करें।
  14. विकिरण के बाद 0 घंटे, 3 घंटे, 6 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे, 72 घंटे, 96 घंटे और 168 घंटे पर समीपस्थ आंतों को इकट्ठा करें।
    1. गृह संस्थान के मानकों के अनुसार सीओ2 इच्छामृत्यु का प्रदर्शन करें।
      चेतावनी: कार्बन डाइऑक्साइड एक खतरनाक पदार्थ (H280) है। दबाव में गैस होती है; गर्म होने पर विस्फोट हो सकता है। ऑक्सीजन को विस्थापित कर सकता है और तेजी से घुटन का कारण बन सकता है।
    2. फिर, छोटी आंत के समीपस्थ भाग को विच्छेदित करें, संलग्न ऊतकों को हटा दें, 10 एमएल सिरिंज से जुड़ी 16 ग्राम सीधी फीडिंग सुई का उपयोग करके ठंडे डीपीबीएस के साथ फ्लश करें, 10 एमएल सिरिंज से जुड़ी 16 जी सीधी फीडिंग सुई का उपयोग करके संशोधित बौइन के फिक्सेटिव बफर के साथ ठीक करें, अनुदैर्ध्य रूप से खोलें, और स्विस-रोल तकनीक का उपयोग करके समीपस्थ आंतों को रोल करें जैसा कि पहले वर्णितहै।
  15. ऊतकों को एक हिस्टोलॉजिकल कैसेट में रखें और 10% बफर फॉर्मेलिन के साथ एक कंटेनर में कमरे के तापमान पर 24-48 घंटे के लिए छोड़ दें। फॉर्मेलिन की मात्रा हिस्टोलॉजिकल कैसेट को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए। जब इनक्यूबेशन समय बीतता है, तो फोर्सप्स का उपयोग करके, हिस्टोलॉजिकल कैसेट को 70% इथेनॉल से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। फिर, ऊतक पैराफिन एम्बेडिंग के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: ऊतक पैराफिन एम्बेडिंग स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय में अनुसंधान हिस्टोलॉजी कोर प्रयोगशाला द्वारा किया गया था। प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है, और पैराफिन ब्लॉक को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    चेतावनी: फॉर्मेलिन एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: स्वास्थ्य खतरा (एच 350, एच 315, एच 317, एच 318, एच 370), और संक्षारक। फॉर्मेलिन कैंसर, त्वचा और आंखों की जलन, अंगों को नुकसान और एलर्जी त्वचा प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकता है।

4. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

  1. पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों वाले हिस्टोलॉजिकल कैसेट को कम से कम 1 घंटे के लिए बर्फ पर रखकर ठंडा करें। एक माइक्रोटोम का उपयोग करके, धुंधला होने के लिए 5 μm मोटे खंड तैयार करें। पूरे लुढ़के हुए नमूने को कवर करने के लिए प्रत्येक ऊतक को क्षैतिज रूप से काटा जाना चाहिए।
    1. पैराफिन ब्लॉक को काटने के बाद, ऊतक वर्गों को 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में स्थानांतरित करें और अनुभागों को चार्ज स्लाइड पर रखें। स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर रात भर रैक पर सूखने के लिए छोड़ दें।
      नोट: प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है, और स्लाइड को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. स्लाइड को स्लाइड होल्डर में रखें और रात भर 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में बेक करें। स्लाइड्स को कम समय के लिए बेक किया जा सकता है, 1-2 घंटे। हालांकि, ताजा (1 महीने से कम पुराने) कट स्लाइड के मामले में यह उचित नहीं है।
    नोट: रासायनिक हुड के नीचे मैन्युअल स्लाइड स्टेनिंग सेट रखें और रासायनिक हुड के तहत जाइलीन, इथेनॉल और हेमटोक्सिलिन के साथ ऊष्मायन करें।
  3. अगले दिन, स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए रासायनिक हुड के नीचे स्लाइड होल्डर में रखकर ठंडा करें।
  4. स्लाइड धारक को 3 मिनट के लिए 100% जाइलीन से भरे कंटेनर में रखकर ऊतकों को अलग करें। ताजा 100% जाइलीन का उपयोग करके इनक्यूबेशन दोहराएं।
    नोट: उस क्षण से, सुनिश्चित करें कि नमूने हर समय गीले रखे गए हैं।
    चेतावनी: जाइलीन एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: ज्वलनशील (जीएचएस 02), तीव्र विषाक्तता (जीएचएस 07), और एक स्वास्थ्य खतरा (एच 226 - एच 304 - एच 312 + एच 332 - एच 315 - एच 31 9 - एच 335 - एच 373 - एच 412)। संभावित खतरनाक प्रभाव यह है कि यह घातक है अगर निगल लिया जाए या वायुमार्ग में प्रवेश किया जाए और त्वचा, आंख और श्वसन जलन पैदा कर सकता है। इसके अतिरिक्त, यह उनींदापन या चक्कर आना पैदा करके मोटर कार्यों को प्रभावित कर सकता है और लंबे समय तक या बार-बार जोखिम के मामले में अंग क्षति का कारण बन सकता है।
  5. निम्नलिखित समाधानों से भरे कंटेनरों में क्रमिक रूप से स्लाइड धारक को रखकर इथेनॉल ढाल में पुनर्जलीकरण अनुभाग: 100% इथेनॉल, 2 मिनट; 95% इथेनॉल, 2 मिनट; 70% इथेनॉल, 2 मिनट।
  6. स्लाइड धारक को आसुत जल से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए आसुत जल में कुल्ला करें।
  7. स्लाइड धारक को हेमेटॉक्सिलिन समाधान से भरे कंटेनर में रखें, और 5 मिनट (रासायनिक हुड के नीचे) के लिए दाग दें।
  8. स्लाइड धारक को नल के पानी से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें और बहते नल के पानी में तब तक कुल्ला करें जब तक कि हेमेटॉक्सिलिन धुंधला न हो जाए, आमतौर पर 2 मिनट के बाद।
  9. स्लाइड धारक को 5% (डब्ल्यू / वी) लिथियम कार्बोनेट समाधान से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। 10 गुना कम करें।
    चेतावनी: लिथियम कार्बोनेट एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: तीव्र विषाक्तता (जीएचएस 07), और एक स्वास्थ्य खतरा (एच 302 - एच 31 9) पैदा करता है। यह निगलने पर हानिकारक है, त्वचा के संपर्क में हानिकारक है, और गंभीर आंखों की जलन का कारण बनता है।
  10. स्लाइड धारक को आसुत जल से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए आसुत जल में कुल्ला करें।
  11. स्लाइड धारक को 5 मिनट के लिए ईओसिन और दाग से भरे कंटेनर में रखें।
  12. स्लाइड धारक को 70% इथेनॉल से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें और संक्षेप में कुल्ला करें (10 एस)।
  13. इथेनॉल ढाल समाधान से भरे कंटेनरों में क्रमिक रूप से स्लाइड धारक को रखकर अनुभागों को निर्जलित करें: 95% इथेनॉल, 5 डिप्स; 100% इथेनॉल, 5 डिप्स।
  14. स्लाइड धारक को 3 मिनट के लिए 100% जाइलीन से भरे कंटेनर में रखकर स्लाइड्स साफ़ करें। ताजा 100% जाइलीन का उपयोग करके इनक्यूबेशन दोहराएं।
  15. रैक से स्लाइड लें, पेपर तौलिया का उपयोग करके ऊतकों के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं, और नमूने के आकार के आधार पर, नमूने की सतह पर जाइलीन-आधारित माउंटिंग माध्यम की एक या दो बूंद जोड़ें। ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर धीरे से एक कवरस्लिप रखकर माउंट करें (सावधान रहें कि किसी भी हवा के बुलबुले को न छोड़ें)। यदि आवश्यक हो तो धीरे से दबाएं। कांच की पूरी सतह को कवर और सील किया जाना चाहिए।
  16. स्लाइड्स को रात भर केमिकल हुड के नीचे छोड़कर सुखाएं। आमतौर पर, माउंटिंग माध्यम 24 घंटे से कम समय में जम जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइड सूखी हैं, एक नमूना स्लाइड बनाई जा सकती है। एक खाली स्लाइड का उपयोग करके, बढ़ते माध्यम की एक बूंद रखें और रात भर रासायनिक हुड के नीचे छोड़ दें। अगले दिन, ड्रॉप को स्पर्श करें और जांचें कि क्या यह ठोस है।
  17. जब स्लाइड सूख जाती हैं, तो प्रकाश माइक्रोस्कोप या उज्ज्वल क्षेत्र चैनल के साथ अधिक उन्नत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ऊतकों के ऊतक विज्ञान का विश्लेषण करें।
    1. मंच पर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें, जब तक कि नमूना दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में न हो, फोकस नॉब का उपयोग करके फोकस समायोजित करें, और नियंत्रित ऊतकों (शाम विकिरणित) की तुलना में हिस्टोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए 10x और / या 20x आवर्धन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें।
    2. यदि माइक्रोस्कोप एक कैमरे से लैस है, तो छवियां भी लें।
      नोट: प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है; स्लाइड को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में विश्लेषण किया जा सकता है। स्लाइड्स को 30 दिनों से अधिक न रखें क्योंकि धुंधलापन धीरे-धीरे दूर हो जाता है।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों वाले हिस्टोलॉजिकल कैसेट को कम से कम 1 घंटे के लिए बर्फ पर रखकर ठंडा करें। एक माइक्रोटोम का उपयोग करके, धुंधला होने के लिए 5 μm मोटे खंड तैयार करें। पूरे लुढ़के हुए नमूने को कवर करने के लिए प्रत्येक ऊतक को क्षैतिज रूप से काटा जाना चाहिए।
    1. पैराफिन ब्लॉक को काटने के बाद, ऊतक वर्गों को 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में स्थानांतरित करें और अनुभागों को चार्ज स्लाइड पर रखें। स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर रात भर रैक पर सूखने के लिए छोड़ दें।
      नोट: प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है, और स्लाइड को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. स्लाइड को स्लाइड होल्डर में रखें और रात भर 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में बेक करें। स्लाइड्स को कम समय के लिए बेक किया जा सकता है, 1-2 घंटे। हालांकि, ताजा (1 महीने से कम समय पहले) कट स्लाइड के मामले में यह उचित नहीं है।
    नोट: रासायनिक हुड के नीचे मैन्युअल स्लाइड स्टेनिंग सेट रखें और रासायनिक हुड के तहत जाइलीन, इथेनॉल और एच2ओ2 / मेथनॉल के साथ ऊष्मायन करें।
  3. अगले दिन, स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए रासायनिक हुड के नीचे स्लाइड होल्डर में रखकर ठंडा करें।
  4. स्लाइड धारक को 3 मिनट के लिए 100% जाइलीन से भरे कंटेनर में रखकर ऊतकों को अलग करें। ताजा 100% जाइलीन का उपयोग करके इनक्यूबेशन दोहराएं।
    नोट: उस क्षण से, सुनिश्चित करें कि नमूने हर समय गीले रखे गए हैं।
  5. रासायनिक हुड के तहत मेथनॉल में 2% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान से भरे कंटेनर में 30 मिनट के लिए स्लाइड को इनक्यूबेट करके अंतर्जात पेरोक्सीडेज बुझाएं।
    चेतावनी: मिथाइल अल्कोहल एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: स्वास्थ्य खतरा (एच 225-एच 301, एच 311, एच 331-एच 370), ज्वलनशील (जीएचएस 02), और तीव्र विषाक्तता (मौखिक, त्वचीय, साँस लेना) (जीएचएस 08) का कारण बनता है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: संक्षारक (जीएचएस 05) और तीव्र विषाक्तता (जीएचएस 07) का कारण बनता है।
  6. स्लाइड धारक को निम्नलिखित समाधानों से भरे कंटेनरों में क्रमिक रूप से रखकर इथेनॉल ढाल में वर्गों को पुनर्जलीकृत करें: 100% इथेनॉल, 3 मिनट; 95% इथेनॉल, 3 मिनट; 70% इथेनॉल, 3 मिनट।
  7. स्लाइड धारक को आसुत जल से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए आसुत जल में कुल्ला करें।
  8. एंटीजन को पुनः प्राप्त करने के लिए, स्लाइड धारक को 250 एमएल साइट्रेट बफर समाधान (10 एमएम सोडियम साइट्रेट, 0.05% ट्वीन -20, पीएच 6.0) के साथ एक कंटेनर में स्थानांतरित करें और एक डिक्लोकिंग चैंबर का उपयोग करके 10 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर पकाएं।
  9. पूरे कंटेनर को ठंडे कमरे में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के दौरान धीरे-धीरे ठंडा होने दें।
  10. 30 मिनट के बाद, साइट्रेट बफर समाधान को आसुत पानी से बदलें और आसुत जल में कुल्ला करें जब तक कि सभी तैरते हुए पैराफिन टुकड़े हटा न दिए जाएं।
  11. स्लाइड्स को धारक से बाहर निकालें (एक बार में), एक पेपर तौलिया पर टैप करें, और पेपर तौलिया के साथ नमूने के आसपास के क्षेत्र को सावधानीपूर्वक सुखाएं। एक पेन का उपयोग करके नमूने के चारों ओर एक बंद आकार खींचें जो एक हाइड्रोफोबिक बैरियर (पीएपी पेन) प्रदान करता है। एक ह्यूमिडिफ़ायर कक्ष में रखें।
  12. एक नमूने की सतह पर घोल के 200 μL जोड़कर TBS-ट्वीन में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ ब्लॉक करें। सुनिश्चित करें कि कोई रिसाव नहीं है। 30 मिनट के लिए एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  13. पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके ब्लॉकिंग समाधान को हटा दें। एक ह्यूमिडिफ़ायर कक्ष में वापस रखें। प्राथमिक एंटीबॉडी की उचित सांद्रता का 100 μL एक अवरुद्ध बफर में फिर से निलंबित हो जाता है और रात भर कोमल रॉकिंग के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है। बीएमआई 1 / ईवाईएफपी के लिए, चिकन एंटी-जीएफपी (कमजोर पड़ने 1: 500) का उपयोग करें; Ki-67 के लिए, खरगोश एंटी-Ki-67 (कमजोर पड़ने 1:200) का उपयोग करें।
  14. पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके एंटीबॉडी समाधान को हटा दें; स्लाइड्स को स्लाइड होल्डर में रखें और टीबीएस-ट्वीन से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए हिलाने से धो लें। 3x दोहराएं। हर बार, टीबीएस-ट्वीन बफर के एक ताजा हिस्से का उपयोग करें।
  15. स्लाइड्स को होल्डर से बाहर निकालें (एक बार में), पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड को टैप करके अतिरिक्त धोने के घोल को हटा दें, और एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में रखें। एक ब्लॉकिंग बफर में फिर से निलंबित द्वितीयक एंटीबॉडी की उचित एकाग्रता का 100 μL जोड़ें, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। द्वितीयक एंटीबॉडी को फ्लोरोफोरे के साथ संयुग्मित किया जाना चाहिए। बीएमआई 1 / ईवाईएफपी के लिए, गधे विरोधी चिकन एलेक्सा फ्लोर 647 (कमजोर पड़ने 1: 500) का उपयोग करें; Ki-67 के लिए, बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लूर 488 (कमजोर पड़ने 1: 500) का उपयोग करें।
  16. पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके एंटीबॉडी समाधान को हटा दें; स्लाइड्स को स्लाइड होल्डर में रखें और टीबीएस-ट्वीन से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए हिलाने से धो लें। 3x दोहराएं। हर बार, टीबीएस-ट्वीन बफर के एक ताजा हिस्से का उपयोग करें।
  17. स्लाइड्स को होल्डर से बाहर निकालें (एक बार में), पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड को टैप करके अतिरिक्त धोने के घोल को हटा दें, और एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में रखें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किए गए ईडीयू धुंधला समाधान के 100 μL जोड़ें और एलेक्सा फ्लूर 555 फ्लोरोफोरे का उपयोग करें।
  18. पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके ईडीयू समाधान निकालें; स्लाइड्स को स्लाइड होल्डर में रखें और टीबीएस-ट्वीन से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए हिलाने से धो लें। 2x दोहराएं। हर बार, टीबीएस-ट्वीन बफर के एक ताजा हिस्से का उपयोग करें।
  19. धारक से स्लाइड्स निकालें (एक समय में एक); पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके अतिरिक्त धोने के घोल को हटा दें और एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में रखें। नमूने की सतह पर होचस्ट 33258 समाधान (टीबीएस-ट्वीन में कमजोर पड़ने 1:1000) के 100 μL को जोड़कर Hoechst 33258 काउंटरस्टेनिंग करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
  20. पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके होचस्ट 33258 समाधान निकालें; स्लाइड्स को स्लाइड होल्डर में रखें और टीबीएस-ट्वीन से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए हिलाने से धो लें।
  21. स्लाइड धारक से स्लाइड निकालें, पेपर तौलिया का उपयोग करके ऊतकों के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं, और नमूने के आकार के आधार पर, नमूने की सतह पर एक्वा-आधारित माउंटिंग माध्यम की एक या दो बूंद जोड़ें। ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर धीरे से एक कवरस्लिप रखकर माउंट करें (सावधान रहें कि किसी भी हवा के बुलबुले को न छोड़ें)। यदि आवश्यक हो तो धीरे से दबाएं। कांच की पूरी सतह को कवर और सील किया जाना चाहिए।
  22. स्लाइड्स को रात भर कमरे के तापमान पर अंधेरे में छोड़कर सुखाएं। आमतौर पर, बढ़ता मीडिया 24 घंटे से भी कम समय में जम जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइड सूखी हैं, एक नमूना स्लाइड बनाई जा सकती है। एक खाली स्लाइड का उपयोग करें; बढ़ते माध्यम की एक बूंद रखें और रात भर रासायनिक हुड के नीचे छोड़ दें। अगले दिन, ड्रॉप को स्पर्श करें और जांचें कि क्या यह ठोस है।
  23. जब स्लाइड सूख जाती है, तो दाग वाले ऊतकों का विश्लेषण उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य फिल्टर से लैस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जा सकता है, जो केआई -67, ईडीयू और बीएमआई 1 / ईवाईएफपी धुंधला (क्रमशः 535 एनएम, 646 एनएम और 700 एनएम) के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
  24. मंच पर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें, जब तक कि नमूना दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में न हो, फोकस नॉब का उपयोग करके फोकस समायोजित करें, और नियंत्रित ऊतकों (शाम विकिरणित) की तुलना में धुंधलापन का विश्लेषण करने के लिए 10x और / या 20x आवर्धन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें। यदि माइक्रोस्कोप एक कैमरे से लैस है, तो छवियों को भी लिया जा सकता है। प्रत्येक चैनल के लिए अलग से चित्र लें और बाद में विलय करें।
    नोट: प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है; स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में विश्लेषण किया जा सकता है। स्लाइड्स को 14 दिनों से अधिक समय तक न रखें क्योंकि धुंधलापन धीरे-धीरे दूर हो जाता है।

6. ट्यूनल धुंधला होना

  1. पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों वाले हिस्टोलॉजिकल कैसेट को कम से कम 1 घंटे के लिए बर्फ पर रखकर ठंडा करें। एक माइक्रोटोम का उपयोग करके, धुंधला होने के लिए 5 μm मोटे खंड तैयार करें। पूरे लुढ़के हुए नमूने को कवर करने के लिए प्रत्येक ऊतक को क्षैतिज रूप से काटा जाना चाहिए।
    1. पैराफिन ब्लॉक को काटने के बाद, ऊतक वर्गों को 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में स्थानांतरित करें और अनुभागों को चार्ज स्लाइड पर रखें। स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर रात भर रैक पर सूखने के लिए छोड़ दें।
      नोट: प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है, और स्लाइड को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. स्लाइड को स्लाइड होल्डर में रखें और रात भर 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में बेक करें।
    नोट: स्लाइड्स को कम समय, 1-2 घंटे के लिए बेक किया जा सकता है। हालांकि, ताजा (1 महीने से कम समय पहले) कट स्लाइड के मामले में यह उचित नहीं है। रासायनिक हुड के नीचे मैन्युअल स्लाइड-स्टेनिंग सेट रखें और रासायनिक हुड के नीचे जाइलीन और इथेनॉल के साथ ऊष्मायन करें।
  3. अगले दिन, स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए रासायनिक हुड के नीचे स्लाइड होल्डर में रखकर ठंडा करें।
  4. स्लाइड होल्डर को 3 मिनट के लिए 100% जाइलीन से भरे कंटेनर में रखकर ऊतकों को अलग करें। ताजा 100% जाइलीन का उपयोग करके इनक्यूबेशन दोहराएं।
    नोट: इस बिंदु से, सुनिश्चित करें कि नमूने हर समय गीले रखे जाते हैं।
  5. निम्नलिखित समाधानों से भरे कंटेनरों में क्रमिक रूप से स्लाइड धारक को रखकर इथेनॉल ढाल में वर्गों को पुनर्जलीकृत करें: 100% इथेनॉल, 3 मिनट; 95% इथेनॉल, 3 मिनट; 90% इथेनॉल, 3 मिनट; 80% इथेनॉल, 3 मिनट; 70% इथेनॉल, 3 मिनट।
  6. स्लाइड धारक को आसुत जल से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें और 1 मिनट के लिए आसुत जल में कुल्ला करें।
  7. स्लाइड्स को धारक से बाहर निकालें (एक बार में), एक पेपर तौलिया पर टैप करें, और पेपर तौलिया के साथ नमूने के आसपास के क्षेत्र को सावधानीपूर्वक सुखाएं। एक पेन का उपयोग करके नमूने के चारों ओर एक बंद आकार खींचें जो एक हाइड्रोफोबिक बैरियर (पीएपी पेन) प्रदान करता है। एक ह्यूमिडिफ़ायर कक्ष में रखें।
  8. हाइड्रोफोबिक बैरियर के भीतर नमूने की सतह पर डीनेस-मुक्त प्रोटीन के समाधान (डीपीबीएस में कमजोर पड़ने 1:25) के 100 μL जोड़ें। 15 मिनट के लिए एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    चेतावनी: प्रोटीन के एक संभावित खतरनाक पदार्थ है: स्वास्थ्य खतरा (एच 315 - एच 31 9 - एच 334)।
  9. पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके प्रोटीन के समाधान को हटा दें; स्लाइड्स को स्लाइड होल्डर में रखें और डीपीबीएस से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए हिलाने से धो लें। 2x दोहराएं। हर बार, डीपीबीएस के एक ताजा हिस्से का उपयोग करें।
  10. ट्यूनल प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें: एंजाइम समाधान (10x) के साथ लेबल समाधान (1x) मिलाएं। पिपेट अच्छी तरह से।
  11. धारक से स्लाइड्स निकालें (एक समय में एक); पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके अतिरिक्त धोने के घोल को हटा दें और एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में रखें। नमूने की सतह पर 50 μL TUNEL प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें और 60 मिनट के लिए एक आर्द्र कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, केवल लेबल समाधान का उपयोग करें (टीडीटी के बिना)।
  12. पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके ट्यूनल समाधान निकालें; स्लाइड्स को स्लाइड होल्डर में रखें और डीपीबीएस से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए हिलाने से धो लें। 2x दोहराएं। हर बार, डीपीबीएस के एक ताजा हिस्से का उपयोग करें।
  13. धारक से स्लाइड्स निकालें (एक समय में एक); पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके अतिरिक्त धोने के घोल को हटा दें और एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में रखें। नमूने की सतह पर होचस्ट 33258 समाधान (टीबीएस-ट्वीन में कमजोर पड़ने 1:1000) के 100 μL को जोड़कर Hoechst 33258 काउंटरस्टेनिंग करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
  14. पेपर टॉवल पर ग्लास स्लाइड टैप करके होचस्ट 33258 समाधान निकालें; स्लाइड्स को स्लाइड होल्डर में रखें और डीपीबीएस से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए हिलाने से धो लें।
  15. स्लाइड धारक से स्लाइड बाहर निकालें; एक पेपर तौलिया का उपयोग करके ऊतकों के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं, और नमूने के आकार के आधार पर, नमूने की सतह पर एक्वा-आधारित माउंटिंग माध्यम की एक या दो बूंद जोड़ें। ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर धीरे से एक कवरस्लिप रखकर माउंट करें (सावधान रहें कि किसी भी हवा के बुलबुले को न छोड़ें)। यदि आवश्यक हो तो धीरे से दबाएं। कांच की पूरी सतह को कवर और सील किया जाना चाहिए।
  16. स्लाइड्स को रात भर कमरे के तापमान पर अंधेरे में छोड़कर सुखाएं। आमतौर पर, माउंटिंग माध्यम 24 घंटे से कम समय में जम जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइड सूखी हैं, एक नमूना स्लाइड बनाई जा सकती है। बढ़ते माध्यम की एक बूंद रखें और रात भर कमरे के तापमान पर अंधेरे में छोड़ दें। अगले दिन, ड्रॉप को स्पर्श करें और जांचें कि क्या यह ठोस है।
  17. जब स्लाइड सूख जाती है, तो दाग वाले ऊतकों का विश्लेषण उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य फिल्टर से लैस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जा सकता है जो ट्यूनल धुंधला (535 एनएम) के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
  18. मंच पर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें, जब तक कि नमूना दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में न हो, फोकस नॉब का उपयोग करके फोकस समायोजित करें, और नियंत्रित ऊतकों (शाम विकिरणित) की तुलना में धुंधलापन का विश्लेषण करने के लिए 10x और / या 20x आवर्धन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें। यदि माइक्रोस्कोप एक कैमरे से लैस है, तो छवियों को भी लिया जा सकता है। प्रत्येक चैनल के लिए अलग से चित्र लें और बाद में विलय करें।
    नोट: प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है; स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में विश्लेषण किया जा सकता है। स्लाइड्स को 14 दिनों से अधिक समय तक न रखें क्योंकि धुंधलापन धीरे-धीरे दूर हो जाता है।

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Representative Results

मुराइन आनुवंशिक वंश अनुरेखण के साथ संयोजन में 12 जी कुल-शरीर विकिरण (टीबीआई) का उपयोग आंत में विकिरण की चोट के परिणामों के गहन विश्लेषण की अनुमति देता है। शुरू करने के लिए, बीएमआई1-सीआरई ईआर; रोसा 26ईवाईएफपी चूहों को एक एकल टैमोक्सीफेन इंजेक्शन मिला, जो बीएमआई 1 + रिजर्व स्टेम सेल आबादी के भीतर बढ़े हुए पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईवाईएफपी) अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। टैमोक्सीफेन इंजेक्शन के दो दिन बाद, चूहों को विकिरण या शाम विकिरण से गुजरना पड़ा। इच्छामृत्यु से तीन घंटे पहले चूहों को ईडीयू का इंजेक्शन दिया गया। इच्छामृत्यु के बाद, छोटी आंत के नमूने 0 घंटे, 3 घंटे, 6 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे, 72 घंटे, 96 घंटे और विकिरण के 7 दिनों के बाद विश्लेषण के लिए एकत्र किए गए थे। उपरोक्त समय पाठ्यक्रम से प्रतिनिधि हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) छवियां (चित्रा 1) चोट के लिए आंतों के उपकला प्रतिक्रिया को दर्शाती हैं। 0 एच समय बिंदु होमियोस्टेटिक आंतों के उपकला का चित्रण है (चित्रा 1); इसके बाद एपोप्टोटिक चरण होता है- 3 घंटे और 48 घंटे के बीच क्रिप्ट डिब्बों के भीतर कोशिकाओं के नुकसान की विशेषता है (चित्रा 1)। फिर पुनर्योजी चरण का अनुसरण करता है, जहां अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को 72 घंटे और 96 घंटे (चित्रा 1) के बीच क्रिप्ट्स को पॉप्युलेट करते हुए पाया जा सकता है। अंत में, यह सामान्यीकरण चरण की ओर जाता है, यहां 7 दिन के समय बिंदु (चित्रा 1) द्वारा दर्शाया गया है।

चित्र 2 आंतों की क्रिप्ट कोशिकाओं की प्रोलिफेरेटिव स्थिति में परिवर्तन को दर्शाता है, जिसका मूल्यांकन ईडीयू (एस-चरण में कोशिकाओं के मार्कर) और केआई -67 (जी 1, एस और जी 2 / एम चरणों में कोशिकाओं के मार्कर) के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन द्वारा किया जाता है, जबकि वंश अनुरेखण (ईवाईएफपी + कोशिकाएं) बीएमआई 1 + रिजर्व स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न कोशिकाओं को चिह्नित करता है। होमियोस्टैसिस (चित्रा 2, 0 एच शाम) के दौरान, ईवाईएफपी की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित बीएमआई 1 + पॉजिटिव कोशिकाएं क्रिप्ट्स के भीतर +4-+ 6 स्थिति तक सीमित हैं। एपोप्टोटिक चरण (24 घंटे और 48 घंटे) के दौरान, ईवाईएफपी-पॉजिटिव कोशिकाएं संख्या में कमी आती हैं (चित्रा 2)। पुनर्योजी चरण (72 घंटे और 96 घंटे) को बीएमआई 1 + पॉजिटिव कोशिकाओं और उनके पूर्वजों (चित्रा 2) के तेजी से प्रसार की विशेषता है; विकिरण के 7 दिनों के बाद, आगे प्रसार और प्रवासन ने आंतों के क्रिप्ट कोशिकाओं को फिर से भर दिया है और आंतों के उपकला अखंडता को बहाल किया है (चित्रा 2)।

शाम-विकिरणित चूहों (नियंत्रण) में, ईडीयू और केआई -67 आंतों के क्रिप्ट्स के ईवाईएफपी नकारात्मक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को दागते हैं, जो सामान्य आंतों के होमियोस्टैसिस की विशेषता है, जो सक्रिय स्टेम कोशिकाओं से पारगमन-प्रवर्धन क्षेत्र के माध्यम से फैली हुई है (चित्रा 2)। विकिरण क्षति एपोप्टोटिक चरण के दौरान अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं के नुकसान का कारण बनती है, जैसा कि ईडीयू और केआई -67 धुंधलापन (चित्रा 2) की कमी से दिखाया गया है। आरक्षित स्टेम कोशिकाओं की सक्रियता (इस उदाहरण में, ईवाईएफपी ने बीएमआई 1 + सकारात्मक कोशिकाओं को चिह्नित किया) और उनके प्रसार के परिणामस्वरूप चोट के बाद 72 घंटे और 96 घंटे पर स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली ईडीयू और केआई -67 सकारात्मक कोशिकाओं में वृद्धि हुई है, जहां क्रिप्ट्स में लगभग विशेष रूप से ईवाईएफपी, ईडीयू और केआई -67 के साथ सह-दाग वाली कोशिकाएं शामिल हैं। प्रसार के देखे गए स्तर चोट के 7 दिनों के बाद सामान्य हो जाते हैं (चित्रा 2)।

विकिरण क्षति के कारण एपोप्टोसिस को चित्रित करने के लिए, ट्यूनल धुंधला किया गया था, और प्रतिनिधि छवियों को चित्रा 3 में शामिल किया गया है। होमियोस्टैसिस (चित्रा 3) के दौरान, कुछ कोशिकाएं एपोप्टोसिस से गुजर रही हैं, जो सामान्य रूप से तेजी से आंतों के उपकला कारोबार की विशेषता है। विकिरण के बाद एपोप्टोटिक चरण (24 घंटे और 48 घंटे) में ट्यूनल धुंधलापन में स्पष्ट वृद्धि देखी जा सकती है (चित्रा 3)। पुनर्योजी चरण के दौरान, ट्यूनल धुंधलापन पुनर्जनन क्रिप्ट्स के भीतर लगातार कम हो जाता है और जब क्रिप्ट सामान्य हो जाते हैं तो फिर से लगभग अनुपस्थित होता है (चित्रा 3)। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक सरल और सुलभ इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग विधि का वर्णन करता है जो लेबलिंग तकनीकों (TUNEL, EDU, Ki-67, EYFP) के एक सरल और व्यापक रूप से नियोजित संयोजन का उपयोग करता है जो चोट के बाद आंतों की कोशिकाओं के व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम है (यहां, विकिरण)। इस दृष्टिकोण को विशिष्ट परिस्थितियों में आंतों के उपकला में पुनर्योजी प्रक्रियाओं को विनियमित करने वाले तंत्र का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इस और इसी तरह के दृष्टिकोणों को नियोजित करने से विभिन्न आंतों के अपमान के बाद वैकल्पिक पुनर्योजी प्रक्रियाओं को रोशन किया जाएगा और आगे, बाधा समारोह के नुकसान की रोकथाम के लिए चिकित्सीय रणनीतियों की जांच की अनुमति मिलेगी।

Figure 1
चित्रा 1: कुल शरीर विकिरण के बाद एक समय के बाद छोटे आंतों के ऊतकों के हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग वाले वर्गों की प्रतिनिधि छवियां। बीएमआई1-सीआरई ईआर; रोसा 26ईवाईएफपी चूहों को 12 जी कुल-शरीर विकिरण या शाम विकिरण से 2 दिन पहले टैमोक्सीफेन की एक खुराक मिली। चूहों का बलिदान किया गया था, और छोटी आंत के ऊतकों को आंकड़े में इंगित समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था। सभी छवियों को 10x आवर्धन पर लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: विकिरण के बाद छोटी आंत वर्गों के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां। बीएमआई 1-सीआरईईआर; रोसा 26ईवाईएफपी चूहों को 12 जी कुल-शरीर विकिरण या शाम विकिरण से 2 दिन पहले टैमोक्सीफेन की एक खुराक मिली। चूहों का बलिदान किया गया था, और छोटी आंत के ऊतकों को आंकड़े में इंगित समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था। ऊतक वर्गों को एस-चरण (गुलाबी) में कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए ईडीयू के साथ दाग दिया गया था और जी 0, एस और जी 2 / एम चरणों (पीले) में कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए केआई -67 के साथ। ईवाईएफपी (हरा) बीएमआई 1 + कोशिकाओं और उनके पूर्वजों को चिह्नित करता है और वंश अनुरेखण को प्रदर्शित करता है। नाभिक की कल्पना करने के लिए अनुभागों को डीएपीआई (नीले) के साथ आगे बढ़ाया गया था। डेटा को 10x आवर्धन पर विलय छवियों के रूप में दिखाया गया है और 20x आवर्धन पर अलग-अलग दागों के इनसेट (ये 10x छवियों से उत्पन्न हुए हैं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: विकिरण पर छोटी आंत वर्गों के इम्यूनोफ्लोरोसेंट ट्यूनल धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां। बीएमआई1-सीआरई ईआर; रोसा 26ईवाईएफपी चूहों को 12 जी कुल-शरीर विकिरण या शाम विकिरण से 2 दिन पहले टैमोक्सीफेन की एक खुराक मिली। चूहों का बलिदान किया गया था, और छोटी आंत के ऊतकों को आंकड़े में इंगित समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था। ट्यूनल (लाल) एपोप्टोटिक कोशिकाओं को दाग देता है। इन छवियों को नाभिक की कल्पना करने के लिए DAPI (नीले) के साथ काउंटरस्टेन किया गया था। दिखाए गए चित्र 20x आवर्धन पर लिए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विकिरण चोट मॉडल का वर्णन करता है। यह चोट के बाद 7 दिनों के दौरान आंतों के उपकला में परिवर्तन के सटीक विश्लेषण की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से, चयनित समय बिंदु चोट के महत्वपूर्ण चरणों को दर्शाते हैं और आंत (चोट, एपोप्टोसिस, पुनर्जनन और सामान्यीकरण चरणों) में अलग-अलग परिवर्तनों की विशेषता है। विकिरण के इस मॉडल को स्थापित किया गया है और सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया गया है, जो रेडियोथेरेपी61 से गुजरने वाले रोगियों द्वारा अनुभव की गई नकल करने के लिए चोट की उपयुक्त अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करता है। कोलोरेक्टल कैंसर और स्त्री रोग संबंधी कैंसर वाले आधे से अधिक रोगी पेट की रेडियोथेरेपी 40,62,63 से गुजरते हैं। रेडियोथेरेपी को लक्षित करने के लिए उन्नत तरीकों के बावजूद, रोगियों को स्वस्थ आंतों के ऊतकों के विकिरण का अनुभव होता है, जो यहां प्रस्तुत कुल-शरीर विकिरण मॉडल के साथ देखे गए पैथोफिज़ियोलॉजी का उत्पादन करता है। इसलिए, यहां वर्णित विकिरण मॉडल संभावित रूप से रोगियों और / या चिकित्सा कर्मियों के आकस्मिक विकिरण जोखिम के नतीजों को संबोधित कर सकता है और इस प्रकार, मानव स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण है।

बीएमआई 1-क्रेईआर; रोसा 26ईवाईएफपी चूहों का मॉडल माउस बीएमआई 1 (बीएमआई 1 पॉलीकॉम्ब रिंग फिंगर ऑन्कोजीन) प्रमोटर के ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण के तहत टैमोक्सीफेन-इंड्यूसेबल सीआरई को वहन करता है। इसके अतिरिक्त, इन चूहों में एक आर 26-स्टॉप-ईवाईएफपी अनुक्रम होता है, जहां स्टॉप कोडन को लॉक्सपी पक्षों से घिरा होता है, जिसके बाद जीटी (आरओएसए) 26 एसओआर लोकस में एन्हांस्ड येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन (ईवाईएफपी) डाला जाता है। ईवाईएफपी की अभिव्यक्ति को एक अपस्ट्रीम लोक्सपी-फ्लैंक्ड स्टॉप अनुक्रम द्वारा अवरुद्ध किया जाता है, लेकिन इसे टैमोक्सीफेन-प्रेरित, क्रे-मध्यस्थता लक्षित विलोपन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, जिससे बीएमआई 1-व्यक्त कोशिकाओं के वंश अनुरेखण की अनुमति मिलती है, जो क्रिप्ट कोशिकाओं की एक आरक्षित स्टेम सेल-विशिष्ट उप-जनसंख्या है। बीएमआई 1-सीआरईईआर के साथ संयोजन में विकिरण प्रोटोकॉल; रोसा 26ईवाईएफपी चूहों मॉडल को पहले आंतों के पुनर्जननको विनियमित करने में प्रतिलेखन कारकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। चित्रा 1 से चित्रा 3 में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम हाल के प्रकाशनों18,56 में प्रस्तुत परिणामों के समान परिणाम दिखाते हैं।

ध्यान दें, बीएमआई 1-क्रेईआर; रोसा 26ईवाईएफपी चूहे आंतों के पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए नियोजित कई ट्रांसजेनिक पशु मॉडल में से एक हैं। आंतों के उपकला 18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,64,64,67 की पुनर्योजी क्षमता में विशिष्ट कोशिकाओं और मार्गों की भूमिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए अन्य मुराइन वंश अनुरेखण मॉडल को विकिरण के साथ जोड़ा गया है . इन मॉडलों को आरक्षित स्टेम कोशिकाओं की विभिन्न आबादी की भूमिका की जांच करने, स्रावी और एंटरोसाइट वंश के अग्रदूतों का पता लगाने और आंतों के उपकला कोशिकाओं की प्रत्येक उप-जनसंख्या के भीतर विशिष्ट जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इन जांचों के संयुक्त परिणाम आंतों के उपकला की पुनर्योजी क्षमता की समझ का विस्तार करने में मदद करेंगे।

महत्वपूर्ण रूप से, मामूली संशोधनों के साथ, इस तकनीक को विकिरण की चोट पर माइक्रोबायोटा और विभिन्न उपकला, स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के बीच संबंधों की जांच की अनुमति देनी चाहिए। अलग-अलग वंश-अनुरेखण पशु मॉडल पेश करने से वास्तविक समय के व्यवहार और चोट के बाद कोशिकाओं की विभिन्न उप-आबादी की बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति मिलेगी। वैकल्पिक रूप से, ऊतकों के धुंधलापन को आरएनए-अनुक्रमण, एकल-कोशिका आरएनए-अनुक्रमण, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस), या प्रोटिओमिक विश्लेषण द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है ताकि चोट के बाद आंतों के पुनर्जनन के दौरान विशिष्ट सेल वंश की भूमिका के बारे में अधिक गहन ज्ञान प्राप्त किया जा सके। इस चोट मॉडल का उपयोग विकिरण के दुष्प्रभावों को कम करने, वसूली के समय को कम करने और रोगी देखभाल की गुणवत्ता में सुधार करने के उद्देश्य से नए उपचार के तौर-तरीकों का परीक्षण करने के लिएकिया जा सकता है। यद्यपि यहां वर्णित विकिरण मॉडल आंतों के उपकला के उत्थान का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम कर सकता है, लेकिन इसकी कई सीमाएं भी हैं। कुल-शरीर विकिरण खुराक के परिणामस्वरूप बाद में हेमटोपोइएटिक सिंड्रोम होता है, जो आंतों के पुनर्जनन की जांच में बाधा डालता है। अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण से इसे टाला जा सकता है। इसके अलावा, पेट-केवल चोट प्रोटोकॉल में संशोधन संभावित रूप से विकिरण71 के कुछ दुष्प्रभावों को सुधार सकता है। हालांकि, इस मॉडल को अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है जो चोट के लिए आंत की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं (जैसे, संज्ञाहरण)। संयोग से, पेट का विकिरण हेमटोपोइएटिक सिंड्रोम के बिना विकिरण-प्रेरित गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सिंड्रोम (आरआईजीएस) पैदा करता है, जो पूरे शरीर के विकिरण (डब्ल्यूबीआई) से भिन्न होता है, जिसमें डब्ल्यूबीआई समान जीआई लक्षण विज्ञान पैदा करता है लेकिन चोट71,72 के बाद हेमटोपोइएटिक फ़ंक्शन का आंशिक नुकसान शामिल है।

ध्यान दें, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु मॉडल जैसे कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित परिष्कृत हैं और विशिष्ट कोशिकाओं के वंश अनुरेखण की अनुमति देते हैं। हालांकि, ये मॉडल, हालांकि बहुत फायदेमंद हैं, बनाए रखने के लिए अतिरिक्त प्रयास की आवश्यकता होती है। ट्रांसजेनिक पशु मॉडल जो सशर्त जीन विलोपन की अनुमति देते हैं, उत्पन्न करना मुश्किल है, और चोट पर उनका समय पर विलोपन आसानी से पूरा नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, अधिकांश ट्रांसजेनिक मॉडल केवल रुचि के जीन के सशर्त विलोपन या निष्क्रियता की अनुमति देते हैं, लेकिन इंड्यूसेबल नहीं होते हैं और इस प्रकार, जीन फ़ंक्शन को बहाल करने में असमर्थ होते हैं और अध्ययन में बाधा डाल सकते हैं। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक पशु मॉडल को आमतौर पर ब्याज के जीन की निष्क्रियता या अतिवृद्धि प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त रसायनों (जैसे, टैमोक्सीफेन, डॉक्सीसाइक्लिन) के साथ उपचार की आवश्यकता होती है। इन पदार्थों के साथ उपचार, कुछ हद तक, आंतों के उपकला की प्रतिक्रिया को बदल सकता है या चोट की गंभीरता को जोड़ सकता है 73,74,75,76। इसके अलावा, टैमोक्सीफेन द्वारा वंश अनुरेखण का प्रेरण विकिरण की चोट के समय के करीब पेश किया जा सकता है ताकि पुनर्जनन में शामिल कोशिकाओं के लेबलिंग में सुधार हो सके (उदाहरण के लिए, चोट से 6-24 घंटे पहले)। इस प्रकार, जंगली प्रकार के चूहों और आईएफ स्टेनिंग (जैसे, केआई -67, पीसीएनए, ईडीयू, ट्यूनल, कैसपेस 3) के संयोजन के साथ ट्रांसजेनिक मॉडल को प्रतिस्थापित करना संभव है। यह मॉडल आंत की पुनर्योजी क्षमता के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, हालांकि यह कोशिकाओं की एक विशिष्ट उप-जनसंख्या के अध्ययन की अनुमति नहीं देता है।

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। यह सुनिश्चित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है कि स्वस्थ चूहों का उपयोग प्रयोग के लिए किया जाता है, क्योंकि वे विकिरण और रसायनों के साथ उपचार के संपर्क में आएंगे। यदि विभिन्न चूहों के समूहों के साथ प्रयोग दिन, सप्ताह या महीनों के अंतर पर किए जाते हैं, तो एक ही समयरेखा का पालन करना अच्छा अभ्यास है, उदाहरण के लिए, दिन के एक ही समय में टैमोक्सीफेन इंजेक्शन। विकिरण प्रक्रिया को तुरंत किया जाना चाहिए, और चूहों को सीधे उनके मूल पिंजरों में वापस कर दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, नरम भोजन और बहुत सारा पानी प्रदान करने से विकिरण के कुछ प्रतिकूल प्रभावों को सुधारने में मदद मिल सकती है। स्विस-रोल तकनीक को आंतों के ऊतकों के व्यापक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए सुझाव दियाजाता है। यह तकनीक तुच्छ नहीं है, और यह सुनिश्चित करने के लिए पूर्व प्रयास किया जाना चाहिए कि धुंधला होने के लिए ऊतक की त्रुटिहीन गुणवत्ता प्राप्त की जाती है। चूहों के प्रयोगों और धुंधलापन के लिए सभी समाधान ताजा तैयार किए जाने चाहिए और उचित परिस्थितियों में संग्रहीत किए जाने चाहिए। एंटीबॉडी के साथ काम करते समय, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों का उपयोग करके स्लाइडों का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है और यदि संभव हो, तो एक ही कैटलॉग नंबर और लॉट नंबर के साथ एंटीबॉडी का उपयोग करें। इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और तैयारी के 1 सप्ताह के भीतर चित्रित किया जाना चाहिए। लंबे समय तक भंडारण, यहां तक कि -20 डिग्री सेल्सियस पर, सिग्नल के नुकसान का परिणाम हो सकता है। एच एंड ई स्लाइड को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है क्योंकि फ्लोरोफोरे स्थिरता के नुकसान की कोई चिंता नहीं है।

सारांश में, यहां प्रस्तुत वंश-अनुरेखण विकिरण चोट मॉडल अपमान के बाद आंतों के सेल भाग्य को ट्रैक करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रासंगिक मॉडल है और आंतों के उपकला के पैथोफिज़ियोलॉजी की समझ में सुधार के लिए विभिन्न मुराइन मॉडल और आणविक तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है। आंतों के उपकला पुनर्जनन को नियंत्रित करने वाले आणविक और सेलुलर तंत्र में अंतर्दृष्टि नए उपचार और लाभकारी चिकित्सीय हस्तक्षेप के विकास का कारण बन सकती है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक ऊतक नमूना तैयारी के साथ विशेषज्ञ सहायता के लिए स्टोनी ब्रुक कैंसर सेंटर हिस्टोलॉजी रिसर्च कोर और पशु देखभाल और हैंडलिंग के साथ सहायता के लिए स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधन प्रभाग को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान डीके 124342 से एग्निएस्का बी बियालकोवस्का और डीके052230 से डॉ विन्सेंट डब्ल्यू यांग को दिए गए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

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References

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जीव विज्ञान अंक 185
आयनीकरण विकिरण के जवाब में आंतों के उपकला पुनर्जनन
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Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

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