Summary
Denne protokollen beskriver en analyse for å bestemme respons på levamisol, en farmakologisk agonist av en klasse Caenorhabditis elegans acetylkolinreseptorer. I denne flytende levamisolsvømmingsanalysen observerer og kvantitiserer forskere visuelt den tidsavhengige lammelsen av dyr dyrket i 24-brønnsplater.
Abstract
Ved det nevromuskulære veikrysset (NMJ) fører bindingen av den eksitatoriske nevrotransmitteren acetylkolin (ACh) til postsynaptiske reseptorer til muskelkontraksjon. Som i vertebrat skjelettmuskulatur er kolinerg signalering i kroppsveggmusklene til modellorganismen Caenorhabditis elegans nødvendig for bevegelse. Eksponering for levamisol, en farmakologisk agonist av en klasse ACh-reseptorer på kroppens veggmuskler, forårsaker tidsavhengig lammelse av villdyr. Endret følsomhet for levamisol antyder defekter i signalering ved NMJ eller muskelfunksjon. Her presenteres en protokoll for en flytende levamisolanalyse utført på C. elegans dyrket i 24-brønnsplater. Kraftig svømming av dyrene i væske muliggjør vurdering og kvantifisering av levamisol-indusert lammelse i hundrevis av ormer over en times tidsperiode uten å kreve fysisk manipulasjon. Denne prosedyren kan brukes med både villtype og mutanter som har endret følsomhet for levamisol for å demonstrere de funksjonelle konsekvensene av endret signalering ved NMJ.
Introduction
Aktivering av postsynaptiske acetylkolinreseptorer (AChRs) på skjelettmuskulatur resulterer i et elektrisk signal som fører til muskelkontraksjon. Forstyrrelse av nevromuskulær funksjon resulterer i myasteniske syndromer og muskeldystrofier hos mennesker 1,2,3,4. Nematoden Caenorhabditis elegans har blitt brukt mye for å lære om evolusjonært konserverte grunnleggende biologiske prosesser og sykdomsmekanismer. Vertebrate skjelettmuskler og C. elegans kroppsveggmuskler er funksjonelt ekvivalente i kontrollen av bevegelse5. Her presenteres en enkel analyse som kan brukes til å sammenligne villtype C. elegans med mutanter som har endret nevromuskulær signalering eller muskelfunksjon.
Eksitatoriske og hemmende innganger mottatt fra henholdsvis kolinerge og GABAergiske motorneuroner får muskler på den ene siden av C. elegans-kroppen til å trekke seg sammen mens musklene på den andre siden slapper av, noe som muliggjør koordinert bevegelse6. Levamisol, et anthelmintisk middel som brukes til å behandle parasittiske nematodeinfeksjoner, binder seg til og aktiverer konstitutivt en klasse AChRs på kroppens veggmuskler, noe som resulterer i tidsavhengig lammelse7. Dermed kan endret følsomhet for levamisol brukes til å identifisere C. elegans med defekter i balansen mellom eksitatorisk og hemmende signalering 7,8,9,10,11,12,13,14,15. For eksempel mutasjoner i underenheter av levamisolfølsom AChR (L-AChR), som UNC-63, samt C. elegans homolog av Cubilin, LEV-10, som kreves for L-AChR-klynger ved synapsen, påvirker eksitatorisk signalering og resulterer i levamisolresistens 7,8. Mutasjoner i GABAA-reseptoren UNC-49 reduserer hemmende signalering og forårsaker overfølsomhet overfor levamisol12.
Overfølsomhet eller resistens mot levamisol har tradisjonelt blitt vurdert ved å overføre dyr til agarplater som inneholder levamisol og deretter regelmessig prodding ormene for å bestemme tidspunktet for lammelse oppstår13,14,15. Vi har utviklet en flytende levamisol svømmeanalyse som eliminerer behovet for fysisk manipulering av dyrene og muliggjør screening av hundrevis av dyr på bare 1 time. Her beskrives bruken av denne analysen med villtype, unc-63 (x26), lev-10 (x17) og unc-49 (e407) dyr. Imidlertid kan denne protokollen også utføres på C. elegans utsatt for RNAi, som ble gjort for å validere knockdowns identifisert i en genom-bred RNAi-skjerm for endret levamisolfølsomhet11.
For denne farmakologiske analysen ble ormer dyrket til voksen alder i 24-brønnsplater, 0,4 mM levamisol i M9-buffer ble tilsatt til hver brønn, og antall bevegelige dyr ble registrert hvert 5. minutt i 1 time. Levamisolindusert lammelse ble visuelt observert over tid, og etter fullført analyse ble data kvantifisert. Evalueringen av mutanter sammen med wild-type C. elegans tillater elevene å først gjøre spådommer om potensielle fenotypiske effekter og deretter utføre eksperimenter for å teste sine hypoteser. Avslutningsvis er denne enkle, billige, flytende levamisolanalysen en ideell måte å demonstrere virkningen av tap av spesifikke gener på NMJ-funksjonen.
Protocol
1. Klargjøring av plater for levamisolanalysen
- Forbered nematodevekstmedium (NGM) media ved å kombinere 3 g NaCl, 2,5 g pepton og 17 g agar med 1 liter avionisert (DI) vann i en kolbe med rørstang.
- Etter autoklavering, legg mediet på en kokeplate satt til 70 ° C og rør med moderat hastighet i 1 time.
- Tilsett 1 ml 5 mg / ml kolesterol dråpevis for å forhindre nedbør, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 og 25 ml 1 M pH 6,0 kaliumfosfatbuffer til mediet.
- Overfør 2 ml NGM-medier til hver brønn i en 24-brønnsplate med en steril serologisk pipette (figur 1).
- La platene tørke på benken i 2 dager før såing med bakterier. For langtidsoppbevaring, plasser dem ved 4 °C.
- Strek ut OP50 E. coli på en lysogeni buljong (LB) plate og vokse over natten ved 37 ° C.
- Velg en enkelt OP50-koloni i B-buljong (10 g trypton og 5 g NaCl i 1 L DI H2O) og sett kulturen risting på 37 ° C over natten.
- Bruk en steril pipet til å slippe 30 μL OP50-suspensjon på agaren i midten av hver brønn (figur 1).
MERK: Pass på at du ikke skader agaroverflaten, da dette vil føre til ormegraving. - La platene stå i romtemperatur i minst 2 dager etter såing for å la det dannes en bakteriell plen.
MERK: Hvis bakteriene i midtbrønnene ikke er tørre etter 2 dager, la platene stå åpne i hetten i 20 minutter (figur 1). Platen skal helles og frøes med bakterier 1-2 uker før analysen.
2. Synkronisering av C. elegans (dag 1)
- Vokse villtype, unc-63 (x26), lev-10 (x17) og unc-49 (e407) C. elegans til voksen alder på 6 cm plater, forbereder minst åtte plater per belastning. Bekreft at det er mange ikke-sultne gravide voksne på platene.
MERK: Dette er dobbelt så mange plater som nødvendig; Det er imidlertid viktig å ha reserveplater i tilfelle den første batchen av egg blir ødelagt under bleking. - Lag 10x M9 buffer ved å oppløse 59,6 g Na 2 HPO 4 (dibasisk), 29,9 g KH 2 PO 4 (monobasisk), 12,8 g NaCl og2,5gMgSO4 i 750 ml DI-vann under omrøring. Når det er oppløst, ta volumet opp til 1 L og filtrer steriliser. Fortynn 1:10 og autoklav for å lage 1x M9 buffer.
MERK: 1x M9-bufferen kan gjøres uker eller måneder i forveien. - Forbered blekeløsning under hetten på synkroniseringsdagen. Bland 10 ml blekemiddel (materialtabell), 2,5 ml 10 N NaOH og 37,5 ml DI-vann i et 50 ml konisk rør. Bruk vernebriller, hansker og et laboratoriefrakk når du arbeider med blekeløsningen.
- Bruk en plastoverføringspipet til å vaske voksne ormer fra minst fire plater med 1x M9 buffer og overfør dem til et 15 ml konisk rør.
- Spinn ved 716 x g i 1 min ved romtemperatur, og fjern deretter supernatanten ved hjelp av en overføringsrør.
- Tilsett 10 ml av blekeløsningen. Inverter eller rist slangen forsiktig i ~4 minutter til de fleste, men ikke alle, av ormekroppene er oppløst (figur 1).
MERK: Vær forsiktig så du ikke overbleker ormene, da dette vil ødelegge eggene. Visse mutasjoner kan øke vanskeligheten med eggisolasjon. - Spinn ved 716 x g i 1 min.
- Hell av blekemiddeloppløsningen i en bevegelse; Så lenge røret ikke ristes på dette tidspunktet, vil eggene holde seg til siden av røret.
- Legg til 15 ml 1x M9 buffer og inverter. Spinn ved 716 x g i 1 min, og hell av M9-bufferen i en jevn bevegelse.
- Utfør tre vasker totalt med 1x M9 buffer, som beskrevet i trinn 2.9.
- Etter den endelige vasken, tilsett 10 ml fersk 1x M9 og legg på en rotator over natten ved 15 ° C for å isolere en synkronisert populasjon av sultede første larvedyr (L1).
MERK: Før du legger på rotatoren, må du kontrollere at det er egg i M9-bufferen. Hvis ikke, gjenta prep med backup plater og blekemiddel for en kortere tid.
3. Plating synkronisert C. elegans (dag 2)
- Skriv ut et 24-brønns platekart og tilordne stammer til randomiserte steder. Hver stamme skal være representert i 24-brønnsplaten minst seks ganger.
- Omtrent 24 timer etter blekemiddelforberedelsen, spinn ned utsultede L1-ormer i M9-buffer ved 716 x g i 1 min ved romtemperatur.
- Fjern ~9 ml M9-buffer med en plastoverføringspipet, og bland deretter forsiktig de sultede første larvalstadormene (L1s) i den gjenværende M9-bufferen.
- Pipet umiddelbart 3 μL av ormene i M9-buffer på et mikroskopglass og bestem antall L1-er; ønsket tall er 20-30 L1s i 3 μL. Spinn ned og fjern M9 hvis ormkonsentrasjonen er for lav, og tilsett M9 hvis konsentrasjonen er for høy.
MERK: Kontroller antall ormer per 3 μL minst 2x, snu røret hver gang. - Pipet 3 μL L1s (20-30 ormer totalt) inn i hver brønn i henhold til det ferdiglagde platekartet (trinn 3.1; Figur 1).
MERK: Inverter røret med L1s i M9 ofte for å opprettholde en jevn fordeling av ormer som de vil bosette seg til bunnen. Hvis dette ikke gjøres, vil noen brønner ha for få ormer, mens andre vil ha for mange. Ikke stikk hull på agaren med pipetspissen, da dette vil føre til at dyrene graver seg. - La ormene vokse til voksen alder i 3 dager ved 20 °C.
MERK: Bruk av forskjellige veksttemperaturer og visse mutasjoner kan påvirke modningshastigheten, så sørg for å vurdere C. elegans livssyklus.
4. Utføre levamisolanalysen (dag 5)
- Skriv ut et tomt dataark, som vil bli brukt til å registrere antall ormer som beveger seg i hver brønn hvert 5. minutt i 1 time.
MERK: Studentene vil kunne telle ormene i maksimalt 12 brønner hvert 5. minutt. De 12 beste brønnene analyseres i den første timen, med de nederste 12 brønnene analysert i den påfølgende timen. - Sjekk ormene i 24-brønnsplatene. Bruk en markør til å lage en "X" på platelokket over brønner som har forurensning, har sultet eller har for mange ormer (>40), noe som vil gjøre telling vanskelig.
- Lag 0,4 mM levamisoloppløsning ved å tilsette 200 μL 100 mM levamisolbestand til 50 ml 1x M9. Forbered 100 mM levamisolbestand ved å oppløse 240,76 mg levamisolhydroklorid i 10 ml H2O og oppbevar det ved -20 °C.
MERK: Levamisol må fortynnes i M9; fortynning i H2O akselererer lammelse. Studentene skal bruke hansker. Inntak av høye konsentrasjoner av levamisol er giftig. - Start en tidtaker, og bruk deretter 1 ml 0,4 mM levamisol til de to første brønnene, slik at dyrene svømmer fritt. Fortsett å legge levamisol til de tilstøtende brønnene, svimlende tiden i henhold til antall brønner som skal analyseres.
MERK: For eksempel, hvis 10 brønner analyseres, vil levamisol bli tilsatt på følgende måte: brønnene 1 og 2 på tidspunkt 0, brønnene 3 og 4 etter 1 min, brønnene 5 og 6 etter 2 min, brønnene 7 og 8 etter 3 min, og brønnene 9 og 10 etter 4 min. - Etter 5 minutter begynner du å telle bare antall bevegelige ormer i hver brønn manuelt, fra og med den første brønnen, og registrerer dette tallet på dataarket (figur 1). Tellere kan brukes, men er ikke nødvendig for å nøyaktig bestemme antall bevegelige ormer.
MERK: Studentene må holde øye med timeren, da de noen ganger kommer bak i tidlige tidspunkter før mange ormer lammes. Antall tidspunkter kan justeres, eller færre brønner kan analyseres ved hvert tidspunkt om nødvendig. - Fortsett å telle antall bevegelige ormer i hver brønn hvert 5. minutt i 1 time.
MERK: Nedsenking i M9 induserer konstant svømmebevegelse i løpet av denne 1 timers analysen, noe som eliminerer behovet for prodding av ormene for å vurdere lammelse (figur 2A). Eksponering for 0,4 mM levamisoloppløsning induserer tidsavhengig lammelse som observert ved opphør av svømming; Ormer som lammer, gjenoppretter ikke. - Gjenta trinn 4.4.-4.6. for resten av brønnene i platen.
- På slutten av analysen, eller når tiden tillater det, registrer det totale antall ormer i hver brønn.
5. Analyse av data
- Hent platekartet (trinn 3.1.) og registrer hvilken belastning som tilsvarer hver brønn.
MERK: På grunn av mengden data som samles inn, vil den påfølgende analysen og diskusjonen av dataene ta minst et par timer. - Skriv inn dataene i et regneark, som starter med totalt antall ormer i hver brønn og organiserer etter genotype.
- Ved å kombinere data fra brønnene, bestem antall ormer som beveger seg på hvert tidspunkt for hver belastning.
- Bruk disse dataene til å lage en "overlevelseskurve" i den statistiske programvaren (Table of Materials) for å visuelt vise den tidsavhengige lammelsen av befolkningen (figur 2B).
- Lag en datatabell slik at kolonnen til venstre angir tid og påfølgende kolonner inneholder dataene for hver belastning. For hvert dyr som er lammet i løpet av de første 5 minuttene, opprett en rad og skriv inn en "1" i 5 min. Gjenta dette for hvert tidspunkt. For alle dyr som ikke lammer ved slutten av analysen, skriv inn en "0" i 60 min.
- Utfør parvise sammenligninger ved hjelp av log-rank (Mantel-Cox) -testen i den statistiske programvaren (Table of Materials) for å avgjøre om det er en statistisk signifikant forskjell mellom to forskjellige stammer.
- For tilleggs-/alternativanalyse, i stedet for å utføre trinn 5.3. og trinn 5.4., bestemme prosentandelen av dyr som beveger seg i hver brønn ved hvert tidspunkt. Plott gjennomsnittet med standardfeil på hvert tidspunkt for alle stammer analysert ved hjelp av et regnearkprogram eller den statistiske programvaren (figur 2C).
Representative Results
Signalering gjennom AChRs- og GABA-reseptorer gjør at muskler på den ene siden av C. elegans-kroppen kan trekke seg sammen mens musklene på den andre siden slapper av, noe som muliggjør koordinert bevegelse 6,16. Levamisolbinding til ionotrope L-AChRs forårsaker sammentrekning, noe som fører til tidsavhengig lammelse av villdyr. Her vurderte vi sensitiviteten til villtype, unc-63 L-AChR mutant, lev-10 L-AChR clustering mutant og unc-49 GABAA reseptor mutant C. elegans til levamisol. Mutasjoner i underenheter av L-AChR, så vel som i gener som kreves for å transportere L-AChRs til muskelplasmamembranen, klynger av postsynaptiske L-AChRs og nedstrøms Ca 2+ signalering, forårsaker motstand mot levamisolindusert lammelse 7,8,9,10,11,16,17, som observert i unc-63 og lev-10 mutanter (figur2B ,C). Tap av GABA-gated ion kanal UNC-49 forårsaket levamisolhypersensitivitet (figur 2B, C) på grunn av forstyrrelse av riktig balanse mellom kolinerg og GABAerg signalering12. Da denne analysen nylig ble utført av studenter i et avansert genetikklaboratorium, observerte 100% av studentene levamisolresistens med unc-63 og lev-10 mutanter, mens 88% observerte levamisoloverfølsomhet med unc-49 mutanten. Disse dataene samlet inn med den flytende levamisolsvømmeanalysen er i samsvar med fenotyper observert i tradisjonelle platebaserte levamisolanalyser 7,8,11,12,13.
Figur 1: Skjematisk fremstilling og implementering av levamisolanalyse. 24-brønns NGM-plater helles; 2 dager senere blir OP50 Escherichia coli sådd inn i brønnene. C. elegans synkroniseres gjennom blekemiddelprep, og første larvestadium (L1) dyr for hver stamme som skal analyseres (vill type, svart; UNC-63(x26), magenta; lev-10(x17), grønn; UNC-49(E407), blå) pipetteres i brønnene i henhold til et forhåndsbestemt platekart dagen etter. Etter 3 dagers vekst ved 20 ºC, eller når dyrene når voksen alder, tilsettes 0,4 mM levamisol i M9-buffer til hver brønn, og antall bevegelige dyr telles hvert 5. minutt i 1 time. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Levamisolindusert lammelse hos villtype og representativ mutant C. elegans. (A) Eksponering for 0,4 mM levamisol forårsaker tidsavhengig lammelse; dette observeres ikke for dyr som svømmer i 1x M9 buffer for 1 t. (B) Tidsavhengig lammelse av villtype (svart), UNC-63 (x26) (magenta), lev-10 (x17) (grønn) og UNC-49 (E407) (blå) dyr i levamisolsvømmingsanalysen. Tap av L-AChR-underenheten UNC-63 eller L-AChR-klyngeprotein LEV-10 resulterte i levamisolresistens, og tap av GABA A-reseptoren UNC-49 forårsaket levamisolhypersensitivitet. n ≥ 50 per genotype, p < 0,0001 for alle mutanter sammenlignet med villtypen i dette representative eksperimentet. (C) Ved å bruke de samme dataene som i panel (B), ble prosentandelen av bevegelige dyr ved hvert tidspunkt (gjennomsnitt av prosentandelene for hver brønn ± SE) bestemt for hver stamme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Endret respons på levamisol kan identifisere gener som kreves for postsynaptisk kolinerg signalering og muskelfunksjon. Protokollen her beskriver en flytende levamisolanalyse som brukes til å kvantifisere tidsavhengig lammelse over en 1 time tidsperiode. Studentene gjør spådommer om effekten av visse genetiske mutasjoner, utfører et eksperiment med stor prøvestørrelse, og kvantitiserer deretter resultatene. Denne analysen er en enkel, effektiv måte å kvantifisere levamisol-indusert lammelse uten å plukke eller prodding dyr, noe som gjør den egnet for lavere laboratorier, samt forskere som studerer nevromuskulær overføring. Diskutert her er noen av de vanligste fallgruvene, begrensningene i analysen og en variasjon i protokollen som muliggjør bruk med RNAi knockdown dyr; Også diskutert her er hvordan denne analysen kan legges inn i en kursbasert grunnforskningserfaring.
Riktig forberedelse av 24-brønnsplatene er viktig. Først må bakterieplener være helt tørre før de oppdager L1-dyr i brønnene. Hvis ikke tørket nok, blandes bakteriene med levamisoloppløsningen under analysen, snu væsken overskyet og forhindrer individer i å kunne telle ormene. For det andre, når du synkroniserer ormer gjennom blekemiddelprep, må dyrene ikke bli utsatt for blekemiddelløsningen for lenge, da dette vil føre til at det beskyttende belegget på eggene går i oppløsning. For det tredje er det avgjørende å oppdage bare 20-30 L1s per brønn, da for mange ormer i brønnene gjør det ekstremt vanskelig å nøyaktig telle antallet som beveger seg i den tildelte tiden. Til slutt er det viktig å opprettholde en aseptisk teknikk under fremstillingen av platene, da forurensede brønner ikke kan analyseres.
Det er noen begrensninger som må vurderes når du utfører denne analysen. For det første kan telling av antall bevegelige ormer i hver brønn hvert 5. minutt være overveldende for personer som mangler tidligere laboratorieerfaring, og dette kan føre til upresis datainnsamling. Når det gjelder andre analyser som brukes til å bestemme legemiddelfølsomhet18,19, kan dette eksperimentet utføres med færre tidspunkter. For det andre er plating av sultne L1-er isolert fra en blekemiddelprep en enkel metode for å oppnå en synkronisert befolkning; Det må imidlertid gjøres justeringer dersom utviklingstidspunktet er forskjellig mellom stammene som analyseres. Det er mulig å plukke sent fjerde larvestadium dyr (L4s) i en 24-brønns plate for denne analysen; Men når du forbereder mange plater, er dette for arbeidskrevende. Alternativt bør man bestemme hvor lang tid det tar for hver stamme å nå L4 og deretter plassere L1-ene i brønnene på forskjellige tidspunkter for å justere for forskjeller i modningshastighet. Til slutt, mens denne analysen kan brukes til å identifisere nye gener som er viktige for postsynaptisk muskelfunksjon11, kan endret levamisolrespons også skyldes mutasjon eller RNAi-knockdown av presynaptiske gener12. Hvis endret levamisolfølsomhet observeres, må ytterligere eksperimenter utføres for å bestemme årsaken til denne fenotypen.
Ved å gjøre noen få modifikasjoner på 24-brønnsplatene, kan den beskrevne levamisolsvømmeanalysen også utføres på RNAi-knockdowndyr11. Gene knockdown gjennom RNAi kan oppnås ved å mate C. elegans bakterier som uttrykker dobbeltstrenget RNA som tilsvarer genet av interesse20. For fremstilling av RNAi-plater må 1 ml 1M IPTG og 1 ml 25 mg / ml karbenicillin tilsettes per liter medium etter fjerning fra autoklaven. Bakteriekulturer dyrkes ved å plukke en enkelt koloni i 3 ml LB-buljong pluss 3 μL 25 mg / ml karbenicillin, og riste ved 37 ° C over natten, og platekartet lages når de forskjellige bakteriene blir oppdaget i brønnene. C. elegans synkroniseres med blekemiddelprep som beskrevet; Imidlertid bør RNAi overfølsom eri-1 (mg366) stamme brukes i stedet for den ville typen for å øke gen knockdown. RNAi knockdowns resulterer i de samme levamisolfenotypene observert for tap av funksjon mutanter11.
Protokollen som presenteres her kan brukes i laboratorieforskning, som et frittstående eksperiment i bachelorlaboratoriet, eller i åpningsukene av et avansert grunnkurs som en introduksjon til grunnleggende C. elegans teknikker og nevromuskulær funksjon. I et mer avansert oppdagelsesbasert kurs kan studentene bruke denne analysen til å avgjøre om tapet av C. elegans homologer av gener mutert hos personer med myasteniske syndromer, muskeldystrofier eller myopatier endrer levamisolfølsomhet. Avslutningsvis gir denne enkle, billige levamisolfølsomhetsanalysen en praktisk tilnærming til å lære om signalering ved NMJ og få erfaring med å jobbe med C. elegans modellsystem.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Riya Dattani og Lauren Hogstrom, som samlet dataene i figur 2B, C blind for genotype i BISC413 Advanced Genetics Laboratory (våren 2022) ved University of Delaware. Ytterligere informasjon om BISC413 kursbasert grunnforskningserfaring (CURE), samt tilgang til laboratoriehåndboken designet av J. Tanis, er tilgjengelig på forespørsel. Nematodestammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center, som støttes av NIH-ORIP (P40 OD010440). Dette arbeidet ble støttet av en P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (til JET).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
References
- Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
- Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
- Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
- Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
- Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
- Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
- Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
- Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047 (2021).
- Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
- Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
- Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
- Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
- Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
- Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
- Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
- Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400 (2017).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
