Detta protokoll beskriver en analys för att bestämma svaret på levamisol, en farmakologisk agonist av en klass av Caenorhabditis elegans acetylkolinreceptorer. I denna flytande levamisolsimanalys observerar och kvantifierar forskare visuellt den tidsberoende förlamningen hos djur som odlas i 24-brunnsplattor.
Vid den neuromuskulära korsningen (NMJ) leder bindningen av den excitatoriska neurotransmittorn acetylkolin (ACh) till postsynaptiska receptorer till muskelkontraktion. Liksom i ryggradsdjurens skelettmuskulatur krävs kolinerg signalering i kroppsväggsmusklerna hos modellorganismen Caenorhabditis elegans för rörelse. Exponering för levamisol, en farmakologisk agonist av en klass av ACh-receptorer på kroppsväggsmusklerna, orsakar tidsberoende förlamning av vilda djur. Förändrad känslighet för levamisol tyder på defekter i signalering vid NMJ eller muskelfunktion. Här presenteras ett protokoll för en flytande levamisoleanalys utförd på C. elegans odlade i 24-brunnsplattor. Kraftig simning av djuren i vätska möjliggör bedömning och kvantifiering av levamisolinducerad förlamning i hundratals maskar under en timmes tidsperiod utan att kräva fysisk manipulation. Denna procedur kan användas med både vildtyp och mutanter som har förändrad känslighet för levamisol för att visa de funktionella konsekvenserna av förändrad signalering vid NMJ.
Aktivering av postsynaptiska acetylkolinreceptorer (AChRs) på skelettmuskulaturen resulterar i en elektrisk signal som leder till muskelkontraktion. Störning av neuromuskulär funktion resulterar i myastheniska syndrom och muskeldystrofier hos människor 1,2,3,4. Nematoden Caenorhabditis elegans har använts flitigt för att lära sig om evolutionärt bevarade grundläggande biologiska processer och sjukdomsmekanismer. Ryggradsdjurens skelettmuskler och C. elegans kroppsväggsmuskler är funktionellt likvärdiga vid kontroll av rörelse5. Här presenteras en enkel analys som kan användas för att jämföra vildtyp C. elegans med mutanter som har förändrat neuromuskulär signalering eller muskelfunktion.
Excitatoriska och hämmande ingångar från kolinerga respektive GABAerga motorneuroner får muskler på ena sidan av C. elegans kropp att dra ihop sig medan musklerna på andra sidan slappnar av, vilket möjliggör samordnad rörelse6. Levamisol, ett anthelmintiskt medel som används för att behandla parasitiska nematodinfektioner, binder till och aktiverar konstitutivt en klass av AChR på kroppsväggsmusklerna, vilket resulterar i tidsberoende förlamning7. Således kan förändrad känslighet för levamisol användas för att identifiera C. elegans med defekter i balansen mellan excitatorisk och hämmande signalering 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Till exempel mutationer i underenheter av den levamisolkänsliga AChR (L-AChR), såsom UNC-63, liksom C. elegans homolog av Cubilin, LEV-10, som krävs för L-AChR-klustring vid synapsen, påverkar excitatorisk signalering och resulterar i levamisolresistens 7,8. Mutationer i GABAA-receptorn UNC-49 minskar hämmande signalering och orsakar överkänslighet mot levamisol12.
Överkänslighet eller resistens mot levamisol har traditionellt bedömts genom att överföra djur till agarplattor som innehåller levamisol och sedan regelbundet stötta maskarna för att bestämma den tidpunkt då förlamning inträffar13,14,15. Vi har utvecklat en flytande levamisol simanalys som eliminerar behovet av fysisk manipulation av djuren och möjliggör screening av hundratals djur på bara 1 timme. Här beskrivs användningen av denna analys med vildtyp, unc-63 (x26), lev-10 (x17) och unc-49 (e407) djur. Detta protokoll kan dock också utföras på C. elegans som exponerats för RNAi, vilket gjordes för att validera knockdowns som identifierats i en genomomfattande RNAi-skärm för förändrad levamisolkänslighet11.
För denna farmakologiska analys odlades maskar till vuxen ålder i 24-brunnsplattor, 0,4 mM levamisol i M9-buffert tillsattes till varje brunn och antalet rörliga djur registrerades var 5: e minut i 1 timme. Levamisolinducerad förlamning observerades visuellt över tiden, och efter avslutad analys kvantifierades data. Utvärderingen av mutanter tillsammans med vildtyp C. elegans gör det möjligt för eleverna att först göra förutsägelser om potentiella fenotypiska effekter och sedan utföra experiment för att testa sina hypoteser. Sammanfattningsvis är denna enkla, billiga, flytande levamisoleanalys ett idealiskt sätt att visa effekten av förlusten av specifika gener på NMJ-funktionen.
Förändrat svar på levamisol kan identifiera gener som krävs för postsynaptisk kolinerg signalering och muskelfunktion. Protokollet här beskriver en flytande levamisoleanalys som används för att kvantifiera tidsberoende förlamning under en tidsperiod på 1 timme. Eleverna gör förutsägelser om effekterna av vissa genetiska mutationer, utför ett experiment med stor provstorlek och kvantifierar sedan sina resultat. Denna analys är ett enkelt, effektivt sätt att kvantifiera levamisolinducerad förlamning utan att plocka eller sticka djur, vilket gör den lämplig för grundutbildningslaboratorier, liksom forskare som studerar neuromuskulär överföring. Här diskuteras några av de vanligaste fallgroparna, analysens begränsningar och en variation av protokollet som möjliggör dess användning med RNAi-knockdown-djur; Här diskuteras också hur denna analys kan bäddas in i en kursbaserad grundutbildningsupplevelse.
Korrekt förberedelse av 24-brunnsplattorna är viktigt. Först måste bakteriella gräsmattor vara helt torra innan de upptäcker L1-djur i brunnarna. Om de inte torkas tillräckligt blandas bakterierna med levamisollösningen under analysen, vilket gör vätskan grumlig och förhindrar att individer kan räkna maskarna. För det andra, när man synkroniserar maskar genom blekmedelsförberedelser, får djuren inte utsättas för blekmedelslösningen för länge eftersom detta kommer att leda till att den skyddande beläggningen på äggen sönderfaller. För det tredje är det viktigt att bara upptäcka 20-30 L1s per brunn, eftersom för många maskar i brunnarna gör det extremt svårt att exakt räkna antalet som rör sig under den tilldelade tiden. Slutligen är det viktigt att upprätthålla en aseptisk teknik under beredningen av plattorna eftersom förorenade brunnar inte kan analyseras.
Det finns några begränsningar som måste beaktas när du utför denna analys. För det första kan det vara överväldigande att räkna antalet rörliga maskar i varje brunn var 5: e minut för individer som saknar tidigare laboratorieerfarenhet, och detta kan leda till oprecis datainsamling. När det gäller andra analyser som används för att bestämma läkemedelskänslighet18,19 kan detta experiment utföras med färre tidpunkter. För det andra är plätering av svältade L1s isolerade från en blekmedelsförberedelse en enkel metod för att erhålla en synkroniserad befolkning; Justeringar måste dock göras om utvecklingstidpunkten skiljer sig åt mellan de stammar som analyseras. Det är möjligt att plocka sena fjärde larvstadiumdjur (L4s) i en 24-brunnsplatta för denna analys; Men när man förbereder många plattor är detta för arbetsintensivt. Alternativt bör man bestämma hur lång tid det tar för varje stam att nå L4 och sedan placera L1:orna i brunnarna vid olika tidpunkter för att justera för skillnader i mognadshastighet. Slutligen, medan denna analys kan användas för att identifiera nya gener som är viktiga för postsynaptisk muskelfunktion11, kan förändrat levamisolesvar också orsakas av mutation eller RNAi-knockdown av presynaptiska gener12. Om förändrad levamisolkänslighet observeras måste ytterligare experiment utföras för att bestämma orsaken till denna fenotyp.
Genom att göra några modifieringar av 24-brunnsplattorna kan den beskrivna levamisole-simanalysen också utföras på RNAi knockdown-djur11. Gene knockdown genom RNAi kan uppnås genom att mata C. elegans-bakterier som uttrycker dubbelsträngat RNA som motsvarar genen av intresse20. För beredning av RNAi-plattor måste 1 ml 1 M IPTG och 1 ml 25 mg / ml karbenicillin tillsättas per liter media efter avlägsnande från autoklaven. Bakteriekulturer odlas genom att plocka en enda koloni i 3 ml LB-buljong plus 3 μL 25 mg / mLcarbenicillin och skaka vid 37 ° C över natten, och plattkartan görs när de olika bakterierna upptäcks i brunnarna. C. elegans synkroniseras med blekmedelsförberedelser enligt beskrivningen; emellertid bör RNAi-överkänslig eri-1 (mg366) stam användas istället för den vilda typen för att öka gennedslagningen. RNAi-knockdowns resulterar i samma levamisolefenotyper som observerats för funktionsförlustmutanter11.
Protokollet som presenteras här kan användas i laboratorieforskning, som ett fristående experiment i grundutbildningslaboratoriet eller under de inledande veckorna av en avancerad grundkurs som en introduktion till grundläggande C. elegans-tekniker och neuromuskulär funktion. I en mer avancerad upptäcktsbaserad kurs kan studenterna använda denna analys för att avgöra om förlusten av C. elegans-homologer av gener muterade hos individer med myastheniska syndrom, muskeldystrofier eller myopatier förändrar levamisolkänsligheten. Sammanfattningsvis ger denna enkla, billiga levamisolekänslighetsanalys ett praktiskt tillvägagångssätt för att lära sig om signalering vid NMJ och få erfarenhet av att arbeta med C. elegans-modellsystemet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Riya Dattani och Lauren Hogstrom, som samlade in data i figur 2B, C blind för genotyp i BISC413 Advanced Genetics Laboratory (våren 2022) vid University of Delaware. Ytterligare information om BISC413 kursbaserad grundutbildning (CURE), samt tillgång till labbhandboken designad av J. Tanis, finns tillgänglig på begäran. Nematodstammar tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center, som stöds av NIH-ORIP (P40 OD010440). Detta arbete stöddes av en P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (till J.E.T.).
60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
Low Splash Regular Bleach – 121oz – up & up | Target | Search target.com | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |