Summary
Detta protokoll beskriver en analys för att bestämma svaret på levamisol, en farmakologisk agonist av en klass av Caenorhabditis elegans acetylkolinreceptorer. I denna flytande levamisolsimanalys observerar och kvantifierar forskare visuellt den tidsberoende förlamningen hos djur som odlas i 24-brunnsplattor.
Abstract
Vid den neuromuskulära korsningen (NMJ) leder bindningen av den excitatoriska neurotransmittorn acetylkolin (ACh) till postsynaptiska receptorer till muskelkontraktion. Liksom i ryggradsdjurens skelettmuskulatur krävs kolinerg signalering i kroppsväggsmusklerna hos modellorganismen Caenorhabditis elegans för rörelse. Exponering för levamisol, en farmakologisk agonist av en klass av ACh-receptorer på kroppsväggsmusklerna, orsakar tidsberoende förlamning av vilda djur. Förändrad känslighet för levamisol tyder på defekter i signalering vid NMJ eller muskelfunktion. Här presenteras ett protokoll för en flytande levamisoleanalys utförd på C. elegans odlade i 24-brunnsplattor. Kraftig simning av djuren i vätska möjliggör bedömning och kvantifiering av levamisolinducerad förlamning i hundratals maskar under en timmes tidsperiod utan att kräva fysisk manipulation. Denna procedur kan användas med både vildtyp och mutanter som har förändrad känslighet för levamisol för att visa de funktionella konsekvenserna av förändrad signalering vid NMJ.
Introduction
Aktivering av postsynaptiska acetylkolinreceptorer (AChRs) på skelettmuskulaturen resulterar i en elektrisk signal som leder till muskelkontraktion. Störning av neuromuskulär funktion resulterar i myastheniska syndrom och muskeldystrofier hos människor 1,2,3,4. Nematoden Caenorhabditis elegans har använts flitigt för att lära sig om evolutionärt bevarade grundläggande biologiska processer och sjukdomsmekanismer. Ryggradsdjurens skelettmuskler och C. elegans kroppsväggsmuskler är funktionellt likvärdiga vid kontroll av rörelse5. Här presenteras en enkel analys som kan användas för att jämföra vildtyp C. elegans med mutanter som har förändrat neuromuskulär signalering eller muskelfunktion.
Excitatoriska och hämmande ingångar från kolinerga respektive GABAerga motorneuroner får muskler på ena sidan av C. elegans kropp att dra ihop sig medan musklerna på andra sidan slappnar av, vilket möjliggör samordnad rörelse6. Levamisol, ett anthelmintiskt medel som används för att behandla parasitiska nematodinfektioner, binder till och aktiverar konstitutivt en klass av AChR på kroppsväggsmusklerna, vilket resulterar i tidsberoende förlamning7. Således kan förändrad känslighet för levamisol användas för att identifiera C. elegans med defekter i balansen mellan excitatorisk och hämmande signalering 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Till exempel mutationer i underenheter av den levamisolkänsliga AChR (L-AChR), såsom UNC-63, liksom C. elegans homolog av Cubilin, LEV-10, som krävs för L-AChR-klustring vid synapsen, påverkar excitatorisk signalering och resulterar i levamisolresistens 7,8. Mutationer i GABAA-receptorn UNC-49 minskar hämmande signalering och orsakar överkänslighet mot levamisol12.
Överkänslighet eller resistens mot levamisol har traditionellt bedömts genom att överföra djur till agarplattor som innehåller levamisol och sedan regelbundet stötta maskarna för att bestämma den tidpunkt då förlamning inträffar13,14,15. Vi har utvecklat en flytande levamisol simanalys som eliminerar behovet av fysisk manipulation av djuren och möjliggör screening av hundratals djur på bara 1 timme. Här beskrivs användningen av denna analys med vildtyp, unc-63 (x26), lev-10 (x17) och unc-49 (e407) djur. Detta protokoll kan dock också utföras på C. elegans som exponerats för RNAi, vilket gjordes för att validera knockdowns som identifierats i en genomomfattande RNAi-skärm för förändrad levamisolkänslighet11.
För denna farmakologiska analys odlades maskar till vuxen ålder i 24-brunnsplattor, 0,4 mM levamisol i M9-buffert tillsattes till varje brunn och antalet rörliga djur registrerades var 5: e minut i 1 timme. Levamisolinducerad förlamning observerades visuellt över tiden, och efter avslutad analys kvantifierades data. Utvärderingen av mutanter tillsammans med vildtyp C. elegans gör det möjligt för eleverna att först göra förutsägelser om potentiella fenotypiska effekter och sedan utföra experiment för att testa sina hypoteser. Sammanfattningsvis är denna enkla, billiga, flytande levamisoleanalys ett idealiskt sätt att visa effekten av förlusten av specifika gener på NMJ-funktionen.
Protocol
1. Beredning av plattor för levamisoleanalysen
- Förbered nematodtillväxtmedium (NGM) -medier genom att kombinera 3 g NaCl, 2,5 g pepton och 17 g agar med 1 liter avjoniserat (DI) vatten i en kolv med en omrörningsstång.
- Efter autoklavering, sätt mediet på en kokplatta inställd på 70 ° C och rör om med en måttlig hastighet i 1 h.
- Tillsätt 1 ml 5 mg / ml kolesterol droppvis för att förhindra utfällning, 1 ml 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 och 25 ml 1 M pH 6,0 kaliumfosfatbuffert till mediet.
- Överför 2 ml NGM-media till varje brunn på en 24-brunnsplatta med en steril serologisk pipett (figur 1).
- Låt plattorna torka på bänkskivan i 2 dagar innan du sår med bakterier. För långvarig lagring, placera dem vid 4 °C.
- Stryk ut OP50 E. coli på en lysogen buljongplatta (LB) och odla över natten vid 37 °C.
- Välj en enda OP50-koloni i B-buljong (10 g trypton och 5 g NaCl i 1 liter DIH2O) och låt kulturen skaka vid 37 °C över natten.
- Släpp 30 μl OP50-suspension på agar i mitten av varje brunn med en steril pipett (figur 1).
OBS: Var noga med att inte skada agarytan eftersom det kommer att leda till maskgrävning. - Låt plattorna sitta i rumstemperatur i minst 2 dagar efter sådd så att en bakteriegräsmatta bildas.
OBS: Om bakterierna i mittbrunnarna inte är torra efter 2 dagar, lämna plattorna öppna i huven i 20 minuter (figur 1). Plattorna ska hällas och utsädes med bakterier 1-2 veckor före analysen.
2. Synkronisera C. elegans (dag 1)
- Odla vildtyp, unc-63 (x26), lev-10 (x17) och unc-49 (e407) C. elegans till vuxen ålder på 6 cm plattor, förbereda minst åtta plattor per stam. Bekräfta att det finns många icke-svältande gravida vuxna på tallrikarna.
OBS: Detta är dubbelt så många plattor som behövs; Det är dock viktigt att ha reservplattor om den första satsen ägg förstörs under blekning. - Gör 10x M9-buffert genom att lösa upp 59,6 g Na 2 HPO 4 (dibasisk), 29,9 g KH 2 PO4 (monobasisk), 12,8 g NaCl och 2,5g MgSO4 i 750 ml DI-vatten under omrörning. När den är upplöst, ta upp volymen till 1 liter och filtrera sterilisera. Späd 1:10 och autoklave för att göra 1x M9 buffert.
OBS: 1x M9-bufferten kan göras veckor eller månader i förväg. - Förbered blekningslösning under huven på synkroniseringsdagen. Blanda 10 ml blekmedel (materialtabell), 2,5 ml 10 N NaOH och 37,5 ml DI-vatten i ett 50 ml koniskt rör. Använd skyddsglasögon, handskar och en labbrock när du arbetar med blekningslösningen.
- Tvätta gravida vuxna maskar från minst fyra plattor med 1x M9-buffert med en plastöverföringspipett och överför dem till ett 15 ml koniskt rör.
- Snurra på 716 x g i 1 min vid rumstemperatur och ta sedan bort supernatanten med en överföringspipett.
- Tillsätt 10 ml av blekningslösningen. Vänd eller skaka försiktigt röret i ~ 4 minuter tills de flesta, men inte alla, maskkropparna har lösts upp (figur 1).
OBS: Var försiktig så att du inte bleker maskarna för mycket eftersom det kommer att förstöra äggen. Vissa mutationer kan öka svårigheten med äggisolering. - Snurra på 716 x g i 1 min.
- Häll av blekmedelslösningen i en rörelse; Så länge röret inte skakas vid denna tidpunkt kommer äggen att hålla fast vid sidan av röret.
- Lägg till 15 ml 1x M9-buffert och invertera. Snurra på 716 x g i 1 min och häll av M9-bufferten i en jämn rörelse.
- Utför totalt tre tvättar med 1x M9-buffert, enligt beskrivningen i steg 2.9.
- Efter den sista tvätten, tillsätt 10 ml färsk 1x M9 och placera på en rotator över natten vid 15 ° C för att isolera en synkroniserad population av svältande första larvstadium (L1) stadiumdjur.
OBS: Innan du placerar på rotatorn, kontrollera att det finns ägg i M9-bufferten. Om inte, upprepa förberedelsen med reservplattor och blekmedel under en kortare tid.
3. Plätering synkroniserad C. elegans (dag 2)
- Skriv ut en 24-brunns plattkarta och tilldela stammar till slumpmässiga platser. Varje stam ska representeras i 24-brunnsplattan minst sex gånger.
- Cirka 24 timmar efter blekningsförberedelsen, snurra ner kläckta utsvultna L1-maskar i M9-buffert vid 716 x g i 1 min vid rumstemperatur.
- Ta bort ~ 9 ml M9-buffert med en plastöverföringspipett och blanda sedan försiktigt de svältande första larvstegsmaskarna (L1s) i den återstående M9-bufferten.
- Pipett omedelbart 3 μL av maskarna i M9-buffert på ett mikroskopglas och bestäm antalet L1s; önskat tal är 20-30 L1s i 3 μL. Snurra ner och ta bort M9 om maskkoncentrationen är för låg och tillsätt M9 om koncentrationen är för hög.
OBS: Kontrollera antalet maskar per 3 μL minst 2x, invertera röret varje gång. - Pipett 3 μL L1s (totalt 20-30 maskar) i varje brunn enligt den färdiga plattkartan (steg 3.1; Figur 1).
OBS: Invertera röret med L1s i M9 ofta för att upprätthålla en jämn fördelning av maskar eftersom de kommer att sätta sig till botten. Om detta inte är gjort kommer vissa brunnar att ha för få maskar, medan andra kommer att ha för många. Piercera inte heller agar med pipettspetsen eftersom det kommer att få djuren att gräva. - Låt maskarna växa till vuxen ålder i 3 dagar vid 20 °C.
OBS: Användningen av olika tillväxttemperaturer och vissa mutationer kan påverka mognadshastigheten, så var noga med att överväga C. elegans livscykel.
4. Utföra levamisoleanalysen (dag 5)
- Skriv ut ett tomt datablad som kommer att användas för att registrera antalet maskar som rör sig i varje brunn var 5: e minut i 1 timme.
OBS: Eleverna kommer att kunna räkna maskarna i högst 12 brunnar var 5: e minut. De 12 bästa brunnarna analyseras under den första timmen, med de nedre 12 brunnarna analyserade under den efterföljande timmen. - Kontrollera maskarna i 24-brunnsplattorna. Använd en markör och gör ett "X" på plattlocket över alla brunnar som har förorening, har svält eller har för många maskar (>40), vilket gör det svårt att räkna.
- Gör 0,4 mM levamisollösning genom att tillsätta 200 μl 100 mM levamisolbuljong till 50 ml 1x M9. Bered 100 mM levamisol stam genom att lösa upp 240,76 mg levamisolhydroklorid i 10 mlH2Ooch förvara den vid −20 °C.
OBS: Levamisol måste spädas i M9. utspädning iH2Oaccelererar förlamning. Eleverna ska bära handskar. Förtäring av höga koncentrationer av levamisol är giftigt. - Starta en timer och tillsätt sedan 1 ml 0,4 mM levamisol till de två första brunnarna med hjälp av en överföringspipett, så att djuren simmar fritt. Fortsätt att lägga till levamisol till de intilliggande brunnarna, förskjuten tiden beroende på antalet brunnar som ska analyseras.
OBS: Till exempel, om 10 brunnar analyseras, kommer levamisol att tillsättas på följande sätt: brunnar 1 och 2 vid tiden 0, brunnar 3 och 4 efter 1 min, brunnar 5 och 6 efter 2 min, brunnar 7 och 8 efter 3 min och brunnar 9 och 10 efter 4 min. - Vid 5 minuter börjar du manuellt räkna endast antalet rörliga maskar i varje brunn, börjar med den första brunnen, och registrerar det numret på databladet (figur 1). Räknare kan användas men krävs inte för att exakt bestämma antalet rörliga maskar.
OBS: Eleverna måste hålla ett öga på timern eftersom de ibland kommer efter under tidiga tidpunkter innan många maskar förlamas. Antalet tidpunkter kan justeras, eller färre brunnar kan analyseras vid varje tidpunkt om det behövs. - Fortsätt att räkna antalet rörliga maskar i varje brunn var 5: e minut i 1 timme.
OBS: Nedsänkning i M9 inducerar konstant simrörelse under loppet av denna 1 h-analys, vilket eliminerar behovet av maskarnas prodding för att bedöma förlamning (figur 2A). Exponering för 0,4 mM levamisollösning inducerar tidsberoende förlamning som observerats genom att simningen upphör. maskar som förlamar återhämtar sig inte. - Upprepa steg 4.4.-4.6. för resten av brunnarna i plattan.
- I slutet av analysen, eller när tiden tillåter, registrera det totala antalet maskar i varje brunn.
5. Analys av data
- Hämta plattkartan (steg 3.1.) och registrera vilken töjning som motsvarar varje brunn.
OBS: På grund av mängden data som samlas in kommer den efterföljande analysen och diskussionen av data att ta minst ett par timmar. - Ange data i ett kalkylblad, börja med det totala antalet maskar i varje brunn och organisera efter genotyp.
- Genom att kombinera data från brunnarna bestämmer du antalet maskar som rör sig vid varje tidpunkt för varje stam.
- Använd dessa data för att skapa en "överlevnadskurva" i statistikprogramvaran (Materialförteckning) för att visuellt visa befolkningens tidsberoende förlamning (figur 2B).
- Gör en datatabell så att den vänstra kolumnen anger tid och efterföljande kolumner innehåller data för varje stam. För varje djur som är förlamat inom de första 5 minuterna, skapa en rad och ange en "1" i 5 min. Upprepa detta för varje tidpunkt. För alla djur som inte förlamar i slutet av analysen, ange en "0" i 60 min.
- Utför parvisa jämförelser med hjälp av log-rank (Mantel-Cox) -testet i den statistiska programvaran (Materialtabell) för att avgöra om det finns en statistiskt signifikant skillnad mellan två olika stammar.
- För ytterligare/alternativ analys, istället för att utföra steg 5.3. och steg 5.4., bestäm procentandelen djur som rör sig i varje brunn vid varje tidpunkt. Rita upp medelvärdet med standardfel vid varje tidpunkt för alla stammar som analyseras med hjälp av ett kalkylprogram eller statistikprogrammet (figur 2C).
Representative Results
Signalering genom AChRs- och GABA-receptorer gör att muskler på ena sidan av C. elegans kropp kan dra ihop sig medan musklerna på andra sidan slappnar av, vilket möjliggör samordnad rörelse 6,16. Levamisolbindning till jonotropa L-AChR orsakar sammandragning, vilket leder till tidsberoende förlamning av vilda djur. Här bedömde vi känsligheten hos vild typ, unc-63 L-AChR-mutant, lev-10 L-AChR-klustermutant och unc-49 GABA A-receptormutant C. elegans till levamisol. Mutationer i underenheter av L-AChR, liksom i gener som krävs för att transportera L-AChR till muskelplasmamembranet, klustring av postsynaptiska L-AChRs och nedströms Ca 2+ signalering, orsakar resistens mot levamisolinducerad förlamning 7,8,9,10,11,16,17, som observerats i unc-63- och lev-10-mutanterna (figur2B ,C). Förlust av den GABA-gated jonkanalen UNC-49 orsakade levamisol överkänslighet (figur 2B,C) på grund av störningar i den korrekta balansen mellan kolinerga och GABAerga signalering12. När denna analys nyligen utfördes av studenter i ett avancerat genetiklaboratorium observerade 100% av studenterna levamisolresistens med unc-63- och lev-10-mutanterna, medan 88% observerade levamisoleöverkänslighet med unc-49-mutanten. Dessa data som samlats in med den flytande levamisolsimanalysen överensstämmer med fenotyper som observerats i traditionella plattbaserade levamisoleanalyser 7,8,11,12,13.
Figur 1: Schematisk för förberedelse och implementering av levamisolanalys. 24-brunns NGM-plattor hälls; 2 dagar senare sås OP50 Escherichia coli i brunnarna. C. elegans synkroniseras genom blekmedelsförberedelser och första larvstadiet (L1) djur för varje stam som ska analyseras (vild typ, svart; UNC-63(x26), magenta; lev-10(x17), grön; UNC-49(E407), blå) pipetteras in i brunnarna enligt en förutbestämd plattkarta dagen därpå. Efter 3 dagars tillväxt vid 20 ºC, eller när djuren når vuxen ålder, tillsätts 0,4 mM levamisol i M9-buffert till varje brunn och antalet rörliga djur räknas var 5: e minut i 1 h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Levamisolinducerad förlamning hos vild typ och representativ mutant C. elegans. A) Exponering för 0,4 mM levamisol orsakar tidsberoende förlamning. Detta observeras inte för djur som simmar i 1x M9-buffert i 1 h. (B) Tidsberoende förlamning av vildtyp (svart), unc-63(x26 ) (magenta), lev-10(x17 ) (grön) och UNC-49(e407 ) (blå) djur i levamisolesimanalysen. Förlust av L-AChR-underenheten UNC-63 eller L-AChR-klusterprotein LEV-10 resulterade i levamisolresistens, och förlust av GABAA-receptorn UNC-49 orsakade levamisol överkänslighet. n ≥ 50 per genotyp, p < 0,0001 för alla mutanter jämfört med den vilda typen i detta representativa experiment. C) Med hjälp av samma uppgifter som i panel B fastställdes procentandelen djur i rörelse vid varje tidpunkt (genomsnitt av procentsatserna för varje brunn ± SE) för varje stam. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Förändrat svar på levamisol kan identifiera gener som krävs för postsynaptisk kolinerg signalering och muskelfunktion. Protokollet här beskriver en flytande levamisoleanalys som används för att kvantifiera tidsberoende förlamning under en tidsperiod på 1 timme. Eleverna gör förutsägelser om effekterna av vissa genetiska mutationer, utför ett experiment med stor provstorlek och kvantifierar sedan sina resultat. Denna analys är ett enkelt, effektivt sätt att kvantifiera levamisolinducerad förlamning utan att plocka eller sticka djur, vilket gör den lämplig för grundutbildningslaboratorier, liksom forskare som studerar neuromuskulär överföring. Här diskuteras några av de vanligaste fallgroparna, analysens begränsningar och en variation av protokollet som möjliggör dess användning med RNAi-knockdown-djur; Här diskuteras också hur denna analys kan bäddas in i en kursbaserad grundutbildningsupplevelse.
Korrekt förberedelse av 24-brunnsplattorna är viktigt. Först måste bakteriella gräsmattor vara helt torra innan de upptäcker L1-djur i brunnarna. Om de inte torkas tillräckligt blandas bakterierna med levamisollösningen under analysen, vilket gör vätskan grumlig och förhindrar att individer kan räkna maskarna. För det andra, när man synkroniserar maskar genom blekmedelsförberedelser, får djuren inte utsättas för blekmedelslösningen för länge eftersom detta kommer att leda till att den skyddande beläggningen på äggen sönderfaller. För det tredje är det viktigt att bara upptäcka 20-30 L1s per brunn, eftersom för många maskar i brunnarna gör det extremt svårt att exakt räkna antalet som rör sig under den tilldelade tiden. Slutligen är det viktigt att upprätthålla en aseptisk teknik under beredningen av plattorna eftersom förorenade brunnar inte kan analyseras.
Det finns några begränsningar som måste beaktas när du utför denna analys. För det första kan det vara överväldigande att räkna antalet rörliga maskar i varje brunn var 5: e minut för individer som saknar tidigare laboratorieerfarenhet, och detta kan leda till oprecis datainsamling. När det gäller andra analyser som används för att bestämma läkemedelskänslighet18,19 kan detta experiment utföras med färre tidpunkter. För det andra är plätering av svältade L1s isolerade från en blekmedelsförberedelse en enkel metod för att erhålla en synkroniserad befolkning; Justeringar måste dock göras om utvecklingstidpunkten skiljer sig åt mellan de stammar som analyseras. Det är möjligt att plocka sena fjärde larvstadiumdjur (L4s) i en 24-brunnsplatta för denna analys; Men när man förbereder många plattor är detta för arbetsintensivt. Alternativt bör man bestämma hur lång tid det tar för varje stam att nå L4 och sedan placera L1:orna i brunnarna vid olika tidpunkter för att justera för skillnader i mognadshastighet. Slutligen, medan denna analys kan användas för att identifiera nya gener som är viktiga för postsynaptisk muskelfunktion11, kan förändrat levamisolesvar också orsakas av mutation eller RNAi-knockdown av presynaptiska gener12. Om förändrad levamisolkänslighet observeras måste ytterligare experiment utföras för att bestämma orsaken till denna fenotyp.
Genom att göra några modifieringar av 24-brunnsplattorna kan den beskrivna levamisole-simanalysen också utföras på RNAi knockdown-djur11. Gene knockdown genom RNAi kan uppnås genom att mata C. elegans-bakterier som uttrycker dubbelsträngat RNA som motsvarar genen av intresse20. För beredning av RNAi-plattor måste 1 ml 1 M IPTG och 1 ml 25 mg / ml karbenicillin tillsättas per liter media efter avlägsnande från autoklaven. Bakteriekulturer odlas genom att plocka en enda koloni i 3 ml LB-buljong plus 3 μL 25 mg / mLcarbenicillin och skaka vid 37 ° C över natten, och plattkartan görs när de olika bakterierna upptäcks i brunnarna. C. elegans synkroniseras med blekmedelsförberedelser enligt beskrivningen; emellertid bör RNAi-överkänslig eri-1 (mg366) stam användas istället för den vilda typen för att öka gennedslagningen. RNAi-knockdowns resulterar i samma levamisolefenotyper som observerats för funktionsförlustmutanter11.
Protokollet som presenteras här kan användas i laboratorieforskning, som ett fristående experiment i grundutbildningslaboratoriet eller under de inledande veckorna av en avancerad grundkurs som en introduktion till grundläggande C. elegans-tekniker och neuromuskulär funktion. I en mer avancerad upptäcktsbaserad kurs kan studenterna använda denna analys för att avgöra om förlusten av C. elegans-homologer av gener muterade hos individer med myastheniska syndrom, muskeldystrofier eller myopatier förändrar levamisolkänsligheten. Sammanfattningsvis ger denna enkla, billiga levamisolekänslighetsanalys ett praktiskt tillvägagångssätt för att lära sig om signalering vid NMJ och få erfarenhet av att arbeta med C. elegans-modellsystemet.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Riya Dattani och Lauren Hogstrom, som samlade in data i figur 2B, C blind för genotyp i BISC413 Advanced Genetics Laboratory (våren 2022) vid University of Delaware. Ytterligare information om BISC413 kursbaserad grundutbildning (CURE), samt tillgång till labbhandboken designad av J. Tanis, finns tillgänglig på begäran. Nematodstammar tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center, som stöds av NIH-ORIP (P40 OD010440). Detta arbete stöddes av en P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (till J.E.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
References
- Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
- Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
- Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
- Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
- Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
- Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
- Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
- Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047 (2021).
- Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
- Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
- Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
- Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
- Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
- Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
- Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
- Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400 (2017).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
