Summary
Den nuværende protokol beskriver en optimeret hæmatopoietisk stam- og stamcellekulturprocedure (HSPC) til robust indkapsling af genredigerede celler in vivo.
Abstract
CRISPR/Cas9 er et meget alsidigt og effektivt genredigeringsværktøj, der er vedtaget bredt for at korrigere forskellige genetiske mutationer. Muligheden for genmanipulation af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC'er) in vitro gør HSPC'er til en ideel målcelle til genterapi. HSPC'er mister imidlertid moderat deres engraftment og multilineage genbefolkningspotentiale i ex vivo-kulturen . I denne undersøgelse beskrives ideelle kulturforhold, der forbedrer HSPC-engraftment og genererer et øget antal genmodificerede celler in vivo. Den aktuelle rapport viser optimerede in vitro-kulturforhold , herunder typen af kulturmedier, unikt tilskud til cocktail med små molekyler, cytokinkoncentration, cellekulturplader og dyrkningstæthed. Derudover leveres en optimeret HSPC-genredigeringsprocedure sammen med validering af genredigeringshændelserne. Til in vivo-validering vises den genredigerede HSPC's infusion og post-engraftment-analyse hos musemodtagere. Resultaterne viste, at kultursystemet øgede hyppigheden af funktionelle HSC'er in vitro, hvilket resulterede i robust engraftment af genredigerede celler in vivo.
Introduction
Den manglende adgang til humant leukocytantigen (HLA) -matchede donorer i allogene transplantationsmiljøer og den hurtige udvikling af meget alsidige og sikre genteknologiske værktøjer gør autolog hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) til en helbredende behandlingsstrategi for arvelige blodsygdomme 1,2. Autolog hæmatopoietisk stam- og stamcelle (HSPC) genterapi involverer indsamling af patienters HSPC'er, genetisk manipulation, korrektion af sygdomsfremkaldende mutationer og transplantation af genkorrigerede HSPC'er til patienten 3,4. Det vellykkede resultat af genterapien afhænger imidlertid af kvaliteten af det transplanterbare genmodificerede transplantat. Genmanipulationstrinnene og ex vivo-kulturen af HSPC'er påvirker transplantatets kvalitet ved at reducere hyppigheden af langvarige hæmatopoietiske stamceller (LT-HSC'er), hvilket nødvendiggør infusion af store doser genmanipulerede HSPC'er 2,5,6.
Flere små molekyler, herunder SR1 og UM171, anvendes i øjeblikket til at udvide HSPC'er med navlestrengsblod robust 7,8. For voksne HSPC'er er der på grund af det højere celleudbytte, der opnås ved mobilisering, ikke behov for robust ekspansion. Det er imidlertid afgørende for dets genterapianvendelser, at isolerede HSPC'er bevares i ex vivo-kulturen. Derfor udvikles en tilgang med fokus på kulturberigelse af hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) ved hjælp af en kombination af små molekyler: Resveratrol, UM729 og SR1 (RUS)7. De optimerede HSPC-kulturbetingelser fremmer berigelsen af HSC'er, hvilket resulterer i øget hyppighed af genmodificerede HSC'er in vivo og reducerer behovet for genmanipulation af store doser HSPC'er, hvilket letter omkostningseffektive genterapimetoder8.
Her beskrives en omfattende protokol for HSPCs kultur sammen med infusion og analyse af genredigerede celler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo-forsøg på immundefekte mus blev godkendt af og udført efter retningslinjerne fra Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, Indien. Granulocytkolonistimulerende faktor (G-CSF)-mobiliserede perifere blodprøver blev indsamlet fra raske humane donorer med informeret samtykke efter at have opnået Institutional Review Board (IRB) godkendelse.
1. Isolering af mononukleære celler i perifert blod (PBMNC'er) og oprensning af CD34 + celler
- Udfør PBMNC-isolering ved at følge nedenstående trin.
BEMÆRK: Til in vitro HSPC-kultur og genredigering er det ideelt at starte med mindst 1 x 106 HSPC'er / gruppe. Til in vivo-engraftmentanalyse er et startcellenummer på mindst 5 x 10 6 HSPC'er/gruppe ideelt, hvis en gruppe indeholder otte mus, og hver mus er infunderet med mindst6 x 105 celler. For at opnå et tilstrækkeligt antal PBMNC'er (~ 1 x 109) til proceduren anbefales det at starte med 20 ml mobiliseret perifert blod (mPB).- Efter opsamling af mPB fortyndes 20 ml mPB med sterilt 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) i forholdet 1:1.
BEMÆRK: Effektiviteten af G-CSF-mobilisering kan variere mellem individerne9, og derfor varierer antallet af HSPC'er opnået fra 20 ml mobiliseret blod mellem donorer. - Tilsæt 10 ml densitetsgradientmedium (Lymfoprep, se Materialetabel) til et 50 ml rør og lag det fortyndede blod gennem rørets sider i et forhold på 1: 2.
BEMÆRK: Hældning af 50 ml røret i en vinkel på 20 ° under tilsætning af fortyndet blod forhindrer det i at blande sig med Lymphoprep, hvilket fører til klar adskillelse af blodkomponenter efter centrifugering. - Centrifuge ved 600 x g i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) med en accelerationshastighed på 1 m/s² og en decelerationshastighed på 1 m/s². Det øverste lag (plasma) kasseres ved hjælp af en serologisk pipette, og høst den buffy coat, der er til stede ved interfasen (PBMNC'er) over densitetsgradientmellemlaget.
BEMÆRK: Aspirer buffy-pelsen ved hjælp af en serologisk pipette ved forsigtigt at hvirvle den på siderne af røret. Undgå at samle et større volumen interfase, mens du opsuger buffy-pelsen for at forhindre granulocyt- og RBC-forurening. - Overfør PBMNC'erne til et frisk 50 ml konisk rør, og fortynd cellesuspensionen med 1x PBS i forholdet 1:2.
BEMÆRK: Fortynd cellesuspensionen med 1x PBS i forholdet 1:4, hvis der blev opsamlet et overskud af interfase under aspirering af buffy-pelsen. - Cellesuspensionen centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur med en accelerationshastighed på 9 m/s² og en decelerationshastighed på 7 m/s², og supernatanten kasseres ved hjælp af en serologisk pipette. Der tilsættes 30 ml iskold RBC-lysisbuffer (se tabel 7) til pelleten og inkuberes i is i 10 min. Bland ved at vende røret hvert 2. minut.
- Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur med en accelerationshastighed på 9 m/s² og en decelerationshastighed på 7 m/s², og supernatanten kasseres. Trin 1.1.5.-1.1.6 gentages. indtil pelletrødmen forsvinder. Resuspender pelleten med basalmedier (IMDM, se Materialetabel) og udfør et celletal ved hjælp af trypanblå i et Neubauer-kammer10.
BEMÆRK: De isolerede PBMNC'er kan straks bruges til at rense CD34+ HSPC'er. Til kryopræservering centrifugeres 5 x 108 celler ved 200 x g i 5 minutter, og der tilsættes 4 ml cryomedier indeholdende IMDM: FBS: DMSO (se materialetabel) i forholdet 7:2:1. - Overfør hætteglassene til en 1 °C kryokøler, og opbevar dem ved -80 °C i op til 12 timer. Overfør og opbevar kryovialerne i en flydende nitrogenbeholder til langtidsopbevaring.
- Efter opsamling af mPB fortyndes 20 ml mPB med sterilt 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) i forholdet 1:1.
- Genoplive de kryopræserverede PBMNC'er.
- Halvt tø kryovalerne op i et 37 °C vandbad ved blid hvirvlen i <1 min. Overfør cellesuspensionen af kryovial til et 50 ml rør indeholdende IMDM i et forhold på 1:10.
- Cellesuspensionen centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur med en accelerationshastighed på 9 m/s² og en decelerationshastighed på 7 m/s², og supernatanten kasseres ved hjælp af en serologisk pipette.
- Rens CD34+ cellerne fra PBMNC'er ved at følge nedenstående trin.
- Rensningsbufferen forberedes med steril 1x PBS indeholdende 2% filtreret føtalt bovint serum (FBS). PBMNC-cellepelleten i bufferen i bufferen i henhold til tabel 1 suspenderes.
BEMÆRK: Bufferen skal være Ca++ og Mg++ fri. - Cellesuspensionen indeholdende 1 x 10 8-5 x 108 celler friske eller kryopræserverede PBMNC'er overføres til 5 ml rundbundsrøret af polystyren (se materialetabel).
BEMÆRK: Tilsæt DNase (se Materialetabel) i en slutkoncentration på 100 μg/ml til cellesuspensionen for at forhindre celleklumpning. Vi brugte et kommercielt tilgængeligt sæt til CD34-rensning indeholdende Human CD34 Positive Selection Cocktail og Dextran Rapid Spheres (se Materialetabel). - Tilsæt kommercielt tilgængelig human CD34 Positive Selection Cocktail (se materialetabel) i koncentrationen af 100 μL/ml celler og resuspenderer forsigtigt.
- Inkuberes ved RT i 30 minutter, og cellesuspensionen gensuspenderes forsigtigt hvert 5. minut. Tilføj 50 μL/ml kommercielt tilgængelige Dextran Rapid Spheres (se Materialetabel), og suspender forsigtigt.
BEMÆRK: Hvirvel dextrankuglerne med høj hastighed i 5 s for at sikre, at partiklerne ser jævnt spredt ud, og tilføj dem derefter til cellerne. - Inkuberes ved RT i 15 minutter og suspenderer forsigtigt cellesuspensionen hvert 5. minut. Lav cellesuspensionen til et samlet volumen på 2,5 ml med rensningsbuffer og suspender den forsigtigt.
- Placer røret i en kommercielt tilgængelig immunmagnetisk søjlefri magnet (se Materialetabel) og inkuber i 5 minutter ved RT. Efter inkubation inverteres magneten og kasseres supernatanten i en kontinuerlig bevægelse.
BEMÆRK: Dextran Rapid Spheres-mærkede CD34+ celler forbliver tiltrukket af siderne af røret af magnetfeltet. Røret skal holdes i omvendt position i 2-3 s. Undgå at ryste eller blotte de dråber, der forbliver hængende fra rørets mund. - Fjern røret fra magneten, og tilsæt 2,5 ml rensningsbuffer. Gentag trin 1.3.6-1.3.7 fem gange.
BEMÆRK: Under tilsætning af rensningsbuffer skal du placere røret i en spids vinkel og tilføje buffer ved at hvirvle røret, da cellerne muligvis klæber til overfladevæggene, mens magneten vendes. - Efter at have afsluttet fem vaske, skal du fjerne røret fra magneten, tilføje 4 ml 1x steril PBS og suspendere cellesuspensionen igen. Overfør cellesuspensionen til 15 ml centrifugerøret, og gør det op til 10 ml med 1x PBS. Udfør et celletal ved hjælp af trypanblå i et Neubauer-kammer10.
- Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved RT (acceleration ~9 m/s², deceleration ~7 m/s²), og supernatanten kasseres med en pipette. For at dyrke HSPC'erne skal du gensuspendere cellerne i HSPC-kulturmedier, som nævnt i trin 2.1.
BEMÆRK: Overskuddet af oprensede HSPC'er var kryopræserveret i et kommercielt tilgængeligt kryopræserveringsmedium (se Materialetabel) med en tæthed på 9 x 106 celler / ml efter dyrkning af HSPC'erne i 12 timer i HSPC-kulturmedier.
- Rensningsbufferen forberedes med steril 1x PBS indeholdende 2% filtreret føtalt bovint serum (FBS). PBMNC-cellepelleten i bufferen i bufferen i henhold til tabel 1 suspenderes.
- Genoplive de kryopræserverede HSPC'er.
- Tø kryovalerne op i <1 minut i et 37 °C vandbad ved blid hvirvlen. Overfør cellesuspensionen i kryovialen til et 50 ml rør.
- Tilsæt 1% BSA resuspenderet i 1x PBS dråbe for dråbe med konstant omrøring og gør det op til 20 ml. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur med en accelerationshastighed på 9 m/s² og en decelerationshastighed på 7 m/s², og supernatanten kasseres ved hjælp af en serologisk pipette.
- Gentag trin 1.4.2. 1x. Resuspender cellerne i HSPC-kulturmedier og -kultur som beskrevet i trin 2.1.
2. In vitro-kultur af rensede HSPC'er
- Forbered kulturmedierne ved hjælp af SFEM-II med SCF (240 ng / ml), FLT3 (240 ng / ml), TPO (80 ng / ml), IL6 (40 ng / ml) og 1x antibiotika-antimykotisk (se materialetabel).
BEMÆRK: Frisklavede kulturmedier anbefales stærkt. Mediet kan dog opbevares ved 4 °C i op til 24 timer efter tilberedning. - Resuspender CD34+ pellet med kulturmediet, tilsæt 3 μL RUS-cocktail/ml medier (Resveratrol, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; se Materialetabel), og dyrkning af cellerne ved 37 °C med 5 % CO2.
BEMÆRK: UM171 (10 nm) kan bruges til at erstatte UM729 (500 nM), da begge har lignende virkninger på HSPC-stammenvedligeholdelse 7. Hætteglassene kan ikke fryses op mere end to gange. - I første omgang sås de rensede celler ved en sammenløb på 5 x 105 / ml i kommercielt tilgængelige delta overfladebehandlede 6-brøndsplader (se Materialetabel) for at fjerne de klæbende celler.
- Gensåning af cellerne i suspensionen ved et sammenløb på 2 x 105 celler / ml i en ny 6-brøndsplade efter 6 timers oprensning.
- Karakteriser stammen af HSPC'erne ved hjælp af flowcytometri før genredigering.
- Til flowcytometrianalyse tages 1 x 105 celler i 100 μL 1x PBS og tilsættes 3 μL (75 ng) CD34 PE, 4 μL (100 ng) CD133 FITC og 4 μL (100 ng) CD90 APC (se Materialetabel).
- Inkuber røret ved RT i 20 minutter i mørke. Cellerne vaskes med 2 ml 1x PBS 2x og centrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved RT. Kassér supernatanten med en pipette, suspender cellepelleten med 150 μL 1x PBS, og anskaf den i flowcytometri.
BEMÆRK: Hvis procentdelen af CD34+ celler er <90%, øges antallet af vaske op til seks gange i trin 1.3.7. Frø de rensede HSPC'er i kulturmedier, og efter 6 timer samles kun cellerne i suspensionen. De fleste CD34-celler klæber til dyrkningspladen.
3. Genredigering af HSPC'er
- Udfør guide RNA-rekonstitution.
BEMÆRK: Syntetisk sgRNA med phosphorothioatmodifikationer rettet mod CCR5-locus blev opnået fra kommercielle kilder (se Materialetabel).- Til rekonstitution indstilles termoblanderen til 37 °C og forvarmer 1x TE-bufferen (se Materialetabel) ved 37 °C i 10 min. Det syntetiske kemisk modificerede hætteglas med sgRNA centrifugeres ved 11.000 x g i 1 minut ved 4 °C.
- Til hætteglasset med sgRNA, der indeholder 1,5 nM frysetørret sgRNA, tilsættes 15 μL 1x TE-buffer, hvilket giver en endelig koncentration på 100 pM/μL. Resuspender forsigtigt op til 5x og hvirvler spidsen rundt om hjørnerne.
- Inkuberes i termoblanderen ved 37 °C i 30-40 s med minimal omrystning. Efter et kort spin opsamles 15 μL sgRNA og opbevares som 1 μl aliquots (100 pM/μL) ved -80 °C til fremtidig brug i op til 1 år.
BEMÆRK: Undgå gentagen frysning-optøning. Der anbefales maksimalt en fryse-optøningscyklus af aliciteret gRNA.
- Udfør nukleofektion ved at følge nedenstående trin.
- På dag 3 af kulturen tælles cellerne ved hjælp af Neubauers forbedrede celletællingskammer10.
- Til RNP-forberedelse (til nukleofektering af 2 x 10 5 celler) skal du tage 1 μL sgRNA rettet mod CCR5-genet (100 pM) i et0,5 ml rør og tilføje 2,65 μL Cas9 (50 pM) ved blid hvirvling rundt om bunden af hætteglasset. Inkuberes ved RT i 10 min.
BEMÆRK: gRNA-sekvens: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG. - Til bufferforberedelse tilsættes 16,4 μL primærcelleopløsning P3 og 3,6 μL supplement, forsynet med det kommercielle nukleofektionssæt (se Materialetabel), og inkuberes ved RT i 10 min. Kulturmedier (trin 2.1.) tilberedes, og det præinkuberes ved 37 °C i dyrkningspladen inden nukleofektion.
- Pellet 2 x 10 5 celler ved centrifugering ved 200 x g i5 minutter ved RT og kassér forsigtigt supernatanten ved hjælp af en pipette uden at forstyrre pelleten. Pelleten suspenderes med 20 μL af bufferen fremstillet i trin 3.2.3. og forsigtigt suspendere det.
- Cellesuspensionen blandes forsigtigt med det forberedte RNP-kompleks (trin 3.2.2.) uden luftbobler. Suspensionen overføres til den kommercielle nukleofektionsstrimmel (se Materialetabel), og vælg pulskoden DZ100 for at elektroporere cellerne ved hjælp af 4D-nukleofenectoren (se Materialetabel).
BEMÆRK: Cellesuspensionens endelige volumen, inklusive buffer- og RNP-komponenterne, må ikke overstige mere end 27 μL/elektroporation. - Til den eksperimentelle kontrol pellets 2 x 10 5 uredigerede HSPC'er ved centrifugering ved 200 x g i5 minutter ved RT og resuspenderer pelleten med 20 μL af bufferen fremstillet i trin 3.2.3. uden RNP-kompleks.
- Der tilsættes 100 μL præinkuberede kulturmedier (trin 3.2.3.) til de elektroporerede celler, og cellerne efterlades uforstyrret i 10 minutter i nukleofektionsstrimlen ved RT. Efter 10 minutters inkubation overføres indholdet til dyrkningspladen i henhold til de eksperimentelle krav.
BEMÆRK: Denne protokol kan anvendes på ikke-homolog slutsammenføjning (NHEJ) -medieret målrettet forstyrrelse af ethvert genomisk locus ved hjælp af målspecifikt gRNA. Den samme protokol kan anvendes til at indføre store deletioner ved at inkludere dobbelt gRNA i trin 3.2.2. 11. Efter 10 minutters RNP-inkubation kan den samme protokol desuden anvendes til homologistyret reparation (HDR)-baseret genredigering, når den er forsynet med en donorskabelon12. Protokollen er blevet valideret af den målrettede forstyrrelse af AAVS1, pseudo β-globin, β-globin og CCR5 locus 7,8.
4. Validering af genredigeringshændelser i HSPC'er
- Udfør DNA-ekstraktion.
- Efter 72 timer efter nukleofektion udføres et celletal ved hjælp af trypanblå i et Neubauer-kammer. Saml 1 x 105 genredigerede HSPC'er til DNA-ekstraktion.
- Centrifuger cellerne ved 11.000 x g i 5 minutter ved RT, og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Pelleten genudsættes med 1 ml 1x PBS, og centrifugeringen gentages, og supernatanten kasseres. Til pelleten tilsættes 20 μL hurtig ekstraktopløsning (se Materialetabel) til 1 x 105 celler og suspenderer pelleten igen.
- Blandingen inkuberes i en termocykler ved 68 °C i 30 min. Efter en kort drejning inkuberes blandingen i en termocykler ved 98 °C i 10 min. Koncentrationen af DNA i det rå lysat måles ved hjælp af et spektrofotometer13.
- Udfør forstærkningen af det genredigerede locus ved PCR.
- Brug Primer3 (se Materialetabel) til at designe de locusspecifikke primere, der spænder over DSB-stedet (dobbeltstrenget brud) med ampliconstørrelser på mellem 400-700 bp (tabel 2).
BEMÆRK: Primer3 er et webbaseret open source-værktøj til design af PCR-primere. - Reaktionsblandingen forberedes som angivet i tabel 3 , og termocyklisten køres med de cykelforhold, der er nævnt i tabel 4. For at bekræfte forstærkningen af det ønskede locus blandes 5 μL PCR-produkt med 6x belastningsfarvestof og indlæses på 2% agarosegelelektroforese fremstillet ved hjælp af TAE-buffer.
BEMÆRK: TAE-bufferkomponenterne er angivet i tabel 7. - Kør i 30-40 minutter ved 100 V og detekter ampliconen ved hjælp af et gelbilleddannelsessystem (se Materialetabel). I henhold til PCR-rensningsproducentprotokollen (se Materialetabel) skal du rydde op i det forstærkede PCR-produkt.
- Mål koncentrationen af det oprensede PCR-produkt ved hjælp af et nanodrop-spektrofotometer (se Materialetabel).
- Brug Primer3 (se Materialetabel) til at designe de locusspecifikke primere, der spænder over DSB-stedet (dobbeltstrenget brud) med ampliconstørrelser på mellem 400-700 bp (tabel 2).
- Udfør Sanger-sekventering og fjernelse af fri farveterminator ved at følge nedenstående trin.
- Reaktionsblandingen fremstilles som vist i tabel 5. Kør termocyklisten med cykelforholdene som nævnt i tabel 6.
- Tilsæt 10 μL HighPrep DTR-reagens (se materialetabel) og 40 μL 85% ethanol til 10 μL PCR-prøve i et 1,5 ml rør og bland det ved kraftig pipettering ca. 8x-10x.
- Inkuber blandingen ved RT i 5 minutter og anbring 1,5 ml røret på magnetisk separationsstativ i 5 minutter. Supernatanten fjernes med en pipette, og der tilsættes 100 μL 85 % ethanol.
- Supernatanten kasseres, og trin 4.3.3 gentages. 1x. Tag 1,5 ml rørene ud af magnetstativet og inkuber dem ved 37 °C i 10 minutter i en termoblander for at tørre ethanolen.
- Suspender perlerne kraftigt med 40 μL nukleasefrit vand og inkuberes ved RT i 5 minutter. Placer røret på magnetseparationsstativet i 5 minutter, og udfør Sanger-sekventering efter offentliggjorte rapporter14,15.
- Udfør en indelfrekvensvurdering ved hjælp af ICE-analyse16.
- Brug Synthego (se Materialetabel) til ICE-analysen.
- Upload ab1 filer med redigerede og uredigerede prøver og gRNA-sekvenser, og klik på analyse for at få hyppigheden af Indels.
5. Transplantation af genredigerede HSPC'er
- Forudsæt den kommercielt tilgængelige NOD scid gamma mus (NSG)17 og NOD. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 mus (se materialetabel) til knoglemarvstransplantation.
- For at prækonditionere NSG-mus skal du vælge 6-8 uger gamle hunmus og adskille dem i kontrol- og redigeringsgrupper ved blindet randomisering.
- Placer NSG-musene i tærteburene og bestråling ved 3,5 Gy ved hjælp af en kommercielt tilgængelig bestråler (se materialetabel) 6-8 timer før HSPC-transplantation.
BEMÆRK: Det anbefales at veje musene før bestråling, og mus, der vejer >20 g, vil blive udsat for bestråling. - Til prækonditionering af 6-8 uger gamle NBSGW-han- og hunmus injiceres busulfan (se Materialetabel) gennem intraperitoneal (IP) injektion i en dosis på 12,5 mg/kg legemsvægt 48 timer før HSPC-transplantation.
BEMÆRK: Busulfan-konditionering øger indkapslingen af menneskelige HSPC'er i museknoglemarven og mindsker behovet for at infundere store doser genredigerede HSPC'er19. Det ideelle interval af busulfandosis til konditionering er mellem 10 mg/kg og 15 mg/kg legemsvægt. Øgede doser af busulfan vil resultere i alvorlige dødelighedsproblemer.
- Forbered cellesuspensionen til knoglemarvstransplantation.
- Efter 10 minutters inkubation af de genredigerede HSPC'er i nukleofektionsstrimlen (se trin 3.2.7.) overføres cellesuspensionen til 10 ml 1x PBS. Tæl cellerne ved hjælp af Neubauers forbedrede celletællingskammer10.
- Til infusion af en mus, pellet 6 x 10 5 celler i et 1,5 ml rør ved centrifugering ved 200 x g i5 minutter ved RT og forsigtigt kassere supernatanten ved hjælp af en pipette uden at forstyrre pellet. Resuspender cellepelleten med 100 μL 1x PBS.
- Tilsæt HSPC'erne ved haleveneinjektion ved at følge nedenstående trin.
- Placer den forkonditionerede NSG- eller NBSGW-mus i museholderen (se Materialetabel).
- Hold musehalen, og skub forsigtigt stikket for at holde musen tilbage. Tør forsigtigt musehalen af med 70% ethanol. Aspirer 100 μL af cellesuspensionen i en 31 G insulinsprøjte.
BEMÆRK: Undgå strengt bobler i infusionsproduktet ved forsigtigt at banke på sprøjten eller forsigtigt flytte stemplet. - Ret lyset fra den infrarøde lampe på halen i 30-40 s, der dækker musens kropsområde med folder af silkepapir. Indsæt forsigtigt den skrå del af nålen i venstre eller højre halevene i en vinkel på 20°.
- Løft halen med venstre pegefinger for at holde den i den plane akse med sprøjten. Tryk stemplet for at infundere cellesuspensionen i venen. Påfør blidt tryk nær det gennemborede område med silkepapir og træk nålen ud.
- Efter 30 s påføring af blidt tryk skal du fjerne musen fra fastholderen og overføre den til buret.
6. Vurdering af kortsigtet engraftmentpotentiale
- Efter 4 ugers human HSPC-transplantation vurderes den kortvarige engraftment ved at indsamle blod via orbital venøs sinus i et hepariniseret rør ved hjælp af en Pasteur-pipette.
- Anæstetisere dyret med ketamin (90-120 mg/kg) og xylazin (8-12 mg/kg) formulering via intraperitoneal (IP) injektion inden prøveindsamling.
BEMÆRK: Påfør forsigtigt trykket på bagbenene på den bedøvede mus for at bekræfte tabet af fornemmelse. - Efter bedøvelse skal du placere dyret i ventral recumbency og forsigtigt scruff musen for at åbne øjet, hvilket gør det muligt for øjets klode at stikke lidt ud.
- Indsæt forsigtigt Pasteur-pipetten i øjets mediale canthus under nicteringsmembranen i en vinkel på 30°-45°. Når Pasteur-pipetten er placeret i den rigtige position, skal du lægge et let tryk på røret og begynde at dreje røret forsigtigt.
BEMÆRK: Blod kommer ind i røret ved kapillær handling, så snart retro-orbital plexus er punkteret.
- Anæstetisere dyret med ketamin (90-120 mg/kg) og xylazin (8-12 mg/kg) formulering via intraperitoneal (IP) injektion inden prøveindsamling.
- Efter indsamling af 50-80 μL perifert blod trækkes pipetten forsigtigt ud af øjets mediale canthus.
- For at ophøre blødningen omkring øjets kredsløb skal du lukke øjenlågene og anvende et blidt tryk ved hjælp af et stykke gasbind.
- Plet cellerne med respektive antistoffer (tabel 8) og inkuber cellerne i mørke i 25-30 minutter ved RT.
- For RBC-lysis tilsættes 3 ml 1x RBC-lysisbuffer (tabel 7) til cellesuspensionen og inkuberes i 10 minutter i is.
- Centrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved RT og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Gentag trin 6.4. indtil pellets rødme forsvinder.
- Tilsæt 2 ml 1x PBS og centrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved RT for at fjerne celleaffaldet forbundet med RBC-lyse.
- Tilsæt 150 μL 1x PBS til pelleten, og fortsæt derefter med immunophenotyping for flowcytometri for at evaluere procentdelen af indpodede humane celler7.
7. Vurdering af langsigtet engraftmentpotentiale
- Aflive musene.
- Ofr de transplanterede mus i uge 16 til engraftmentanalyse ved at indføre 100% CO 2 kvælning20 inde i museburet i1-2 min.
- Bekræft eutanasi ved at konstatere hjerte- og åndedrætsstop og fraværet af muskulære bevægelser med blid klemning af bagbenene. Hvis begge betingelser er opfyldt, skal du fjerne musene fra buret.
- For at evaluere human cellekimerisme skal du samle cellerne fra knoglemarv.
- Isoler celler fra knoglemarven ved at følge nedenstående trin.
- Efter aflivning skal du lave et lodret snit 1 cm over urinrøret og strække sig indtil 1 cm under membranen. Skær vandret i hjørnerne af det indskårne område for at åbne maveregionen bredt.
- Disseker lårbenet og skinnebenet og fjern det bløde væv, der er fastgjort til lårbenet og skinnebenet, ved hjælp af en saks. Skrub forsigtigt med silkepapir og lav et lille hul med en diameter på ikke højere end 0,2 cm i bunden af et 0,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af en skalpel.
- Fjern de proksimale ender af knoglerne ved hjælp af en skalpel og placer knoglerne med den afskårne side vendt mod hullet i 0,5 ml mikrocentrifugeringsrøret. Anbring 0,5 ml røret med knoglerne i 1,5 ml røret indeholdende 100 μL steril 1x PBS.
- Luk låget, drej rørene i 3 minutter ved 1000 x g under sterile forhold ved RT, og kassér de 0,5 ml rør, der indeholder knogler med et tomt marvhulrum. Tilsæt 1 ml 1x PBS til 1,5 ml reaktionsrøret indeholdende knoglemarv og suspenderer forsigtigt cellerne ca. ikke mindre end 10x ved hjælp af en 1 ml pipette.
- Overfør 1 ml cellesuspension til et 15 ml rør indeholdende 9 ml RBC-lysisbuffer. Inkuber cellerne i is i 7 min med blid inversion af rørene hvert 2. minut.
- Efter 7 min centrifugeres ved 200 x g i 5 min ved RT med en acceleration på 9 m/s² og en deacceleration på 7 m/s². Gentag trin 7.2.5. indtil en klar bleg hvid pellet observeres.
- Resuspender cellerne med 10 ml steril 1x DPBS og filtrer knoglemarvscellesuspensionen ved hjælp af en 40 μm cellesi på et 15 ml rør. Skyl cellesilen med 2 ml 1x PBS 2x for at undgå tab af celler.
- Centrifuge i 5 minutter ved 200 x g, RT, og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Resuspender cellerne med 10 ml IMDM med DNase-I ved en arbejdskoncentration på 100 μg/ml.
- Tag 1 x 106 mononukleære celler i et FACS-rør til engraftmentanalyse ved flowcytometri. For at vurdere genredigeringsfrekvensen i indpodede knoglemarvsmononukleære celler, pellet 1 x 106 mononukleære celler ved 11.000 x g i 5 minutter ved RT og kassere supernatanten ved hjælp af en pipette.
8. Immunophenotyping
- Knoglemarvscellerne inkuberes med 1,5 μL af et oprenset rekombinant humant Fc-protein (se Materialetabel) i 15 minutter ved 4 °C, før de farves med antistoffer.
BEMÆRK: Det humane Fc-protein, der anvendes her, er formuleret til at blokere ikke-specifik antistoffarvning forårsaget af receptorer for IgG; derved øger det specificiteten af antistofmærkning 7,21,22. Før antistoffarvning af målcellerne udføres antistoftitrering. Det anbefales stærkt at inkludere FMO-kontroller og isotypekontroller, mens du arbejder på flerfarvet flowcytometrisk analyse. - For at bestemme procentdelen af human celleindkapsling ved hjælp af flowcytometer skal du tage 1 x 106 mononukleære celler i et FACS-rør og plette cellerne som nævnt i tabel 8.
- Inkuber cellerne i mørke i 25-30 min ved RT. Centrifuge ved 200 x g i 5 min ved RT og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette.
- Anskaf cellerne ved hjælp af et flowcytometer, gate cellepopulationen (P1) ved hjælp af fremad (FSC) og sidespredninger (SSC) af mononukleære celler, og juster spændingen i henhold til cellepopulationen. Få 50.000 cellehændelser i P1-populationen.
- For at analysere humane leukocytpopulationer i museknoglemarv skal du gate de humane CD45+ celler og mus CD45.1 fra P1-cellepopulationen ved hjælp af en flowcytometridataanalysesoftware (se Materialetabel).
- Beregn indkapslingen af humane celler ved hjælp af følgende formel8:
% af engraftment = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
BEMÆRK: Tærsklen for menneskelig engraftment blev anset for at være 0,1% positiv for CD45. - Analyser endvidere procentdelen af hCD34+ celler fra humane CD45+ celler for at evaluere de langsigtede genpopulationsceller. For at vurdere multilineage-rekonstitutionen af de indpodede humane celler farves 100 μL cellesuspension i tabel 9.
BEMÆRK: Antistofferne skal titreres før forsøg. - Ved hjælp af flowcytometrisoftwaren gate hCD45 fra P1-cellepopulationen og fra hCD45 kvantificeres procentdelen af hCD19, hCD3 og hCD13 (lymfoide og myeloide delmængder).
9. Vurdering af genredigeringshyppigheden i indpodede knoglemarvsmononukleære celler
- Til knoglemarven mononukleære cellepellet tilsættes 50 μL hurtig ekstraktopløsning (se Materialetabel) til 5 x 105 celler og suspenderer pelleten igen.
- Blandingen inkuberes i en termocykler ved 68 °C i 30 min. Efter en kort drejning inkuberes blandingen i en termocykler ved 98 °C i 10 min.
- Koncentrationen af DNA i det rå lysat måles ved hjælp af et spektrofotometer. Følg trin 4.2.-4.4. for at validere genredigeringsfrekvensen ved hjælp af ICE-analyse 8,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse identificerer ideelle HSPC-kulturforhold, der letter fastholdelsen af CD34 + CD133 + CD90 + HSC'er i ex vivo-kultur. For at demonstrere kulturberigelsen af HSC'er sammen med den forbedrede generering af genmodificerede HSC'er leveres de optimerede procedurer for PBMNC-isolering, CD34+ cellerensning, kultur, genredigering, transplantation, karakterisering af engraftment og genmodificerede celler in vivo (figur 1). Efter oprensning blev flowcytometrievaluering udført for at kontrollere HSPC-markørerne, og HSPC'er blev dyrket i 72 timer. Efter 72 timers kultur blev HSPC'erne nukleofekteret med Cas9 RNP og dyrket i yderligere 2 dage. De optimerede kulturbetingelser indeholdende RUS-cocktailen viste øget levedygtighed og højere frekvens af CD34+CD133+CD90+ HSC'er og øget genredigeringsfrekvens (figur 2). For yderligere at demonstrere, at de optimerede dyrkningsbetingelser øger hyppigheden af genmodificerede celler in vivo, blev dag 3 HSPC'er rettet mod CCR5-locus genredigeret og infunderet i sub-lealt bestrålede NSG-mus. Engraftment af humane celler i museknoglemarv (BM) blev analyseret 16 uger efter infusion (figur 3A). Flowcytometrianalyse af humane CD45+ (hCD45) celler i NSG-mus viste øget engraftment under kulturbetingelserne (figur 3B,C). Analyse af genredigeringsfrekvensen i musens BM-celler viste øget engraftment af genredigerede HSPC'er under RUS-supplerede kulturforhold (figur 3D).
Figur 1: Resumé af denne undersøgelse. Grafisk resumé af proceduren involveret i isolering af PBMNC'er, magnetisk berigelse af CD34+ celler fra PBMNC'er, dyrkning, karakterisering af humane hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC'er), genredigering og transplantation er repræsenteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: RUS-cocktailen beriger hyppigheden af HSC'er. mPB-HSPC'erne blev dyrket i stamcellekulturmediet indeholdende cytokiner med køretøj (DMSO) og RUS-cocktail i 3 dage og genredigeret med 25 pM Cas9-RNP. De genredigerede celler blev analyseret af FACS for markørerne for HSPC'er 48 timer efter nukleofektion. (A) Flowdiagrammer repræsenterer populationen af levende celler (7AAD-) og CD34+ CD90+. (B) Procentdelen og hyppigheden af indelmønstre analyseret 72 timer efter redigering i DMSO- og RUS-behandlede gruppe. (C) Det absolutte antal CD34+ CD90+ celler analyseret 48 timer efter redigering (n = 2) (donor = 1). (D) Det absolutte antal samlede nukleerede celler (TNC) analyserede 48 timer efter redigering (n = 2) (donor = 1). Fejllinjer repræsenterer middelværdi ± SEM, *p ≤ 0,05 (uparret t-test). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Optimerede kulturbetingelser øger hyppigheden af genmodificerede celler in vivo. (A) Skematisk repræsentation af eksperimentet. (B) Repræsentativt FACS-plot, der viser hCD45+-cellerne i musens BM. Indsatsen refererer til humane celler (venstre) og museceller (højre). HSPC'er blev dyrket i 3 dage, genredigeret med sgRNA på dag 3 og transplanteret umiddelbart efter elektroporation. (C) Indkapsling af humane celler i musens BM 16 uger efter infusion (n = 4). (D) Den humane genmodificerede celle (hCD45+ genredigerede celler) kimerisme i mus BM 16 uger efter infusion (n = 4) (donor = 1). Hver prik repræsenterer en individuel mus, og datapunkterne er fra et individuelt eksperiment. Fejllinjer repræsenterer middelværdi ± SEM, *p≤ 0,05 (uparret t-test). Figuren er tilpasset med tilladelse fra Christopher et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Celleantal | Rensningsbuffer (ml) |
| < 1 x 107 celler | 0.1 |
| 1 x 107 - 1 x 108 celler | 0.5 |
| 1 - 5 x 108 celler | 1 |
Tabel 1: Mængden af oprensningsbuffer til fremstilling af den cellulære suspension til CD34+ cellerensning.
| Grundnavn | Sekvens |
| CCR5 Fremad | CAGAGCCAAGCTCTCCATC |
| CCR5 Omvendt | AGAGACGCAACACAGCCA |
| CCR5-sekventering Fremadgående primer | AATGTAGACATCTATGTAGG |
Tabel 2: Primersekvens til forstærkning af CCR5-locus.
| Komponenter | 50 μL reaktion |
| Buffer (5x) | 10 μL |
| Fremadgående primer (10 μM) | 1 μL |
| Omvendt primer (10 μM) | 1 μL |
| DNTP | 4 μL |
| Polymerase | 1 μL |
| Genomisk DNA | 200 ng |
| Nukleasefrit vand | op til 50 μL |
Tabel 3: Reaktionsblandingen til forstærkning af CCR5-locus ved anvendelse af PCR.
| Trin | Varighed | Temperatur | Antal cyklusser |
| Indledende denaturering | 1 minut | 95 °C | 1 |
| Denaturering | 10 sek. | 98 °C | 35 |
| Udglødning | 15 sek. | 56 °C | |
| Forlængelse | 30 s | 68 °C | |
| Endelig forlængelse | 1 minut | 72 °C | 1 |
| Holde | ∞ | 15 °C |
Tabel 4: Termocykliske betingelser for forstærkning af CCR5-locus.
| Komponenter | 10 μL reaktion |
| Buffer (5x) | 2 μL |
| primer (2 μM) | 1,6 μL |
| RR-blanding | 0,75 μL |
| PCR-oprydningsprodukt | 80 ng |
| Nukleasefrit vand | op til 10 μL |
Tabel 5: Reaktionsblandingen for Sanger-sekventering PCR.
| Trin | Varighed | Temperatur | Antal cyklusser |
| Denaturering | 15 sek. | 96 °C | 27 |
| Udglødning | 20 sek. | 55 °C | |
| Forlængelse | 4 minutter | 60 °C | |
| Holde | ∞ | 15 °C |
Tabel 6: Termocykliske betingelser for Sanger-sekventering PCR.
| Buffer | Sammensætning |
| 10x RBC lysis buffer – 100 ml (pH – 7,3) | 8,26 g NH4Cl, 1,19 g NaHCO3, 200 μL EDTA (0,5 M, pH8) |
| 50x TAE-buffer (pH – 8,3) | 50 mM EDTA natriumsalt, 2 M Tris, 1 M iseddike opløses i 1 liter vand |
Tabel 7: Buffersammensætninger
| Antistoffer | Lydstyrke |
| Anti-human CD45 APC | 3 μL |
| Anti-mus CD45.1 PerCP-Cy5 | 4,5 μL |
| Anti-mus CD34 PE | 3 μL |
Tabel 8: Antistoffer anvendt til vurdering af humane celletransplantationer.
| Antistoffer | Lydstyrke |
| Anti-human CD45 APC | 3 μL |
| Anti-mus CD19 PerCP | 15 μL |
| Anti-mus CD13 PE | 15 μL |
| Anti-mus CD3 PE-Cy7 | 2 μL |
Tabel 9: Antistoffer anvendt til vurdering af andelen af multilineageceller afledt af indpodede HSPC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vellykkede resultat af HSPC-genterapi afhænger overvejende af kvaliteten og kvantiteten af indpodbare HSC'er i transplantatet. HSC'ers funktionelle egenskaber påvirkes imidlertid i høj grad i den forberedende fase af genterapiprodukter, herunder af in vitro-kultur og toksicitet i forbindelse med genmanipulationsproceduren. For at overvinde disse begrænsninger har vi identificeret ideelle HSPC'er kulturbetingelser, der bevarer stammen af CD34 + CD133 + CD90 + HSC'er i ex vivo-kultur. Mange forskergrupper har brugt SR1 eller UM171 eller andre molekyler som selvstændige molekyler til at udvide navlestrengsblod (UCB) HSPC'er in vitro23,24. En tidligere undersøgelse brugte en kombination af både SR1 og UM17125. De små molekyler og cytokiner i kulturmediet blev specifikt optimeret til mobiliserede voksne HSPC'er og deres anvendelse i autolog genterapi. Screeningseksperimentet viste, at kombinationen af tre små molekyler Resveratrol, UM729 og SR1 er vigtig for at generere et stort antal CD34 + CD90+ celler og hæmme spredningen af differentierede og engagerede stamceller. UM729 i RUS-cocktailen kan erstattes med UM171. Det er imidlertid mindre muligt at foretage kommercielle indkøb af UM171. Cytokinkoncentrationerne er vedtaget fra den protokol, der blev anvendt i kliniske studier26 for at reducere variabiliteterne under opskaleringsprocessen. Cytokincocktailen indeholder IL6 i stedet for IL3 for at minimere proliferation af stamfadere og HSC-udmattelse in vitro27. Forberedelse af friske alikvoter af kulturmediet (basalmedier + RUS + cytokincocktails) anbefales for at reducere eksperimentel variation og opnå høj reproducerbarhed. Protokollen gælder for både NHEJ- og HDR-medieret genredigering. Især HSPC-kultur på 48-72 timer før elektroporation og 24 timer efter elektroporation er afgørende for HDR-genredigering. De optimerede dyrkningsforhold skal gavne HDR-genredigering ved at bevare stamcellerne. Det blev også observeret, at kulturbetingelserne hjælper lentiviral transduktion i langsigtede HSC'er. Dette tyder på, at hvis virale partikler som AAV6 eller IDLV anvendes som HDR-donor, forventes HDR-redigeringseffektiviteten at blive forbedret, da de optimerede kulturforhold fremmer donorlevering til HSC'er.
For at vurdere genredigeringsresultater, herunder NHEJ og HDR, foreslås NGS-analyse, sonde- eller ddPCR-analyse eller Sanger-sekventering 7,8,28 efterfulgt af dekonvolution ved hjælp af onlineværktøjer (ICE / ICE Knock-In)16 på grund af dets robuste kvantitative karakter. Alternativt kan et T7-endonukleaseassay udføres på redigerede DNA-prøver, og de fragmenterede DNA-bånd kan kvantificeres ved hjælp af ImageJ. T7 endonukleaseassaymetoden er imidlertid mindre præcis end dekonvolutionsanalyse og er rettet mod næste generations sekventering.
Transplantationsprotokollen optimeres også ved at konditionere NBSGW-musene med busulfan, hvilket gør det muligt for lave celledoser at vurdere HSPC-engraftment og genbefolkning. Samlet set skal denne procedure reducere de doser HSPC'er, der kræves til genmanipulation, og øge tilgængeligheden af HSPC-genterapi i udviklingslandene.
I denne undersøgelse blev protokollerne for PBMNC-isolering, CD34+ HSPC-oprensning, genredigering og validering og vurdering af de indpodede genredigerede HSPC'er i museknoglemarv demonstreret. Det er også bevist, at den optimerede HSPC-kultur beriger CD34+CD133+CD90+ HSPC'er og øger kimærismen hos genredigerede celler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke findes konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende personalet på flowcytometrifaciliteten og dyrefaciliteten i CSCR. A. C. finansieres af et ICMR-SRF-stipendium, K. V. K. finansieres af et DST-INSPIRE-stipendium, og P. B. finansieres af et CSIR-JRF-stipendium. Dette arbejde blev finansieret af Institut for Bioteknologi, Indiens regering (bevillingsnr. BT/PR26901/MED/31/377/2017 og BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | - | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | - | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - |
References
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F.
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V.
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
