Den nuværende protokol beskriver en optimeret hæmatopoietisk stam- og stamcellekulturprocedure (HSPC) til robust indkapsling af genredigerede celler in vivo.
CRISPR/Cas9 er et meget alsidigt og effektivt genredigeringsværktøj, der er vedtaget bredt for at korrigere forskellige genetiske mutationer. Muligheden for genmanipulation af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC’er) in vitro gør HSPC’er til en ideel målcelle til genterapi. HSPC’er mister imidlertid moderat deres engraftment og multilineage genbefolkningspotentiale i ex vivo-kulturen . I denne undersøgelse beskrives ideelle kulturforhold, der forbedrer HSPC-engraftment og genererer et øget antal genmodificerede celler in vivo. Den aktuelle rapport viser optimerede in vitro-kulturforhold , herunder typen af kulturmedier, unikt tilskud til cocktail med små molekyler, cytokinkoncentration, cellekulturplader og dyrkningstæthed. Derudover leveres en optimeret HSPC-genredigeringsprocedure sammen med validering af genredigeringshændelserne. Til in vivo-validering vises den genredigerede HSPC’s infusion og post-engraftment-analyse hos musemodtagere. Resultaterne viste, at kultursystemet øgede hyppigheden af funktionelle HSC’er in vitro, hvilket resulterede i robust engraftment af genredigerede celler in vivo.
Den manglende adgang til humant leukocytantigen (HLA) -matchede donorer i allogene transplantationsmiljøer og den hurtige udvikling af meget alsidige og sikre genteknologiske værktøjer gør autolog hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) til en helbredende behandlingsstrategi for arvelige blodsygdomme 1,2. Autolog hæmatopoietisk stam- og stamcelle (HSPC) genterapi involverer indsamling af patienters HSPC’er, genetisk manipulation, korrektion af sygdomsfremkaldende mutationer og transplantation af genkorrigerede HSPC’er til patienten 3,4. Det vellykkede resultat af genterapien afhænger imidlertid af kvaliteten af det transplanterbare genmodificerede transplantat. Genmanipulationstrinnene og ex vivo-kulturen af HSPC’er påvirker transplantatets kvalitet ved at reducere hyppigheden af langvarige hæmatopoietiske stamceller (LT-HSC’er), hvilket nødvendiggør infusion af store doser genmanipulerede HSPC’er 2,5,6.
Flere små molekyler, herunder SR1 og UM171, anvendes i øjeblikket til at udvide HSPC’er med navlestrengsblod robust 7,8. For voksne HSPC’er er der på grund af det højere celleudbytte, der opnås ved mobilisering, ikke behov for robust ekspansion. Det er imidlertid afgørende for dets genterapianvendelser, at isolerede HSPC’er bevares i ex vivo-kulturen. Derfor udvikles en tilgang med fokus på kulturberigelse af hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) ved hjælp af en kombination af små molekyler: Resveratrol, UM729 og SR1 (RUS)7. De optimerede HSPC-kulturbetingelser fremmer berigelsen af HSC’er, hvilket resulterer i øget hyppighed af genmodificerede HSC’er in vivo og reducerer behovet for genmanipulation af store doser HSPC’er, hvilket letter omkostningseffektive genterapimetoder8.
Her beskrives en omfattende protokol for HSPCs kultur sammen med infusion og analyse af genredigerede celler in vivo.
Det vellykkede resultat af HSPC-genterapi afhænger overvejende af kvaliteten og kvantiteten af indpodbare HSC’er i transplantatet. HSC’ers funktionelle egenskaber påvirkes imidlertid i høj grad i den forberedende fase af genterapiprodukter, herunder af in vitro-kultur og toksicitet i forbindelse med genmanipulationsproceduren. For at overvinde disse begrænsninger har vi identificeret ideelle HSPC’er kulturbetingelser, der bevarer stammen af CD34 + CD133 + CD90 + HSC’er i ex vivo-kul…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at anerkende personalet på flowcytometrifaciliteten og dyrefaciliteten i CSCR. A. C. finansieres af et ICMR-SRF-stipendium, K. V. K. finansieres af et DST-INSPIRE-stipendium, og P. B. finansieres af et CSIR-JRF-stipendium. Dette arbejde blev finansieret af Institut for Bioteknologi, Indiens regering (bevillingsnr. BT/PR26901/MED/31/377/2017 og BT/PR31616/MED/31/408/2019)
4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
DMSO | MPBIO | 219605590 | |
DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
Infrared lamp | MURPHY | – | |
Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
Ketamine | KETMIN 50 | – | |
Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
sgRNA | SYNTHEGO | - | |
SPINWIN | TARSON | 1020 | |
StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |