Summary
Mevcut protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanması için optimize edilmiş bir hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) kültür prosedürünü tanımlamaktadır.
Abstract
CRISPR / Cas9, çeşitli genetik mutasyonları düzeltmek için yaygın olarak benimsenen çok yönlü ve verimli bir gen düzenleme aracıdır. Hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC'ler) in vitro gen manipülasyonunun fizibilitesi, HSPC'leri gen tedavisi için ideal bir hedef hücre haline getirmektedir. Bununla birlikte, HSPC'ler ex vivo kültürde engraftment ve multilineage repopulasyon potansiyellerini orta derecede kaybederler. Bu çalışmada, HSPC engraftmanını geliştiren ve in vivo olarak artan sayıda gen modifiye hücre üreten ideal kültür koşulları tanımlanmıştır. Mevcut rapor, kültür ortamının türü, benzersiz küçük moleküllü kokteyl takviyesi, sitokin konsantrasyonu, hücre kültürü plakaları ve kültür yoğunluğu dahil olmak üzere optimize edilmiş in vitro kültür koşullarını göstermektedir. Buna ek olarak, optimize edilmiş bir HSPC gen düzenleme prosedürü, gen düzenleme olaylarının doğrulanması ile birlikte sağlanır. İn vivo doğrulama için, fare alıcılarında gen düzenlenmiş HSPC'lerin infüzyonu ve engraftman sonrası analizi görüntülenir. Sonuçlar, kültür sisteminin fonksiyonel HSC'lerin sıklığını in vitro olarak arttırdığını ve gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanmasını sağladığını göstermiştir.
Introduction
Allojenik transplantasyon ortamlarında insan lökosit antijeni (HLA) ile eşleşen donörlere erişilememesi ve çok yönlü ve güvenli genetik mühendisliği araçlarının hızla geliştirilmesi, otolog hematopoetik kök hücre transplantasyonunu (HKHN) kalıtsal kan hastalıkları için iyileştirici bir tedavi stratejisi haline getirmektedir 1,2. Otolog hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) gen tedavisi, hastaların HSPC'lerinin toplanmasını, genetik manipülasyonu, hastalığa neden olan mutasyonların düzeltilmesini ve gen düzeltilmiş HSPC'lerin hastaya transplantasyonunu içerir 3,4. Bununla birlikte, gen tedavisinin başarılı sonucu, nakledilebilir gen modifiye greftin kalitesine bağlıdır. HSPC'lerin gen manipülasyon adımları ve ex vivo kültürü, uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) sıklığını azaltarak greft kalitesini etkiler ve büyük dozlarda gen ile manipüle edilmiş HSPC'lerininfüzyonunu gerektirir 2,5,6.
SR1 ve UM171 de dahil olmak üzere birkaç küçük molekül şu anda kordon kanı HSPC'lerini 7,8 oranında genişletmek için kullanılmaktadır. Yetişkin HSPC'ler için, mobilizasyonda elde edilen daha yüksek hücre verimi nedeniyle, sağlam genleşme gerekli değildir. Bununla birlikte, ex vivo kültürde izole HSPC'lerin sapını korumak, gen terapisi uygulamaları için çok önemlidir. Bu nedenle, hematopoetik kök hücrelerin (HSC'ler) kültür zenginleştirilmesine odaklanan bir yaklaşım, küçük moleküllerin bir kombinasyonu kullanılarak geliştirilmiştir: Resveratrol, UM729 ve SR1 (RUS)7. Optimize edilmiş HSPC kültür koşulları, HSC'lerin zenginleşmesini teşvik eder, bu da gen modifiye HSC'lerin in vivo sıklığının artmasına neden olur ve yüksek dozlarda HSPC'leri manipüle eden gen ihtiyacını azaltır ve uygun maliyetli gen terapisi yaklaşımlarını kolaylaştırır8.
Burada, HSPC'lerin kültürü için kapsamlı bir protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo infüzyonu ve analizi ile birlikte açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İmmün yetmezlikli fareler üzerindeki in vivo deneyler, Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, Hindistan'ın yönergeleri doğrultusunda onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Granülosit koloni stimüle edici faktör (G-CSF)-mobilize periferik kan örnekleri, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onayı alındıktan sonra sağlıklı insan donörlerinden bilgilendirilmiş onam alınarak toplandı.
1. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMNC'ler) izolasyonu ve CD34 + hücrelerinin saflaştırılması
- Aşağıdaki adımları izleyerek PBMNC yalıtımı gerçekleştirin.
NOT: In vitro HSPC kültürü ve gen düzenleme için, en az 1 x 106 HSPC/grup ile başlamak idealdir. İn vivo engraftman analizi için, bir grup sekiz fare içeriyorsa ve her fare en az 6 x 105 hücreyle aşılanmışsa, en az 5 x 106 HSPC / grup başlangıç hücre sayısı idealdir. İşlem için yeterli sayıda PBMNC (~1 x 109) elde etmek için, 20 mL mobilize periferik kan (mPB) ile başlanması önerilir.- mPB toplandıktan sonra, 20 mL mPB'yi steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1: 1 oranında seyreltin.
NOT: G-CSF mobilizasyonunun etkinliği bireyler9 arasında değişebilir ve bu nedenle, 20 mL mobilize kandan elde edilen HSPC'lerin sayısı bağışçılar arasında değişir. - 50 mL'lik bir tüpe 10 mL yoğunluk gradyanı ortamı ( Lenfopr, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve seyreltilmiş kanı tüpün kenarlarından 1: 2 oranında katmanlayın.
NOT: Seyreltilmiş kanı eklerken 50 mL'lik tüpün 20°'lik bir açıyla eğilmesi, Lenfoprand ile karışmasını önler ve santrifüjlemeden sonra kan bileşenlerinin net bir şekilde ayrılmasına neden olur. - Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 600 x g'da santrifüj, 1 m/s² hızlanma hızı ve 1 m/s² yavaşlama oranı. Serolojik bir pipet kullanarak üst tabakayı (plazma) atın ve yoğunluk gradyanı orta tabakasının üzerindeki interfazda (PBMNC'ler) bulunan buffy katını toplayın.
NOT: Buffy kaplamayı serolojik bir pipet kullanarak tüpün yanlarında hafifçe döndürerek aspire edin. Granülosit ve RBC kontaminasyonunu önlemek için buffy katını aspire ederken daha yüksek hacimli interfaz toplamaktan kaçının. - PBMNC'leri taze bir 50 mL konik tüpe aktarın ve hücre süspansiyonunu 1: 2 oranında 1x PBS ile seyreltin.
NOT: Buffy ceketi aspire ederken fazla miktarda interfaz toplanmışsa, hücre süspansiyonunu 1x PBS ile 1:4 oranında seyreltin. - Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de 9 m/s² hızlanma hızı ve 7 m/s² yavaşlama hızı ile santrifüj edin ve süpernatantı serolojik pipet kullanarak atın. Pelet üzerine 30 mL buz gibi soğuk RBC lizis tamponu ekleyin (bakınız Tablo 7) ve 10 dakika boyunca buzda inkübe edin. Tüpü her 2 dakikada bir ters çevirerek karıştırın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da 9 m/s² hızlanma hızı ve 7 m/s² yavaşlama hızı ile santrifüj yapın ve süpernatanı atın. 1.1.5.-1.1.6 arasındaki adımları yineleyin. pelet kızarıklığı kaybolana kadar. Peletin bazal medya ile yeniden askıya alınması (IMDM, bakınız Malzeme Tablosu) ve Neubauer odası10'da tripan mavisi kullanarak bir hücre sayımı gerçekleştirin.
NOT: İzole PBMNC'ler CD34 + HSPC'leri saflaştırmak için hemen kullanılabilir. Alternatif olarak, PBMNC'ler CD34 + zenginleştirme için gerektiğinde kriyokorunabilir ve canlandırılabilir. Kriyoprezervasyon için, 5 dakika boyunca 200 x g'de 5 x 108 hücreyi santrifüj edin ve 7:2:1 oranında IMDM: FBS: DMSO içeren 4 mL kriyo ortamı ekleyin (bkz. - Şişeleri 1 °C'lik bir kriyosoğutucuya aktarın ve 12 saate kadar -80 °C'de saklayın. Kriyovalleri uzun süreli depolama için sıvı azot kabına aktarın ve saklayın.
- mPB toplandıktan sonra, 20 mL mPB'yi steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1: 1 oranında seyreltin.
- Kriyokorunmuş PBMNC'leri canlandırın.
- Kriyovalleri 37 °C'lik bir su banyosunda <1 dakika boyunca hafifçe döndürerek yarı yarıya çözün. Kriyovalin hücre süspansiyonunu IMDM içeren 50 mL'lik bir tüpe 1:10 oranında aktarın.
- Hücre süspansiyonunu 200 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 9 m/s² hızlanma hızı ve 7 m/s² yavaşlama hızı ile santrifüj edin ve süpernatantı serolojik pipet kullanarak atın.
- CD34+ hücrelerini aşağıdaki adımları izleyerek PBMNC'lerden arındırın.
- Saflaştırma tamponunu,% 2 filtrelenmiş fetal sığır serumu (FBS) içeren steril 1x PBS ile hazırlayın. PBMNC hücre peletini tamponda Tablo 1'e göre yeniden askıya alın.
NOT: Arabellek Ca++ ve Mg++ ücretsiz olmalıdır. - 1 x 108-5 x 108 hücre taze veya kriyokorunmuş PBMNC'ler içeren hücre süspansiyonunu 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarın (bkz.
NOT: Hücre kümelenmesini önlemek için hücre süspansiyonuna 100 μg/mL'lik son konsantrasyonda DNaz (bkz. Malzeme Tablosu) ekleyin. CD34 saflaştırma için İnsan CD34 Pozitif Seçim Kokteyli ve Dextran Hızlı Küreleri içeren ticari olarak temin edilebilen bir kit kullandık (bkz. - Ticari olarak temin edilebilen İnsan CD34 Pozitif Seçim Kokteylini (bakınız Malzeme Tablosu) 100 μL/mL hücre konsantrasyonuna ekleyin ve yavaşça geri çekin.
- RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve hücre süspansiyonunu her 5 dakikada bir nazikçe yeniden askıya alın. Ticari olarak temin edilebilen 50 μL/mL Dextran Hızlı Küre ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve yavaşça askıya alın.
NOT: Parçacıkların eşit dağılmış görünmesini sağlamak için dekstran kürelerini 5 s boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve ardından bunları hücrelere ekleyin. - RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin ve hücre süspansiyonunu her 5 dakikada bir nazikçe yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu saflaştırma tamponu ile toplam 2,5 mL hacme getirin ve yavaşça yeniden askıya alın.
- Tüpü ticari olarak temin edilebilen immünomanyetik kolonsuz bir mıknatısa yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, mıknatısı ters çevirin ve süpernatantı sürekli bir hareketle atın.
NOT: Dextran Hızlı Küreler etiketli CD34+ hücreleri, manyetik alan tarafından tüpün kenarlarına çekilmeye devam eder. Tüp 2-3 s ters pozisyonda tutulmalıdır. Tüpün ağzından asılı kalan damlaları titremekten veya lekelemekten kaçının. - Tüpü mıknatıstan çıkarın ve 2,5 mL saflaştırma tamponu ekleyin. 1.3.6-1.3.7 arasındaki adımları beş kez yineleyin.
NOT: Saflaştırma tamponunun eklenmesi sırasında, tüpü keskin bir açıyla konumlandırın ve tüpü döndürerek tampon ekleyin, çünkü hücreler mıknatısı ters çevirirken yüzey duvarlarına yapışabilir. - Beş yıkamayı tamamladıktan sonra, tüpü mıknatıstan çıkarın, 4 mL 1x steril PBS ekleyin ve hücre süspansiyonunu yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 1x PBS ile 10 mL'ye kadar yapın. Neubauer odası10'da tripan mavisi kullanarak bir hücre sayımı yapın.
- RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın (hızlanma ~9 m/s², yavaşlama ~7 m/s²) ve süpernatantı bir pipetle atın. HSPC'leri kültürlemek için, adım 2.1'de belirtildiği gibi HSPC kültür medyasındaki hücreleri yeniden askıya alın.
NOT: Saflaştırılmış HSPC'lerin fazlalıkları, HSPC'lerin HSPC kültür ortamında 12 saat boyunca kültürlenmesinden sonra ticari olarak temin edilebilen bir kriyoprezervasyon ortamında ( Malzeme Tablosuna bakınız) 9 x 106 hücre / mL yoğunlukta kriyokorunmuştur.
- Saflaştırma tamponunu,% 2 filtrelenmiş fetal sığır serumu (FBS) içeren steril 1x PBS ile hazırlayın. PBMNC hücre peletini tamponda Tablo 1'e göre yeniden askıya alın.
- Kriyokorunmuş HSPC'leri canlandırın.
- Kriyovalleri 37 °C'lik bir su banyosunda <1 dakika boyunca hafifçe döndürerek çözün. Kriyovyaldeki hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Sürekli ajitasyonla 1x PBS'de damla damla %1 BSA yeniden askıya alınıp 20 mL'ye kadar çıkın. 9 m/s² hızlanma hızı ve 7 m/s² yavaşlama hızı ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı serolojik pipet kullanarak atın.
- Adım 1.4.2'yi yineleyin. 1x. HSPC kültür medyasındaki ve kültüründeki hücreleri adım 2.1'de açıklandığı gibi yeniden askıya alın.
2. Saflaştırılmış HSPC'lerin in vitro kültürü
- Kültür ortamını SCF (240 ng/mL), FLT3 (240 ng/mL), TPO (80 ng/mL), IL6 (40 ng/mL ) ve 1x antibiyotik-antimikotik (bkz.
NOT: Taze hazırlanmış kültür ortamı şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, ortam hazırlandıktan sonra 4 ° C'de 24 saate kadar saklanabilir. - CD34+ peletini kültür ortamı ile yeniden askıya alın, 3 μL RUS kokteyli/mL ortam ekleyin (Resveratrol, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; Bkz. Malzeme Tablosu) ve hücreleri %5 CO 2 ile 37 °C'dekültürleyin.
NOT: UM171 (10 nm), her ikisi de HSPCsap bakımı 7 üzerinde benzer etkilere sahip olduğundan, UM729'un (500 nM) yerini almak için kullanılabilir. Şişeler iki kereden fazla dondurularak çözülemez. - Başlangıçta, yapışkan hücreleri çıkarmak için saflaştırılmış hücreleri 5 x 105 / mL'lik bir akıcılıkta ticari olarak temin edilebilen delta yüzeyiyle işlenmiş 6 kuyucuklu plakalarda (bkz.
- Süspansiyondaki hücreleri, 6 saatlik saflaştırmadan sonra yeni bir 6 delikli plakada 2 x 105 hücre / mL'lik bir akıcılıkta yeniden tohumlayın.
- Gen düzenlemeden önce akış sitometrisi kullanarak HSPC'lerin sapını karakterize edin.
- Akış sitometrisi analizi için, 1x PBS'nin 100 μL'sinde 1 x 105 hücre alın ve CD34 PE'den 3 μL (75 ng), CD133 FITC'den 4 μL (100 ng) ve CD90 APC'den 4 μL (100 ng) ekleyin (bkz.
- RT'deki tüpü karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri 2 mL 1x PBS 2x ile yıkayın ve RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. süpernatantı bir pipetle atın, hücre peletini 150 μL 1x PBS ile yeniden askıya alın ve akış sitometrisinde elde edin.
NOT: CD34+ hücrelerinin yüzdesi %<90 ise, adım 1.3.7'de yıkama sayısını altı kata kadar artırın. Saflaştırılmış HSPC'leri kültür ortamında tohumlayın ve 6 saat sonra sadece süspansiyondaki hücreleri toplayın. CD34 hücrelerinin çoğu kültür plakasına yapışır.
3. HSPC'lerin gen düzenlemesi
- Kılavuz RNA sulandırma işlemini gerçekleştirin.
NOT: CCR5 lokusunu hedef alan fosforothioate modifikasyonlarına sahip sentetik sgRNA ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).- Sulandırma için, termomikseri 37 °C'ye ayarlayın ve 1x TE tamponunu (Malzeme Tablosuna bakınız) 10 dakika boyunca 37 °C'de önceden ısıtın. Sentetik kimyasal olarak modifiye edilmiş sgRNA şişesini 11.000 x g'de 4 ° C'de 1 dakika boyunca santrifüj edin.
- 1.5 nM liyofilize sgRNA içeren sgRNA şişesine, 15 μL 1x TE tamponu ekleyin, 100 pm / μL'lik bir son konsantrasyon elde edin.
- Termo mikserde 37 °C'de 30-40 s için minimum sarsıntı ile inkübe edin. Kısa bir spinden sonra, 15 μL sgRNA toplayın ve 1 yıla kadar gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de 1 μl alikot (100 pm / μL) olarak saklayın.
NOT: Tekrar tekrar donarak çözülmeyi önleyin. En fazla bir tane aliquoted gRNA'nın donma-çözülme döngüsü önerilir.
- Aşağıdaki adımları izleyerek nükleofeksiyon gerçekleştirin.
- Kültürün 3. gününde, Neubauer'in geliştirilmiş hücre sayma odası10'u kullanarak hücreleri sayın.
- RNP hazırlığı için (2 x 10 5 hücrenin çekirdeğini oluşturmak için),0.5 mL'lik bir tüpte CCR5 genini (100 pM) hedefleyen 1 μL sgRNA alın ve şişenin dibinde hafifçe dönerek 2.65 μL Cas9 (50 pM) ekleyin. RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
NOT: gRNA dizisi: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG. - Tampon hazırlama için, ticari nükleofeksiyon kiti ile birlikte verilen 16.4 μL P3 birincil hücre çözeltisi ve 3.6 μL takviye ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Kültür ortamını hazırlayın (adım 2.1.) ve nükleofeksiyondan önce kültür plakasında 37 ° C'de preinkübe edin.
- RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yaparak 2 x 105 hücreli pelet ve peleti rahatsız etmeden bir pipet kullanarak süpernatantı yavaşça atın. Pelet, adım 3.2.3'te hazırlanan tamponun 20 μL'si ile yeniden askıya alın. ve yavaşça askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu hazırlanan RNP kompleksi (adım 3.2.2.) ile hava kabarcıkları olmadan yavaşça karıştırın. Süspansiyonu ticari nükleofeksiyon şeridine aktarın (bkz. Malzeme Tablosu) ve 4D nükleofektörü kullanarak hücreleri elektroporat yapmak için DZ100 darbe kodunu seçin (bkz.
NOT: Tampon ve RNP bileşenleri de dahil olmak üzere hücre süspansiyonunun son hacmi, 27 μL/elektroporasyondan fazlasını geçmemelidir. - Deneysel kontrol için, RT'de 5 dakika boyunca 200 xg'de santrifüj yaparak 2 x 10 5 düzenlenmemiş HSPC'leri pelet ve 3.2.3 adımında hazırlanan tamponun 20 μL'si ile peleti yeniden askıya alın. RNP kompleksi olmadan.
- Elektroporasyonlu hücrelere 100 μL önceden inkübe edilmiş kültür ortamı (adım 3.2.3.) ekleyin ve RT'deki nükleofeksiyon şeridinde hücreleri 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, içeriği deneysel gereksinimlere göre kültür plakasına aktarın.
NOT: Bu protokol, hedefe özgü gRNA kullanılarak herhangi bir genomik lokusun homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) aracılı hedefli bozulmasına uygulanabilir. Aynı protokol, adım 3.2.2'ye çift gRNA dahil edilerek büyük delesyonların ortaya çıkarılması için de uygulanabilir. 11. Ayrıca, 10 dakikalık RNP inkübasyonundan sonra, aynı protokol, bir donör şablonu12 ile sağlandığında homoloji yönelimli onarım (HDR) tabanlı gen düzenleme için kullanılabilir. Protokol, AAVS1, psödo-globin, β-globin ve CCR5 lokus 7,8'in hedeflenen bozulması ile β doğrulanmıştır.
4. HSPC'lerde gen düzenleme olaylarının doğrulanması
- DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
- Nükleofeksiyondan 72 saat sonra, bir Neubauer odasında tripan mavisi kullanarak bir hücre sayımı yapın. DNA ekstraksiyonu için 1 x 105 gen düzenlenmiş HSPC'ler toplayın.
- RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 11.000 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı bir pipet kullanarak atın. Peleti 1 mL 1x PBS ile yeniden askıya alın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı atın. Pelete, 1 x 105 hücre için 20 μL hızlı ekstraksiyon çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve peleti yeniden askıya alın.
- Karışımı bir termosikler içinde 68 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Kısa bir dönüşten sonra, karışımı 10 dakika boyunca 98 ° C'de bir termosikler içinde inkübe edin. Bir spektrofotometre13 kullanarak ham lizattaki DNA konsantrasyonunu ölçün.
- Gen düzenlenmiş lokusun PCR ile amplifikasyonunu gerçekleştirin.
- Primer3'ü kullanarak (bkz . Malzeme Tablosu), 400-700 bp arasında değişen amplikon boyutlarına sahip çift sarmallı kırılma (DSB) bölgesini kapsayan lokusa özgü primerleri tasarlayın (Tablo 2).
NOT: Primer3, PCR primerleri tasarlamak için kullanılan web tabanlı açık kaynaklı bir araçtır. - Reaksiyon karışımını Tablo 3'te belirtildiği gibi hazırlayın ve termosikler'i Tablo 4'te belirtilen döngü koşullarıyla çalıştırın. İstenilen lokusun amplifikasyonunu doğrulamak için, 5 μL PCR ürününü 6x yükleme boyası ile karıştırın ve TAE tamponu kullanılarak yapılan% 2 agaroz jel elektroforezi üzerine yükleyin.
NOT: TAE arabellek bileşenleri Tablo 7'de verilmiştir. - 100 V'ta 30-40 dakika boyunca çalıştırın ve bir jel görüntüleme sistemi kullanarak amplikonu tespit edin (bkz. PCR saflaştırma üreticisi protokolüne göre (bakınız Malzeme Tablosu), güçlendirilmiş PCR ürününü temizleyin.
- Saflaştırılmış PCR ürününün konsantrasyonunu bir nanodamla spektrofotometre kullanarak ölçün (bkz.
- Primer3'ü kullanarak (bkz . Malzeme Tablosu), 400-700 bp arasında değişen amplikon boyutlarına sahip çift sarmallı kırılma (DSB) bölgesini kapsayan lokusa özgü primerleri tasarlayın (Tablo 2).
- Aşağıdaki adımları izleyerek Sanger dizilemesini ve serbest boya sonlandırıcı temizleme işlemlerini gerçekleştirin.
- Reaksiyon karışımını Tablo 5'te gösterildiği gibi hazırlayın. Termosikler'i Tablo 6'da belirtildiği gibi bisiklet koşullarıyla çalıştırın.
- 1,5 mL'lik bir tüpte 10 μL PCR örneğine 10 μL HighPrep DTR reaktifi (bkz. Malzeme Tablosu) ve 40 μL %85 etanol ekleyin ve yaklaşık 8x-10x kuvvetli pipetleme ile karıştırın.
- Karışımı RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin ve 1,5 mL tüpü manyetik ayırma standına 5 dakika yerleştirin. Bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve 100 μL% 85 etanol ekleyin.
- Üst öğeyi atın ve adım 4.3.3'ü yineleyin. 1x. 1,5 mL tüpleri mıknatıs standından çıkarın ve etanolün kurutulması için bir termomikserde 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Boncukları 40 μL nükleaz içermeyen suyla kuvvetli bir şekilde yeniden askıya alın ve RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Tüpü 5 dakika boyunca manyetik ayırma standına yerleştirin ve yayınlanan raporlar 14,15'i takiben Sanger dizilimini gerçekleştirin.
- ICE analizi16 ile bir indel frekans değerlendirmesi yapın.
- ICE analizi için Synthego kullanın (bkz.
- Düzenlenmiş ve düzenlenmemiş örneklerin ve gRNA dizilerinin ab1 dosyalarını yükleyin ve Indel'lerin frekansını almak için analiz et'e tıklayın.
5. Gen düzenlenmiş HSPC'lerin transplantasyonu
- Ticari olarak temin edilebilen NOD scid gama faresi (NSG)17 ve NOD'nin ön koşulu. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 fare, kemik iliği nakli için ( bkz.
- NSG farelerini ön koşullandırmak için, 6-8 haftalık dişi fareleri seçin ve kör randomizasyon ile onları kontrol ve düzenlenmiş gruplara ayırın.
- NSG farelerini pasta kafeslerine yerleştirin ve HSPC transplantasyonundan 6-8 saat önce ticari olarak temin edilebilen bir ışınlayıcı kullanarak 3,5 Gy'de ışınlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Farelerin ışınlamadan önce tartılması önerilir ve >20 g ağırlığındaki fareler ışınlamaya tabi tutulur. - 6-8 haftalık erkek ve dişi NBSGW farelerini ön koşullandırmak için, HSPC transplantasyonundan 48 saat önce intraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla busulfan'ı ( Malzeme Tablosuna bakınız) 48 saat önce vücut ağırlığının 12.5 mg / kg dozunda enjekte edin.
NOT: Busulfan koşullandırması, insan HSPC'lerinin fare kemik iliğindeki engraftmanını arttırır ve büyük dozlarda gen düzenlenmiş HSPC'lerin19 aşılanması ihtiyacını azaltır. Şartlandırma için ideal busulfan dozu aralığı 10 mg / kg ila 15 mg / kg vücut ağırlığı arasındadır. Busulfan'ın artan dozları ciddi mortalite sorunlarına neden olacaktır.
- Kemik iliği nakli için hücre süspansiyonunu hazırlayın.
- Nükleofeksiyon şeridindeki gen düzenlenmiş HSPC'lerin 10 dakikalık inkübasyonundan sonra (bkz. adım 3.2.7.), hücre süspansiyonunu 10 mL'lik 1x PBS'ye aktarın. Neubauer'in geliştirilmiş hücre sayma odası10'u kullanarak hücreleri sayın.
- Bir farenin infüzyonu için, RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yaparak 1,5 mL'lik bir tüpte 6 x 105 hücre pelet ve peleti rahatsız etmeden bir pipet kullanarak süpernatantı yavaşça atın. Hücre peletini 100 μL 1x PBS ile yeniden askıya alın.
- HSPC'leri aşağıdaki adımları izleyerek kuyruk damarı enjeksiyonu ile infüze edin.
- Önceden koşullandırılmış NSG veya NBSGW fareyi fare tutucusuna yerleştirin (bkz.
- Fare kuyruğunu tutun ve fareyi dizginlemek için fişi hafifçe itin. Fare kuyruğunu% 70 etanol ile nazikçe silin. 31 G insülin şırıngasında hücre süspansiyonunun 100 μL'sini aspire edin.
NOT: Şırıngaya hafifçe dokunarak veya pistonu hafifçe hareket ettirerek infüzyon ürünündeki kabarcıklardan kesinlikle kaçının. - Kızılötesi lambadan gelen ışığı 30-40 s boyunca kuyruğa yönlendirin ve farenin vücut alanını kağıt mendil kıvrımlarıyla kaplayın. İğnenin eğim kısmını yavaşça sol veya sağ kaudal kuyruk damarına 20°'lik bir açıyla yerleştirin.
- Şırınga ile düzlemsel eksende tutmak için kuyruğu sol işaret parmağınızla kaldırın. Hücre süspansiyonunu damara aşılamak için pistonu itin. Kağıt mendille delinmiş bölgenin yakınına hafif basınç uygulayın ve iğneyi dışarı çekin.
- 30 s hafif basınç uyguladıktan sonra, fareyi tutucudan çıkarın ve kafesine aktarın.
6. Kısa süreli engraftman potansiyelinin değerlendirilmesi
- İnsan HSPC transplantasyonundan 4 hafta sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak heparinize bir tüpte orbital venöz sinüs yoluyla kan toplayarak kısa süreli engraftmanı değerlendirin.
- Numune toplanmadan önce intraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla ketamin (90-120 mg/kg) ve ksilazin (8-12 mg/kg) formülasyonu ile hayvanı anestezi altına alın.
NOT: Duyu kaybını doğrulamak için anestezi uygulanan farenin arka bacaklarına nazikçe basınç uygulayın. - Anestezi uyguladıktan sonra, hayvanı ventral yatışa yerleştirin ve gözü açmak için fareyi hafifçe ovun, bu da gözün küresinin hafifçe çıkıntı yapmasını sağlar.
- Pasteur pipeti, 30°-45° açıda niktasyon zarının altındaki gözün medial kanüsüne nazikçe yerleştirin. Pasteur pipeti uygun konuma yerleştirdikten sonra, tüpe hafif bir basınç uygulayın ve tüpü yavaşça döndürmeye başlayın.
NOT: Retro-orbital pleksus delinir delinmez kan, kılcal hareketle tüpe girecektir.
- Numune toplanmadan önce intraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla ketamin (90-120 mg/kg) ve ksilazin (8-12 mg/kg) formülasyonu ile hayvanı anestezi altına alın.
- 50-80 μL periferik kan topladıktan sonra, pipeti gözün medial kantusundan yavaşça çekin.
- Gözün yörüngesindeki kanamayı durdurmak için, göz kapaklarını kapatın ve bir parça gazlı bez kullanarak hafif basınç uygulayın.
- Hücreleri ilgili antikorlarla sabitleyin (Tablo 8) ve hücreleri RT'de 25-30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin.
- RBC lizisi için, hücre süspansiyonuna 3 mL 1x RBC lizis tamponu ekleyin (Tablo 7) ve buzda 10 dakika inkübe edin.
- RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipet kullanarak atın. Adım 6.4'ü yineleyin. pelet kızarıklığı kaybolana kadar.
- RBC lizisi ile ilişkili hücre kalıntılarını gidermek için RT'de 5 dakika boyunca 2 mL 1x PBS ekleyin ve 200 x g'de santrifüj yapın.
- Pelet için 150 μL 1x PBS ekleyin ve daha sonra aşılanmış insan hücrelerinin yüzdesini değerlendirmek için akış sitometrisi için immünofenotipleme ile devam edin7.
7. Uzun süreli engraftman potansiyelinin değerlendirilmesi
- Fareleri ötenazileştirin.
- Nakledilen fareleri, 16. haftada engraftman analizi için, fareler kafesinin içinde% 100 CO2 boğulma20'yi 1-2 dakika boyunca tanıtarak feda edin.
- Kardiyak ve solunum durmasını ve arka bacakların hafifçe sıkışmasıyla kas hareketlerinin yokluğunu tespit ederek ötenaziyi doğrulayın. Her iki koşul da yerine getirilirse, fareleri kafesten çıkarın.
- İnsan hücresi kimerizmini değerlendirmek için, hücreleri kemik iliğinden toplayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek hücreleri kemik iliğinden izole edin.
- Ötanizasyon sonrası, üretranın 1 cm yukarısında dikey bir kesi yapın ve diyaframın 1 cm altına kadar uzatın. Karın bölgesini geniş ölçüde açmak için kesilmiş alanın köşelerinde yatay olarak kesin.
- Femur ve tibiayı diseke edin ve makas kullanarak femur ve tibiaya bağlı yumuşak dokuları çıkarın. Mendil kağıdı ile nazikçe ovalayın ve neşter kullanarak 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün dibinde 0,2 cm'den daha yüksek olmayan bir çapa sahip küçük bir delik açın.
- Bir neşter kullanarak kemiklerin proksimal uçlarını çıkarın ve kemikleri, kesilen taraf 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünün deliğine bakacak şekilde yerleştirin. 0,5 mL'lik tüpü kemiklerle birlikte 100 μL steril 1x PBS içeren 1,5 mL'lik tüpe yerleştirin.
- Kapağı kapatın, tüpleri RT'de steril koşullar altında 1000 x g'de 3 dakika döndürün ve boş bir ilik boşluğuna sahip kemikler içeren 0,5 mL tüpleri atın. Kemik iliği içeren 1,5 mL reaksiyon tüpüne 1 mL 1x PBS ekleyin ve 1 mL'lik bir pipet kullanarak hücreleri yaklaşık 10 kattan az olmamak üzere nazikçe yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini, 9 mL RBC lizis tamponu içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Her 2 dakikada bir tüplerin hafifçe ters çevrilmesiyle hücreleri 7 dakika boyunca buzda inkübe edin.
- 7 dakika sonra, RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj, 9 m/s² hızlanma ve 7 m/s² ivme azaltma ile santrifüjleyin. 7.2.5 adımını yineleyin. açık soluk beyaz bir pelet gözlenene kadar.
- Hücreleri 10 mL steril 1x DPBS ile yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir tüp üzerinde 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak kemik iliği hücre süspansiyonunu filtreleyin. Hücre kaybını önlemek için hücre süzgecini 2 mL 1x PBS 2x ile durulayın.
- 200 x g, RT'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipet kullanarak atın. 100 μg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonunda DNaz-I ile 10 mL IMDM içeren hücreleri yeniden askıya alın.
- Akış sitometrisi ile engraftman analizi için bir FACS tüpünde 1 x 106 mononükleer hücre alın. Engrafe kemik iliği mononükleer hücrelerinde gen düzenleme sıklığını değerlendirmek için, RT'de 5 dakika boyunca 11.000 x g'de 1 x 106 mononükleer hücre pelet ve süpernatantı bir pipet kullanarak atın.
8. İmmünofenotipleme
- Kemik iliği hücrelerini, antikorlarla boyamadan önce 15 dakika boyunca saflaştırılmış bir rekombinant insan Fc proteininin 1.5 μL'si ile (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: Burada kullanılan insan Fc proteini, IgG reseptörlerinin neden olduğu spesifik olmayan antikor boyamasını bloke etmek için formüle edilmiştir; böylece 7,21,22 antikor etiketlemesinin özgüllüğünü arttırır. Hedef hücrelerin antikor boyamasından önce, antikor titrasyonu gerçekleştirin. Çok renkli flowsitometrik analiz üzerinde çalışırken FMO kontrollerinin ve izotip kontrollerinin dahil edilmesi şiddetle tavsiye edilir. - Akış sitometresi ile insan hücresi engraftmanının yüzdesini belirlemek için, bir FACS tüpünde 1 x 106 mononükleer hücre alın ve hücreleri Tablo 8'de belirtildiği gibi boyayın.
- RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipet kullanarak atın.
- Hücreleri bir akış sitometresi ile elde edin, mononükleer hücrelerin ileri (FSC) ve yan saçılımlarını (SSC) kullanarak hücre popülasyonunu (P1) kapılayın ve voltajı hücre popülasyonuna göre ayarlayın. P1 popülasyonunda 50.000 hücre olayı elde edin.
- Fare kemik iliğindeki insan lökosit popülasyonlarını analiz etmek için, insan CD45 + hücrelerini ve P1 hücre popülasyonundan fare CD45.1'i, bir akış sitometrisi veri analiz yazılımı kullanarak kapıdan geçirin (bkz.
- Aşağıdaki formülü kullanarak insan hücrelerinin engraftmanını hesaplayın8:
Engraftmanın % 'si = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
NOT: İnsan engraftmanı eşiğinin CD45 için %0.1 pozitif olduğu düşünülmüştür. - Ayrıca, uzun süreli repopulasyon hücrelerini değerlendirmek için insan CD45 + hücrelerinden hCD34 + hücrelerinin yüzdesini analiz edin. Aşılanmış insan hücrelerinin çok soylu yeniden yapılanmasını değerlendirmek için, Tablo 9'u takiben 100 μL hücre süspansiyonunu lekeleyin.
NOT: Antikorların deneylerden önce titre edilmesi gerekir. - Akış sitometri yazılımını kullanarak, hCD45'i P1 hücre popülasyonundan kapılar ve hCD45'ten hCD19, hCD3 ve hCD13'ün (lenfoid ve miyeloid alt kümeleri) yüzdesini ölçer.
9. Engrafe kemik iliği mononükleer hücrelerinde gen düzenleme sıklığının değerlendirilmesi
- Kemik iliği mononükleer hücre peletine, 5 x 105 hücre için 50 μL hızlı ekstrakt çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve peleti yeniden askıya alın.
- Karışımı bir termosikler içinde 68 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Kısa bir dönüşten sonra, karışımı 10 dakika boyunca 98 ° C'de bir termosikler içinde inkübe edin.
- Bir spektrofotometre kullanarak ham lizattaki DNA konsantrasyonunu ölçün. 4.2.-4.4 arasındaki adımları izleyin. ICE analizi 8,15 kullanarak gen düzenleme frekansını doğrulamak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma, CD34+CD133+CD90+ HSC'lerin ex vivo kültürde tutulmasını kolaylaştıran ideal HSPC kültür koşullarını tanımlamaktadır. HSC'lerin kültür zenginleştirilmesini, gen modifiye HSC'lerin geliştirilmiş üretimi ile birlikte göstermek için, PBMNC izolasyonu, CD34 + hücre saflaştırma, kültür, gen düzenleme, transplantasyon, engraftmanın karakterizasyonu ve gen modifiye edilmiş hücrelerin in vivo için optimize edilmiş prosedürler sağlanmıştır (Şekil 1). Saflaştırma sonrası, HSPC belirteçlerini kontrol etmek için akış sitometrisi değerlendirmesi yapıldı ve HSPC'ler 72 saat boyunca kültürlendi. 72 saatlik kültürden sonra, HSPC'ler Cas9 RNP ile çekirdeklendirildi ve 2 gün daha kültürlendi. RUS kokteylini içeren optimize edilmiş kültür koşulları, CD34 + CD133 + CD90 + HSC'lerin canlılığının arttığını ve daha yüksek frekans ve gen düzenleme sıklığının arttığını göstermiştir (Şekil 2). Optimize edilmiş kültür koşullarının gen modifiye hücrelerin in vivo sıklığını arttırdığını daha da göstermek için, CCR5 lokusunu hedef alan 3. gün HSPC'ler gen düzenlendi ve alt lethally ışınlanmış NSG farelerine aşılandı. İnsan hücrelerinin fare kemik iliğinde (BM) engraftmanı infüzyondan 16 hafta sonra analiz edildi (Şekil 3A). NSG farelerde insan CD45 + (hCD45) hücrelerinin akış sitometrisi analizi, kültür koşullarında artmış engraftman göstermiştir (Şekil 3B, C). Fare BM hücrelerindeki gen düzenleme sıklığının analizi, RUS takviyeli kültür koşullarında gen düzenlenmiş HSPC'lerin engraftmanının arttığını göstermiştir (Şekil 3D).
Şekil 1: Bu çalışmanın özeti. PBMNC'lerin izole edilmesi, CD34 + hücrelerinin PBMNC'lerden manyetik olarak zenginleştirilmesi, kültürlenmesi, insan hematopoetik kök ve progenitör hücrelerinin (HSPC'ler) karakterizasyonu, gen düzenleme ve transplantasyonda yer alan prosedürün grafiksel özeti temsil edilmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: RUS kokteyli HSC'lerin sıklığını zenginleştirir. mPB-HSPC'ler 3 gün boyunca araçlı sitokinler (DMSO) ve RUS kokteyli içeren kök hücre kültürü ortamında kültürlendi ve 25 pm Cas9-RNP ile gen düzenlendi. Gen düzenlenmiş hücreler, HSPC'lerin 48 saat nükleofeksiyon sonrası belirteçleri için FACS tarafından analiz edildi. (A) Akış grafikleri canlı hücreleri (7AAD-) ve CD34+ CD90+ popülasyonunu temsil eder. (B) İndel modellerinin yüzdesi ve sıklığı, DMSO ve RUS'la tedavi edilen grupta 72 saatlik düzenleme sonrası analiz edildi. (C) Düzenleme sonrası 48 saat analiz edilen CD34+ CD90+ hücrelerinin mutlak sayısı (n = 2) (donör = 1). (D) Düzenleme sonrası 48 saat analiz edilen toplam çekirdekli hücrelerin (TNC) mutlak sayısı (n = 2) (donör = 1). Hata çubukları ortalama SEM, *p ± 0,05 (eşlenmemiş t-testi) ≤ temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Optimize edilmiş kültür koşulları, gen modifiye hücrelerin sıklığını in vivo olarak arttırır . (A) Deneyin şematik gösterimi. (B) Fare BM'sindeki hCD45+ hücrelerini gösteren temsili FACS grafiği. İç kısım, insan hücrelerini (solda) ve fare hücrelerini (sağda) ifade eder. HSPC'ler 3 gün boyunca kültürlendi, 3. günde sgRNA ile gen düzenlendi ve elektroporasyondan hemen sonra nakledildi. (C) İnfüzyondan sonraki 16 haftada fare BM'sinde insan hücrelerinin aşılanması (n = 4). (D) İnfüzyondan 16 hafta sonra fare BM'sinde insan gen modifiye hücre (hCD45 + gen düzenlenmiş hücreler) kimerizmi (n = 4) (donör = 1). Her nokta ayrı bir fareyi temsil eder ve veri noktaları tek bir denemeden alınmıştır. Hata çubukları ortalama ± SEM, *p≤ 0,05'i (eşlenmemiş t-testi) temsil eder. Şekil Christopher ve ark.7'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hücre sayısı | Arıtma tamponu (mL) |
| < 1 x 107 hücre | 0.1 |
| 1 x 107 - 1 x 108 hücre | 0.5 |
| 1 - 5 x 108 hücre | 1 |
Tablo 1: CD34 + hücre saflaştırması için hücresel süspansiyonu hazırlamak için saflaştırma tamponunun hacmi.
| Astar adı | Sıra |
| CCR5 İleri | CAGAGCCAAGCTCTCCATC |
| CCR5 Ters | AGAGACGCAAACACAGCCA |
| CCR5 sıralama İleri astar | AATGTAGACATCTATGTAGG |
Tablo 2: CCR5 lokusunu yükseltmek için astar dizisi.
| Bileşen | 50 μL reaksiyon |
| Arabellek (5x) | 10 μL |
| İleri astar (10 μM) | 1 μL |
| Ters astar (10 μM) | 1 μL |
| dNTP | 4 μL |
| Polimeraz | 1 μL |
| Genomik DNA | 200 ng |
| Nükleaz içermeyen su | 50 μL'ye kadar |
Tablo 3: PCR kullanarak CCR5 lokusunu yükseltmek için reaksiyon karışımı.
| Adım -ları | Süre | Sıcaklık | Döngü Sayısı |
| İlk denatürasyon | 1 dk | 95 °C | 1 |
| Denatürasyon | 10 Saniye | 98 °C | 35 |
| Tavlama | 15 Saniye | 56 °C | |
| Uzantı | 30 Saniye | 68 °C | |
| Son uzatma | 1 dk | 72 °C | 1 |
| Tutmak | ∞ | 15 °C |
Tablo 4: CCR5 lokusunun yükseltilmesi için termosikler koşulları.
| Bileşen | 10 μL reaksiyon |
| Arabellek (5x) | 2 μL |
| astar (2 μM) | 1,6 μL |
| RR karışımı | 0,75 μL |
| PCR temizleme ürünü | 80 ng |
| Nükleaz içermeyen su | 10 μL'ye kadar |
Tablo 5: Sanger dizileme PCR için reaksiyon karışımı.
| Adım -ları | Süre | Sıcaklık | Döngü sayısı |
| Denatürasyon | 15 Saniye | 96 °C | 27 |
| Tavlama | 20 Saniye | 55 °C | |
| Uzantı | 4 dk | 60 °C | |
| Tutmak | ∞ | 15 °C |
Tablo 6: Sanger dizileme PCR için termosikler koşulları.
| Arabellek | Kompozisyon |
| 10x RBC lizis tamponu – 100 mL (pH – 7.3) | 8.26 g NH4Cl, 1.19 g NaHCO3, 200 μL EDTA (0.5 M, pH8) |
| 50x TAE tamponu (pH – 8.3) | 50 mM EDTA sodyum tuzu, 2 M Tris, 1 M buzul asetik asidi 1 L suda çözün |
Tablo 7: Tampon Bileşimleri
| Antikor | Hacim |
| Anti-insan CD45 APC | 3 μL |
| Fare karşıtı CD45.1 PerCP-Cy5 | 4,5 μL |
| Anti-fare CD34 PE | 3 μL |
Tablo 8: İnsan hücresi engraftmanını değerlendirmek için kullanılan antikorlar.
| Antikor | Hacim |
| Anti-insan CD45 APC | 3 μL |
| Anti-mouse CD19 PerCP | 15 μL |
| Anti-fare CD13 PE | 15 μL |
| Anti-fare CD3 PE-Cy7 | 2 μL |
Tablo 9: Aşılanmış HSPC'lerden türetilen çok soylu hücrelerin oranını değerlendirmek için kullanılan antikorlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HSPC gen tedavisinin başarılı sonucu, ağırlıklı olarak greftteki engraflanabilir HSC'lerin kalitesine ve miktarına bağlıdır. Bununla birlikte, HSC'lerin fonksiyonel özellikleri, gen manipülasyon prosedürü ile ilişkili in vitro kültür ve toksisite de dahil olmak üzere, gen terapisi ürünlerinin hazırlık aşamasında oldukça etkilenir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, ex vivo kültürde CD34 + CD133 + CD90 + HSC'lerin kökünü koruyan ideal HSPC kültür koşullarını belirledik. Birçok araştırma grubu, SR1 veya UM171 veya diğer molekülleri, göbek kordon kanı (UCB) HSPC'lerini in vitro23,24'ü genişletmek için bağımsız moleküller olarak kullanmıştır. Önceki bir çalışmada hem SR1 hem de UM17125'in bir kombinasyonu kullanılmıştır. Kültür ortamının küçük molekülleri ve sitokinleri, mobilize yetişkin HSPC'ler ve bunların otolog gen terapisindeki uygulamaları için özel olarak optimize edilmiştir. Tarama deneyi, üç küçük molekül olan Resveratrol, UM729 ve SR1'i birleştirmenin, çok sayıda CD34 + CD90 + hücresi üretmek ve farklılaşmış ve bağlı progenitör hücrelerin çoğalmasını inhibe etmek için önemli olduğunu göstermiştir. RUS kokteylindeki UM729, UM171 ile değiştirilebilir. Bununla birlikte, UM171'in ticari tedariki daha az uygulanabilir. Sitokin konsantrasyonları, ölçek büyütme işlemi sırasındaki değişkenlikleri azaltmak için klinik çalışmalarda kullanılan protokolden26 kabul edilmiştir. Sitokin kokteyli, progenitör proliferasyonunu ve HSC tükenmesini in vitro27 en aza indirmek için IL3 yerine IL6 içerir. Deneysel varyasyonu azaltmak ve yüksek tekrarlanabilirlik elde etmek için kültür ortamının taze alikotlarının (bazal medya + RUS + sitokin kokteylleri) hazırlanması önerilir. Protokol hem NHEJ hem de HDR aracılı gen düzenlemesi için geçerlidir. Özellikle, elektroporasyondan önce 48-72 saat ve elektroporasyondan sonra 24 saat HSPC kültürü, HDR gen düzenlemesi için çok önemlidir. Optimize edilmiş kültür koşulları, kök hücreleri koruyarak HDR gen düzenlemesine fayda sağlamalıdır. Kültür koşullarının uzun süreli HSC'lerde lentiviral transdüksiyona yardımcı olduğu da gözlenmiştir. Bu, AAV6 veya IDLV gibi viral parçacıkların HDR donörü olarak kullanılması durumunda, optimize edilmiş kültür koşulları HSC'lere donör dağıtımını teşvik ettiğinden, HDR düzenleme verimliliğinin artmasının beklendiğini göstermektedir.
NHEJ ve HDR, NGS analizi, prob veya ddPCR analizi veya Sangerdizilimi 7,8,28 dahil olmak üzere gen düzenleme sonuçlarını değerlendirmek için, sağlam nicel doğası nedeniyle çevrimiçi araçlar (ICE / ICE Knock-In)16 kullanılarak dekonvolüsyon önerilmektedir. Alternatif olarak, düzenlenmiş DNA örnekleri üzerinde bir T7 endonükleaz testi yapılabilir ve parçalanmış DNA bantları ImageJ kullanılarak ölçülebilir. Bununla birlikte, T7 endonükleaz testi yaklaşımı, dekonvolüsyon analizinden daha az hassastır ve yeni nesil dizilemeyi hedefler.
Transplantasyon protokolü ayrıca NBSGW farelerini busülfan ile şartlandırarak optimize edilir ve düşük hücre dozlarının HSPC engraftmanını ve yeniden popülasyonunu değerlendirmesini sağlar. Genel olarak, bu prosedür gen manipülasyonu için gerekli HSPC'lerin dozlarını azaltmalı ve gelişmekte olan ülkelerde HSPC gen tedavisinin erişilebilirliğini arttırmalıdır.
Bu çalışmada, fare kemik iliğinde PBMNC izolasyonu, CD34+ HSPC saflaştırma, gen düzenleme ve validasyonu ve engrafte gen düzenlenmiş HSPC'lerin değerlendirilmesi için protokoller gösterilmiştir. Ayrıca, optimize edilmiş HSPC kültürünün CD34 + CD133 + CD90 + HSPC'leri zenginleştirdiği ve gen düzenlenmiş hücrelerin kimerizmini in vivo olarak arttırdığı kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, CSCR'nin akış sitometri tesisinin ve hayvan tesisinin personelini kabul etmek istemektedir. A. C. ICMR-SSF bursu, K. V. K. DST-INSPIRE bursu ve P. B. CSIR-JRF bursu tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir (hibe no. BT/PR26901/MED/31/377/2017 ve BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | - | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | - | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - |
References
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
