वर्तमान प्रोटोकॉल विवो में जीन-संपादित कोशिकाओं के मजबूत एनग्राफमेंट के लिए एक अनुकूलित हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल (एचएसपीसी) संस्कृति प्रक्रिया का वर्णन करता है।
CRISPR / Cas9 एक अत्यधिक बहुमुखी और कुशल जीन-संपादन उपकरण है जो विभिन्न आनुवंशिक उत्परिवर्तनों को सही करने के लिए व्यापक रूप से अपनाया जाता है। विट्रो में हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) के जीन हेरफेर की व्यवहार्यता एचएसपीसी को जीन थेरेपी के लिए एक आदर्श लक्ष्य सेल बनाती है। हालांकि, एचएसपीसी पूर्व विवो संस्कृति में अपनी एनग्राफमेंट और मल्टीलाइनेज रिपॉपुलेशन क्षमता को मामूली रूप से खो देते हैं। वर्तमान अध्ययन में, आदर्श संस्कृति स्थितियों का वर्णन किया गया है जो एचएसपीसी एनग्राफमेंट में सुधार करता है और विवो में जीन-संशोधित कोशिकाओं की बढ़ती संख्या उत्पन्न करता है। वर्तमान रिपोर्ट अनुकूलित इन विट्रो संस्कृति स्थितियों को प्रदर्शित करती है, जिसमें संस्कृति मीडिया का प्रकार, अद्वितीय छोटे अणु कॉकटेल पूरकता, साइटोकिन एकाग्रता, सेल संस्कृति प्लेटें और संस्कृति घनत्व शामिल हैं। इसके अलावा, जीन-संपादन घटनाओं के सत्यापन के साथ-साथ एक अनुकूलित एचएसपीसी जीन-संपादन प्रक्रिया प्रदान की जाती है। विवो सत्यापन में , जीन-संपादित एचएसपीसी जलसेक और माउस प्राप्तकर्ताओं में पोस्ट-एनग्राफमेंट विश्लेषण प्रदर्शित किए जाते हैं। परिणामों से पता चला कि संस्कृति प्रणाली ने विट्रो में कार्यात्मक एचएससी की आवृत्ति में वृद्धि की, जिसके परिणामस्वरूप विवो में जीन-संपादित कोशिकाओं का मजबूत एन्ग्राफमेंट हुआ।
एलोजेनिक प्रत्यारोपण सेटिंग्स में मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) -मिलान दाताओं तक पहुंच और अत्यधिक बहुमुखी और सुरक्षित आनुवंशिक इंजीनियरिंग उपकरणों का तेजी से विकास ऑटोलॉगस हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल प्रत्यारोपण (एचएससीटी) को वंशानुगत रक्तविकारों के लिए एक उपचारात्मक उपचार रणनीति बनाता है। ऑटोलॉगस हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल (एचएसपीसी) जीन थेरेपी में रोगियों के एचएसपीसी का संग्रह, आनुवंशिक हेरफेर, रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तन का सुधार और रोगीमें जीन-सही एचएसपीसी का प्रत्यारोपण शामिल है। हालांकि, जीन थेरेपी का सफल परिणाम प्रत्यारोपण योग्य जीन-संशोधित ग्राफ्ट की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। एचएसपीसी के जीन हेरफेर चरण और पूर्व विवो संस्कृति दीर्घकालिक हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एलटी-एचएससी) की आवृत्ति को कम करके ग्राफ्ट की गुणवत्ता को प्रभावित करती है, जिससे जीन-हेरफेर एचएसपीसी 2,5,6 की बड़ी खुराक के जलसेक की आवश्यकता होती है।
एसआर 1 और यूएम 171 सहित कई छोटे अणुओं को वर्तमान में कॉर्ड ब्लड एचएसपीसी कोमजबूती से 7,8 का विस्तार करने के लिए नियोजित किया जा रहा है। वयस्क एचएसपीसी के लिए, लामबंदी पर प्राप्त उच्च सेल उपज के कारण, मजबूत विस्तार की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, पूर्व विवो संस्कृति में पृथक एचएसपीसी की स्टेमनेस को बनाए रखना इसके जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) के संस्कृति संवर्धन पर ध्यान केंद्रित करने वाला एक दृष्टिकोण छोटे अणुओं के संयोजन का उपयोग करके विकसित किया गया है: रेस्वेराट्रोल, यूएम 729, और एसआर 1 (आरयूएस)7। अनुकूलित एचएसपीसी संस्कृति स्थितियां एचएससी के संवर्धन को बढ़ावा देती हैं, जिसके परिणामस्वरूप विवो में जीन-संशोधित एचएससी की आवृत्ति में वृद्धि होती है, और एचएसपीसी की बड़ी खुराक में जीन हेरफेर की आवश्यकता कम हो जाती है, जिससे लागत प्रभावी जीन थेरेपी दृष्टिकोणकी सुविधा मिलती है।
यहां, विवो में जीन-संपादित कोशिकाओं के जलसेक और विश्लेषण के साथ एचएसपीसी संस्कृति के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।
एचएसपीसी जीन थेरेपी का सफल परिणाम मुख्य रूप से ग्राफ्ट में एनग्राफ्टेबल एचएससी की गुणवत्ता और मात्रा पर निर्भर करता है। हालांकि, जीन थेरेपी उत्पादों के प्रारंभिक चरण के दौरान एचएससी के कार्यात्मक गु…
The authors have nothing to disclose.
लेखक सीएससीआर के फ्लो साइटोमेट्री सुविधा और पशु सुविधा के कर्मचारियों को स्वीकार करना चाहते हैं। ए.सी. को आईसीएमआर-एसआरएफ फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, केवीके को डीएसटी-इंस्पायर फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और पीबी को सीएसआईआर-जेआरएफ फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। इस कार्य को जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार द्वारा वित्त पोषित किया गया था (अनुदान संख्या बीटी /पीआर 26901/ एमईडी / 31/377/2017 और बीटी / पीआर 31616 / एमईडी / 31/408/2019)
4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
DMSO | MPBIO | 219605590 | |
DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
Infrared lamp | MURPHY | – | |
Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
Ketamine | KETMIN 50 | – | |
Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
sgRNA | SYNTHEGO | - | |
SPINWIN | TARSON | 1020 | |
StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |