Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल विवो में जीन-संपादित कोशिकाओं के मजबूत एनग्राफमेंट के लिए एक अनुकूलित हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल (एचएसपीसी) संस्कृति प्रक्रिया का वर्णन करता है।
Abstract
CRISPR / Cas9 एक अत्यधिक बहुमुखी और कुशल जीन-संपादन उपकरण है जो विभिन्न आनुवंशिक उत्परिवर्तनों को सही करने के लिए व्यापक रूप से अपनाया जाता है। विट्रो में हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) के जीन हेरफेर की व्यवहार्यता एचएसपीसी को जीन थेरेपी के लिए एक आदर्श लक्ष्य सेल बनाती है। हालांकि, एचएसपीसी पूर्व विवो संस्कृति में अपनी एनग्राफमेंट और मल्टीलाइनेज रिपॉपुलेशन क्षमता को मामूली रूप से खो देते हैं। वर्तमान अध्ययन में, आदर्श संस्कृति स्थितियों का वर्णन किया गया है जो एचएसपीसी एनग्राफमेंट में सुधार करता है और विवो में जीन-संशोधित कोशिकाओं की बढ़ती संख्या उत्पन्न करता है। वर्तमान रिपोर्ट अनुकूलित इन विट्रो संस्कृति स्थितियों को प्रदर्शित करती है, जिसमें संस्कृति मीडिया का प्रकार, अद्वितीय छोटे अणु कॉकटेल पूरकता, साइटोकिन एकाग्रता, सेल संस्कृति प्लेटें और संस्कृति घनत्व शामिल हैं। इसके अलावा, जीन-संपादन घटनाओं के सत्यापन के साथ-साथ एक अनुकूलित एचएसपीसी जीन-संपादन प्रक्रिया प्रदान की जाती है। विवो सत्यापन में , जीन-संपादित एचएसपीसी जलसेक और माउस प्राप्तकर्ताओं में पोस्ट-एनग्राफमेंट विश्लेषण प्रदर्शित किए जाते हैं। परिणामों से पता चला कि संस्कृति प्रणाली ने विट्रो में कार्यात्मक एचएससी की आवृत्ति में वृद्धि की, जिसके परिणामस्वरूप विवो में जीन-संपादित कोशिकाओं का मजबूत एन्ग्राफमेंट हुआ।
Introduction
एलोजेनिक प्रत्यारोपण सेटिंग्स में मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) -मिलान दाताओं तक पहुंच और अत्यधिक बहुमुखी और सुरक्षित आनुवंशिक इंजीनियरिंग उपकरणों का तेजी से विकास ऑटोलॉगस हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल प्रत्यारोपण (एचएससीटी) को वंशानुगत रक्तविकारों के लिए एक उपचारात्मक उपचार रणनीति बनाता है। ऑटोलॉगस हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल (एचएसपीसी) जीन थेरेपी में रोगियों के एचएसपीसी का संग्रह, आनुवंशिक हेरफेर, रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तन का सुधार और रोगीमें जीन-सही एचएसपीसी का प्रत्यारोपण शामिल है। हालांकि, जीन थेरेपी का सफल परिणाम प्रत्यारोपण योग्य जीन-संशोधित ग्राफ्ट की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। एचएसपीसी के जीन हेरफेर चरण और पूर्व विवो संस्कृति दीर्घकालिक हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एलटी-एचएससी) की आवृत्ति को कम करके ग्राफ्ट की गुणवत्ता को प्रभावित करती है, जिससे जीन-हेरफेर एचएसपीसी 2,5,6 की बड़ी खुराक के जलसेक की आवश्यकता होती है।
एसआर 1 और यूएम 171 सहित कई छोटे अणुओं को वर्तमान में कॉर्ड ब्लड एचएसपीसी कोमजबूती से 7,8 का विस्तार करने के लिए नियोजित किया जा रहा है। वयस्क एचएसपीसी के लिए, लामबंदी पर प्राप्त उच्च सेल उपज के कारण, मजबूत विस्तार की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, पूर्व विवो संस्कृति में पृथक एचएसपीसी की स्टेमनेस को बनाए रखना इसके जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) के संस्कृति संवर्धन पर ध्यान केंद्रित करने वाला एक दृष्टिकोण छोटे अणुओं के संयोजन का उपयोग करके विकसित किया गया है: रेस्वेराट्रोल, यूएम 729, और एसआर 1 (आरयूएस)7। अनुकूलित एचएसपीसी संस्कृति स्थितियां एचएससी के संवर्धन को बढ़ावा देती हैं, जिसके परिणामस्वरूप विवो में जीन-संशोधित एचएससी की आवृत्ति में वृद्धि होती है, और एचएसपीसी की बड़ी खुराक में जीन हेरफेर की आवश्यकता कम हो जाती है, जिससे लागत प्रभावी जीन थेरेपी दृष्टिकोणकी सुविधा मिलती है।
यहां, विवो में जीन-संपादित कोशिकाओं के जलसेक और विश्लेषण के साथ एचएसपीसी संस्कृति के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।
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Protocol
विवो प्रयोगों में इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों को इंस्टीट्यूट एनिमल एथिक्स कमेटी (आईएईसी), क्रिश्चियन मेडिकल कॉलेज, वेल्लोर, भारत के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए अनुमोदित और प्रदर्शन किया गया था। संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) अनुमोदन प्राप्त करने के बाद सूचित सहमति के साथ स्वस्थ मानव दाताओं से ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जी-सीएसएफ) -जुटाए गए परिधीय रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे।
1. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमएनसी) का अलगाव और सीडी 34 + कोशिकाओं का शुद्धिकरण
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए पीबीएमएनसी अलगाव करें।
नोट: इन विट्रो एचएसपीसी संस्कृति और जीन संपादन के लिए, कम से कम 1 x 106 एचएसपीसी / समूह से शुरू करना आदर्श है। विवो एनग्राफमेंट विश्लेषण में , कम से कम 5 x 106 एचएसपीसी / समूह की प्रारंभिक सेल संख्या आदर्श है यदि एक समूह में आठ चूहे हैं और प्रत्येक माउस को कम से कम 6 x 105 कोशिकाओं के साथ संक्रमित किया जाता है। प्रक्रिया के लिए पर्याप्त संख्या में पीबीएमएनसी (~ 1 x 109) प्राप्त करने के लिए, 20 एमएल जुटाए गए परिधीय रक्त (एमपीबी) से शुरू करने की सिफारिश की जाती है।- एमपीबी के संग्रह के बाद, 1: 1 अनुपात में बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 20 एमएल एमपीबी को पतला करें।
नोट: जी-सीएसएफ लामबंदी की दक्षता व्यक्तियों9 के बीच भिन्न हो सकती है, और इसलिए, 20 एमएल जुटाए गए रक्त से प्राप्त एचएसपीसी की संख्या दाताओं के बीच भिन्न होती है। - 50 एमएल ट्यूब में 10 एमएल घनत्व ढाल माध्यम (लिम्फोप्रेप, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और 1: 2 अनुपात में ट्यूब के किनारों के माध्यम से पतला रक्त परत करें।
नोट: पतला रक्त जोड़ते समय 20 ° के कोण पर 50 एमएल ट्यूब को झुकाना इसे लिम्फोप्रेप के साथ मिश्रण करने से रोकता है, जिससे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद रक्त घटकों का स्पष्ट पृथक्करण होता है। - कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज 1 m/s² की त्वरण दर और 1 m/s² की मंदी दर के साथ। सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके ऊपरी परत (प्लाज्मा) को त्याग दें और घनत्व ढाल मध्यम परत के ऊपर इंटरफेज (पीबीएमएनसी) पर मौजूद बफी कोट की कटाई करें।
नोट: ट्यूब के किनारों पर धीरे-धीरे घुमाकर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके बफी कोट को एस्पिरेट करें। ग्रैन्यूलोसाइट और आरबीसी संदूषण को रोकने के लिए बफी कोट को एस्पिरेटेड करते समय इंटरफेज़ की उच्च मात्रा एकत्र करने से बचें। - पीबीएमएनसी को एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 1: 2 अनुपात में 1 एक्स पीबीएस के साथ सेल निलंबन को पतला करें।
नोट: सेल निलंबन को 1: 4 के अनुपात में 1x PBS के साथ पतला करें यदि बफी कोट को एस्पिरेटेड करते समय इंटरफेज की अधिकता एकत्र की गई थी। - सेल निलंबन को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, जिसमें 9 m/s² की त्वरण दर और 7 m/s² की मंदी दर हो और सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। पेलेट में 30 एमएल बर्फ-ठंडा आरबीसी लाइसिस बफर ( तालिका 7 देखें) जोड़ें और 10 मिनट के लिए बर्फ में इनक्यूबेट करें। ट्यूब को हर 2 मिनट में मोड़कर मिलाएं।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज 9 m/s² की त्वरण दर और 7 m/s² की मंदी दर के साथ, और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। चरण 1.1.5.-1.1.6 दोहराएँ। जब तक कि गोली लालिमा गायब न हो जाए। बेसल मीडिया (आईएमडीएम, सामग्री की तालिका देखें) के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और न्यूबॉयर कक्ष10 में ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके सेल गिनती करें।
नोट: CD34+ HSPCs को शुद्ध करने के लिए पृथक PBMNCs का तुरंत उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, CD34+ संवर्धन के लिए जब भी आवश्यक हो, PBMNCs को क्रायोसंरक्षित और पुनर्जीवित किया जा सकता है। क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, सेंट्रीफ्यूज 5 x 108 कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 200 x g पर जोड़ता है और 7: 2: 1 के अनुपात में आईएमडीएम: एफबीएस: डीएमएसओ ( सामग्री की तालिका देखें) युक्त 4 एमएल क्रायो मीडिया जोड़ता है। - शीशियों को 1 डिग्री सेल्सियस क्रायोकूलर में स्थानांतरित करें और उन्हें 12 घंटे तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। क्रायोवियल्स को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन कंटेनर में स्थानांतरित और संग्रहीत करें।
- एमपीबी के संग्रह के बाद, 1: 1 अनुपात में बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 20 एमएल एमपीबी को पतला करें।
- क्रायोसंरक्षित पीबीएमएनसी को पुनर्जीवित करें।
- <1 मिनट के लिए सौम्य घूमकर 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में क्रायोवियल्स को आधा पिघलाएं। क्रायोवियल के सेल निलंबन को 1: 10 के अनुपात में आईएमडीएम युक्त 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- सेल सस्पेंशन को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर 9 m/s² की त्वरण दर और 7 m/s² की मंदी दर के साथ सेंट्रीफ्यूज करें, और सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए पीबीएमएनसी से सीडी 34+ कोशिकाओं को शुद्ध करें।
- बाँझ 1x PBS के साथ शुद्धिकरण बफर तैयार करें जिसमें 2% फ़िल्टर किए गए भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) होते हैं। तालिका 1 के अनुसार बफर में पीबीएमएनसी सेल पेलेट को पुन: निलंबित करें।
नोट: बफर Ca++ और Mg++ मुक्त होना चाहिए। - ताजा या क्रायोसंरक्षित पीबीएमएनसी की 1 x 108-5 x 108 कोशिकाओं वाले सेल निलंबन को 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन गोल-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: सेल क्लंपिंग को रोकने के लिए सेल निलंबन में 100 μg / mL की अंतिम सांद्रता पर DNase जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। हमने सीडी 34 शुद्धिकरण के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग किया जिसमें मानव सीडी 34 सकारात्मक चयन कॉकटेल और डेक्सट्रान रैपिड स्फीयर शामिल हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। - कोशिकाओं के 100 μL / mL की एकाग्रता पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव CD34 सकारात्मक चयन कॉकटेल ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और धीरे से पुन: निलंबित करें।
- 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें और धीरे से हर 5 मिनट में सेल निलंबन को फिर से निलंबित करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डेक्सट्रान रैपिड गोले के 50 μL / mL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और धीरे से पुन: निलंबित करें।
नोट: भंवर 5 सेकंड के लिए उच्च गति पर डेक्सट्रान गोले को सुनिश्चित करने के लिए कि कण समान रूप से बिखरे हुए दिखाई देते हैं और फिर उन्हें कोशिकाओं में जोड़ते हैं। - 15 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें और धीरे से हर 5 मिनट में सेल निलंबन को फिर से निलंबित करें। शुद्धिकरण बफर के साथ सेल निलंबन को 2.5 एमएल की कुल मात्रा में बनाएं और इसे धीरे से निलंबित करें।
- ट्यूब को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इम्यूनोमैग्नेटिक कॉलम-फ्री चुंबक में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, चुंबक को उलट दें और एक निरंतर गति में सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
नोट: डेक्सट्रान रैपिड स्फीयर-टैग किए गए सीडी 34 + कोशिकाएं चुंबकीय क्षेत्र द्वारा ट्यूब के किनारों की ओर आकर्षित रहती हैं। ट्यूब को 2-3 सेकंड के लिए उल्टी स्थिति में रखा जाना चाहिए। ट्यूब के मुंह से लटकने वाली बूंदों से कांपने या सोख्ता से बचें। - चुंबक से ट्यूब को हटा दें और 2.5 एमएल शुद्धिकरण बफर जोड़ें। चरण 1.3.6-1.3.7 को पांच बार दोहराएँ।
नोट: शुद्धिकरण बफर के अतिरिक्त, ट्यूब को एक तीव्र कोण पर रखें और ट्यूब को घुमाकर बफर जोड़ें, क्योंकि चुंबक को उलटते समय कोशिकाएं सतह की दीवारों का पालन कर सकती हैं। - पांच धोने के बाद, चुंबक से ट्यूब को हटा दें, 1x बाँझ पीबीएस के 4 एमएल जोड़ें, और सेल निलंबन को फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 1x PBS के साथ 10 mL तक बनाएं। न्यूबॉयर चैंबर10 में ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके सेल काउंट करें।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज (त्वरण ~ 9 m/s², मंदी ~ 7 m/s²) और एक पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। एचएसपीसी को कल्चर करने के लिए, एचएसपीसी कल्चर मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, जैसा कि चरण 2.1 में उल्लेख किया गया है।
नोट: एचएसपीसी संस्कृति मीडिया में 12 घंटे के लिए एचएसपीसी की खेती के बाद शुद्ध एचएसपीसी की अधिकता को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) में 9 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर क्रायोप्रिजर्व किया गया था।
- बाँझ 1x PBS के साथ शुद्धिकरण बफर तैयार करें जिसमें 2% फ़िल्टर किए गए भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) होते हैं। तालिका 1 के अनुसार बफर में पीबीएमएनसी सेल पेलेट को पुन: निलंबित करें।
- क्रायोसंरक्षित एचएसपीसी को पुनर्जीवित करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में <1 मिनट के लिए क्रायोवियल्स को कोमल घुमाकर पिघलाएं। क्रायोवियल में सेल निलंबन को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- निरंतर आंदोलन के साथ बूंद-दर-बूंद 1x PBS ड्रॉप में 1% बीएसए पुन: निलंबित करें और इसे 20 एमएल तक बनाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज 9 m/s² की त्वरण दर और 7 m/s² की मंदी दर के साथ और सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
- चरण 1.4.2 दोहराएँ। 1x. चरण 2.1 में वर्णित एचएसपीसी संस्कृति मीडिया और संस्कृति में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
2. शुद्ध एचएसपीसी की इन विट्रो संस्कृति
- एससीएफ (240 एनजी / एमएल), एफएलटी 3 (240 एनजी / एमएल), टीपीओ (80 एनजी / एमएल), आईएल 6 (40 एनजी / एमएल), और 1 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के साथ एसएफईएम -2 का उपयोग करके संस्कृति मीडिया तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: ताजा तैयार संस्कृति मीडिया अत्यधिक अनुशंसित है। हालांकि, तैयारी के बाद मीडिया को 24 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - सीडी 34 + गोली को संस्कृति मीडिया के साथ पुन: निलंबित करें, मीडिया के आरयूएस कॉकटेल / एमएल के 3 μL जोड़ें (रेस्वेराट्रोल, 10 μM; UM729, 500 nM; स्टेम रेजिनिन -1, 750 एनएम; सामग्री की तालिका देखें), और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं कोकल्चर करें।
नोट: UM171 (10 nm) का उपयोग UM729 (500 nM) को प्रतिस्थापित करने के लिए किया जा सकता है क्योंकि दोनों का HSPC स्टेमनेस रखरखाव 7 पर समान प्रभाव पड़ताहै। शीशियों को दो बार से अधिक फ्रीज-पिघलाया नहीं जा सकता है। - प्रारंभ में, अनुयायी कोशिकाओं को हटाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डेल्टा सतह-उपचारित 6-वेल प्लेटों (सामग्री की तालिका देखें) में 5 x 105/एमएल की स्थिरता पर शुद्ध कोशिकाओं को बीज दें।
- शुद्धिकरण के 6 घंटे बाद एक नई 6-वेल प्लेट में 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल की स्थिरता पर निलंबन में कोशिकाओं को पुन: स्थापित करें।
- जीन संपादन से पहले फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एचएसपीसी की स्टेमनेस को चिह्नित करें।
- फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, 1x PBS के 100 μL में 1 x 105 कोशिकाओं को लें और CD34 PE के 3 μL (75 ng), CD133 FITC के 4 μL (100 ng) और CD90 APC के 4 μL (100 ng) जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- अंधेरे में 20 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को 1x PBS 2x के 2 mL और सेंट्रीफ्यूज के साथ RT पर 5 मिनट के लिए धोएं। सतह पर तैरने वाले को पिपेट से छोड़ दें, सेल पेलेट को 1x PBS के 150 μL के साथ पुन: निलंबित करें, और इसे प्रवाह साइटोमेट्री में प्राप्त करें।
नोट: यदि CD34+ कोशिकाओं का प्रतिशत <90% है, तो चरण 1.3.7 में धोने की संख्या छह गुना तक बढ़ाएँ। कल्चर मीडिया में शुद्ध एचएसपीसी को बीज दें और 6 घंटे के बाद, निलंबन में केवल कोशिकाओं को इकट्ठा करें। अधिकांश सीडी 34- कोशिकाएं संस्कृति प्लेट का पालन करती हैं।
3. एचएसपीसी का जीन संपादन
- गाइड आरएनए पुनर्गठन करें।
नोट: सीसीआर 5 लोकस को लक्षित करने वाले फॉस्फोरोथियोएट संशोधनों के साथ सिंथेटिक एसजीआरएनए वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)।- पुनर्गठन के लिए, थर्मो मिक्सर को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x TE बफर ( सामग्री की तालिका देखें) को प्रीहीट करें। सिंथेटिक रासायनिक रूप से संशोधित एसजीआरएनए शीशी को 11,000 x g पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- 1.5 एनएम लियोफिलाइज्ड एसजीआरएनए युक्त एसजीआरएनए शीशी में, 1x TE बफर का 15 μL जोड़ें, जिससे 100 pM/μL की अंतिम सांद्रता प्राप्त होती है।
- थर्मो मिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-40 सेकंड के लिए न्यूनतम झटकों के साथ इनक्यूबेट करें। एक छोटी सी स्पिन के बाद, 15 μL sgRNA एकत्र करें और 1 वर्ष तक भविष्य के उपयोग के लिए -80 °C पर 1 μl एलिकोट (100 pM/ μL) के रूप में स्टोर करें।
नोट: बार-बार फ्रीज-पिघलने से बचें। एलिकोटेड जीआरएनए के अधिकतम एक फ्रीज-पिघलने चक्र की सिफारिश की जाती है।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए न्यूक्लियोफेक्शन करें।
- संस्कृति के तीसरे दिन, न्यूबॉयर के बेहतर सेल गिनती कक्ष10 का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
- आरएनपी तैयारी के लिए (न्यूक्लियोफेक्टिंग 2 x 105 कोशिकाओं के लिए), 0.5 एमएल ट्यूब में सीसीआर 5 जीन (100 पीएम) को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए का 1 μ लें और शीशी के तल के चारों ओर कोमल घूमकर Cas9 (50 pM) के 2.65 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
नोट: जीआरएनए अनुक्रम: (सीसीआर 5) टीजीएसीएएटीएटीटीएटीएटीसीजीजी। - बफर तैयारी के लिए, पी 3 प्राथमिक सेल समाधान के 16.4 μL और पूरक के 3.6 μL जोड़ें, जो वाणिज्यिक न्यूक्लियोफेक्शन किट ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ प्रदान किया गया है, और 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। संस्कृति मीडिया (चरण 2.1.) तैयार करें और न्यूक्लियोफेक्शन से पहले संस्कृति प्लेट में इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीइनक्यूबेट करें।
- गोली 2 x 10 5 कोशिकाओं को आरटी पर5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके और गोली को परेशान किए बिना पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। चरण 3.2.3 में तैयार बफर के 20 μL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। और धीरे से इसे फिर से निलंबित करें।
- हवा के बुलबुले के बिना तैयार आरएनपी कॉम्प्लेक्स (चरण 3.2.2.) के साथ धीरे से सेल निलंबन मिलाएं। निलंबन को वाणिज्यिक न्यूक्लियोफेक्शन स्ट्रिप में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और 4 डी न्यूक्लियोफेक्टर का उपयोग करके कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करने के लिए पल्स कोड डीजेड 100 का चयन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: बफर और आरएनपी घटकों सहित सेल निलंबन की अंतिम मात्रा, 27 μL / इलेक्ट्रोपोरेशन से अधिक नहीं होनी चाहिए। - प्रायोगिक नियंत्रण के लिए, गोली 2 x 105 असंपादित एचएसपीसी आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके, और चरण 3.2.3 में तैयार बफर के 20 μL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। आरएनपी कॉम्प्लेक्स के बिना।
- इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं में पूर्व-इनक्यूबेटेड कल्चर मीडिया (चरण 3.2.3.) के 100 μL जोड़ें और आरटी पर न्यूक्लियोफेक्शन स्ट्रिप में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को अबाधित छोड़ दें। इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद, सामग्री को प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल को लक्ष्य-विशिष्ट जीआरएनए का उपयोग करके किसी भी जीनोमिक लोकस के गैर-समरूप अंत जुड़ने (एनएचईजे) -मध्यस्थता लक्षित व्यवधान पर लागू किया जा सकता है। चरण 3.2.2 में दोहरी जीआरएनए को शामिल करके बड़े विलोपन शुरू करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है। 11. इसके अलावा, आरएनपी इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद, दाता टेम्पलेट12 के साथ प्रदान किए जाने पर होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) -आधारित जीन संपादन के लिए एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। प्रोटोकॉल को एएवीएस 1, स्यूडो β-ग्लोबिन, β-ग्लोबिन और सीसीआर 5 लोकस 7,8 के लक्षित व्यवधान द्वारा मान्य किया गया है।
4. एचएसपीसी में जीन-संपादन घटनाओं का सत्यापन
- डीएनए निष्कर्षण करें।
- न्यूक्लियोफेक्शन के 72 घंटे बाद, न्यूबॉयर कक्ष में ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके एक सेल गिनती करें। डीएनए निष्कर्षण के लिए 1 x 105 जीन-संपादित एचएसपीसी एकत्र करें।
- आरटी में 5 मिनट के लिए 11,000 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। 1x PBS के 1 एमएल के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। गोली में, 1 x 105 कोशिकाओं के लिए त्वरित अर्क समाधान (सामग्री की तालिका देखें) के 20 μL जोड़ें और गोली को फिर से निलंबित करें।
- मिश्रण को 30 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइक्लर में इनक्यूबेट करें। एक छोटी स्पिन के बाद, मिश्रण को 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइक्लर में इनक्यूबेट करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर13 का उपयोग करके कच्चे लाइसेट में डीएनए की एकाग्रता को मापें।
- पीसीआर द्वारा जीन-संपादित लोकस का प्रवर्धन करें।
- प्राइमर 3 ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करते हुए, डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक (डीएसबी) साइट पर फैले लोकस-विशिष्ट प्राइमरों को 400-700 बीपी (तालिका 2) के बीच एम्प्लिकॉन आकार के साथ डिज़ाइन करें।
नोट: प्राइमर 3 पीसीआर प्राइमर डिजाइन करने के लिए एक वेब-आधारित ओपन-सोर्स टूल है। - तालिका 3 में दिए गए अनुसार प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें और तालिका 4 में उल्लिखित साइकिल िंग स्थितियों के साथ थर्मोसाइक्लर चलाएं। वांछित टिड्डी के प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए, 6x लोडिंग डाई के साथ पीसीआर उत्पाद के 5 μL मिलाएं और टीएई बफर का उपयोग करके बनाए गए 2% अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन पर लोड करें।
नोट: टीएई बफर घटक तालिका 7 में प्रदान किए गए हैं। - 100 वी पर 30-40 मिनट के लिए चलाएं और जेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके एम्प्लिकॉन का पता लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। पीसीआर शुद्धिकरण निर्माता प्रोटोकॉल ( सामग्री की तालिका देखें) के अनुसार, प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद को साफ करें।
- नैनोड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शुद्ध पीसीआर उत्पाद की एकाग्रता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- प्राइमर 3 ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करते हुए, डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक (डीएसबी) साइट पर फैले लोकस-विशिष्ट प्राइमरों को 400-700 बीपी (तालिका 2) के बीच एम्प्लिकॉन आकार के साथ डिज़ाइन करें।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए सेंगर अनुक्रमण और मुफ्त डाई टर्मिनेटर हटाने का प्रदर्शन करें।
- तालिका 5 में दिखाए गए अनुसार प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। तालिका 6 में उल्लिखित साइकिल चलाने की स्थिति के साथ थर्मोसाइक्लर चलाएं।
- 1.5 एमएल ट्यूब में पीसीआर नमूने के 10 μL में उच्चप्रेप डीटीआर अभिकर्मक का 10 μL ( सामग्री की तालिका देखें) और 85% इथेनॉल का 40 μL जोड़ें और इसे लगभग 8x-10x जोरदार पाइप द्वारा मिलाएं।
- मिश्रण को 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें और 1.5 एमएल ट्यूब को चुंबकीय पृथक्करण स्टैंड पर 5 मिनट के लिए रखें। पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को हटा दें और 85% इथेनॉल का 100 μL जोड़ें।
- सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और चरण 4.3.3 दोहराएं। 1x. चुंबक स्टैंड से 1.5 एमएल ट्यूबों को निकालें और इथेनॉल को सुखाने के लिए थर्मो मिक्सर में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- 40 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ मोतियों को सख्ती से पुन: निलंबित करें और 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। ट्यूब को चुंबकीय पृथक्करण स्टैंड पर 5 मिनट के लिए रखें, और प्रकाशित रिपोर्ट14,15 के बाद सेंगर अनुक्रमण करें।
- आईसीई विश्लेषण16 द्वारा एक इंडेल आवृत्ति मूल्यांकन करें।
- आईसीई विश्लेषण के लिए सिंथेगो (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
- संपादित और असंपादित नमूने और जीआरएनए अनुक्रमों की एबी 1 फाइलें अपलोड करें और इंडेल की आवृत्ति प्राप्त करने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें।
5. जीन-संपादित एचएसपीसी का प्रत्यारोपण
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध NOD Scid गामा माउस (NSG)17 और NOD की पूर्व शर्त। अस्थि-मज्जा प्रत्यारोपण के लिए सीजी-किटडब्ल्यू-41जेटायर +PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW) 18 चूहे ( सामग्री की तालिका देखें)।
- एनएसजी चूहों की पूर्व शर्त के लिए, 6-8 सप्ताह की मादा चूहों को चुनें और उन्हें अंधे यादृच्छिककरण द्वारा नियंत्रण और संपादित समूहों में अलग करें।
- एनएसजी चूहों को पाई पिंजरों में रखें और एचएसपीसी प्रत्यारोपण से 6-8 घंटे पहले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इरेडिएटर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 3.5 जीवाई पर विकिरणित करें।
नोट: विकिरण से पहले चूहों का वजन करने की सिफारिश की जाती है, और >20 ग्राम वजन वाले चूहों को विकिरण के अधीन किया जाएगा। - 6-8 सप्ताह के नर और मादा एनबीएसजीडब्ल्यू चूहों की पूर्व शर्त के लिए, एचएसपीसी प्रत्यारोपण से 48 घंटे पहले 12.5 मिलीग्राम / किलोग्राम शरीर के वजन की खुराक पर इंट्रापरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से बुसल्फान ( सामग्री की तालिका देखें) इंजेक्ट करें।
नोट: बुसल्फान कंडीशनिंग माउस अस्थि मज्जा में मानव एचएसपीसी के एनग्राफ्टमेंट को बढ़ाता है और जीन-संपादित एचएसपीसी19 की बड़ी खुराक को शामिल करने की आवश्यकता को कम करता है। कंडीशनिंग के लिए बुसल्फान खुराक की आदर्श सीमा शरीर के वजन के 10 मिलीग्राम / किग्रा से 15 मिलीग्राम / किलोग्राम के बीच है। बुसल्फान की बढ़ी हुई खुराक के परिणामस्वरूप गंभीर मृत्यु दर के मुद्दे होंगे।
- अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के लिए सेल निलंबन तैयार करें।
- न्यूक्लियोफेक्शन स्ट्रिप में जीन-संपादित एचएसपीसी के इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद (चरण 3.2.7 देखें), सेल निलंबन को 1x PBS के 10 एमएल में स्थानांतरित करें। न्यूबॉयर के बेहतर सेल काउंटिंग चैंबर10 का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
- एक माउस के जलसेक के लिए, आरटी पर5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करके 1.5 एमएल ट्यूब में गोली 6 x 10 5 कोशिकाएं होती हैं और गोली को परेशान किए बिना पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे सतह पर तैरने वाले को छोड़ देती हैं। सेल पेलेट को 1x PBS के 100 μL के साथ पुन: निलंबित करें।
- नीचे दिए गए चरणों के बाद पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा एचएसपीसी को इंजेक्ट करें।
- माउस निरोधक में पूर्व शर्त एनएसजी या एनबीएसजीडब्ल्यू माउस रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- माउस पूंछ को पकड़ें और माउस को रोकने के लिए प्लग को धीरे से धक्का दें। धीरे से माउस पूंछ को 70% इथेनॉल के साथ पोंछें। 31 ग्राम इंसुलिन सिरिंज में सेल निलंबन का एस्पिरेट 100 μL।
नोट: धीरे से सिरिंज को टैप करके या धीरे से प्लंजर को स्थानांतरित करके जलसेक उत्पाद में बुलबुले से सख्ती से बचें। - इन्फ्रारेड लैंप से प्रकाश को 30-40 सेकंड के लिए पूंछ पर निर्देशित करें, माउस के शरीर के क्षेत्र को टिशू पेपर की सिलवटों से कवर करें। धीरे से सुई के बेवेल भाग को बाएं या दाएं पुच्छल पूंछ की नस में 20 ° के कोण पर डालें।
- सिरिंज के साथ प्लानर अक्ष में बनाए रखने के लिए पूंछ को बाईं तर्जनी उंगली से उठाएं। नस में सेल निलंबन को इंजेक्ट करने के लिए प्लंजर को धक्का दें। टिशू पेपर के साथ छेदे हुए क्षेत्र के पास कोमल दबाव लागू करें और सुई को बाहर निकालें।
- कोमल दबाव लगाने के 30 सेकंड के बाद, माउस को निरोधक से हटा दें और इसे अपने पिंजरे में स्थानांतरित करें।
6. अल्पकालिक एनग्राफमेंट क्षमता का आकलन
- मानव एचएसपीसी प्रत्यारोपण के 4 सप्ताह के बाद, पाश्चर पिपेट का उपयोग करके हेपरिनाइज्ड ट्यूब में कक्षीय शिरापरक साइनस के माध्यम से रक्त एकत्र करके अल्पकालिक एनग्राफमेंट का आकलन करें।
- नमूना संग्रह से पहले इंट्रापरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से केटामाइन (90-120 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलाज़िन (8-12 मिलीग्राम / किग्रा) फॉर्मूलेशन के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें।
नोट: संवेदना के नुकसान की पुष्टि करने के लिए एनेस्थेटाइज्ड माउस के पिछले अंगों पर धीरे से दबाव लागू करें। - एनेस्थेटाइजिंग के बाद, जानवर को वेंट्रल रिकंबेंसी में रखें और धीरे से आंख खोलने के लिए माउस को दबाएं, जिससे आंख के ग्लोब को थोड़ा बाहर निकलने की अनुमति मिलती है।
- धीरे से पाश्चर पिपेट को 30 ° -45 ° कोण पर निकोटिंग झिल्ली के नीचे आंख के मध्यवर्ती कैंथस में डालें। पाश्चर पिपेट को उचित स्थिति में रखने के बाद, ट्यूब पर थोड़ा दबाव डालें और ट्यूब को धीरे से घुमाना शुरू करें।
नोट: रेट्रो-ऑर्बिटल प्लेक्सस पंचर होते ही रक्त केशिका क्रिया द्वारा ट्यूब में प्रवेश करेगा।
- नमूना संग्रह से पहले इंट्रापरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से केटामाइन (90-120 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलाज़िन (8-12 मिलीग्राम / किग्रा) फॉर्मूलेशन के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें।
- परिधीय रक्त के 50-80 μL एकत्र करने के बाद, धीरे से आंख के मध्यवर्ती कैंथस से पिपेट को वापस ले लें।
- आंख की कक्षा के चारों ओर रक्तस्राव को रोकने के लिए, पलकों को बंद करें और धुंध के टुकड़े का उपयोग करके कोमल दबाव लागू करें।
- कोशिकाओं को संबंधित एंटीबॉडी (तालिका 8) के साथ दाग दें और आरटी पर 25-30 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
- आरबीसी लाइसिस के लिए, सेल निलंबन में, 1x RBC लाइसिस बफर (तालिका 7) के 3 एमएल जोड़ें और बर्फ में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- आरटी में 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। चरण 6.4 दोहराएँ। जब तक कि गोली की लालिमा गायब न हो जाए।
- आरबीसी लाइसिस से जुड़े सेल मलबे को हटाने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए 200 x g पर 1x PBS और सेंट्रीफ्यूज के 2 एमएल जोड़ें।
- पेलेट में 1x PBS का 150 μL जोड़ें और फिर फ्लो साइटोमेट्री के लिए इम्यूनोफेनोटाइपिंग के साथ आगे बढ़ें ताकि एनग्राफ्टेड मानव कोशिकाओं के प्रतिशत का मूल्यांकनकिया जा सके।
7. दीर्घकालिक एनग्राफ्टमेंट क्षमता का आकलन
- चूहों को मार डाला।
- 1-2 मिनट के लिए चूहों के पिंजरे के अंदर 100% सीओ 2 श्वासावरोध20 पेश करके एनग्राफ्टमेंट विश्लेषण के लिए 16 वें सप्ताह में प्रत्यारोपित चूहों का त्याग करें।
- कार्डियक और रेस्पिरेटरी अरेस्ट और पिछले अंगों की कोमल चुभन के साथ मांसपेशियों की गतिविधियों की अनुपस्थिति का पता लगाकर इच्छामृत्यु की पुष्टि करें। यदि दोनों शर्तें पूरी हो जाती हैं, तो चूहों को पिंजरे से हटा दें।
- मानव कोशिका चिमेरिज्म का मूल्यांकन करने के लिए, अस्थि मज्जा से कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए अस्थि मज्जा से कोशिकाओं को अलग करें।
- यूथेनाइजेशन के बाद, मूत्रमार्ग से 1 सेमी ऊपर एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं और डायाफ्राम से 1 सेमी नीचे तक विस्तारित करें। पेट के क्षेत्र को व्यापक रूप से खोलने के लिए इंसाइज्ड क्षेत्र के कोनों पर क्षैतिज रूप से काटें।
- फीमर और टिबिया को विच्छेदित करें और कैंची का उपयोग करके फीमर और टिबिया से जुड़े नरम ऊतकों को हटा दें। धीरे से टिशू पेपर से स्क्रब करें और स्केलपेल का उपयोग करके 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर 0.2 सेमी से अधिक व्यास वाला एक छोटा छेद बनाएं।
- स्केलपेल का उपयोग करके हड्डियों के समीपस्थ सिरों को हटा दें और हड्डियों को 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब के छेद की ओर कटे हुए पक्ष के साथ रखें। 1.5 एमएल ट्यूब में हड्डियों के साथ 0.5 एमएल ट्यूब रखें जिसमें बाँझ 1x पीबीएस का 100 μL होता है।
- ढक्कन बंद करें, आरटी में बाँझ परिस्थितियों में 1000 x g पर 3 मिनट के लिए ट्यूबों को घुमाएं, और खाली मज्जा गुहा वाली हड्डियों वाले 0.5 एमएल ट्यूबों को छोड़ दें। अस्थि मज्जा युक्त 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में 1x PBS का 1 mL जोड़ें और धीरे से 1 mL पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को लगभग 10x से कम नहीं पर पुन: निलंबित करें।
- सेल निलंबन के 1 एमएल को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 9 एमएल आरबीसी लाइसिस बफर होता है। हर 2 मिनट में ट्यूबों के कोमल व्युत्क्रम के साथ 7 मिनट के लिए बर्फ में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
- 7 मिनट के बाद, सेंट्रीफ्यूज आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर 9 m/s² के त्वरण और 7 m/s² के अवक्रमण के साथ। चरण 7.2.5 दोहराएँ। जब तक एक स्पष्ट पीला सफेद गोली नहीं देखा जाता है।
- 10 एमएल बाँझ 1x DPBS के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 15 एमएल ट्यूब पर 40 μm सेल स्ट्रेनर का उपयोग करके अस्थि मज्जा सेल निलंबन को फ़िल्टर करें। कोशिकाओं के नुकसान से बचने के लिए सेल छन्नी को 1x PBS 2x के 2 एमएल के साथ धोएं।
- 200 x g, RT पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। 100 μg/mL की कार्यशील सांद्रता पर DNase-I के साथ IMDM के 10 mL के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
- फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एनग्राफ्टमेंट विश्लेषण के लिए एफएसीएस ट्यूब में 1 x 106 मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को लें। एनग्राफ्ड अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में जीन-संपादन आवृत्ति का आकलन करने के लिए, आरटी पर 5 मिनट के लिए 11,000 x g पर पेलेट 1 x 106 मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं और पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
8. इम्यूनोफेनोटाइपिंग
- एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने से पहले 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शुद्ध पुनः संयोजक मानव एफसी प्रोटीन ( सामग्री की तालिका देखें) के 1.5 μL के साथ अस्थि मज्जा कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
नोट: यहां उपयोग किया जाने वाला मानव एफसी प्रोटीन आईजीजी के लिए रिसेप्टर्स के कारण गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला होने को अवरुद्ध करने के लिए तैयार किया गया है; इस प्रकार, यह एंटीबॉडी लेबलिंग 7,21,22 की विशिष्टता को बढ़ाता है। लक्ष्य कोशिकाओं के एंटीबॉडी धुंधला होने से पहले, एंटीबॉडी अनुमापन करें। मल्टी-कलर फ्लोसाइटोमेट्रिक विश्लेषण पर काम करते समय एफएमओ नियंत्रण और आइसोटाइप नियंत्रण को शामिल करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। - प्रवाह साइटोमीटर द्वारा मानव कोशिका एनग्राफमेंट के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए, एफएसीएस ट्यूब में 1 x 106 मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को लें और तालिका 8 में उल्लिखित कोशिकाओं को दाग दें।
- आरटी में 25-30 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूज 200 x g पर आरटी में 5 मिनट के लिए और पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
- एक प्रवाह साइटोमीटर द्वारा कोशिकाओं को प्राप्त करें, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के फॉरवर्ड (एफएससी) और साइड स्कैटर्स (एसएससी) का उपयोग करके सेल आबादी (पी 1) को गेट करें, और सेल आबादी के अनुसार वोल्टेज को समायोजित करें। पी 1 आबादी में 50,000 सेल घटनाओं का अधिग्रहण करें।
- माउस अस्थि मज्जा में मानव ल्यूकोसाइट आबादी का विश्लेषण करने के लिए, फ्लो साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पी 1 सेल आबादी से मानव सीडी 45 + कोशिकाओं और माउस सीडी 45.1 को गेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- निम्न सूत्र8 का उपयोग करके मानव कोशिकाओं के एनग्राफ्टमेंट की गणना करें:
एनग्राफमेंट का % = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100।
नोट: मानव एनग्राफ्टमेंट के लिए सीमा को सीडी 45 के लिए 0.1% सकारात्मक माना जाता था। - इसके अलावा, दीर्घकालिक पुनर्जनन कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए मानव सीडी 45 + कोशिकाओं से एचसीडी 34 + कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण करें। संलग्न मानव कोशिकाओं के बहुवंशीय पुनर्गठन का आकलन करने के लिए, तालिका 9 के बाद सेल निलंबन के 100 μL दाग दें।
नोट: प्रयोगों से पहले एंटीबॉडी को टाइट करने की आवश्यकता होती है। - फ्लो साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, पी 1 सेल आबादी से एचसीडी 45 को गेट करें और एचसीडी 45 से, एचसीडी 19, एचसीडी 3 और एचसीडी 13 (लिम्फोइड और माइलॉयड उपसमुच्चय) के प्रतिशत को निर्धारित करें।
9. एनग्राफ्ड अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में जीन-संपादन आवृत्ति का आकलन
- अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर सेल पेलेट में, 5 x 10 5 कोशिकाओं के लिए त्वरित अर्क समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के50 μL जोड़ें और गोली को फिर से निलंबित करें।
- मिश्रण को 30 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइक्लर में इनक्यूबेट करें। एक छोटी स्पिन के बाद, मिश्रण को 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइक्लर में इनक्यूबेट करें।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके कच्चे लाइसेट में डीएनए की एकाग्रता को मापें। चरण 4.2.-4.4 का पालन करें। आईसीई विश्लेषण 8,15 का उपयोग करके जीन-संपादन आवृत्ति को मान्य करने के लिए।
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Representative Results
वर्तमान अध्ययन आदर्श एचएसपीसी संस्कृति स्थितियों की पहचान करता है जो पूर्व विवो संस्कृति में सीडी 34 + सीडी 133 + सीडी 90 + एचएससी के प्रतिधारण की सुविधा प्रदान करता है। जीन-संशोधित एचएससी की बढ़ी हुई पीढ़ी के साथ एचएससी के संस्कृति संवर्धन को प्रदर्शित करने के लिए, पीबीएमएनसी अलगाव, सीडी 34 + सेल शुद्धिकरण, संस्कृति, जीन संपादन, प्रत्यारोपण, एनग्राफमेंट के लक्षण वर्णन और विवो में जीन-संशोधित कोशिकाओं के लिए अनुकूलित प्रक्रियाएं प्रदान की जाती हैं (चित्रा 1)। शुद्धिकरण के बाद, एचएसपीसी मार्करों की जांच के लिए फ्लो साइटोमेट्री मूल्यांकन किया गया था, और एचएसपीसी को 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। 72 घंटे की संस्कृति के बाद, एचएसपीसी को कैस 9 आरएनपी के साथ न्यूक्लियसंक्रमित किया गया और अतिरिक्त 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया। आरयूएस कॉकटेल युक्त अनुकूलित संस्कृति स्थितियों ने सीडी 34 + सीडी 133 + सीडी 90 + एचएससी की बढ़ी हुई व्यवहार्यता और उच्च आवृत्ति और जीन-संपादन आवृत्ति में वृद्धि दिखाई (चित्रा 2)। आगे यह प्रदर्शित करने के लिए कि अनुकूलित संस्कृति की स्थिति विवो में जीन-संशोधित कोशिकाओं की आवृत्ति में वृद्धि करती है, सीसीआर 5 लोकस को लक्षित करने वाले दिन 3 एचएसपीसी को जीन-संपादित किया गया और उप-घातक रूप से विकिरणित एनएसजी चूहों में शामिल किया गया। माउस अस्थि मज्जा (बीएम) में मानव कोशिकाओं के एनग्राफ्टमेंट का विश्लेषण जलसेक के 16 सप्ताह बाद किया गया था (चित्रा 3 ए)। एनएसजी चूहों में मानव सीडी 45 + (एचसीडी 45) कोशिकाओं के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने संस्कृति स्थितियों (चित्रा 3 बी, सी) में वृद्धि देखी। माउस बीएम कोशिकाओं में जीन-संपादन आवृत्ति के विश्लेषण ने आरयूएस-पूरक संस्कृति स्थितियों (चित्रा 3 डी) में जीन-संपादित एचएसपीसी के एनग्राफ्टमेंट में वृद्धि दिखाई।
चित्र 1: वर्तमान अध्ययन का सारांश। पीबीएमएनसी को अलग करने, पीबीएमएनसी से सीडी 34+ कोशिकाओं के चुंबकीय संवर्धन, संवर्धन, मानव हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) के लक्षण वर्णन, जीन संपादन और प्रत्यारोपण में शामिल प्रक्रिया का ग्राफिकल सारांश दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: आरयूएस कॉकटेल एचएससी की आवृत्ति को समृद्ध करता है। एमपीबी-एचएसपीसी को स्टेम सेल कल्चर मीडिया में 3 दिनों के लिए वाहन (डीएमएसओ) और आरयूएस कॉकटेल के साथ साइटोकिन्स युक्त सुसंस्कृत किया गया था और कैस 9-आरएनपी के 25 पीएम के साथ जीन-संपादित किया गया था। जीन-संपादित कोशिकाओं का विश्लेषण एचएसपीसी 48 एच पोस्ट न्यूक्लियोफेक्शन के मार्करों के लिए एफएसीएस द्वारा किया गया था। (ए) प्रवाह भूखंड जीवित कोशिकाओं (7 एएडी-) और सीडी 34 + सीडी 90 + आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) डीएमएसओ और आरयूएस-उपचारित समूह में 72 घंटे के पोस्ट एडिटिंग का विश्लेषण किए गए इंडेल पैटर्न के प्रतिशत और आवृत्ति। (C) CD34+ CD90+ कोशिकाओं की पूर्ण संख्या का विश्लेषण 48 घंटे के बाद संपादन (n = 2) (दाता = 1) किया गया। (डी) कुल न्यूक्लियेटेड कोशिकाओं (टीएनसी) की पूर्ण संख्या ने 48 घंटे पोस्ट-एडिटिंग (एन = 2) (दाता = 1) का विश्लेषण किया। त्रुटि पट्टियाँ SEM, *p ≤ 0.05 (अप्रकाशित t-test) ± माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: अनुकूलित संस्कृति की स्थिति विवो में जीन-संशोधित कोशिकाओं की आवृत्ति को बढ़ाती है। (बी) माउस बीएम में एचसीडी 45 + कोशिकाओं को दिखाने वाला प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट। इनसेट मानव कोशिकाओं (बाएं) और माउस कोशिकाओं (दाएं) को संदर्भित करता है। एचएसपीसी को 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था, तीसरे दिन एसजीआरएनए के साथ जीन-संपादित किया गया था, और इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद प्रत्यारोपित किया गया था। (सी) जलसेक के 16 सप्ताह बाद माउस बीएम में मानव कोशिकाओं का एनग्राफमेंट (एन = 4)। (डी) मानव जीन-संशोधित सेल (एचसीडी 45+ जीन-संपादित कोशिकाएं) माउस बीएम में 16 सप्ताह के बाद जलसेक (एन = 4) (दाता = 1) में चिमेरिज्म। प्रत्येक बिंदु एक व्यक्तिगत माउस का प्रतिनिधित्व करता है, और डेटा बिंदु एक व्यक्तिगत प्रयोग से हैं। त्रुटि पट्टियाँ SEM, *p≤ 0.05 (अप्रकाशित t-test) ± माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं. यह आंकड़ा क्रिस्टोफर एट अल.7 की अनुमति से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| सेल की गिनती | शुद्धिकरण बफर (एमएल) |
| < 1 x 107 कोशिकाएं | 0.1 |
| 1 x 107 - 1 x 108 कोशिकाएँ | 0.5 |
| 1 - 5 x 108 कोशिकाएं | 1 |
तालिका 1: सीडी 34 + सेल शुद्धिकरण के लिए सेलुलर निलंबन तैयार करने के लिए शुद्धिकरण बफर की मात्रा।
| प्राइमर का नाम | अनुक्रम |
| CCR5 फॉरवर्ड | CAGAGCCAAGCTCCTC |
| CCR5 रिवर्स | AGAGACGCAACAGCCA |
| CCR5 अनुक्रमण फॉरवर्ड प्राइमर | AATGTAGACATATGTAGG |
तालिका 2: सीसीआर 5 लोकस को बढ़ाने के लिए प्राइमर अनुक्रम।
| घटक | 50 μL प्रतिक्रिया |
| बफर (5x) | 10 μL |
| फॉरवर्ड प्राइमर (10 μM) | 1 μL |
| रिवर्स प्राइमर (10 μM) | 1 μL |
| dNTP | 4 μL |
| पोलीमरेज़ | 1 μL |
| जीनोमिक डीएनए | 200 एनजी |
| न्यूक्लियस मुक्त पानी | 50 μL तक |
तालिका 3: पीसीआर का उपयोग करके सीसीआर 5 लोकस को बढ़ाने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण।
| सीढ़ी | अवधि | तापमान | चक्रों की संख्या |
| प्रारंभिक विकृतीकरण | 1 मिनट | 95 °C | 1 |
| विकृतीकरण | 10 s | 98 °C | 35 |
| एनीलिंग | 15 s | 56 °C | |
| विस्तार | 30 s | 68 °C | |
| अंतिम विस्तार | 1 मिनट | 72 °C | 1 |
| पकड | ∞ | 15 °C |
तालिका 4: सीसीआर 5 लोकस को बढ़ाने के लिए थर्मोसाइक्लर की स्थिति।
| घटक | 10 μL प्रतिक्रिया |
| बफर (5x) | 2 μL |
| प्राइमर (2 μM) | 1.6 μL |
| आरआर मिश्रण | 0.75 μL |
| पीसीआर सफाई उत्पाद | 80 ng |
| न्यूक्लियस मुक्त पानी | 10 μL तक |
तालिका 5: सेंगर अनुक्रमण पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण।
| सीढ़ी | अवधि | तापमान | चक्रों की संख्या |
| विकृतीकरण | 15 s | 96 °C | 27 |
| एनीलिंग | 20 s | 55 °C | |
| विस्तार | 4 मिनट | 60 °C | |
| पकड | ∞ | 15 °C |
तालिका 6: सेंगर अनुक्रमण पीसीआर के लिए थर्मोसाइक्लर की स्थिति।
| बफ़र | संयोजन |
| 10x RBC लाइसिस बफर – 100 mL (pH – 7.3) | NH4Cl का 8.26 ग्राम, NaHCO3 का 1.19 g, EDTA का 200 μL (0.5 M, pH8) |
| 50x TAE बफर (pH – 8.3) | 1 लीटर पानी में 50 mM EDTA सोडियम नमक, 2 M Tris, 1 M ग्लेशियल एसिटिक एसिड घोलें |
तालिका 7: बफर रचनाएँ
| एंटीबॉडी | आयतन |
| एंटी-ह्यूमन सीडी 45 एपीसी | 3 μL |
| एंटी-माउस CD45.1 PerCP-Cy5 | 4.5 μL |
| एंटी-माउस CD34 PE | 3 μL |
तालिका 8: मानव कोशिका एनग्राफमेंट का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी।
| एंटीबॉडी | आयतन |
| एंटी-ह्यूमन सीडी 45 एपीसी | 3 μL |
| एंटी-माउस CD19 PerCP | 15 μL |
| एंटी-माउस CD13 PE | 15 μL |
| एंटी-माउस CD3 PE-Cy7 | 2 μL |
तालिका 9: एनग्राफ्टेड एचएसपीसी से प्राप्त बहुवंशीय कोशिकाओं के अनुपात का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी।
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Discussion
एचएसपीसी जीन थेरेपी का सफल परिणाम मुख्य रूप से ग्राफ्ट में एनग्राफ्टेबल एचएससी की गुणवत्ता और मात्रा पर निर्भर करता है। हालांकि, जीन थेरेपी उत्पादों के प्रारंभिक चरण के दौरान एचएससी के कार्यात्मक गुण अत्यधिक प्रभावित होते हैं, जिसमें इन विट्रो कल्चर और जीन हेरफेर प्रक्रिया से जुड़े विषाक्तता शामिल हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने आदर्श एचएसपीसी संस्कृति स्थितियों की पहचान की है जो पूर्व विवो संस्कृति में सीडी 34 + सीडी 133 + सीडी 90 + एचएससी की स्टेमनेस को बनाए रखते हैं। कई शोध समूहों ने एसआर 1 या यूएम 171 या अन्य अणुओं का उपयोग स्टैंड-अलोन अणुओं के रूप में किया है ताकि इन विट्रो23,24 में गर्भनाल रक्त (यूसीबी) एचएसपीसी का विस्तार किया जा सके। एक पिछले अध्ययन में एसआर 1 और यूएम 17125 दोनों के संयोजन का उपयोग किया गया था। संस्कृति माध्यम के छोटे अणुओं और साइटोकिन्स को विशेष रूप से वयस्क एचएसपीसी और ऑटोलॉगस जीन थेरेपी में उनके आवेदन के लिए अनुकूलित किया गया था। स्क्रीनिंग प्रयोग से पता चला कि तीन छोटे अणुओं रेस्वेराट्रोल, यूएम 729 और एसआर 1 का संयोजन, सीडी 34 + सीडी 90 + कोशिकाओं की एक उच्च संख्या उत्पन्न करने और विभेदित और प्रतिबद्ध पूर्वज कोशिकाओं के प्रसार को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। आरयूएस कॉकटेल में UM729 को UM171 के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। तथापि, यूएम171 की वाणिज्यिक खरीद कम व्यवहार्य है। साइटोकिन सांद्रता को प्रोटोकॉल से अपनाया जाता है जिसे स्केल-अप प्रक्रिया के दौरान वैरिएबिलिटी को कम करने के लिए नैदानिक अध्ययन26 में नियोजित किया गया था। साइटोकाइन कॉकटेल में इन विट्रो27 में पूर्वज प्रसार और एचएससी थकावट को कम करने के लिए आईएल 3 के बजाय आईएल 6 होता है। प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करने और उच्च प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए संस्कृति मीडिया (बेसल मीडिया + आरयूएस + साइटोकिन कॉकटेल) के ताजा एलिकोट तैयार करने की सिफारिश की जाती है। प्रोटोकॉल NHEJ- और HDR-मध्यस्थता जीन संपादन दोनों के लिए लागू है। विशेष रूप से, इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले 48-72 घंटे और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 24 घंटे की एचएसपीसी संस्कृति एचडीआर जीन संपादन के लिए महत्वपूर्ण है। अनुकूलित संस्कृति स्थितियों को स्टेम कोशिकाओं को संरक्षित करके एचडीआर जीन संपादन को लाभ पहुंचाना चाहिए। यह भी देखा गया कि संस्कृति की स्थिति दीर्घकालिक एचएससी में लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन में सहायता करती है। इससे पता चलता है कि, यदि एएवी 6 या आईडीएलवी जैसे वायरल कणों का उपयोग एचडीआर दाता के रूप में किया जाता है, तो एचडीआर संपादन दक्षता में सुधार होने की उम्मीद है, क्योंकि अनुकूलित संस्कृति की स्थिति एचएससी में दाता वितरण को बढ़ावा देती है।
एनएचईजे और एचडीआर सहित जीन संपादन परिणामों का आकलन करने के लिए, एनजीएस विश्लेषण, जांच या डीडीपीसीआर विश्लेषण, या सेंगर अनुक्रमण 7,8,28 का सुझाव दिया जाता है, इसके बाद ऑनलाइन टूल (आईसीई / आईसीई नॉक-इन) 16 का उपयोग करके डीकन्वोल्यूशन का सुझाव दिया जाता है, इसकी मजबूत मात्रात्मक प्रकृति के कारण। वैकल्पिक रूप से, एक टी 7 एंडोन्यूक्लिज़ परख संपादित डीएनए नमूनों पर किया जा सकता है, और खंडित डीएनए बैंड को इमेजजे का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है। हालांकि, टी 7 एंडोन्यूक्लिज़ परख दृष्टिकोण डीकन्वोल्यूशन विश्लेषण की तुलना में कम सटीक है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को लक्षित करता है।
प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल को एनबीएसजीडब्ल्यू चूहों को बुसल्फान के साथ कंडीशनिंग करके भी अनुकूलित किया जाता है, जिससे एचएसपीसी एनग्राफमेंट और रिपॉपुलेशन का आकलन करने के लिए कम सेल खुराक सक्षम होती है। कुल मिलाकर, इस प्रक्रिया को जीन हेरफेर के लिए आवश्यक एचएसपीसी की खुराक को कम करना चाहिए और विकासशील देशों में एचएसपीसी जीन थेरेपी की पहुंच में वृद्धि करनी चाहिए।
वर्तमान अध्ययन में, पीबीएमएनसी अलगाव, सीडी 34 + एचएसपीसी शुद्धिकरण, जीन संपादन और सत्यापन, और माउस अस्थि मज्जा में संलग्न जीन-संपादित एचएसपीसी के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया गया था। यह भी साबित हो गया है कि अनुकूलित एचएसपीसी संस्कृति सीडी 34 + सीडी 133 + सीडी 90 + एचएसपीसी को समृद्ध करती है और विवो में जीन-संपादित कोशिकाओं के चिमेरिज्म को बढ़ाती है।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित मौजूद नहीं हैं।
Acknowledgments
लेखक सीएससीआर के फ्लो साइटोमेट्री सुविधा और पशु सुविधा के कर्मचारियों को स्वीकार करना चाहते हैं। ए.सी. को आईसीएमआर-एसआरएफ फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, केवीके को डीएसटी-इंस्पायर फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और पीबी को सीएसआईआर-जेआरएफ फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। इस कार्य को जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार द्वारा वित्त पोषित किया गया था (अनुदान संख्या बीटी /पीआर 26901/ एमईडी / 31/377/2017 और बीटी / पीआर 31616 / एमईडी / 31/408/2019)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | - | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | - | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - |
References
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