Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Summary

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Durchführung von Magnetresonanztomographie, Clearing und Immunmarkierung intakter Mausgehirne mit iDISCO+, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Bildgebung mittels Lichtblattmikroskopie und nachgeschalteten Analysen mit NuMorph.

Abstract

Die Gewebereinigung gefolgt von Lichtblattmikroskopie (LSFM) ermöglicht die zelluläre Bildgebung intakter Gehirnstrukturen und ermöglicht eine quantitative Analyse struktureller Veränderungen, die durch genetische oder Umweltstörungen verursacht werden. Die Ganzhirnbildgebung führt zu einer genaueren Quantifizierung von Zellen und zur Untersuchung regionsspezifischer Unterschiede, die bei häufig verwendeter Mikroskopie von physisch geschnittenem Gewebe übersehen werden können. Die Verwendung von Lichtblattmikroskopie zur Abbildung geklärter Gehirne erhöht die Aufnahmegeschwindigkeit im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie erheblich. Obwohl diese Bilder sehr große Mengen an Gehirnstrukturdaten produzieren, sind die meisten Computerwerkzeuge, die eine Merkmalsquantifizierung in Bildern von geklärtem Gewebe durchführen, darauf beschränkt, spärliche Zellpopulationen und nicht alle Kerne zu zählen.

Hier demonstrieren wir NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), eine Gruppe von Analysewerkzeugen, um alle Kerne und Kernmarker in annotierten Regionen eines postnatalen Day 4 (P4) Mausgehirns nach der Klärung und Bildgebung auf einem Lichtblattmikroskop zu quantifizieren. Wir beschreiben Magnetresonanztomographie (MRT) zur Messung des Gehirnvolumens vor der Schrumpfung durch Dehydratationsschritte zur Gewebereinigung, Gewebereinigung mit der iDISCO+-Methode, einschließlich Immunmarkierung, gefolgt von Lichtblattmikroskopie mit einer kommerziell erhältlichen Plattform zur Abbildung von Mäusegehirnen mit zellulärer Auflösung. Anschließend demonstrieren wir diese Bildanalyse-Pipeline mit NuMorph, die verwendet wird, um Intensitätsunterschiede zu korrigieren, Bildkacheln zu nähen, mehrere Kanäle auszurichten, Kerne zu zählen und Gehirnregionen durch Registrierung in öffentlich verfügbaren Atlanten zu kommentieren.

Wir haben diesen Ansatz unter Verwendung öffentlich verfügbarer Protokolle und Software entwickelt, so dass jeder Forscher mit den erforderlichen Mikroskop- und Rechenressourcen diese Techniken durchführen kann. Diese Gewebereinigungs-, Bildgebungs- und Computerwerkzeuge ermöglichen die Messung und Quantifizierung der dreidimensionalen (3D) Organisation von Zelltypen im Kortex und sollten für jedes Wildtyp- / Knockout-Mausstudiendesign allgemein anwendbar sein.

Introduction

Die Bildgebung des gesamten Gehirns mit Einzelzellauflösung ist eine wichtige Herausforderung in den Neurowissenschaften. Gehirnbilder mit zellularer Auflösung ermöglichen eine detaillierte Analyse und Kartierung von Gehirnschaltkreisen auf Systemebene und wie diese Schaltkreise durch genetische oder umweltbedingte Risikofaktoren für neuropsychiatrische Störungen, zelluläres Verhalten bei sich entwickelnden Embryonen sowie neuronale Schaltkreise im erwachsenen Gehirn gestört werden ^1,2,3. Es gibt mehrere histologische Methoden, die hochauflösende Bilder des rekonstruierten 3D-Gehirns ermöglichen. Diese Techniken erfordern jedoch teure, spezialisierte Geräte, sind möglicherweise nicht mit der Immunmarkierung kompatibel, und die zweidimensionale (2D) Natur einiger Methoden kann zu Gewebeschäden und Scherung während des Schneidens^{führen 4,5}.

Jüngste Fortschritte haben einen alternativen Ansatz für die Abbildung ganzer Gehirne ermöglicht, der keine Gewebeschnitte erfordert. Sie beinhalten die Verwendung von Gewebereinigung, um Gehirne transparent zu machen. Transparenz wird bei den meisten Gewebereinigungsmethoden erreicht, indem sowohl Lipide entfernt werden, da sie eine Hauptquelle der Lichtstreuung sind, als auch der Brechungsindex (RI) des Objekts mit dem RI der Probenimmersionslösung während der Bildgebung abgeglichen wird. Licht kann dann die Grenze zwischen Materialien passieren,^ohne 6,7,8,9 gestreut zu werden.

Gewebereinigungsmethoden wie iDISCO+ werden häufig mit schneller 3D-Bildgebung mittels Einzelphotonen-Anregungsmikroskopie wie LSFM ^6,7,10 kombiniert. In transparenten Geweben, die mit einem Fluorophor markiert sind, bildet die Lichtblattfluoreszenzmikroskopie Schnitte durch Anregung mit einer dünnen Lichtebene¹¹. Der Hauptvorteil von LSFM besteht darin, dass jeweils ein einzelner optischer Schnitt beleuchtet wird, wobei die gesamte Fluoreszenz der Moleküle in diesem Abschnitt angeregt wird, wodurch das Photobleichen minimiert wird. Darüber hinaus ermöglicht die Abbildung einer gesamten optischen Scheibe eine kamerabasierte Erkennung dieser angeregten Scheibe und erhöht die Geschwindigkeit relativ zum Punktscannen¹². LSFM erzeugt zerstörungsfrei gut registrierte optische Schnitte, die für die 3D-Rekonstruktion geeignet sind.

Während die iDISCO+-Methode eine kostengünstige Gewebereinigung innerhalb von ~3 Wochen ermöglicht, können Dehydratisierungsschritte innerhalb des Protokolls zu einer Schrumpfung des Gewebes und einer möglichen Veränderung der Probenmorphologie führen, wodurch volumetrische Messungen beeinträchtigt^{werden 6,10}. Durch Hinzufügen einer sekundären bildgebenden Methode wie MRT, die vor dem Gewebereinigungsverfahren verwendet wird, kann der Grad der durch die Gewebereinigung induzierten Schrumpfung in der gesamten Probe gemessen werden. Während der Dehydratisierungsschritte können Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften zwischen grauer und weißer Substanz zu ungleichmäßigen Verformungen der Hirnsubstanz führen, was zu unterschiedlichen Gewebereinigungs-induzierten Volumendeformationen zwischen Wildtyp- und mutierten Proben führt und Interpretationen volumetrischer Unterschiede in diesen Proben verwirren kann^10,13 . Die MRT wird durchgeführt, indem das Tier zuerst mit einem Kontrastmittel (z. B. Gadolinium) perfundiert wird, gefolgt von der Inkubation des extrahierten Gewebes von Interesse in einer Tauchlösung (z. B. Fomblin) vor der Bildgebung¹⁴. Die MRT ist kompatibel mit der Gewebereinigung und der Durchführung von LSFM an derselben Probe.

LSFM wird häufig verwendet, um großflächige Mikroskopiebilder zur qualitativen Visualisierung des interessierenden Hirngewebes zu erstellen, anstatt die Gehirnstruktur quantitativ zu bewerten (Abbildung 1). Ohne quantitative Bewertung ist es schwierig, strukturelle Unterschiede nachzuweisen, die auf genetische oder umweltbedingte Beleidigungen zurückzuführen sind. Da sich die Gewebereinigungs- und Bildgebungstechnologien verbessern und die Kosten für Speicher und Rechenleistung sinken, wird die Quantifizierung von Zelltyplokalisationen innerhalb des interessierenden Gewebes zugänglicher, so dass mehr Forscher diese Daten in ihre Studien einbeziehen können.

Mit über 100 Millionen Zellen im Gehirn der Maus¹⁵ und bildgebenden Sitzungen des gesamten Gehirns, die Terabytes an Daten generieren können, besteht eine erhöhte Nachfrage nach fortschrittlichen Bildanalysewerkzeugen, die eine genaue Quantifizierung von Merkmalen in den Bildern, wie z. B. Zellen, ermöglichen. Es gibt eine Vielzahl von Segmentierungsmethoden für gewebebereinigte Bilder, die Schwellenwerte für die Intensität der Kernfärbung anwenden und Objekte mit vordefinierten Formen, Größen oder Dichten filtern^10,16,17,18. Ungenaue Interpretationen der Ergebnisse können jedoch durch Variationen von Parametern wie Zellgröße, Bildkontrast und Beschriftungsintensität entstehen. Dieser Artikel beschreibt unser etabliertes Protokoll zur Quantifizierung von Zellkernen im Gehirn der Maus. Zuerst beschreiben wir die Schritte zur Gewebeentnahme des P4-Mausgehirns, gefolgt von einem Gewebereinigungs- und Immunmarkierungsprotokoll, das von der öffentlich verfügbaren iDISCO+-Methode¹⁰ optimiert wurde. Zweitens beschreiben wir die Bildaufnahme mittels MRT und Lichtblattmikroskopie, einschließlich der Parameter, die für die Aufnahme von Bildern verwendet werden. Schließlich beschreiben und demonstrieren wir NuMorph¹⁹, eine Reihe von Bildanalysewerkzeugen, die unsere Gruppe entwickelt hat und die zelltypspezifische Quantifizierung nach Gewebeklärung, Immunmarkierung mit Kernmarkern und Lichtblattbildgebung von annotierten Regionen ermöglicht.

Protocol

Alle Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina in Chapel Hill verwendet und von diesem genehmigt.

1. Mausdissektion und Durchblutung

HINWEIS: Die folgenden Dissektionen wurden an P4- und P14-Mäusen mit einer Spritze durchgeführt. Das Volumen der Perfusionsflüssigkeit variiert je nach Alter des Tieres.

1. Perfusion
   ACHTUNG: Paraformaldehyd (PFA) ist eine gefährliche Chemikalie. Führen Sie alle Perfusionsschritte in einem chemischen Abzug durch.
   1. Vor der Operation Pentobarbital über intraperitoneale Injektion (100 mg/kg) verabreichen und das Anästhetikum wirken lassen.
   2. Sobald das Tier eine chirurgische Anästhesieebene erreicht hat, verwenden Sie die Zehenklemmreaktionsmethode, um die Nichtreaktion zu bestätigen.
   3. Machen Sie einen seitlichen Schnitt unter dem Brustkorb, um die Brusthöhle des Tieres freizulegen.
   4. Schneiden Sie mit einer gebogenen, chirurgischen Schere vorsichtig durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein auf einer Seite des Tieres und machen Sie einen identischen Schnitt auf der gegenüberliegenden Seite, so dass das Brustbein weggehoben werden kann und das Herz freigelegt wird.
   5. Ohne die absteigende Aorta zu beschädigen, schneiden Sie vorsichtig das mit dem Herzen verbundene Gewebe ab, bevor Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof machen, damit Blut aus dem Gefäßsystem fließen kann.
   6. Mit einer spritzenbasierten Methode wird die Maus durch den linken Ventrikel mit 10 ml bzw. 7 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für P14 bzw. P4 mit einer Perfusionsrate von 1,5 ml / min durch das System durchblutet.
   7. Sobald das Blut geklärt ist, erneut mit 10 ml PBS + 4% PFA und 7 ml PBS + 4% PFA für P14 bzw. P4 bei 4 °C mit einer Perfusionsrate von 1,5 ml / min durchbluten, um das Tier zu fixieren.
      HINWEIS: Fixationszittern werden beobachtet, und das Tier wird nach Abschluss steif sein. Wenn Sie MRT an Proben verwenden, perfusionieren Sie mit ähnlichen Mengen an PBS und PFA für jeden Zeitpunkt + 20% Gadolinium-basiertes MRT-Kontrastmittel in der PFA-Lösung.
   8. Entfernen Sie den Kopf mit einer chirurgischen Schere und lassen Sie ihn mit PBS + 4% PFA für 24 h bei 4 °C für eine vollständige Fixierung fallen.
      HINWEIS: In diesem Stadium bleibt das Gehirn mit eingeschaltetem Schädel intakt (siehe Abschnitt 2). Pausenpunkt: Gehirne können in diesem Stadium für mehrere Monate in PBS + 0,1% Natriumazid bei 4 °C gelagert werden.

2. MR-basierte Grobhirnstruktur-Bildgebung mit intaktem Schädel und Analyse

HINWEIS: Das Gehirn muss wie oben beschrieben in Gadolinium perfundiert und inkubiert werden, ohne aus dem Schädel entfernt zu werden. Alle MRT findet vor der Entfernung des Gehirns aus dem Schädel statt, um unbeabsichtigten Gewebeverlust während der Dissektion zu vermeiden. Die Bildgebung mit einem intakten Schädel unterstützt auch das Gehirn im Probenhalter (z. B. Spritze) während der Probenvorbereitung und Bildgebung.

1. Probenvorbereitung
   HINWEIS: Die folgenden Schritte sind für P4- und P14-Maus-Gehirnproben optimiert. Die benötigte Spritzengröße hängt von der physischen Größe der Probe ab.
   1. Wenn Sie eine MRT an der Probe durchführen, entfernen Sie die Haut vom Schädel und inkubieren Sie sie in PBS + 3% Gadolinium für 23 Tage bei 4 ° C, bevor Sie¹⁴ Bilder geben. Nach 23 Tagen spülen Sie die Proben schnell in PBS ab.
   2. Verwenden Sie 5-ml-Spritzen, um einen Probenhalter für die MRT zu erstellen, wobei Spritzenkolben verwendet werden, um jedes Ende des mit der Spritze²⁰ hergestellten Halters zu schließen. Verwenden Sie Kunststoffteile, um den Schädel fest im Halter zu halten (Abbildung 2A). Entfernen Sie die Markierungen auf der Spritze mit Ethanol, um Artefakte bei der Bildgebung zu vermeiden.
   3. Legen Sie den Schädel sicher in den Probenhalter und füllen Sie ihn mit einer MRT-kompatiblen Tauchlösung (siehe Materialtabelle). Schließen Sie den Halter und entfernen Sie alle Luftblasen mit einer Spritze.
      HINWEIS: Pausenpunkt: Der Schädel kann vor der Bildgebung mehrere Monate in der Immersionslösung gelagert werden.
2. Grobhirnstruktur-Bildgebung (MRT)
   1. Bilden Sie die Proben mit einem 9,4T/30 cm horizontalen MRT-System mit einer 15-mm-Volumenspule und einer Spin-Echo-basierten Sequenz mit den folgenden Parametern ab: Räumliche Auflösung: 60 μm x 60 μm x 60 μm; Gesamtscanzeit: 7 h 12 min; Echozeit (TE): 6,83 ms; Wiederholzeit (TR): 40 ms; Flip-Winkel der Anregung / Neufokussierung: 90/180 Grad; Bildgröße:166 x 168 x 209 Voxel; Sichtfeld (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; Bandbreite: 100.000 kHz.
3. Computergestützte Brutto-Hirnstruktur-Analyse
   1. Entfernen Sie den umgebenden Schädel aus rohen MRT-Bildern, indem Sie das Gehirn der Maus manuell mit einer Segmentierungssoftware verfolgen. Wenden Sie als Nächstes die voxelweise Multiplikationsoperation zwischen dem Maskenbild und dem rohen MRT-Bild an, um das schädelgestreifte Gehirn-MRT-Bild zu erzeugen.
      HINWEIS: Die Ausgabe ist ein binäres Maskenbild, bei dem die Intensität für Gehirnvoxel auf 1 und 0 eingestellt ist.
   2. Wenden Sie eine starre Bildregistrierung an (wobei nur Translation und Rotation geschätzt werden) mit "Flirt" im FSL-Paket^21,22, um das schädelgestreifte MRT-Bild (bewegtes Bild) an das entsprechende Lichtblattmikroskopiebild (Referenzbild) anzupassen.
   3. Wenden Sie eine nicht starre Registrierung an (unter Verwendung von "SyN" in der ANTS-Software²³), um die Punkt-zu-Punkt-Übereinstimmungen zwischen dem starr ausgerichteten MRT-Bild in Schritt 2.3.2 und dem Lichtblattbild (dasselbe Referenzbild in Schritt 2.3.2) zu ermitteln.
      HINWEIS: Die Ausgabe enthält das verzerrte MRT-Bild und das Verformungsfeld, das mit den Volumenänderungen von MRT- zu den Lichtblattbildern verbunden ist.
   4. Berechnen Sie die Jacobische Determinante auf dem in Schritt 2.3.3 erzeugten Deformationsfeld, das die Volumenänderung in einer 3 x 3 x 3 Voxel-Nachbarschaft quantifiziert.
   5. Richten Sie schädelabgestreifte Bilder mit dem Allen Developmental Mouse Brain Atlas mithilfe der deformierbaren Bildregistrierung aus.
      HINWEIS: Die etablierte räumliche Punkt-zu-Punkt-Korrespondenz ermöglicht die automatische Annotation von Hirnregionen von Interesse im neuen Mausbild (Abbildung 2C-H).

3. Hirndissektion aus dem Schädel

1. Machen Sie einen Mittellinienschnitt entlang der Oberseite des Schädels vom Hals bis zur Nase, um den Schädel freizulegen.
2. Legen Sie die Schädelbasis frei, indem Sie den verbleibenden Nackenmuskel und alle anderen Restmuskeln abschneiden.
3. Schneiden Sie mit einer scharfen chirurgischen Schere vorsichtig entlang der inneren Oberfläche des Schädels und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu schädigen, indem Sie beim Schneiden mit der scharfen chirurgischen Ausrüstung einen sanften Druck nach oben aufrechterhalten.
4. Verwenden Sie eine Pinzette, um die beiden geschnittenen Schädelhälften vom Gehirn weg zu schälen und überschüssiges Fett, das am Gehirn befestigt ist, vorsichtig zu entfernen.
5. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um jede Dura zu trimmen, die das Gehirn mit dem Schädel verbindet, und verwenden Sie dann einen Spatel, um das Gehirn sanft vom Kopf zu entfernen.
6. Entfernen Sie das Gehirn, waschen Sie mit PBS und wechseln Sie dann zu PBS mit 0,1% Natriumazid und halten Sie es bei 4 ° C für die Langzeitlagerung.

4. Gewebereinigung

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde vom iDISCO+-Protokoll für P4-Mäuse⁶ adaptiert, mit geringfügigen Änderungen. Einige Details können sich für verschiedene Zeitpunkte / Arten / Experimente ändern). ACHTUNG: Methanol, Dichlormethan (DCM) und Dibenzylether (DBE) sind gefährliche Chemikalien. Diese Gewebereinigungsschritte werden in einem chemischen Abzug durchgeführt.

1. Antikörpervalidierung
   HINWEIS: Die Methanolkompatibilität von nicht getesteten Antikörpern muss überprüft werden, da sie durch die im iDISCO+-Protokoll geforderten aggressiven Methanolwäschen negativ beeinflusst werden können. Eine Liste der Antikörper, die nachweislich in iDISCO+ wirken, finden Sie auf der Website²⁴.
   1. Extrahieren Sie 10 μm gefrorene Abschnitte des PFA-fixierten Gewebes von Interesse auf stereologischen Objektträgern.
   2. Die Abschnitte in 100% Methanol für 3 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Rehydrieren Sie in PBS, bevor Sie mit Standard-Immunhistochemie-Protokollen fortfahren, um festzustellen, ob der Antikörper das erwartete Muster der Fluoreszenz nach dem Waschen von Methanol zeigt. Verwenden Sie zur Positivkontrolle einen Objektträger, der nicht mit Methanol behandelt wurde.
2. Puffervorbereitung
   1. Bereiten Sie Puffer nach dem offiziellen iDISCO-Protokoll vor. Informationen zur Zusammensetzung der Puffer und anderer in diesem Protokoll verwendeter Lösungen finden Sie in der Materialtabelle .
3. Vorbehandlung
   1. Dehydratisieren Sie die Probe mit Methanol / PBS-Serie: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; Je 1 h bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die Verwendung von PBS während der Dehydratisierung hilft, das Reißen der Proben in Methanolwäschen zu verhindern.
   2. Die Probe wird 1 h lang in 100% Methanol gewaschen und dann bei 4 °C für 1 h gekühlt, bevor sie über Nacht unter Schütteln in 66% DCM/33% Methanol bei Raumtemperatur inkubiert wird.
   3. Die Probe wird 2x in 100%igem Methanol bei Raumtemperatur gewaschen und anschließend bei 4 °C gekühlt.
   4. Verwenden Sie frisches 5%_H2O2in Methanol, um die Probe über Nacht bei 4 °C zu bleichen.
   5. Rehydrieren Sie die Probe mit der Methanol/PBS-Serie: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; Je 1 h bei Raumtemperatur und 2x 1 h in PTx.2 bei Raumtemperatur waschen.
   6. Inkubieren Sie die Probe in 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO bei 37 °C über Nacht.
   7. Inkubieren Sie die Probe in 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Desoxycholat/0,1% NP40/20% DMSO bei 37 °C über Nacht.
   8. In PTx.2 bei Raumtemperatur zweimal 1 h waschen.
4. Immunmarkierung
   1. Inkubieren Sie die Proben in Permeabilisierungslösung bei 37 °C für 2 Tage (~48 h).
   2. Blockieren Sie die Proben in Blocking Solution bei 37 °C für 2 Tage (~48 h).
   3. Inkubation der Proben mit primären Antikörpern in PTwH / 5% DMSO / 3% Serum bei 37 °C für 4 Tage (~96 h) (z. B. Kaninchen (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) und Anti-Ctip2 Ratte (Rt) Antikörper (1:400) (Materialtabelle).
   4. 3 x 1 h in PTwH waschen. Weitere 2 h in PTwH waschen. Über Nacht bei Raumtemperatur in der Waschlösung einwirken lassen.
   5. Inkubation der Proben mit sekundären Antikörpern und einem Kernfarbstoff, wie TO-PRO-3, in PTwH / 3% Serum bei 37 °C für 4 Tage (~96 h; z.B. Ziegen-Anti-Rb(1:50) und (Ziegen-Anti-Rt(1:200)) (Materialtabelle).
   6. 3 x 1 h in PTwH waschen Weitere 2 h in PTwH waschen. Über Nacht bei Raumtemperatur in der Waschlösung einwirken lassen.
5. Lichtung
   1. Dehydratisieren Sie in Methanol/PBS-Serie-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h jeweils bei Raumtemperatur. 3 h unter Schütteln in 66% DCM / 33% Methanol bei Raumtemperatur inkubieren.
      HINWEIS: Die Probe kann unmittelbar nach der Dehydratisierung in 100% Methanol über Nacht bei Raumtemperatur belassen werden.
   2. In 100% DCM zweimal 15 min bei Raumtemperatur (mit Schütteln) inkubieren, um den MeOH zu waschen.
   3. In Dibenzylether (DBE) inkubieren, ohne bei Raumtemperatur zu schütteln. Stellen Sie sicher, dass das Röhrchen fast vollständig mit DBE gefüllt ist, um eine Oxidation der Probe zu verhindern. Beenden Sie das Mischen der Lösung, indem Sie vor der Bildgebung einige Male umkehren.

5. Lightsheet-Bildgebung

HINWEIS: iDISCO-gewebebereinigte Gehirne wurden mit einem Lichtblattmikroskop abgebildet, das mit einem 2X/0,5 NA-Objektiv, einer komplementären Metalloxid-Halbleiterkamera und einer Mikroskopbetriebs- und Bildaufnahmesoftware bei 0,75 x 0,75 x 4 μm/Voxel für den P4-Zeitpunkt ausgestattet war, da dies eine Einzelzellauflösung innerhalb des Kortex ermöglichte (Abbildung 3A, B).

1. Probenmontage
   1. Montieren Sie die Probe vorsichtig im richtigen Probengrößenhalter, so dass die Probe aufgrund des Nennarbeitsabstands des Lichtschichtmikroskops (5,7 mm minus 0,5 mm Sicherheitsmarge) mit der Z-Dimension nicht mehr als 5,2 mm tief ausgerichtet ^ist25.
   2. Platzhalter in der Probenhalterung mit der Schraube des Halters in einem Winkel von 45° zu den Halterungen der Halterung (Abbildung 1B). Positionieren Sie die Halterung so, dass der Lichtweg senkrecht zur Probe verläuft (Abbildung 1C).
2. Bildgebungsparameter
   1. Stellen Sie den Zoomkörper des Mikroskops auf 4-fache Vergrößerung oder höher ein, was 0,75 μm/Pixel ergibt.
      HINWEIS: Einzelzell-Computeranalysen von P4-Lichtblattbildern können mit jedem handelsüblichen Lichtblattmikroskop durchgeführt werden, das eine Auflösung von 0,75 x 0,75 x 4 μm/Voxel oder höher ermöglicht. Eine niedrigere Auflösung reicht für Gehirne zu späteren Zeitpunkten aus, in denen die Kerne spärlicher verteilt sind.
   2. Wählen Sie in der Bilderfassungssoftware ein einzelnes Lichtblatt mit einem NA = ~0,08 (9 μm Dicke/4 μm z-Schritt).
      HINWEIS: Diese Einstellung in Kombination mit der horizontalen dynamischen Fokussierung ermöglicht die Bildgebung des gesamten Gehirns mit einer Einzelzellauflösung eines Mausgehirns innerhalb einer angemessenen Zeit. Für ein postnatales Day 4 (P4) Gehirn wird die Bildaufnahmezeit auf 11-15 h für drei Kanäle geschätzt, abhängig von der Größe des Gehirns.
   3. Um sicherzustellen, dass die axiale Auflösung entlang der Breite des Bildes beibehalten wird, wählen Sie " Horizontale dynamische Fokussierung" und wenden Sie die empfohlene Anzahl von Schritten in Abhängigkeit von der Laserwellenlänge an. Stellen Sie für ein ganzes P4-Mausgehirn die horizontale dynamische Fokussierung auf 11 ein. Passen Sie den Feinfokus für jeden Kanal in Bezug auf den Registrierungskanal an.
      HINWEIS: Hier wird der TO-PRO-3-Kanal (647 nm) im Allen Developmental Mouse Brain Atlas registriert, da dieser alle Kerne markiert.
   4. Passen Sie die Laserleistung pro Kanal in Bezug auf die Kanaleigenschaften an.
      HINWEIS: Längere Wellenlängen erfordern eine höhere Laserleistung als kürzere Wellenlängen. Zum Beispiel müssen die 780 nm mit einer hohen Laserleistung (70% - 75%) und geringer Belichtung (50 ms) abgebildet werden, während der 647-nm-Kanal eine durchschnittliche Laserleistung (40% - 45%) und eine geringe Belichtung (50 ms) erfordert.
   5. Stellen Sie die Lichtblattbreite auf ~50 % ein, um sicherzustellen, dass die Blattleistung optimal in der y-Dimension für diese Stichprobengröße verteilt wird.
      HINWEIS: In Kombination mit der horizontalen dynamischen Fokussierung bietet eine Blattbreite von 50 % eine durchschnittliche Verteilung der Leistung über das Bild mit einem reduzierten Risiko der Photobleiche²⁵.
   6. Legen Sie die Anzahl der Kacheln in Bezug auf die Größe der Stichprobe mit einer empfohlenen Überlappung von 15 % zwischen den Kacheln fest und erfassen Sie Bilder für jeden Kanal sequenziell für jeden Stapel an einer bestimmten Kachelposition.

6. Bildverarbeitung mit NuMorph

HINWEIS: Die NuMorph-Pipeline besteht aus drei Hauptteilen für die 3D-Bildanalyse: Vorverarbeitung, Analyse und Auswertung. Diese Teile wurden in NMp_template.m, NMa_template.m bzw. NMe_template.m organisiert, die im Folgenden erläutert werden. Darüber hinaus wird NM_setup.m hinzugefügt, um Softwarepakete herunterzuladen und zu installieren, die für den reibungslosen Betrieb von NuMorph erforderlich sind. NM_samples.m bietet auch eine Vorlage zur Eingabe von Bildakquisitionsinformationen.

1. NuMorph-Einrichtung
   1. Laden Sie den Conda Environment Manager für Linux²⁶ herunter und installieren Sie ihn. Laden Sie die NuMorph^{19-Bildverarbeitungstools} herunter und installieren Sie sie.
   2. Führen Sie in der Befehlszeile Matlab aus. Führen Sie NM_setup.m von NuMorph aus, um Softwarepakete für Bildanalysen herunterzuladen und zu installieren, die für Analysen benötigt werden.
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass die Conda-Umgebung ordnungsgemäß eingerichtet ist und dass alle Tools und Add-ons, die Matlab zum Ausführen der drei Pipelines benötigt, korrekt heruntergeladen und installiert werden. Am bemerkenswertesten sind hier Elastix für die laufende Registrierung und 3D-Unet für die Zellerkennung und -zählung.
2. Geben Sie Beispielnamen, Eingabe- und Ausgabeverzeichnisse, Kanalinformationen und Lightsheet-Bildgebungsparameter an, indem Sie die Datei NM_samples.m.
   HINWEIS: Hier wird empfohlen, zu überprüfen, ob die richtigen Informationen, insbesondere das Bildeingabeverzeichnis, korrekt angegeben sind. Fehler werden hier in der Regel erst aufgerufen, wenn nachfolgende Schritte ausgeführt werden.
3. Bildvorverarbeitung
   1. Intensitätsanpassung
      1. Stellen Sie im NMp_template die Intensitätsanpassung = true ein.
         HINWEIS: Auf true setzen, wenn eine Intensitätsanpassung erforderlich ist. Wenn nicht, stellen Sie die Intensitätsanpassung ein = false. Es gibt auch eine Option, um 'update' zu verwenden, um vorherige Anpassungsparameter zu überschreiben.
      2. Legen Sie beim Arbeiten mit einem neuen Satz von Bildern die Option verarbeitete Bilder verwenden = false fest. Andernfalls geben Sie alle zuvor gespeicherten Bilddatensätze im Ausgabeverzeichnis an (z. B. "aligned", "stitched"), die für nachfolgende Verarbeitungsschritte verwendet werden sollen.
         HINWEIS: Diese Option wird bereitgestellt, wenn Eingabebilder bereits vorverarbeitet wurden. In diesem Fall werden vorverarbeitete Bilder als Eingabebilder verwendet und die Option wird auf den Namen des Unterverzeichnisses im Ausgabeverzeichnis gesetzt.
      3. Setzen Sie save images = true.
         HINWEIS: Mit dieser Option wird sichergestellt, dass verarbeitete Bilder im Ausgabeverzeichnis gespeichert werden. Andernfalls werden nur Parameter berechnet und gespeichert.
      4. Legen Sie save samples = true fest.
         HINWEIS: Diese Option stellt sicher, dass die Beispielergebnisse für jeden Hauptschritt gespeichert werden.
      5. Set adjust tile shading = basic zum Anwenden der Schattierungskorrektur unter Verwendung des BaSiC-Algorithmus²⁷ oder manuell zum Anwenden der Kachelschattierungskorrektur unter Verwendung von Messungen aus dem Lichtblattmikroskop bei bestimmten Lichtblattbreiten.
         HINWEIS: Diese Option korrigiert die ungleichmäßige Beleuchtung entlang der y-Dimension, die durch die Form der Blatttaille verursacht wird.
   2. Ausrichtung des Bildkanals
      1. Legen Sie in NMp_template die Kanalausrichtung = true fest. Setzen Sie diese Option auf true, wenn eine Kanalausrichtung erforderlich ist. Wenn nicht, legen Sie den Wert auf false fest. Legen Sie die Kanalausrichtungsmethode entweder auf translation (starr) oder elastix (nicht starr) fest.
         HINWEIS: Das Translationsverfahren verwendet starre 2D-Registrierungsansätze bei der Ausrichtung mehrerer Kanäle, während das Elastix-Verfahren nicht-starre B-Splines²⁸ verwendet, um die Rotationsdrift zu korrigieren, die während der langen Bildaufnahme¹⁹ auftreten kann.
   3. Iteratives Bild-Stitching
      1. Setzen Sie NMp_template Stichbilder = true.
         HINWEIS: Setzen Sie diese Option auf true, wenn Stitching erforderlich ist.
      2. Setzen Sie die Sichtverfeinerung = true.
         HINWEIS: Diese Option wird verwendet, um die Übersetzung in xy mithilfe der Transformation für unveränderliche Merkmalstransformation^{skalieren 29} weiter zu verfeinern.
      3. Lastausrichtungsparameter festlegen = true.
         HINWEIS: Diese Option verwendet die Kanalausrichtungsübersetzungen während des Stitchings. Diese Option wird bei Mehrkanal-Bildgebung empfohlen. Andernfalls auf false festgelegt.
      4. Legen Sie Überlappung = 0,15 fest, um Kachelüberlappungen während der Bildgebung abzugleichen.
   4. Um einen dieser Vorverarbeitungsschritte auszuführen, führen Sie in Matlab außerhalb NMp_template Umgebung Folgendes aus:
      1. Geben Sie den Beispielnamen an. Set config = NM_config(process,sample).
      2. Führen Sie einen der Vorverarbeitungsschritte aus, indem Sie NM_process(config,stage) angeben und die Stufe mit Intensität, Ausrichtung oder Stitch für einen der Prozesse angeben. Überprüfen Sie das Ausgabeverzeichnis auf Ausgabedateien für jede der Phasen (Abbildung 3 und Abbildung 4).
4. Bildanalyse
   1. Vor NuMorph
      1. Beginnen Sie mit einem 3D-Atlasbild und einem zugehörigen Anmerkungsbild, das jedes Voxel einer bestimmten Struktur zuordnet.
         HINWEIS: Hier wird der P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas verwendet, der aus dem MagellanMapper³⁰ generiert wurde.
      2. Richten Sie sowohl das Atlasbild als auch die Anmerkungsdatei aus, um sicherzustellen, dass sie in der richtigen Ausrichtung korrekt übereinstimmen.
   2. Innerhalb von NuMorph
      HINWEIS: Nachdem der Atlas und seine Anmerkungen korrekt ausgerichtet sind, müssen die Dateien in NuMorph "munged" oder verarbeitet werden, damit sie für die spätere Verwendung gespeichert werden können. Verwenden Sie dazu die Funktion munge_atlas, um Eingaben wie unten gezeigt anzugeben.
      1. Geben Sie Atlas_file: (Zeichenfolge) an. Geben Sie den vollständigen Pfad zur Atlasdatei an.
      2. Geben Sie Annotation_file: (Zeichenfolge) an. Geben Sie den vollständigen Pfad zu den zugeordneten Anmerkungen an.
      3. Geben Sie die Auflösung an: (1x3 numerisch). Geben Sie die Auflösung des Atlas y,x,z als Mikrometer pro Pixel an.
      4. Ausrichtung angeben: (1 x 3 Zeichen). Geben Sie die Atlasorientierung an und stellen Sie sicher, dass sie mit dem Aufbau der Probe in der Halterung übereinstimmt (anterior(a)/posterior(p),superior(s)/inferior(i),left(l)/right(r)).
      5. Halbkugel angeben: Geben Sie an, welche Gehirnhälfte abgebildet wurde ("links", "rechts", "beide", "keine").
      6. Geben Sie out_resolution:(int) an. Geben Sie die isotrope Auflösung der Atlasausgabe in Mikrometern an. (Standard: 25).
      7. Führen Sie den Befehl "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, resolution, orientation, hemisphere)" aus, um munged Annotationen in /data/annotation_data und eine Kopie des Atlasbildes in /data/atlas zu generieren.
      8. Lesen Sie die Matlab-Struktur und die Atlas-Datei, um sicherzustellen, dass beide Dateien korrekt in der richtigen Ausrichtung angeordnet sind.
         HINWEIS: Ein zusätzlicher Zellklassifizierungsschritt kann durchgeführt werden, um Zelltypen basierend auf der Kolokalisierung von immunmarkierten Proteinmarkern zu quantifizieren.
   3. Resampling
      1. Legen Sie NMa_template resampling images = true fest, wenn Sie eine Bildregistrierung durchführen, um auf den Atlas zu verweisen oder heruntergerechnete Mengen hochauflösender Datensätze zu generieren.
         HINWEIS: Die NMa_template.m wird verwendet, um die Parameter für die Neuprobenahme, Registrierung, Zellkernerkennung und Zellzählung einzustellen.
      2. Stellen Sie die Auflösung für die Neuberechnung so ein, dass sie dem Atlas entspricht.
         HINWEIS: Hier wird eine isotrope Auflösung von 25 μm³/voxel verwendet, da der Referenzatlas diese Auflösung aufweist.
      3. Geben Sie die Kanalnummer an, die mit Resample-Kanälen = [ ] neu berechnet werden soll.
         HINWEIS: Hier wird die Kanalnummer so eingestellt, dass sie mit dem Kernkanal übereinstimmt. Wenn diese Option leer ist, wird nur der Registrierungskanal neu gesampelt.
   4. Registrierung
      1. Setzen Sie in NMa_template register images = true. Legen Sie den Wert auf true fest, wenn eine Registrierung erforderlich ist. Wenn nicht, setzen Sie registration = false.
      2. Geben Sie die Atlasdatei so an, dass sie mit der Datei im Atlasverzeichnis übereinstimmt.
      3. Registrierungsparameter festlegen = Standard.
         HINWEIS: Diese Option verwendet eine affine gefolgt von B-Spline-Transformation, um die räumliche Übereinstimmung zu schätzen. Andernfalls definieren Sie einen neuen Satz von Registrierungsparametern über Elastix in /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Legen Sie save registered images = true fest.
         HINWEIS: Ausgabedateien aus der Registrierung und dem Resampling können heruntergeladen und in Matlab oder anderen Visualisierungstools wie FIJI³¹ visuell überprüft werden.
   5. Zellkernerkennung, Zellzählung und -klassifizierung
      Hinweis: Hier auftretende Fehler können darauf zurückzuführen sein, dass die Anmerkungsdatei nicht korrekt angegeben wurde oder das Alter des Beispiels nicht mit der richtigen Anmerkung übereinstimmt.
      1. Setzen Sie NMa_template sowohl die Anzahl der Kerne als auch die Klassifizierung der Zellen = true.
      2. Set-count-Methode = 3dunet.
         HINWEIS: Diese Option ermöglicht die Verwendung des trainierten 3D-Unet-Modells¹⁹. Wählen Sie andernfalls Hessisch aus, das die Hessische Bloberkennungsmethode verwendet.
      3. Legen Sie min_intensity fest, um einen Mindestintensitätsschwellenwert für erkannte Objekte zu definieren.
         HINWEIS: Ein geeigneter Schwellenwert wird empirisch basierend auf dem Signal-Rausch-Verhältnis der nuklearen Markierung bestimmt.
      4. Legen Sie classify_method auf einen der beiden Schwellenwerte fest, der auf einer unüberwachten Fluoreszenzintensität an Schwerpunktpositionen basiert, oder auf svm, der einen überwachten linearen SVM-Klassifikator (Support Vector Machine) modelliert.
         HINWEIS: In diesem Schritt werden alle erkannten Zellen in vier Hauptklassen mit 3-Kanal-Bildgebung klassifiziert. Mit diesem Protokoll werden Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2⁺, Ctip2-/Brn2^- und Ausreißer erzeugt.
   6. Analyseschritte
      1. Geben Sie den Beispielnamen an. Legen Sie config =NM_config(analyze,sample) fest.
      2. Führen Sie einen der Analyseschritte aus, indem Sie NM_analyze(config,stage) angeben und die Phase mithilfe von Resample, Register, Count oder Klassifizieren angeben. Überprüfen Sie das Ausgabeverzeichnis auf Ausgabedateien für jede der Phasen (Abbildung 5).
   7. Zelltypklassifikation und Gruppenanalyse
      1. Setzen Sie NMe_template update = true und überschreiben Sie alle zuvor berechneten Statistiken.
         HINWEIS: Die NMe_template.m bietet die Möglichkeit, eine Zelltypgruppenanalyse über Gehirnregionen desselben analysierten Gehirns hinweg durchzuführen.
      2. Legen Sie compare_structures_by entweder auf Index fest, um nach allen eindeutigen Anmerkungen zu vergleichen, oder auf Tabelle, um Strukturen gemäß der Tabelle zu vergleichen.
      3. Legen Sie den template_file fest, der alle möglichen Strukturindizes angibt und in /annotations vorhanden sein muss.
      4. Legen Sie structure_table fest, und geben Sie die zu bewertenden Strukturen an.
      5. Geben Sie die Zellzählung und die Zelltypklassifizierung wie in NMa_template.m. beschrieben an.
      6. Legen Sie compare_groups fest, um die zu vergleichenden Gruppen anzugeben.
      7. Setzen Sie paired auf true oder false, um entweder einen gepaarten t-Test oder einen Zwei-Stichproben-t-Test durchzuführen.
   8. Analyse ausführen.
      HINWEIS: Um diesen Schritt auszuführen, führen Sie Folgendes in Matlab außerhalb der NMe_template.m-Umgebung aus.
      1. Geben Sie den Beispielnamen an. Legen Sie config =NM_config(evaluate,sample) fest.
      2. Führen Sie den Analyseschritt aus, indem Sie NM_evaluate(config,stage) und die Bühne angeben. Überprüfen Sie das Ausgabeverzeichnis auf Ausgabedateien für die Gruppenanalyse.

Representative Results

Da das iDISCO+-Protokoll eine signifikante Gewebeschrumpfung einführt, die mit dem Auge leicht wahrnehmbar ist (Abbildung 2B), haben wir dieser Pipeline vor der Gewebereinigung einen MRT-Schritt hinzugefügt, um die durch die Gewebereinigung induzierte Schrumpfung zu quantifizieren. Der Workflow beginnt mit der Entfernung des Nicht-Hirngewebes aus dem MR-Bild (Abbildung 2C). Als nächstes wird eine starre Transformation (3 Translations- und 3 Drehwinkel) angewendet, um das MR-Bild am Lichtblattbild auszurichten (Abbildung 2D). Auf diese Weise beobachteten wir einen Gesamtvolumenverlust von 60%, der durch das Gewebereinigungsverfahren induziert wurde (Abbildung 2E), was mit den Schätzungen der Volumenänderung durch das Auge übereinstimmte (Abbildung 2B). Dieses Ergebnis unterscheidet sich deutlich von einem früheren Bericht, in dem ein Rückgang von 5%-10%^10,32 gemeldet wurde. Der Unterschied in der Schrumpfung kann durch den Unterschied im Tieralter zwischen den beiden Studien (P4 vs. erwachsene Gehirne) oder durch Zeitunterschiede in der Methanolwäsche im Clearing-Schritt des iDISCO+-Protokolls (16 h vs. 2 h) verursacht werden. Um den Grad der Gewebeschrumpfung in verschiedenen Regionen des Gehirns abzubilden, haben wir außerdem eine deformierbare Bildregistrierung eingesetzt, bei der das Lichtblattbild als Referenz verwendet wird. Das registrierte MR-Bild ist in (Abbildung 2F) dargestellt. Die geschätzte Volumenänderung aufgrund des Gewebereinigungsverfahrens ist farbcodiert, wobei im Kortex im Vergleich zu anderen Gehirnregionen ein größerer Schrumpfungsgrad beobachtet wird (Abbildung 2G).

Um das Volumen der Gehirnregionen zu messen, führten wir eine Segmentierung des MRT durch Registrierung in einem kommentierten Atlas durch. Die Segmentierung von MR-abgebildeten Gehirnen wurde als erfolgreich angesehen, wenn das Referenzatlas-Overlay eng mit den anatomischen Grenzen übereinstimmte, die durch Kontrastunterschiede in den rohen MRT-Bildern identifiziert wurden (Abbildung 2H). Die Überlagerung während der Registrierung hängt von einer guten Probenvorbereitung (Abbildung 2A), der Bildaufnahme und dem Abisolieren des Schädels ab. Der Schädelstripping-Schritt ist entscheidend für gute Registrierungsergebnisse, da die Registrierung versucht, das Referenzbild vom Atlas zum gesamten MR-Bild zu verzerren, einschließlich aller Schädel, die im Bild verbleiben. Die Einbeziehung des Schädels in die Registrierung kann die Ergebnisse verzerren und zu einem falsch registrierten 3D-Volumenrendering der Segmentierung führen. Das endgültige 3D-Volumen-Rendering kann dann mit ITK-SNAP³³ visualisiert werden (Abbildung 2H). Diese Methode wird verwendet, um grobe Hirnvolumenunterschiede zwischen Stichprobengruppen zu bewerten. Die zelluläre Basis, die den mit der MRT entdeckten Volumenunterschieden zugrunde liegt, kann durch Zellzählung mit Gewebereinigung, Lichtblattmikroskopie und NuMorph verfolgt werden.

Das Ziel der Gewebereinigung und -analyse ist es, die Beiträge verschiedener Zelltypen zu Unterschieden zwischen experimentellen Bedingungen (z. B. Genotyp, Umweltexposition) zu bewerten, indem einzelne Kerne mit NuMorph gezählt werden. Die Gewebereinigung mit dem iDISCO+-Protokoll und neuronalen schichtspezifischen Zellkernmarkern führte zu klar definierten Zellgruppen von Neuronen der oberen und unteren Schicht im Isokortex (Abbildung 3).

Die Zellzählung mit NuMorph hängt von erfolgreichen Vorverarbeitungsschritten ab, die Intensitätsanpassung, Kanalausrichtung und Stitching umfassen (Abbildung 4A). Fehler, die bei einem dieser Schritte auftreten, können zu unsachgemäßem Stitching führen (Abbildung 4B,C). Beispielsweise kann eine unsachgemäße Bildaufnahme zu Bildern mit unscharfen und unscharfen Mustern während der Vorverarbeitung führen (Abbildung 4C). Um Kerne aus bestimmten Hirnregionen zu zählen, werden die zusammengefügten Bilder mit einem öffentlich zugänglichen Atlas annotiert. Wir haben unsere zusammengefügten Bilder auf eine korrigierte Version des P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas³⁴ registriert. Hier wurden die zusammengefügten Bilder von einer hohen Auflösung (0,75 x 0,75 x 4 μm³/Voxel) auf eine niedrigere Auflösung (25 μm³/voxel isotrope Auflösung) heruntergerechnet, um der Auflösung des Atlas zu entsprechen. Die Anpassung der Auflösung des Atlas gewährleistet die korrekte Registrierung der Bilder im Atlas und liefert regionale Anmerkungen in den aufgenommenen Bildern (Abbildung 5A).

Um eine spezifische zelltypspezifische Zählung durchzuführen, markierten wir Neuronen der oberen Schicht, die Brn2 exprimieren, Neuronen der unteren Schicht, die Ctip2 exprimieren, und alle Kerne mit TO-PRO-3 (Abbildung 3B). Die Bildgebung erfolgt mit ausreichender räumlicher Auflösung, um einzelne Kerne zu trennen (0,75 x 0,75 x 4 μm³/Voxel). Die Schwerpunkte der Kerne werden mit einem trainierten 3D-Unet-Modell in NuMorph detektiert (Abbildung 5B,C). Wir entdeckten ~12 × 10 6 Gesamtkerne, die To-Pro-3+ im Isokortex waren, einschließlich ~2,6 × 10 6 Brn2+ und 1,6 × 10⁶ Ctip2⁺ Kerne. Wir entdeckten auch ~3,7 × 10 6 und 2,9 × 10⁶ To-Pro-3⁺ Gesamtkerne in den Basalganglien bzw. im Hippocampus-Allocortex. Etwa 1,5 × 10 6 und <1 × 10⁶ Ctip2+-Zellen wurden in den Basalganglien bzw. im Hippocampus-Allocortex gezählt, obwohl eine vernachlässigbare Anzahl von Brn2⁺-Zellen nachgewiesen wurde (Abbildung 5D). Die Gesamtzahl der Kerne im Isokortex und im Allocortex des Hippocampus zusammen (~ 15 Millionen Zellen) ähnelt den zuvor berichteten Gesamtzellzahlen in der Großhirnrinde der Maus¹⁵. Diese Ergebnisse zeigen den Nutzen der MRT-Bildgebung, der iDISCO+-Gewebereinigungsmethodik und der NuMorph-Computeranalyse, um volumetrische, Gesamtzellzahl und zelltypspezifische Zählungen aufzudecken, die den Unterschieden in der Gehirnstruktur der Maus zwischen experimentellen Gruppen zugrunde liegen.

Abbildung 1: Überblick über die Ganzhirn-Einzelzellanalyse intakter neonataler 3D-Gewebe-geklärter Mäusegehirne. (A) Überblick über iDISCO+ Gewebereinigung, Lichtblattbildgebung und 3D-Bildanalyse. (B) Bilder, die die korrekte Probenmontage auf dem Lichtblattmikroskop zeigen. (C) Karikatur, die die Probenmontage relativ zum Lichtblattpfad zeigt. Abkürzung: ab = Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bruttohirnstrukturmessungen mit MRT. (A) Bild der Probenvorbereitung für die MRT. (B) Bilder von repräsentativen P4-Gehirnen vor und nach der iDISCO+ Gewebeklärung. Maßstabsbalken = 5,0 cm. (C) MR-Rohbild mit Schädel in 60 x 60 x 60 μm³. Maßstabsbalken = 800 μm. (D) Lichtblattaufnahme des Mausgehirns bei 25 x 25 x 25 μm³. Gesamtvolumen = 68,7 mm³. Beachten Sie, dass ein kleiner Abschnitt des dorsalen Isocortex während der Dissektion, die durch eine Pfeilspitze (weiß) markiert ist, unbeabsichtigt entfernt wurde. Maßstabsbalken = 800 μm. (E) MR-Aufnahme des Mausgehirns nach Schädelstripping und starrer Registrierung. Gesamtvolumen = 171,9 mm³. Einfügen (gelb) zeigt die Gehirnkontur aus dem Lichtblattbild. Maßstabsbalken = 800 μm. (F) Registriertes MR-Bild in Bezug auf das Lichtblattbild zur Beurteilung der Verformung. Maßstabsbalken = 800 μm. (G) Voxelweises Gehirnmapping zur Beurteilung von Volumenänderungen zwischen Lichtblattbild und MR-Bild, wobei Blau und Rot Schrumpfung bzw. Expansion vom MR-Bild zum Lichtblattbild anzeigen. Insgesamt gab es einen Volumenverlust von 60%, aber einige Regionen wie der Isokortex zeigten im Vergleich zu anderen eine stärkere Schrumpfung. (H) Linkes Bild: Axiale Ansicht des MRT-Bildes mit registrierten Segmentierungen aus dem Allen Developmental Brain Atlas überlagert. Rechtes Feld: 3D-Volumendarstellung der Segmentierung. Maßstabsbalken = 800 μm. Abkürzungen: OB = Riechkolben; Dpall = dorsales Pallium/Isocortex; Mb = Mittelhirn; Cb = Kleinhirn. Ausrichtung: R = Rostral; L = seitlich; D = Dorsal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Bilder mit zellulärer Auflösung und Kanalausrichtung. (A) Optischer axialer Schnitt der TO-PRO-3 (TP3) Kernfärbung und Immunmarkierung für Ctip2 (untere Schichtneuron) und Brn2 (obere Schicht Neuron) Marker im P4-Mausgehirn. Maßstabsbalken = 1 mm. (B) Vergrößerter Einschub kortikaler Bereiche in A (Kasten) mit korrekter Kanalausrichtung mit erwarteter Lokalisation von Brn2-immunmarkierten oberen Schicht- und Ctip2-immunmarkierten unteren Schichtneuronen. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Beispiele für Bild-Stitching . (A) Beispielergebnisse aus einem iterativen, korrekt zusammengefügten 2D-Bild. Maßstabsbalken = 1 mm. Einfügen zeigt ein Beispiel für korrektes Zusammenfügen beim Vergrößern. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Beispielergebnisse aus einem iterativen, falsch zusammengefügten 2D-Bild. Maßstabsbalken = 1 mm. Einfügen zeigt ein Beispiel für falsches Stitching beim Vergrößern (Überhang). Maßstabsbalken = 100 μm. (C) Stichprobenergebnisse aus einem iterativen 2D-Bild, das falsch zusammengefügt wurde. Maßstabsbalken = 1 mm. Einfügen zeigt ein Beispiel für falsches Stitching beim Vergrößern (unscharf). Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Niedrig aufgelöste Bildregistrierung, hochauflösende Zellkernerkennung und Zellzählung im P4-Mausgehirn. (A) Linkes Bild: Ein Beispiel für einen Z-Slice aus 3D-Bildern des gesamten Gehirns, die auf eine isotrope Auflösung von 25 μm umgesampelt wurden. Maßstabsbalken = 1 mm. Mittleres Bild: Anmerkungen aus dem Allen Developmental Brain Atlas (P4), registriert für das Mikroskopiebild. Maßstabsbalken = 1 mm. Rechtes Feld: Überlagerung des linken und mittleren Feldes. Maßstabsbalken = 1 mm. (B) Beispiel für ein intensitätsangepasstes zusammengefügtes Bild in axialer Ansicht. Der eingerahmte Bereich wird in (C) angezeigt. Maßstabsbalken = 1 mm. (C) Automatische Detektion von Kernen (rot). Maßstabsbalken = 50 μm. (D) Quantifizierung von Zelltypen in verschiedenen Hirnregionen des P4-Gehirns (Basalganglien, Hippocampus-Allocortex und Isocortex). Rot = Neuronen der oberen Schicht, die mit Brn2 markiert sind, Grün = Neuronen der unteren Schicht, die mit Ctip2 markiert sind, und Blau = alle Kerne, die mit To-Pro-3-Farbstoff markiert sind. Abkürzungen: DPall = Dorsales Pallium (Isocortex); MPall = Mediales Pallium (Allokortex des Hippocampus); CSPall = Zentrales Subpallium (klassische Basalganglien). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

NuMorph-Analysestufe	Geschätzte Zeit
Intensitätsanpassung	1 Std.
Kanalausrichtung	2 Minuten
Iteratives 2D-Stitching	12 Uhr
Resampling	3 Minuten
Registrierung	3 Minuten
Zellzählung	5 Std.
Zellklassifikation	10 Minuten

Tabelle 1: NuMorph-Analysezeiten.

Discussion

Gewebereinigungsmethoden sind nützliche Techniken zur Messung der 3D-Zellorganisation des Gehirns. Es gibt eine Vielzahl von Gewebereinigungsmethoden, die in der Literatur beschrieben sind, jede mit ihren Vorteilen und Einschränkungen 6,7,8,9. Die Möglichkeiten für Computerwerkzeuge zur Analyse der Zelltypen in den gewebebereinigten Bildern sind relativ begrenzt. Andere verfügbare Werkzeuge wurden implementiert, um Zellpopulationen zu spärlichen, in denen die Segmentierung weniger schwierig ist ^10,35 oder haben die Gewebeexpansion¹⁶ genutzt. Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung eines Mausgehirns für die Bildgebung mit iDISCO+ Tissue Clearing und demonstriert NuMorph, eine computergestützte Pipeline zur Verarbeitung und Quantifizierung von Kernen innerhalb von Strukturen eines Mauskortex, die von LSFM erfasst werden. Es wurde entwickelt, um ein angemessenes Gleichgewicht zwischen der Länge der Bildgebungszeit, der Erkennungsgenauigkeit von Zellkernen und den Rechenressourcen zu finden. Diese Pipeline steht im Gegensatz zu anderen derzeit verfügbaren Werkzeugen, indem sie zuverlässig alle Kerne segmentiert, anstatt spärliche Populationen markierter Zellen 10,36,37. Wir haben bereits gezeigt, dass die Genauigkeit der Zelldetektion hoch ist, mit signifikant kürzeren Bildgebungszeiten und stark reduzierten erfassten Datengrößen für die Erfassung der gesamten Hemisphäre im Vergleich zu anderen Methoden¹⁹. NuMorph adressiert eine Reihe wichtiger Herausforderungen bei der Analyse von Mehrkanal-Lichtblattbildern, wie z.B. die Bereitstellung von Werkzeugen für die Kanalausrichtung, die Korrektur von Bühnenbewegungen mit einem Stitching-Tool und die Korrektur der Signalhelligkeit in den Bildkacheln. Der in diesem Papier vorgestellte Workflow ist für die breitere wissenschaftliche Gemeinschaft nützlich und für alle Gruppen in Forschungseinrichtungen zugänglich. Eine Übersicht über den Prozess ist in Abbildung 1 zu sehen.

Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Prozess, von der Mausperfusion bis zur Computeranalyse, die sich auf die nachgelagerte Bildqualität, Quantifizierung und Ergebnisse auswirken können. Es ist wichtig, dass die Perfusion so durchgeführt wird, dass das gesamte Blut aus dem Gehirn entfernt wird, da die Blutgefäße eine natürliche Autofluoreszenz haben, die die Intensität in den Bildern beeinflusst und Anpassungen in der Pipeline erfordert, was sich nachteilig auf die Ergebnisse auswirkt. Die Dauer der PFA-Fixierung ist ebenfalls entscheidend, da das Untertauchen des Gehirns in 4% PFA länger als 24 Stunden zu einer "Überfixierung" der Probe und zu einem Riss des Gehirns führen kann, das während des iDISCO+-Prozesses spröde wird. Das oben beschriebene iDISCO-Protokoll wurde gegenüber dem offiziellen Protokoll auf der Website²⁴ leicht modifiziert. Eine wichtige Änderung ist die Hinzufügung von PBS zur Methanol/PBS-Serie anstelle von Wasser im ursprünglichen Protokoll. Dies soll kortikale Risse in den embryonalen und frühen postnatalen Gehirnen verhindern, die wahrscheinlich aufgrund der unvollständigen Entwicklung von Gliazellen, axonalen Projektionen und extrazellulärer Matrix auftreten. Abhängig von dem in diesem Protokoll verwendeten Gewebe müssen möglicherweise bei jedem Schritt des iDISCO+-Protokolls Änderungen vorgenommen werden, z. B. die Änderung der Antikörperkonzentrationen und die Erhöhung der Inkubationszeiten größerer Gewebeproben, um die idealen Parameter zu optimieren, um den Marker der Wahl zu erfassen und genau zu analysieren.

Es ist bekannt, dass während des iDISCO+-Gewebereinigungsprozesses eine Gewebeschrumpfung auftritt, die dann die volumetrischen Messungen stromabwärts ^6,10 verändern kann. Alternative Methoden, wie MRT, die vor der Gewebereinigung durchgeführt wird, können verwendet werden, um das Ausmaß einer Veränderung der Gewebegröße bei Kontrollen im Vergleich zu Versuchstieren zu bestimmen, um festzustellen, ob volumetrische Unterschiede auf den untersuchten Phänotyp und nicht auf den Gewebereinigungsprozess zurückzuführen sind. Heterogene Veränderungen in den Volumina der kortikalen Regionen der Mutanten können sich je nach regionalem Zellgehalt unterscheiden, da die graue und weiße Substanz des Gehirns durch die Methanoldehydratation unterschiedlich beeinflusst werden kann. Die MRT-Daten können verwendet werden, um festzustellen, ob die Gewebeschrumpfung in den Subregionen des Gehirns ungleichmäßig ist (Abbildung 2G), und alle Änderungen, die durch das Clearing-Protokoll entstehen, können in der nachgeschalteten Computeranalyse angepasst werden. Darüber hinaus verwendet das iDISCO+-Verfahren aggressive Methanolwäschen, um die Probe zu dehydrieren, was zu Schäden oder Veränderungen bestimmter Antigene auf den Kernoberflächen führen kann. Es wird empfohlen, alle verwendeten Antikörper zuerst an Hirngewebeschnitten zu testen, die ~3 h in 100% Methanol gewaschen wurden, um sicherzustellen, dass der Antikörper mit dem iDISCO+-Protokoll kompatibel ist.

Für große Datensätze, die lange Verarbeitungszeiten erfordern, empfehlen wir die Verwendung der No-Window-Version von MATLAB unter Linux, die Strategien wie die Implementierung des Befehls "nohup" ermöglicht, der einen Prozess auch nach dem Verlust der Verbindung zu einem Server weiter ausführt. Darüber hinaus benötigt NuMorph eine hohe Rechenleistung, daher empfehlen wir mindestens 10 GB Speicher für Analysen. Wir analysieren die Beispiele mit einer Linux-Workstation mit CentOS 7, die mit einem 2,6-GHz-14-Core-Prozessor, 8 x 64 GB DDR4 2400 LRDIMM-Speicher, 4 x 11 GB GPUs und 2 x 4 TB externen SSDs ausgestattet ist. Die hier verwendeten Lichtblattrohdaten betrugen 620 GB und der Speicherbedarf für die Prozesse 10 GB. Hier haben wir eine Tabelle mit den geschätzten Zeiten für den Abschluss der einzelnen Schritte der NuMorph-Analysen eingefügt, wie in Tabelle 1 dargestellt.

Die Bildvorverarbeitungsschritte umfassen die Intensitätsanpassung in der XY-Dimension für jede Z-Ebene, Kanalausrichtung und Stitching. Die Bildintensität wird angepasst, um Intensitätsunterschiede zwischen Kacheln und ungleichmäßige Beleuchtung entlang der y-Dimension zu berücksichtigen. Der Intensitätsunterschied tritt aufgrund der inhärenten technischen Eigenschaften des Lichtblatts auf, wenn es zwischen Kacheln²⁵ abbildet. Als Nächstes wird die Kanalausrichtung durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Bildkanäle in einer Mehrkanalbildgebung korrekt ausgerichtet werden. Dieser Schritt wird empfohlen, da jeder Kanal in der Mehrkanalbildgebung einzeln erfasst wird und subtile Bewegungen des Tisches Probendriften verursachen und zu räumlichen Fehlausrichtungen führen können¹⁹. Schließlich werden die Kacheln pro z-Ebene zusammengefügt, um in jeder z-Ebene ein einzelnes Bild zu bilden. Am Ende wird es einen Stapel von zusammengefügten Bildern pro Kanal geben, die das gesamte Volumen der Probe darstellen. Das iterative Bild-Stitching basiert auf einer benutzerdefinierten Methode, um alle 2D-Bilder pro Kanal in einem 3D-Volumen des^{Beispiels 19} zu organisieren. Die Methode implementiert zunächst eine paarweise z-Korrespondenz in axialer Richtung, um Kachelbereiche abzugleichen, die sich sowohl in horizontaler als auch in vertikaler Richtung überlappen. Die endgültige z-Verschiebung jeder Kachel wird anhand des minimalen Spannbaums³⁸ bestimmt. Das iterative 2D-Stitching wird in einem Stapel durchgeführt, der an einer Stelle in der Mitte des Stapels mit weniger Hintergrundsignal beginnt. Die obere linke Kachel wird bei jeder Stitching-Iteration an erster Stelle platziert, um eine subtile Verschiebung von Bildern in der z-Dimension zu verhindern.

Es wird empfohlen, jede der Vorverarbeitungspipelines sequenziell auszuführen, insbesondere bei der Optimierung zur Korrektur von Fehlern. Die Hauptprobleme treten oft während der Nähschritte auf. Ein Problem, das auftreten kann, ist die falsche Bildaufnahme auf dem Lichtblatt. Dieses Problem kann auftreten, wenn die horizontale dynamische Fokussierung auf dem Lichtblatt falsch eingestellt ist, und kann zu wechselnden phasen- und phasenverschobenen Mustern in den Bildern führen (Abbildung 4B, C). Zusätzliche Fehler können auftreten, wenn die Probe nicht fest gesichert war und während der Entnahme eine signifikante Probenbewegung auftrat. In diesen Fällen ist ein genaues Stitching möglicherweise nicht möglich, da keine paarweise Übereinstimmung zwischen benachbarten Kacheln vorhanden ist. Andere potenzielle Fehler können von der Stichstartseite herrühren. NuMorph bestimmt die Stichstartstelle ungefähr in der Mitte des Stapels. Wenn jedoch ein signifikanter Hintergrund in der Start-Slice-Site vorhanden ist, können Fehler im paarweisen Vergleich in Bildkacheln auftreten. Hier empfiehlt es sich, einen Startort zu wählen, der ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist.

Die hier beschriebene Bildanalyse umfasst das Bild-Resampling von zusammengefügten Bildern von hoher Auflösung (0,75 x 0,75 x 4 μm³/Voxel) bis zu einer niedrigeren isotropen Auflösung von 25 μm³/Voxel. Wir sampeln die zusammengefügten Bilder aus dem Kernkanal neu, um die zusammengefügten Bilder im nächsten Schritt³⁴ im Allen Developmental Mouse Brain Atlas zu registrieren. Die Zellen werden dann für jeden Kanal in annotierten Regionen der Bilder in Bezug auf den Atlas mit hoher Auflösung (0,75 x 0,75 x 4 μm³/Voxel) unter Verwendung eines trainierten 3D-Unet-Modells¹⁹ gezählt. Diese Methode kann auch zum Erkennen und Zählen von Blobobjekten verwendet werden. Bei der Entwicklung von NuMorph testeten wir die Segmentierungsgenauigkeit im Vergleich zu völlig neuen Bildern, die noch nie während des Trainings zu sehen waren und aus dem gleichen Gewebereinigungsverfahren, demselben Mikroskop und der gleichen nuklearen Markierungsgenauigkeit von 0,99 und einem Abruf von 0,94¹⁹ stammten. Die Genauigkeit von NuMorph wurde noch nicht an verschiedenen Gewebereinigungsverfahren, Mikroskopen oder Markern getestet. Daher ist die Genauigkeit der Segmentierung in anderen experimentellen Designs unbekannt. Der Standardatlas in NM_setup.m ist der erwachsene Nissl-gefärbte Allen Reference Atlas³⁹ mit der dritten Iteration von Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework (CCFv3) als benutzerdefinierte Anmerkung.

Obwohl NuMorph effektiv Gewebe analysiert, die vergleichsweise dicht sind, wie der erwachsene Mauskortex, können anspruchsvollere experimentelle Designs (wie embryonale Mäusegehirne oder hochdichte Strukturen wie das Kleinhirn) die Entwicklung zusätzlicher Rechenwerkzeuge erfordern. Aktuelle Community-basierte Bemühungen versuchen, angemessene Annotationsdaten für das Training von Deep-Learning-Modellen zu erstellen, die zur Segmentierung dieser schwierigeren Fälle verwendet werden⁴⁰. Fortschritte in Light-Sheet-Imaging-Technologien ermöglichen eine quantitative Untersuchung subzellulärer Strukturen mit hohem Durchsatz, wobei neue Ansätze wie die Dual-View-Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM) zu einer erhöhten Auflösung und Genauigkeit in zelldichten Hirnregionen führen^40,41. Da sich die Fortschritte bei der Gewebereinigung, Bildgebung und Computerwerkzeugen, die an dieser Forschung beteiligt sind, weiterentwickeln, hoffen wir, dass sie zu einer breiteren Nutzung von Gewebereinigungsmethoden für quantitative Analysen darüber führen werden, wie neuropsychiatrische Störungen von Veränderungen in der Gehirnstruktur herrühren können, die durch genetische oder umweltbedingte Risikofaktoren induziert werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)