Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تصوير خلية واحدة للدماغ بالكامل وتحليل أدمغة الفئران حديثي الولادة السليمة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي ومسح الأنسجة والفحص المجهري للورقة الضوئية

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول طرق إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي ، والتطهير ، ووضع العلامات المناعية لأدمغة الفئران السليمة باستخدام iDISCO + ، متبوعا بوصف تفصيلي للتصوير باستخدام الفحص المجهري للورقة الضوئية ، والتحليلات النهائية باستخدام NuMorph.

Abstract

تتيح إزالة الأنسجة متبوعة بالفحص المجهري للصفائح الضوئية (LSFM) التصوير الخلوي الدقيق لبنية الدماغ السليمة ، مما يسمح بالتحليل الكمي للتغيرات الهيكلية الناجمة عن الاضطرابات الجينية أو البيئية. ينتج عن تصوير الدماغ بالكامل تقدير كمي أكثر دقة للخلايا ودراسة الاختلافات الخاصة بالمنطقة التي قد يتم تفويتها باستخدام الفحص المجهري الشائع الاستخدام للأنسجة المقسمة جسديا. إن استخدام الفحص المجهري للورقة الضوئية لتصوير الأدمغة التي تم تطهيرها يزيد بشكل كبير من سرعة الاكتساب مقارنة بالفحص المجهري متحد البؤر. على الرغم من أن هذه الصور تنتج كميات كبيرة جدا من البيانات الهيكلية للدماغ ، إلا أن معظم الأدوات الحسابية التي تؤدي ميزة القياس الكمي في صور الأنسجة التي تم تطهيرها تقتصر على حساب مجموعات الخلايا المتناثرة ، بدلا من جميع النوى.

هنا ، نوضح NuMorph (قياس التشكل القائم على النواة) ، وهي مجموعة من أدوات التحليل ، لتحديد جميع النوى والعلامات النووية داخل المناطق المشروحة لدماغ فأر ما بعد الولادة في اليوم الرابع (P4) بعد التطهير والتصوير على مجهر ورقة ضوئية. نحن نصف التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لقياس حجم الدماغ قبل الانكماش الناجم عن خطوات الجفاف لإزالة الأنسجة ، وتطهير الأنسجة باستخدام طريقة iDISCO + ، بما في ذلك وضع العلامات المناعية ، متبوعا بالفحص المجهري للورقة الضوئية باستخدام منصة متاحة تجاريا لتصوير أدمغة الفئران بدقة خلوية. ثم نوضح خط أنابيب تحليل الصور هذا باستخدام NuMorph ، والذي يستخدم لتصحيح اختلافات الكثافة ، ودمج مربعات الصور ، ومحاذاة قنوات متعددة ، وعد النوى ، والتعليق على مناطق الدماغ من خلال التسجيل في الأطالس المتاحة للجمهور.

لقد صممنا هذا النهج باستخدام البروتوكولات والبرامج المتاحة للجمهور ، مما يسمح لأي باحث لديه المجهر والموارد الحسابية اللازمة لأداء هذه التقنيات. تسمح أدوات إزالة الأنسجة والتصوير والحساب هذه بقياس وقياس التنظيم ثلاثي الأبعاد (3D) لأنواع الخلايا في القشرة ويجب أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع على أي تصميم لدراسة الفئران من النوع البري / بالضربة القاضية.

Introduction

يعد تصوير الدماغ بالكامل بدقة خلية واحدة تحديا مهما في علم الأعصاب. تسمح صور الدماغ ذات الدقة الخلوية بإجراء تحليل مفصل ورسم خرائط على مستوى النظام لدوائر الدماغ وكيف تتعطل هذه الدوائر بسبب عوامل الخطر الوراثية أو البيئية للاضطرابات العصبية والنفسية ، والسلوك الخلوي في الأجنة النامية ، وكذلك الدوائر العصبية في الدماغ البالغ1،2،3. هناك العديد من الأساليب النسيجية التي تسمح لصور عالية الدقة من الدماغ 3D إعادة بنائها. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنيات معدات متخصصة باهظة الثمن ، وقد لا تكون متوافقة مع وضع العلامات المناعية ، وقد تؤدي الطبيعة ثنائية الأبعاد (2D) لبعض الطرق إلى تلف الأنسجة والقص أثناء التقسيم 4,5.

قدمت التطورات الحديثة نهجا بديلا لتصوير أدمغة كاملة لا تتطلب تقسيم الأنسجة. أنها تنطوي على استخدام إزالة الأنسجة لجعل الأدمغة شفافة. يتم تحقيق الشفافية في معظم طرق إزالة الأنسجة عن طريق إزالة الدهون ، لأنها مصدر رئيسي لتشتت الضوء ، ومطابقة معامل الانكسار (RI) للكائن مع RI لمحلول غمر العينة أثناء التصوير. يمكن للضوء بعد ذلك المرور عبر الحدود بين المواد دون أن يتشتت6،7،8،9.

غالبا ما يتم دمج طرق إزالة الأنسجة ، مثل iDISCO + ، مع التصوير السريع ثلاثي الأبعاد باستخدام الفحص المجهري لإثارة الفوتون الواحد ، مثل LSFM6،7،10. داخل الأنسجة الشفافة الموسومة بفلوروفور ، يقوم المجهر الفلوري ذو الورقة الضوئية بأقسام الإثارة بمستوى رفيع من الضوء11. الميزة الرئيسية ل LSFM هي أن قسما بصريا واحدا يضيء في كل مرة ، مع إثارة كل التألق من الجزيئات داخل هذا القسم ، مما يقلل من التبييض الضوئي. علاوة على ذلك ، يتيح تصوير شريحة بصرية كاملة الكشف المستند إلى الكاميرا عن تلك الشريحة المثيرة ، مما يزيد من السرعة بالنسبة لمسح النقاط12. تنتج LSFM بشكل غير مدمر أقساما بصرية مسجلة جيدا ومناسبة لإعادة بناء 3D.

بينما تسمح طريقة iDISCO + بإزالة الأنسجة غير المكلفة في غضون ~ 3 أسابيع ، قد تؤدي خطوات الجفاف داخل البروتوكول إلى انكماش الأنسجة والتغيير المحتمل في مورفولوجيا العينة ، مما يؤثر على القياسات الحجمية6،10. يمكن أن تؤدي إضافة طريقة تصوير ثانوية ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي ، لاستخدامها قبل إجراء إزالة الأنسجة إلى قياس درجة الانكماش الناجم عن إزالة الأنسجة عبر العينة. أثناء خطوات الجفاف ، قد تؤدي الاختلافات في الخواص الميكانيكية بين المادة الرمادية والبيضاء إلى تشوهات غير منتظمة في مادة الدماغ ، مما يؤدي إلى تشوهات حجم غير متشابهة ناتجة عن إزالة الأنسجة بين العينات البرية والمتحولة وقد تربك تفسيرات الاختلافات الحجمية في هذه العينات10,13 . يتم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي عن طريق أولا بتزويد الحيوان بعامل تباين (على سبيل المثال ، الجادولينيوم) ، يليه احتضان الأنسجة المستخرجة ذات الأهمية في محلول غمر (على سبيل المثال ، فومبلين) قبل التصوير14. التصوير بالرنين المغناطيسي متوافق مع إزالة الأنسجة وإجراء LSFM على نفس العينة.

غالبا ما يستخدم LSFM لإنشاء صور مجهرية واسعة النطاق للتصور النوعي لأنسجة المخ محل الاهتمام بدلا من التقييم الكمي لبنية الدماغ (الشكل 1). بدون التقييم الكمي ، من الصعب إثبات الاختلافات الهيكلية الناتجة عن الإهانات الجينية أو البيئية. مع تحسن تقنيات إزالة الأنسجة والتصوير ، إلى جانب انخفاض تكاليف التخزين وقوة الحوسبة ، أصبح تحديد توطين نوع الخلية داخل الأنسجة ذات الاهتمام أكثر سهولة ، مما يسمح لمزيد من الباحثين بتضمين هذه البيانات في دراساتهم.

مع وجود أكثر من 100 مليون خلية في دماغ الفأر15 وجلسات تصوير الدماغ بالكامل التي يمكن أن تولد تيرابايت من البيانات ، هناك طلب متزايد على أدوات تحليل الصور المتقدمة التي تسمح بالقياس الكمي الدقيق للميزات داخل الصور ، مثل الخلايا. توجد مجموعة من طرق التجزئة للصور التي تم تطهيرها من الأنسجة والتي تطبق عتبة لكثافة التلوين النووي وتصفية الكائنات ذات الأشكال أو الأحجام أو الكثافات المحددة مسبقا10،16،17،18. ومع ذلك ، يمكن أن تنشأ التفسيرات غير الدقيقة للنتائج من الاختلافات في المعلمات مثل حجم الخلية وتباين الصورة وكثافة وضع العلامات. تصف هذه الورقة بروتوكولنا المعمول به لتحديد نوى الخلية في دماغ الفأر. أولا ، نقوم بتفصيل خطوات جمع الأنسجة لدماغ الفأر P4 ، متبوعا ببروتوكول إزالة الأنسجة ووضع العلامات المناعية المحسن من طريقة iDISCO +المتاحة للجمهور 10. ثانيا ، نصف الحصول على الصور باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي والفحص المجهري للورقة الضوئية ، بما في ذلك المعلمات المستخدمة لالتقاط الصور. أخيرا ، وصفنا وأوضحنا NuMorph19 ، وهي مجموعة من أدوات تحليل الصور التي طورتها مجموعتنا والتي تسمح بالقياس الكمي المحدد لنوع الخلية بعد إزالة الأنسجة ، ووضع العلامات المناعية باستخدام العلامات النووية ، وتصوير الورقة الضوئية للمناطق المشروحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استخدام جميع الفئران وفقا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل.

1. تشريح الماوس والتروية

ملاحظة: تم إجراء التشريح التالي على الفئران P4 و P14 باستخدام حقنة. يختلف حجم سائل التروية حسب عمر الحيوان.

  1. التروية
    تنبيه: بارافورمالدهيد (PFA) مادة كيميائية خطرة. نفذ جميع خطوات التروية في غطاء دخان كيميائي.
    1. قبل الجراحة، يتم تطبيق بنتوباربيتال عن طريق الحقن داخل الصفاق (100 ملغ/كغ) والسماح للمخدر بأن يصبح ساري المفعول.
    2. بمجرد وصول الحيوان إلى مستوى التخدير الجراحي ، استخدم طريقة استجابة إصبع القدم لتأكيد عدم الاستجابة.
    3. قم بعمل شق جانبي أسفل القفص الصدري لكشف التجويف الصدري للحيوان.
    4. باستخدام مقص جراحي منحني ، قم بقطع القفص الصدري بعناية حتى الترقوة على جانب واحد من الحيوان وقم بعمل قطع مماثل على الجانب الآخر ، مما يسمح برفع القص بعيدا ، مما يعرض القلب.
    5. دون الإضرار بالشريان الأورطي النازل، قم بقص أي نسيج متصل بالقلب بعناية قبل إجراء شق صغير في الأذين الأيمن للسماح للدم بالتدفق خارج الأوعية الدموية.
    6. باستخدام طريقة قائمة على المحاقن ، قم بتمرير الماوس عبر البطين الأيسر ب 10 مل و 7 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ل P14 و P4 ، على التوالي ، بمعدل تروية يبلغ 1.5 مل / دقيقة عبر النظام.
    7. بمجرد مسح الدم ، استخدم مرة أخرى 10 مل من PBS + 4٪ PFA و 7 مل من PBS + 4٪ PFA ل P14 و P4 ، على التوالي ، عند 4 درجات مئوية بمعدل تروية 1.5 مل / دقيقة لإصلاح الحيوان.
      ملاحظة: سيتم ملاحظة هزات التثبيت ، وسيكون الحيوان قاسيا عند الانتهاء. في حالة استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي على العينات ، قم بأداء أحجام مماثلة من PBS و PFA لكل نقطة زمنية + 20٪ عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي القائم على الجادولينيوم في محلول PFA.
    8. قم بإزالة الرأس باستخدام مقص جراحي وإسقاط الإصلاح باستخدام PBS + 4٪ PFA لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية للتثبيت الكامل.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يظل الدماغ سليما مع الجمجمة (انظر القسم 2). نقطة التوقف: يمكن تخزين الأدمغة لعدة أشهر في هذه المرحلة في PBS + 0.1٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.

2. تصوير بنية الدماغ الإجمالية القائمة على التصوير بالرنين المغناطيسي مع الجمجمة السليمة والتحليل

ملاحظة: يجب أن يكون الدماغ متخللا ومحتضنا في الجادولينيوم كما هو موضح أعلاه دون إزالته من الجمجمة. يحدث كل التصوير بالرنين المغناطيسي قبل إزالة الدماغ من الجمجمة لتجنب فقدان الأنسجة غير المقصود أثناء التشريح. يوفر التصوير باستخدام جمجمة سليمة أيضا دعما للدماغ في حامل العينة (أي المحقنة) أثناء تحضير العينة والتصوير.

  1. إعداد العينة
    ملاحظة: تم تحسين الخطوات التالية لعينات دماغ الماوس P4 و P14. يعتمد حجم المحقنة المطلوب على الحجم المادي للعينة.
    1. في حالة إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي على العينة ، قم بإزالة الجلد من الجمجمة واحتضان في PBS + 3٪ جادولينيوم لمدة 23 يوما عند 4 درجات مئوية قبل التصوير14. بعد 23 يوما ، شطف العينات بسرعة في PBS.
    2. استخدم محاقن سعة 5 مل لإنشاء حامل عينة للتصوير بالرنين المغناطيسي ، باستخدام مكابس المحاقن لإغلاق كل طرف من طرفي الحامل المصنوع من المحقنة20. استخدم قطعا بلاستيكية لتثبيت الجمجمة بإحكام في مكانها في الحامل (الشكل 2 أ). قم بإزالة العلامات الموجودة على المحقنة بالإيثانول لمنع القطع الأثرية عند التصوير.
    3. ضع الجمجمة بإحكام في حامل العينة واملأها بمحلول غمر متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي (انظر جدول المواد). أغلق الحامل وأزل جميع فقاعات الهواء باستخدام حقنة.
      ملاحظة: نقطة التوقف: قد يتم تخزين الجمجمة في محلول الغمر لعدة أشهر قبل التصوير.
  2. تصوير بنية الدماغ الإجمالية (MRI)
    1. تصوير العينات باستخدام نظام التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات أفقيا 9.4 طن / 30 سم باستخدام ملف حجم 15 مم وتسلسل قائم على صدى الدوران مع المعلمات التالية: الاستبانة المكانية: 60 ميكرومتر × 60 ميكرومتر × 60 ميكرومتر ؛ إجمالي وقت المسح: 7 ساعات و 12 دقيقة ؛ وقت الصدى (TE): 6.83 مللي ثانية ؛ وقت التكرار (TR): 40 مللي ثانية ؛ زوايا الإثارة / إعادة التركيز: 90/180 درجة ؛ حجم الصورة:166 × 168 × 209 فوكسلز ؛ مجال الرؤية (FOV): 9.9 مم × 10.1 مم × 12.4 مم ؛ عرض النطاق الترددي: 100000 كيلو هرتز.
  3. تحليل بنية الدماغ الإجمالية الحسابية
    1. قم بإزالة الجمجمة المحيطة من صور التصوير بالرنين المغناطيسي الخام عن طريق تتبع دماغ الفأر يدويا باستخدام برنامج التجزئة. بعد ذلك ، قم بتطبيق عملية الضرب الحكيمة بين صورة القناع وصورة التصوير بالرنين المغناطيسي الخام لتوليد صورة التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ المجردة من الجمجمة.
      ملاحظة: الإخراج عبارة عن صورة قناع ثنائي حيث يتم ضبط شدة فوكسل الدماغ على 1 و 0 بخلاف ذلك.
    2. قم بتطبيق تسجيل الصورة الجامدة (تقدير الترجمة والتدوير فقط) باستخدام "المغازلة" في حزمة FSL21,22 لمحاذاة صورة التصوير بالرنين المغناطيسي المجردة من الجمجمة (الصورة المتحركة) مع صورة الفحص المجهري المقابلة للورقة الضوئية (الصورة المرجعية).
    3. قم بتطبيق التسجيل غير الجامد (باستخدام "SyN" في برنامج ANTS23) للعثور على المراسلات من نقطة إلى نقطة بين صورة التصوير بالرنين المغناطيسي المحاذية الصلبة في الخطوة 2.3.2 إلى صورة الورقة الخفيفة (نفس الصورة المرجعية في الخطوة 2.3.2).
      ملاحظة: يتضمن الإخراج صورة التصوير بالرنين المغناطيسي المشوهة ومجال التشوه المرتبط بتغيرات الحجم من التصوير بالرنين المغناطيسي إلى صور الورقة الخفيفة.
    4. احسب محدد Jacobian في حقل التشوه الذي تم إنشاؤه في الخطوة 2.3.3 ، والذي يحدد مقدار تغير الحجم في حي محلي 3 × 3 × 3 voxel.
    5. قم بمحاذاة الصور المجردة من الجمجمة مع أطلس دماغ الفأر التنموي من ألين باستخدام تسجيل الصور المشوهة.
      ملاحظة: تسمح المراسلات المكانية الثابتة من نقطة إلى نقطة بالتعليق التلقائي على مناطق الدماغ ذات الأهمية في صورة الماوس الجديدة (الشكل 2C-H).

3. تشريح الدماغ من الجمجمة

  1. قم بعمل شق في خط الوسط على طول الجزء العلوي من الجمجمة من الرقبة إلى الأنف لكشف الجمجمة.
  2. كشف قاعدة الجمجمة عن طريق تقليم عضلة الرقبة المتبقية وجميع العضلات المتبقية الأخرى.
  3. باستخدام مقص جراحي حاد ، يتم قصه بعناية على طول السطح الداخلي للجمجمة ، مع الحرص على عدم إتلاف الدماغ من خلال الحفاظ على ضغط تصاعدي لطيف أثناء القطع باستخدام المعدات الجراحية الحادة.
  4. استخدم الملقط لتقشير نصفي الجمجمة المقطوعين بعيدا عن الدماغ وتقليم الدهون الزائدة المرتبطة بالدماغ بعناية.
  5. استخدم مقصا جراحيا لتقليم أي جافية تربط الدماغ بالجمجمة ، ثم استخدم ملعقة لإزالة الدماغ برفق من الرأس.
  6. قم بإزالة الدماغ ، واغسله باستخدام PBS ، ثم قم بالتبديل إلى PBS مع 0.1٪ أزيد الصوديوم واحتفظ به عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأجل.

4. تطهير الأنسجة

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من بروتوكول iDISCO + لفئران P46 ، مع تغييرات طفيفة. قد تتغير بعض التفاصيل لنقاط زمنية / أنواع / تجارب مختلفة). تنبيه: الميثانول وثنائي كلورو الميثان (DCM) وثنائي بنزيل الأثير (DBE) هي مواد كيميائية خطرة. يتم تنفيذ خطوات إزالة الأنسجة هذه في غطاء دخان كيميائي.

  1. التحقق من صحة الأجسام المضادة
    ملاحظة: يجب التحقق من توافق الميثانول للأجسام المضادة غير المختبرة لأنها قد تتأثر سلبا بغسل الميثانول القاسي المطلوب في بروتوكول iDISCO +. للحصول على قائمة بالأجسام المضادة التي ثبت أنها تعمل في iDISCO+ ، راجع موقع الويب24.
    1. حصاد 10 ميكرومتر من المقاطع المجمدة من الأنسجة الثابتة PFA ذات الأهمية على شرائح مجسمة.
    2. احتضان الأقسام في الميثانول 100 ٪ لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
    3. أعد الترطيب في برنامج تلفزيوني قبل الشروع في بروتوكولات الكيمياء المناعية القياسية لتحديد ما إذا كان الجسم المضاد يظهر النمط المتوقع من التألق بعد غسل الميثانول. للتحكم الإيجابي ، استخدم شريحة غير معالجة بالميثانول.
  2. إعداد العازلة
    1. قم بإعداد المخازن المؤقتة وفقا لبروتوكول iDISCO الرسمي. راجع جدول المواد لمعرفة تكوين المخازن المؤقتة والحلول الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول.
  3. المعالجه المسبقه
    1. جفف العينة بسلسلة الميثانول / برنامج تلفزيوني: 20٪ ، 40٪ ، 60٪ ، 80٪ ، 100٪ ؛ 1 ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يساعد استخدام PBS أثناء الجفاف على منع تكسير العينات في غسل الميثانول.
    2. اغسل العينة في ميثانول 100٪ لمدة 1 ساعة ، ثم تبرد عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة قبل الحضانة طوال الليل مع رج 66٪ DCM / 33٪ ميثانول في درجة حرارة الغرفة.
    3. اغسل العينة 2x في ميثانول 100٪ في درجة حرارة الغرفة ، ثم بردها عند 4 درجات مئوية.
    4. استخدم 5٪ H 2 O2الطازج في الميثانول لتبييض العينة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    5. إعادة ترطيب العينة بسلسلة الميثانول / PBS: 80٪ ، 60٪ ، 40٪ ، 20٪ ، PBS ؛ 1 ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة ويغسل 2x لمدة 1 ساعة في PTx.2 في درجة حرارة الغرفة.
    6. احتضان العينة في 1x PBS / 0.2٪ TritonX-100 / 20٪ DMSO عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    7. احتضان العينة في 1x PBS / 0.1٪ Tween-20 / 0.1٪ TritonX-100 / 0.1٪ Deoxycholate / 0.1٪ NP40 / 20٪ DMSO عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    8. يغسل في PTx.2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مرتين.
  4. وضع العلامات المناعية
    1. احتضان العينات في محلول النفاذية عند 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام (~ 48 ساعة).
    2. كتلة العينات في حجب الحل في 37 °C لمدة 2 أيام (~ 48 ساعة).
    3. احتضان العينات بجسم مضاد أولي في PTwH / 5٪ DMSO / مصل 3٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام (~ 96 ساعة) (على سبيل المثال ، أرنب (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1: 100) وجسم مضاد لفئران Ctip2 (Rt) (1: 400) (جدول المواد).
    4. اغسل 3 × 1 ساعة في PTwH. اغسل لمدة 2 ساعة أخرى في PTwH. اتركيه في محلول الغسيل طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
    5. احتضان العينات بجسم مضاد ثانوي وصبغة نووية ، مثل TO-PRO-3 ، في مصل PTwH / 3٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام (~ 96 ساعة ؛ على سبيل المثال ، الماعز المضاد Rb (1:50) و (الماعز anti-Rt (1: 200)) (جدول المواد).
    6. اغسل 3 × 1 ساعة في PTwH اغسل لمدة 2 ساعة أخرى في PTwH. اتركيه في محلول الغسيل طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  5. مسح
    1. يجفف في سلسلة الميثانول / PBS -20٪ ، 40٪ ، 60٪ ، 80٪ ، 100٪ -1 ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. احتضان لمدة 3 ساعات ، مع الاهتزاز ، في 66 ٪ DCM / 33 ٪ الميثانول في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن ترك العينة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مباشرة بعد الجفاف في الميثانول بنسبة 100٪.
    2. احتضن في 100٪ DCM لمدة 15 دقيقة مرتين في درجة حرارة الغرفة (مع الرج) لغسل MeOH.
    3. احتضان في ثنائي بنزيل الأثير (DBE) دون اهتزاز في درجة حرارة الغرفة. تأكد من ملء الأنبوب بالكامل تقريبا ب DBE لمنع أكسدة العينة. الانتهاء من خلط الحل عن طريق قلب عدة مرات قبل التصوير.

5. تصوير ورقة الضوء

ملاحظة: تم تصوير أدمغة iDISCO التي تم تطهيرها من الأنسجة باستخدام مجهر ذو ورقة ضوئية ، ومجهز بهدف 2X / 0.5 NA ، وكاميرا تكميلية لأشباه الموصلات أكسيد المعادن ، وبرنامج تشغيل المجهر والحصول على الصور عند 0.75 × 0.75 × 4 ميكرومتر / فوكسل للنقطة الزمنية P4 حيث سمح ذلك بدقة خلية واحدة داخل القشرة (الشكل 3 أ ، ب).

  1. تركيب العينة
    1. قم بتركيب العينة بعناية في حامل حجم العينة الصحيح بحيث يتم توجيه العينة ببعد z لا يزيد عمقه عن 5.2 مم بسبب مسافة العمل المقدرة لمجهر الورقة الضوئية (5.7 مم ناقص هامش أمان 0.5 مم)25.
    2. ضع حاملا في مهد العينة مع برغي الحامل بزاوية 45 درجة على دعامات المهد (الشكل 1 ب). ضع المهد بحيث يكون مسار الضوء عموديا على العينة (الشكل 1 ج).
  2. معلمات التصوير
    1. اضبط جسم التكبير / التصغير على المجهر على تكبير 4x أو أعلى ينتج 0.75 ميكرومتر / بكسل.
      ملاحظة: يمكن إجراء التحليلات الحسابية أحادية الخلية على صور الورقة الضوئية P4 باستخدام أي مجهر ورقة ضوئية متاح تجاريا يسمح بدقة 0.75 × 0.75 × 4 ميكرومتر / فوكسل أو أعلى. دقة أقل كافية للأدمغة في نقاط زمنية لاحقة تكون فيها النوى أكثر توزيعا بشكل أقل.
    2. في برنامج الحصول على الصور ، حدد ورقة ضوئية واحدة مع NA = ~ 0.08 (سمك 9 ميكرومتر / 4 ميكرومتر z خطوة).
      ملاحظة: يسمح هذا الإعداد جنبا إلى جنب مع التركيز البؤري الديناميكي الأفقي بتصوير الدماغ بالكامل بدقة خلية واحدة لدماغ الفأر في غضون فترة زمنية معقولة. بالنسبة لدماغ اليوم الرابع (P4) بعد الولادة ، يقدر وقت الحصول على الصورة ب 11-15 ساعة لثلاث قنوات حسب حجم الدماغ.
    3. لضمان الحفاظ على الدقة المحورية على طول عرض الصورة، حدد التركيز البؤري الديناميكي الأفقي وقم بتطبيق عدد الخطوات الموصى به وفقا لطول موجة الليزر. بالنسبة لدماغ ماوس P4 بالكامل ، اضبط التركيز الديناميكي الأفقي على 11. اضبط التركيز الدقيق لكل قناة فيما يتعلق بقناة التسجيل.
      ملاحظة: هنا ، يتم تسجيل قناة TO-PRO-3 (647 نانومتر) في أطلس دماغ الفأر التنموي Allen حيث يقوم هذا بتسمية جميع النوى.
    4. اضبط طاقة الليزر لكل قناة فيما يتعلق بخصائص القناة.
      ملاحظة: تتطلب الأطوال الموجية الأطول طاقة ليزر أعلى مقارنة بالأطوال الموجية الأقصر. على سبيل المثال ، يجب تصوير 780 نانومتر بقوة ليزر عالية (70٪ - 75٪) وتعرض منخفض (50 مللي ثانية) ، بينما تتطلب قناة 647 نانومتر متوسط طاقة ليزر (40٪ - 45٪) وتعرض منخفض (50 مللي ثانية).
    5. اضبط عرض الورقة الخفيفة على ~ 50٪ لضمان توزيع طاقة الورقة على النحو الأمثل في البعد y لحجم العينة هذا.
      ملاحظة: بالاقتران مع التركيز البؤري الديناميكي الأفقي، يوفر عرض الورقة بنسبة 50٪ توزيعا متوسطا للطاقة عبر الصورة مع تقليل خطر التبييض الضوئي25.
    6. قم بتعيين عدد البلاطات فيما يتعلق بحجم العينة مع تداخل موصى به بنسبة 15٪ بين التجانبات ، والتقط صورا لكل قناة بالتتابع لكل مكدس في موضع تجانب معين.

6. معالجة الصور باستخدام NuMorph

ملاحظة: يحتوي خط أنابيب NuMorph على ثلاثة أجزاء رئيسية لتحليل الصور ثلاثية الأبعاد: المعالجة المسبقة والتحليل والتقييم. تم تنظيم هذه الأجزاء في NMp_template.m و NMa_template.m و NMe_template.m على التوالي ، والتي تمت مناقشتها أدناه. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة NM_setup.m لتنزيل وتثبيت حزم البرامج اللازمة لتشغيل NuMorph بسلاسة. يوفر NM_samples.m أيضا نموذجا لإدخال معلومات الحصول على الصور.

  1. إعداد NuMorph
    1. قم بتنزيل وتثبيت مدير بيئة كوندا لنظام التشغيل Linux26. قم بتنزيل وتثبيت أدوات معالجة الصور NuMorph19 .
    2. في سطر الأوامر ، قم بتشغيل Matlab. قم بتشغيل NM_setup.m من NuMorph لتنزيل وتثبيت حزم برامج تحليل الصور اللازمة للتحليلات.
      ملاحظة: تضمن هذه الخطوة إعداد بيئة conda بشكل صحيح بالإضافة إلى ضمان تنزيل جميع الأدوات والوظائف الإضافية اللازمة ل Matlab لتشغيل كل من خطوط الأنابيب الثلاثة وتثبيتها بشكل صحيح. أبرزها هنا Elastix لتشغيل التسجيل و 3D-Unet للكشف عن الخلايا والعد.
  2. حدد أسماء العينات وأدلة الإدخال والإخراج ومعلومات القناة ومعلمات تصوير الورقة الضوئية عن طريق تحرير الملف NM_samples.m.
    ملاحظة: هنا ، يوصى بالتحقق مرة أخرى للتأكد من تحديد المعلومات الصحيحة ، وخاصة دليل إدخال الصورة ، بشكل صحيح. لا يتم استدعاء الأخطاء عادة هنا حتى يتم تشغيل الخطوات اللاحقة.
  3. المعالجة المسبقة للصور
    1. تعديل الشدة
      1. في NMp_template ، اضبط ضبط شدة التعديل = صواب.
        ملاحظة: اضبط على true إذا كان ضبط الكثافة مطلوبا. إذا لم يكن كذلك ، فقم بتعيين تعديل الكثافة = خطأ. هناك أيضا خيار لاستخدام "تحديث" للكتابة فوق معلمات التعديل السابقة.
      2. تعيين استخدام الصور المعالجة = false عند العمل مع مجموعة جديدة من الصور. بخلاف ذلك ، أشر إلى أي مجموعات بيانات صور محفوظة مسبقا في دليل الإخراج (على سبيل المثال ، "محاذاة" ، "مخيط") لاستخدامها في خطوات المعالجة اللاحقة.
        ملاحظة: يتم توفير هذا الخيار في الحالة التي تمت فيها معالجة الصور المدخلة مسبقا. في هذه الحالة ، سيتم استخدام الصور المعالجة مسبقا كصور إدخال وسيتم تعيين الخيار على اسم الدليل الفرعي في دليل الإخراج.
      3. تعيين حفظ الصور = صواب.
        ملاحظة: يضمن استخدام هذا الخيار حفظ الصور المعالجة في دليل الإخراج; خلاف ذلك ، سيتم حساب المعلمات فقط وحفظها.
      4. تعيين حفظ العينات = صواب.
        ملاحظة: يضمن هذا الخيار حفظ نتائج العينة لكل خطوة رئيسية.
      5. اضبط ضبط تظليل البلاط = أساسي لتطبيق تصحيح التظليل باستخدام خوارزمية BaSiC27 أو يدوي لتطبيق تصحيح تظليل البلاط باستخدام قياسات من مجهر الورقة الضوئية بعرض ورقة ضوئية محددة.
        ملاحظة: يصحح هذا الخيار الإضاءة غير المتساوية على طول البعد y الناتجة عن شكل خصر الورقة.
    2. محاذاة قناة الصورة
      1. في NMp_template ، قم بتعيين محاذاة القناة = true. اضبط هذا الخيار على true إذا كانت محاذاة القناة مطلوبة. إذا لم يكن كذلك ، اضبط على خطأ. اضبط طريقة محاذاة القناة إما على الترجمة (جامدة) أو elastix (غير جامدة).
        ملاحظة: تستخدم طريقة الترجمة أساليب تسجيل 2D جامدة في محاذاة قنوات متعددة بينما تستخدم طريقة elastix خطوط B غير جامدة28 لتصحيح الانجراف الدوراني ، والذي قد يحدث أثناء الحصول على صورة طويلة19.
    3. خياطة الصور التكرارية
      1. في NMp_template ، قم بتعيين صور غرزة = صواب.
        ملاحظة: اضبط هذا الخيار على true إذا كانت الخياطة مطلوبة.
      2. تعيين صقل الغربلة = صحيح.
        ملاحظة: يستخدم هذا الخيار لمزيد من تحسين الترجمة في xy باستخدام تحويل ميزة متغيرة المقياس29.
      3. تعيين معلمات محاذاة الحمل = صواب.
        ملاحظة: يستخدم هذا الخيار ترجمات محاذاة القناة أثناء الخياطة. يوصى بهذا الخيار مع التصوير متعدد القنوات. وإلا، فاضبط على false.
      4. اضبط التداخل = 0.15 لمطابقة تداخلات البلاط أثناء التصوير.
    4. لتشغيل أي من خطوات المعالجة المسبقة هذه، قم بتشغيل ما يلي في Matlab خارج بيئة NMp_template:
      1. حدد اسم العينة. تعيين التكوين = NM_config (عملية ، عينة).
      2. قم بتشغيل أي من خطوات المعالجة المسبقة عن طريق تحديد NM_process (التكوين ، المرحلة) وتحديد المرحلة باستخدام الكثافة أو المحاذاة أو الغرزة لأي من العمليات. تحقق من دليل الإخراج لملفات الإخراج لكل مرحلة من المراحل (الشكل 3 والشكل 4).
  4. تحليل الصور
    1. قبل نومورف
      1. ابدأ بصورة أطلس 3D وصورة تعليق توضيحي مرتبطة بها تعين كل فوكسل لهيكل معين.
        ملاحظة: يتم استخدام أطلس دماغ الماوس التنموي P4 Allen الذي تم إنشاؤه من MagellanMapper30 هنا.
      2. قم بمحاذاة كل من صورة الأطلس وملف التعليقات التوضيحية للتأكد من تطابقهما بشكل صحيح في الاتجاه الصحيح.
    2. ضمن نومورف
      ملاحظة: الآن بعد محاذاة الأطلس والتعليقات التوضيحية الخاصة به بشكل صحيح ، يجب "دمج" الملفات أو معالجتها داخل NuMorph بحيث يمكن حفظها لاستخدامها لاحقا. للقيام بذلك ، استخدم الدالة munge_atlas لتحديد المدخلات كما هو موضح أدناه.
      1. حدد Atlas_file: (سلسلة). قم بتوفير المسار الكامل لملف الأطلس.
      2. حدد Annotation_file: (سلسلة). قم بتوفير المسار الكامل للتعليقات التوضيحية المرتبطة.
      3. حدد الدقة: (1x3 رقمي). حدد دقة الأطلس y,x,z كميكرون لكل بكسل.
      4. حدد الاتجاه: (1 × 3 أحرف). قدم اتجاه الأطلس وتأكد من مطابقته لإعداد العينة في المهد (الأمامي (أ) / الخلفي (ع) ، الأعلى (الق) / السفلي (i) ، اليسار (l) / اليمين (r)).
      5. تحديد نصف الكرة الأرضية: حدد نصف الكرة المخية الذي تم تصويره ("يسار" ، "يمين" ، "كلاهما" ، "لا شيء").
      6. حدد out_resolution:(int). حدد الدقة الخواص لإخراج الأطلس بالميكرونات. (الافتراضي: 25).
      7. قم بتشغيل الأمر "munge_atlas(atlas_file، annotation_file، الاستبانة، الاتجاه، نصف الكرة الأرضية)" لإنشاء تعليقات توضيحية في /data/annotation_data ونسخة من صورة الأطلس في /data/atlas.
      8. اقرأ بنية Matlab وملف الأطلس للتحقق من أن كلا الملفين قد تم دمجهما بشكل صحيح في الاتجاه الصحيح.
        ملاحظة: يمكن إجراء خطوة إضافية لتصنيف الخلايا لتحديد أنواع الخلايا بناء على التوطين المشترك لعلامات البروتين المناعية.
    3. اختزال
      1. في NMa_template ، قم بتعيين صور إعادة العينة = true ، في حالة إجراء تسجيل الصورة للإشارة إلى الأطلس أو لإنشاء أحجام مصغرة من مجموعات البيانات عالية الدقة.
        ملاحظة: سيتم استخدام NMa_template.m لتعيين معلمات إعادة التشكيل والتسجيل واكتشاف النوى وعد الخلايا.
      2. قم بتعيين دقة إعادة التشكيل لمطابقة الأطلس.
        ملاحظة: هنا ، يتم استخدام دقة 25 ميكرومتر3 / voxel الخواص لأن الأطلس المرجعي موجود في هذه الدقة.
      3. حدد رقم القناة المراد إعادة تشكيلها باستخدام قنوات إعادة العينة = [ ].
        ملاحظة: هنا ، يتم تعيين رقم القناة ليتطابق مع القناة النووية. إذا كان هذا الخيار فارغا، إعادة تشكيل قناة التسجيل فقط.
    4. تسجيل
      1. في NMa_template ، قم بتعيين صور التسجيل = true. اضبط على true إذا كان التسجيل مطلوبا. إذا لم يكن كذلك ، فقم بتعيين التسجيل = خطأ.
      2. حدد ملف الأطلس ليطابق الملف في دليل الأطلس.
      3. تعيين معلمات التسجيل = الافتراضي.
        ملاحظة: يستخدم هذا الخيار affine متبوعا بتحويل شريحة B لتقدير المراسلات المكانية. بخلاف ذلك ، حدد مجموعة جديدة من معلمات التسجيل عبر Elastix في /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. تعيين حفظ الصور المسجلة = صواب.
        ملاحظة: يمكن تنزيل ملفات الإخراج من التسجيل وإعادة التشكيل وفحصها بصريا في Matlab أو أدوات التصور الأخرى مثل FIJI31.
    5. الكشف عن النوى وعد الخلايا وتصنيفها
      ملاحظة: قد تكون الأخطاء التي تحدث هنا بسبب عدم تحديد ملف التعليقات التوضيحية بشكل صحيح أو عدم مطابقة عمر العينة مع التعليق التوضيحي الصحيح.
      1. في NMa_template ، قم بتعيين كل من عدد النوى وتصنيف الخلايا = true.
      2. تعيين طريقة العد = 3dunet.
        ملاحظة: يسمح هذا الخيار باستخدام طراز 3D-Unet19 المدرب. وإلا، فحدد Hessian الذي يستخدم طريقة الكشف عن النقطة في Hessian.
      3. قم بتعيين min_intensity لتحديد حد أدنى للكثافة للكائنات المكتشفة.
        ملاحظة: تحدد عتبة مناسبة تجريبيا استنادا إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء في وضع العلامات النووية.
      4. اضبط classify_method على أي من العتبتين ، والذي يعتمد على شدة مضان غير خاضعة للإشراف في مواضع centroid أو svm ، والتي تقوم بنمذجة مصنف آلة متجه الدعم الخطي (SVM) الخاضع للإشراف.
        ملاحظة: ستصنف هذه الخطوة جميع الخلايا المكتشفة إلى أربع فئات رئيسية مع تصوير 3 قنوات. باستخدام هذا البروتوكول ، يتم إنشاء Ctip2 + / Brn2- و Ctip2- / Brn2 + و Ctip2- / Brn2- والقيم المتطرفة.
    6. خطوات التحليل
      1. حدد اسم العينة. تعيين التكوين = NM_config (تحليل ، عينة).
      2. قم بتشغيل أي من خطوات التحليل عن طريق تحديد NM_analyze (التكوين ، المرحلة) وتحديد المرحلة باستخدام إعادة التشكيل أو التسجيل أو العد أو التصنيف. تحقق من دليل الإخراج لملفات الإخراج لكل مرحلة من المراحل (الشكل 5).
    7. تصنيف نوع الخلية وتحليل المجموعة
      1. في NMe_template ، قم بتعيين update = true والكتابة فوق جميع الإحصائيات السابقة المحسوبة.
        ملاحظة: يوفر NMe_template.m خيار إجراء تحليل مجموعة من نوع الخلية عبر مناطق الدماغ من نفس الدماغ الذي يتم تحليله.
      2. قم بتعيين compare_structures_by إلى أي فهرس للمقارنة بكل التعليقات التوضيحية الفريدة أو جدول لمقارنة الهياكل وفقا للجدول.
      3. قم بتعيين template_file ، الذي يحدد جميع فهارس البنية الممكنة ويجب أن يكون موجودا في / التعليقات التوضيحية.
      4. تعيين structure_table وتحديد الهياكل لتقييمها.
      5. حدد عدد الخلايا وتصنيف نوع الخلية كما هو موضح في NMa_template.m.
      6. اضبط compare_groups لتحديد مجموعات للمقارنة.
      7. اضبط الاقتران إما على صواب أو خطأ إما لإجراء اختبار t مقترن أو اختبار t ثنائي العينة.
    8. تشغيل التحليل.
      ملاحظة: لتنفيذ هذه الخطوة، قم بتشغيل ما يلي في Matlab خارج بيئة NMe_template.m.
      1. حدد اسم العينة. تعيين التكوين = NM_config (تقييم ، عينة).
      2. قم بتشغيل خطوة التحليل عن طريق تحديد NM_evaluate (التكوين ، المرحلة) وتحديد المرحلة . تحقق من دليل الإخراج لملفات الإخراج لتحليل المجموعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نظرا لأن بروتوكول iDISCO + يقدم انكماشا كبيرا في الأنسجة ، والذي يمكن ملاحظته بسهولة بالعين (الشكل 2 ب) ، فقد أضفنا خطوة التصوير بالرنين المغناطيسي إلى خط الأنابيب هذا قبل إزالة الأنسجة لتحديد الانكماش الناجم عن إزالة الأنسجة. يبدأ سير العمل بإزالة الأنسجة غير المخية من صورة التصوير بالرنين المغناطيسي (الشكل 2C). بعد ذلك ، يتم تطبيق تحويل جامد (3 زوايا ترجمة و 3 زوايا دوران) لمحاذاة صورة MR مع صورة الورقة الضوئية (الشكل 2D). من خلال القيام بذلك ، لاحظنا فقدان إجمالي الحجم بنسبة 60٪ الناجم عن إجراء إزالة الأنسجة (الشكل 2E) ، والذي كان متسقا مع تقديرات تغير الحجم بالعين (الشكل 2B). تختلف هذه النتيجة تماما عن تقرير سابق حيث تم الإبلاغ عن انكماش بنسبة 5٪ -10٪ 10,32. قد يكون الاختلاف في الانكماش ناتجا عن الاختلاف في عمر الحيوان بين الدراستين (P4 مقابل أدمغة البالغين) أو بسبب الاختلافات الزمنية في غسل الميثانول في خطوة المقاصة لبروتوكول iDISCO + (16 ساعة مقابل 2 ساعة). لرسم خريطة لدرجات انكماش الأنسجة عبر مناطق مختلفة من الدماغ ، قمنا بنشر تسجيل صورة قابلة للتشوه حيث يتم استخدام صورة الورقة الضوئية كمرجع. تظهر صورة MR المسجلة في (الشكل 2F). يتم ترميز تغير الحجم المقدر بسبب إجراء إزالة الأنسجة بالألوان ، حيث لوحظ وجود درجة أكبر من الانكماش في القشرة مقارنة بمناطق الدماغ الأخرى (الشكل 2G).

لقياس أحجام مناطق الدماغ ، أجرينا تجزئة التصوير بالرنين المغناطيسي من خلال التسجيل في أطلس مشروح. اعتبر تقسيم الأدمغة المصورة بالرنين المغناطيسي ناجحا إذا تطابق تراكب الأطلس المرجعي بشكل وثيق مع الحدود التشريحية التي حددتها الاختلافات في التباين في صور التصوير بالرنين المغناطيسي الخام (الشكل 2H). يعتمد التراكب أثناء التسجيل على التحضير الجيد للعينة (الشكل 2 أ) ، والحصول على الصور ، وتجريد الجمجمة. تعد خطوة تجريد الجمجمة أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج تسجيل جيدة حيث سيحاول التسجيل تشويه الصورة المرجعية من الأطلس إلى صورة MR بأكملها ، بما في ذلك أي جمجمة متبقية في الصورة. يمكن أن يؤدي إدراج الجمجمة في التسجيل إلى تشويه النتائج وإنتاج عرض حجم 3D مسجل بشكل غير صحيح للتجزئة. يمكن بعد ذلك تصور عرض حجم 3D النهائي باستخدام ITK-SNAP33 (الشكل 2H). تستخدم هذه الطريقة لتقييم الاختلافات الإجمالية في حجم الدماغ عبر مجموعات العينات. يمكن متابعة الأساس الخلوي الكامن وراء اختلافات الحجم المكتشفة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام عد الخلايا مع إزالة الأنسجة والفحص المجهري للورقة الضوئية و NuMorph.

الهدف من إزالة الأنسجة وتحليلها هو تقييم مساهمات أنواع الخلايا المختلفة في الاختلافات عبر الظروف التجريبية (على سبيل المثال ، النمط الجيني ، التعرض البيئي) عن طريق حساب النوى الفردية باستخدام NuMorph. أدت إزالة الأنسجة باستخدام بروتوكول iDISCO + وعلامات النوى الخاصة بالطبقة العصبية إلى مجموعات خلايا محددة بوضوح من الخلايا العصبية للطبقة العليا والسفلى في القشرة المتساوية (الشكل 3).

يعتمد عد الخلايا باستخدام NuMorph على خطوات المعالجة المسبقة الناجحة التي تتضمن ضبط الكثافة ومحاذاة القناة والخياطة (الشكل 4 أ). يمكن أن تؤدي الأخطاء التي تحدث في أي من هذه الخطوات إلى خياطة غير صحيحة (الشكل 4 ب ، ج). على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي الحصول على صورة غير صحيح إلى صور ذات أنماط داخل التركيز وخارج التركيز أثناء المعالجة المسبقة (الشكل 4C). لحساب النوى من مناطق معينة من الدماغ ، يتم شرح الصور المخيطة باستخدام أطلس متاح للجمهور. سجلنا صورنا المخيطة على نسخة مصححة من P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas34. هنا ، تم اختزال الصور المخيطة من دقة عالية (0.75 × 0.75 × 4 ميكرومتر مكعب / فوكسل) إلى دقة أقل (دقة 25 ميكرومتر مكعب / فوكسل الخواص) لتتناسب مع دقة الأطلس. وتضمن مطابقة دقة الأطلس التسجيل الصحيح للصور مع الأطلس وتوفر شروحا إقليمية في الصور المقتناة (الشكل 5 ألف).

لإجراء عد محدد من نوع الخلية ، قمنا بتسمية الخلايا العصبية للطبقة العليا التي تعبر عن Brn2 ، والخلايا العصبية في الطبقة السفلية التي تعبر عن Ctip2 ، وجميع النوى باستخدام TO-PRO-3 (الشكل 3B). يتم إجراء التصوير بدقة مكانية كافية لفصل النوى الفردية (0.75 × 0.75 × 4 ميكرومتر3 / فوكسل). يتم الكشف عن النوى المركزية باستخدام نموذج 3D-Unet مدرب في NuMorph (الشكل 5B ، C). اكتشفنا ~ 12 × 10 6 نوى إجمالية كانت To-Pro-3+ في القشرة المخية المتساوية ، بما في ذلك ~ 2.6 × 10 6 Brn2 + و 1.6 × 10 6 نوى Ctip2 +. اكتشفنا أيضا ~ 3.7 × 10 6 و 2.9 × 106 نوى كلية To-Pro-3+ في العقد القاعدية والقشرة المخية الحصينية ، على التوالي. تم حساب ما يقرب من 1.5 × 10 6 و <1 × 106 خلايا Ctip2 + في العقد القاعدية والقشرة المخية الحصينية ، على التوالي ، على الرغم من اكتشاف عدد ضئيل من خلايا Brn2 + (الشكل 5D). إجمالي عدد النوى في القشرة المخية المتساوية والقشرة المخية الحصينية مجتمعة (~ 15 مليون خلية) مماثلة لإجمالي عدد الخلايا المبلغ عنه سابقا في القشرة الدماغية للفأر15. توضح هذه النتائج فائدة التصوير بالرنين المغناطيسي ، ومنهجية إزالة الأنسجة iDISCO + ، والتحليل الحسابي NuMorph للكشف عن الحجم ، وعدد الخلايا الكلي ، والأعداد المحددة لنوع الخلية الكامنة وراء الاختلافات في بنية دماغ الفأر عبر المجموعات التجريبية.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على تحليل خلية واحدة للدماغ بالكامل لأدمغة الفئران 3D السليمة لأنسجة 3D حديثي الولادة. (أ) نظرة عامة على إزالة الأنسجة iDISCO + ، وتصوير ورقة الضوء ، وتحليل الصور 3D. (ب) صور توضح تركيب العينة الصحيحة على مجهر الصفيحة الضوئية. (ج) رسم كاريكاتوري يوضح تركيب العينة بالنسبة إلى مسار الورقة الخفيفة. اختصار: ab = الأجسام المضادة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: قياسات بنية الدماغ الإجمالية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي. (أ) صورة توضح تحضير العينة للتصوير بالرنين المغناطيسي. (ب) صور لأدمغة P4 التمثيلية قبل وبعد إزالة أنسجة iDISCO +. شريط المقياس = 5.0 سم. (C) صورة MR أولية مع جمجمة متصلة بحجم 60 × 60 × 60 ميكرومتر مكعب. شريط المقياس = 800 ميكرومتر. (D) صورة ورقة ضوئية لدماغ الفأر عند 25 × 25 × 25 ميكرومتر مكعب. الحجم الكلي = 68.7 مم3. لاحظ أن جزءا صغيرا من القشرة المتساوية الظهرية تمت إزالته عن غير قصد أثناء التشريح المميز برأس السهم (أبيض). شريط المقياس = 800 ميكرومتر. (ه) صورة MR لدماغ الفأر بعد تجريد الجمجمة والتسجيل الصلب. الحجم الكلي = 171.9 مم3. إدراج (أصفر) يظهر محيط الدماغ من صورة الورقة الخفيفة. شريط المقياس = 800 ميكرومتر. (F) صورة MR مسجلة في إشارة إلى صورة ورقة ضوئية لتقييم التشوه. شريط المقياس = 800 ميكرومتر. (ز) رسم خرائط الدماغ من فوكسل لتقييم تغيرات الحجم بين صورة الورقة الضوئية وصورة MR حيث يشير اللون الأزرق والأحمر إلى الانكماش والتوسع من صورة MR إلى صورة الورقة الضوئية ، على التوالي. بشكل عام ، كان هناك خسارة في الحجم بنسبة 60٪ ، لكن بعض المناطق مثل القشرة المخية أظهرت انكماشا أكبر مقارنة بمناطق أخرى. (H) اللوحة اليسرى: منظر محوري لصورة التصوير بالرنين المغناطيسي مع أجزاء مسجلة من أطلس ألين التنموي للدماغ المتراكب. اللوحة اليمنى: 3D حجم تقديم التجزئة. شريط المقياس = 800 ميكرومتر. الاختصارات: OB = لمبة شمية. Dpall = الباليوم الظهري / القشرة المتماثلة ؛ Mb = الدماغ المتوسط. Cb = المخيخ. الاتجاه: R = روسترال ؛ L = الجانبي ؛ D = الظهرية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: صور الدقة الخلوية ومحاذاة القناة. (أ) المقطع المحوري البصري من التلوين النووي TO-PRO-3 (TP3) ووضع العلامات المناعية لعلامات Ctip2 (الخلايا العصبية في الطبقة السفلية) و Brn2 (الخلايا العصبية للطبقة العليا) في دماغ الفأر P4. شريط المقياس = 1 مم. (B) أقحم موسع للمناطق القشرية في A (مربع) يوضح محاذاة القناة الصحيحة مع التوطين المتوقع للطبقة العليا المناعية Brn2 والخلايا العصبية ذات الطبقة السفلية المناعية Ctip2. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: أمثلة خياطة الصور . (أ) نتائج العينة من صورة تكرارية 2D مخيطة بشكل صحيح. شريط المقياس = 1 مم. يظهر إدراج مثالا على الخياطة الصحيحة التي تم تكبيرها. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (B) نتائج العينة من صورة 2D تكرارية مخيطة بشكل غير صحيح. شريط المقياس = 1 مم. يظهر إدراج مثالا على خياطة غير صحيحة تم تكبيرها (البروز). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (C) نتائج العينة من صورة مخيطة بشكل غير صحيح 2D. شريط المقياس = 1 مم. يظهر إدراج مثالا على خياطة غير صحيحة تم تكبيرها (خارج نطاق التركيز البؤري). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تسجيل صورة منخفضة الدقة ، واكتشاف نوى عالية الدقة ، وعدد الخلايا في دماغ الفأر P4. (أ) اللوحة اليسرى: مثال على شريحة z من صور 3D لورقة ضوء الدماغ بالكامل أعيد تشكيلها إلى دقة 25 ميكرومتر. شريط المقياس = 1 مم. اللوحة الوسطى: تعليقات توضيحية من أطلس ألين التنموي للدماغ (P4) مسجلة في الصورة المجهرية. شريط المقياس = 1 مم. اللوحة اليمنى: تراكب اللوحات اليسرى والوسطى. شريط المقياس = 1 مم. (B) مثال على صورة مخيطة معدلة الكثافة في العرض المحوري. المنطقة المحاصرة موضحة في (C). شريط المقياس = 1 مم. (C) الكشف الآلي عن النوى (أحمر). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (د) القياس الكمي لأنواع الخلايا في مناطق الدماغ المختلفة من الدماغ P4 (العقد القاعدية ، الحصين Allocortex ، و Isocortex). الأحمر = الخلايا العصبية للطبقة العليا المسمى Brn2 ، والأخضر = الخلايا العصبية في الطبقة السفلية المسمى Ctip2 ، والأزرق = جميع النوى الموسومة بصبغة To-Pro-3. الاختصارات: DPall = الباليوم الظهري (إيزوكورتكس) ؛ MPall = الباليوم الإنسي (القشرة المخية الحصينية) ؛ CSPall = subpallium المركزية (العقد القاعدية الكلاسيكية). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مرحلة تحليل NuMorph الوقت المقدر
تعديل الشدة 1 ساعة
محاذاة القناة 2 دقيقة
2D خياطة التكرارية 12 ساعة
اختزال 3 دقائق
تسجيل 3 دقائق
عد الخلايا 5 ساعات
تصنيف الخلية 10 دقائق

الجدول 1: أوقات تحليل NuMorph.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طرق إزالة الأنسجة هي تقنيات مفيدة لقياس التنظيم الخلوي 3D للدماغ. هناك مجموعة من طرق إزالة الأنسجة الموصوفة في الأدبيات ، ولكل منها مزاياها وقيودها6،7،8،9. خيارات الأدوات الحسابية لتحليل أنواع الخلايا في الصور التي تم تطهيرها من الأنسجة محدودة نسبيا. تم تنفيذ أدوات أخرى متاحة لمجموعات الخلايا المتناثرة التي يكون فيها التجزئة أقل صعوبة 10,35 أو استفادت من توسع الأنسجة16. تصف هذه الورقة إعداد دماغ الفأر للتصوير باستخدام إزالة أنسجة iDISCO + وتوضح NuMorph ، وهو خط أنابيب حسابي لمعالجة النوى وقياسها داخل هياكل قشرة الفأر التي تم التقاطها بواسطة LSFM. وهي مصممة لتحقيق توازن مناسب بين طول وقت التصوير ودقة الكشف عن نوى الخلية والموارد الحسابية. يتناقض خط الأنابيب هذا مع الأدوات الأخرى المتاحة حاليا من خلال تقسيم جميع النوى بشكل موثوق ، بدلا من المجموعات المتفرقة من الخلايا المصنفة10،36،37. لقد أظهرنا سابقا أن دقة اكتشاف الخلايا عالية ، مع أوقات تصوير أقصر بكثير وأحجام بيانات مكتسبة أقل بكثير لاكتساب نصف الكرة الأرضية بالكامل مقارنة بالطرق الأخرى19. يعالج NuMorph عددا من التحديات المهمة لتحليل صور الورقة الضوئية متعددة القنوات ، مثل توفير أدوات لمحاذاة القناة ، وتصحيح حركات المسرح باستخدام أداة خياطة ، وتصحيح سطوع الإشارة في مربعات الصورة. سير العمل المقدم في هذه الورقة مفيد للمجتمع العلمي الأوسع ويمكن الوصول إليه لجميع المجموعات في المؤسسات البحثية. يمكن رؤية نظرة عامة على العملية في الشكل 1.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال هذه العملية من نضح الماوس إلى التحليل الحسابي الذي يمكن أن يؤثر على جودة المصب للصور والقياس الكمي والنتائج. من الضروري أن يتم إجراء التروية بحيث يتم إزالة كل الدم من الدماغ ، حيث أن الأوعية الدموية لها تألق ذاتي طبيعي يؤثر على شدة الصور وسيتطلب تعديلات في خط الأنابيب ، مما يؤثر سلبا على النتائج. تعد مدة تثبيت PFA أمرا بالغ الأهمية أيضا ، حيث أن ترك الأدمغة مغمورة في 4٪ PFA لمدة تزيد عن 24 ساعة قد يؤدي إلى "تثبيت" العينة ويؤدي إلى تكسير الدماغ ، والذي يصبح هشا أثناء عملية iDISCO +. تم تعديل بروتوكول iDISCO الموصوف أعلاه بشكل طفيف من البروتوكول الرسمي الموجود على موقع الويب24. أحد التعديلات المهمة هو إضافة PBS إلى سلسلة الميثانول / PBS ، بدلا من الماء في البروتوكول الأصلي. هذا لمنع التشقق القشري في الأدمغة الجنينية والمبكرة بعد الولادة ، والذي يحدث على الأرجح بسبب التطور غير المكتمل للخلايا الدبقية ، والإسقاطات المحورية ، والمصفوفة خارج الخلية. اعتمادا على الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول ، قد يتعين إجراء تعديلات في كل خطوة من خطوات بروتوكول iDISCO + ، مثل تغيير تركيزات الأجسام المضادة وزيادة أوقات حضانة عينات الأنسجة الأكبر ، لتحسين المعلمات المثالية لالتقاط العلامة المفضلة وتحليلها بدقة.

من المعروف أن انكماش الأنسجة يحدث أثناء عملية إزالة الأنسجة iDISCO + ، والتي قد تغير بعد ذلك القياسات الحجمية في اتجاه مجرى النهر 6,10. يمكن استخدام طرق بديلة ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي الذي يتم إجراؤه قبل إزالة الأنسجة ، لتحديد مدى أي تغيير في حجم الأنسجة في الضوابط مقابل التجارب لتحديد ما إذا كانت أي اختلافات حجمية ناتجة عن النمط الظاهري المدروس وليس من عملية إزالة الأنسجة. قد تختلف التغيرات غير المتجانسة في أحجام المناطق القشرية للمتحولات اعتمادا على المحتوى الخلوي الإقليمي ، حيث قد تتأثر المادة الرمادية والبيضاء في الدماغ بشكل تفاضلي بجفاف الميثانول. يمكن استخدام بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي لتحديد ما إذا كان انكماش الأنسجة غير منتظم في جميع أنحاء المناطق الفرعية للدماغ (الشكل 2G) ، ويمكن تعديل أي تغييرات يتكبدها بروتوكول المقاصة في التحليل الحسابي النهائي. علاوة على ذلك ، تستخدم عملية iDISCO + غسالات الميثانول القاسية لتجفيف العينة ، مما قد يؤدي إلى تلف أو تغييرات في بعض المستضدات على أسطح النوى. يوصى باختبار أي أجسام مضادة مستخدمة أولا على أقسام أنسجة المخ التي تم غسلها لمدة ~ 3 ساعات في الميثانول بنسبة 100٪ للتأكد من أن الجسم المضاد متوافق مع بروتوكول iDISCO +.

بالنسبة لمجموعات البيانات الضخمة التي تتطلب أوقات معالجة طويلة ، نوصي باستخدام إصدار عدم وجود نافذة من MATLAB في Linux والذي يسمح باستراتيجيات مثل تنفيذ الأمر "nohup" ، والذي سيستمر في تشغيل العملية حتى بعد فقد الاتصال بالخادم. علاوة على ذلك ، يتطلب NuMorph قوة حوسبة عالية ، لذلك نوصي بذاكرة 10 جيجابايت على الأقل للتحليلات. نقوم بتحليل العينات باستخدام محطة عمل Linux تعمل بنظام CentOS 7 ، وهي مجهزة بمعالج 2.6 جيجاهرتز 14 نواة ، وذاكرة 8 × 64 جيجابايت DDR4 2400 LRDIMM ، و 4 × 11 جيجابايت GPUs ، و 2 × 4 تيرابايت SSD خارجي. كانت بيانات الورقة الخفيفة الخام المستخدمة هنا 620 جيجابايت وكانت متطلبات الذاكرة للعمليات 10 جيجابايت. هنا ، قمنا بتضمين جدول بالأوقات المقدرة لإكمال كل خطوة من تحليلات NuMorph كما هو موضح في الجدول 1.

تتضمن خطوات المعالجة المسبقة للصورة ضبط الكثافة في البعد xy لكل مستوى z ومحاذاة القناة والخياطة. يتم ضبط كثافة الصورة لحساب الاختلافات في الكثافة بين البلاط والإضاءة غير المتساوية على طول البعد y. يحدث الاختلاف في الشدة بسبب الخصائص التقنية المتأصلة في ورقة الضوء أثناء صورها بين البلاط25. بعد ذلك ، يتم إجراء محاذاة القناة لضمان محاذاة قنوات الصورة بشكل صحيح في التصوير متعدد القنوات. يوصى بهذه الخطوة نظرا لأن كل قناة في التصوير متعدد القنوات يتم الحصول عليها بشكل فردي وقد تتسبب الحركات الدقيقة للمرحلة في انحرافات العينة وتؤدي إلى اختلال مكاني19. أخيرا ، يتم بعد ذلك خياطة البلاط لكل مستوى z معا لتشكيل صورة واحدة في كل مستوى z. في النهاية ، سيكون هناك كومة من الصور المخيطة لكل قناة تمثل الحجم الكامل للعينة. تعتمد خياطة الصور التكرارية على طريقة مخصصة لتنظيم جميع الصور ثنائية الأبعاد لكل قناة في حجم 3D للعينة19. تقوم الطريقة أولا بتنفيذ مراسلات z زوجية في الاتجاه المحوري لمطابقة مناطق البلاط المتداخلة في كل من الاتجاه الأفقي والرأسي. يتم تحديد إزاحة z النهائية لكل بلاطة باستخدام الحد الأدنى لشجرة الامتداد38. يتم إجراء خياطة تكرارية 2D في مكدس يبدأ من موقع في وسط المكدس مع إشارة خلفية أقل. يتم وضع اللوحة العلوية اليسرى أولا لكل تكرار خياطة لمنع التحول الدقيق للصور في البعد z.

نوصي بتشغيل كل مسار من مسارات المعالجة المسبقة بالتتابع، خاصة عند التحسين لتصحيح الأخطاء. غالبا ما تحدث المشاكل الرئيسية أثناء خطوات الخياطة. إحدى المشكلات التي يمكن أن تنشأ هي الحصول على صورة غير صحيحة على الورقة الخفيفة. قد تحدث هذه المشكلة عندما يتم ضبط التركيز الديناميكي الأفقي بشكل غير صحيح على ورقة الضوء وقد يؤدي إلى تناوب أنماط داخل الطور / خارج الطور في الصور (الشكل 4B ، C). قد تنشأ أخطاء إضافية إذا لم يتم تأمين العينة بإحكام ، وحدثت حركة عينة كبيرة أثناء الاستحواذ. في هذه الحالات ، قد لا تكون الخياطة الدقيقة ممكنة بسبب نقص المراسلات الزوجية بين البلاط المجاور. يمكن أن تنبع الأخطاء المحتملة الأخرى من موقع بدء الغرزة. يحدد NuMorph موقع بدء الغرزة تقريبا في منتصف المكدس. ومع ذلك ، عندما تكون هناك خلفية مهمة في موقع شريحة البداية ، قد تحدث أخطاء في المقارنة الزوجية في تجانبات الصورة. يوصى هنا باختيار موقع بداية يحتوي على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية.

يتضمن تحليل الصور الموصوف هنا إعادة أخذ عينات من الصور المخيطة من الدقة العالية (0.75 × 0.75 × 4 ميكرومتر مكعب / فوكسل) إلى دقة أقل الخواص تبلغ 25 ميكرومتر مكعب / فوكسل. نعيد تشكيل الصور المخيطة من القناة النووية لتسجيل الصور المخيطة في أطلس دماغ الفأر التنموي من ألين في الخطوة34 التالية. ثم يتم عد الخلايا لكل قناة في مناطق مشروحة من الصور بالإشارة إلى الأطلس بدقة عالية (0.75 × 0.75 × 4 ميكرومتر مكعب / فوكسل) باستخدام نموذج 3D-Unet مدرب19. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لاكتشاف كائنات blob وعدها. عند تطوير NuMorph ، اختبرنا دقة التجزئة بالنسبة إلى الصور الجديدة تماما التي لم يسبق لها مثيل أثناء التدريب والتي كانت من نفس إجراء إزالة الأنسجة ، ونفس المجهر ، ونفس دقة العثور على الملصق النووي 0.99 واستدعاء 0.9419. لم يتم اختبار دقة NuMorph بعد على إجراءات إزالة الأنسجة المختلفة أو المجاهر أو العلامات. وبالتالي ، فإن دقة التجزئة في التصاميم التجريبية الأخرى غير معروفة. الأطلس الافتراضي في NM_setup.m هو أطلس Allen ReferenceAtlas 39 الملون ب Nissl مع التكرار الثالث لإطار الإحداثيات المشتركة لدماغ Allen Mouse (CCFv3) كتعليق توضيحي مخصص.

على الرغم من أن NuMorph يحلل الأنسجة بشكل فعال ، والتي تكون كثيفة نسبيا ، مثل قشرة الفأر البالغة ، إلا أن التصميمات التجريبية الأكثر تحديا (مثل أدمغة الفئران الجنينية أو الهياكل عالية الكثافة مثل المخيخ) قد تتطلب تطوير أدوات حسابية إضافية. تحاول الجهود المجتمعية الحالية إنتاج بيانات شرح كافية للتدريب على نماذج التعلم العميق المستخدمة لتقسيم هذه الحالات الأكثر صعوبة40. تسمح التطورات في تقنيات التصوير بورقة الضوء بالتحقيق الكمي عالي الإنتاجية للهياكل تحت الخلوية ، مع مناهج جديدة مثل الفحص المجهري للإضاءة الانتقائية المقلوبة ثنائية الرؤية (diSPIM) مما يؤدي إلى زيادة الدقة والدقة في مناطق الدماغ الخلوية الكثيفة40,41. مع تطور التطورات في إزالة الأنسجة والتصوير والأدوات الحسابية المشاركة في هذا البحث ، نأمل أن تؤدي إلى استخدام أوسع لطرق إزالة الأنسجة للتحليلات الكمية حول كيفية حدوث اضطرابات نفسية عصبية يمكن أن تنبع من التغيرات في بنية الدماغ الناجمة عن عوامل الخطر الوراثية أو البيئية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01MH121433 و R01MH118349 و R01MH120125 إلى JLS و R01NS110791 إلى GW) ومؤسسة الأمل. نشكر بابلو أرييل من مختبر خدمات الفحص المجهري لمساعدته في تصوير العينات. يتم دعم مختبر خدمات الفحص المجهري في قسم علم الأمراض والطب المخبري جزئيا من خلال منحة الدعم الأساسية لمركز السرطان P30 CA016086 إلى مركز Lineberger الشامل للسرطان بجامعة نورث كارولينا (UNC). يتم دعم نواة الفحص المجهري لعلم الأعصاب من خلال منحة P30 NS045892. تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور جزئيا من قبل منحة الدعم المؤسسي لمركز نورث كارولينا للتكنولوجيا الحيوية 2016-IDG-1016.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 186 ،
تصوير خلية واحدة للدماغ بالكامل وتحليل أدمغة الفئران حديثي الولادة السليمة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي ومسح الأنسجة والفحص المجهري للورقة الضوئية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., … More

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., McCormick, C. M., Dere, M., Khan, S., Kim, M., Wang, T. W. W., He, Q., Wu, G., Shih, Y. Y. I., Stein, J. L. Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64096, doi:10.3791/64096 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter