Summary
该协议描述了使用iDISCO +对完整小鼠大脑进行磁共振成像，清除和免疫标记的方法，然后详细说明了使用光片显微镜成像和使用NuMorph的下游分析。
Abstract
组织清除后进行光片显微镜（LSFM）能够对完整的大脑结构进行细胞分辨率成像，从而可以定量分析由遗传或环境扰动引起的结构变化。全脑成像可以更准确地定量细胞，并研究物理切片组织的常用显微镜可能遗漏的区域特异性差异。与共聚焦显微镜相比，使用光片显微镜对清除的大脑进行成像大大提高了采集速度。尽管这些图像产生非常大量的大脑结构数据，但大多数在清除组织图像中进行特征量化的计算工具仅限于计数稀疏的细胞群，而不是所有细胞核。
在这里，我们展示了NuMorph（基于核的形态测量），一组分析工具，用于量化出生后第4天（P4）小鼠大脑注释区域内的所有细胞核和核标记物，在光片显微镜上清除和成像。我们描述了磁共振成像（MRI），以在组织清除脱水步骤引起的收缩之前测量脑体积，使用iDISCO+方法清除组织，包括免疫标记，然后使用市售平台进行光片显微镜，以细胞分辨率对小鼠大脑进行成像。然后，我们使用NuMorph演示了这个图像分析管道，该管道用于校正强度差异，拼接图像图块，对齐多个通道，计数细胞核，并通过注册到公开可用的图谱来注释大脑区域。
我们使用公开可用的协议和软件设计了这种方法，允许任何具有必要显微镜和计算资源的研究人员执行这些技术。这些组织清除、成像和计算工具允许测量和量化皮层中细胞类型的三维 （3D） 组织，应广泛适用于任何野生型/敲除小鼠研究设计。
Introduction
单细胞分辨率的全脑成像是神经科学中的一个重要挑战。细胞分辨率脑图像允许对脑回路进行详细分析和系统级映射，以及该回路如何被神经精神疾病的遗传或环境风险因素、发育中的胚胎中的细胞行为以及成人大脑中的神经回路破坏1，2，3。有多种组织学方法可以对重建的3D大脑进行高分辨率图像;然而，这些技术需要昂贵的专用设备，可能与免疫标记不兼容，并且某些方法的二维（2D）性质可能导致切片过程中的组织损伤和剪切4，5。
最近的进展提供了一种不需要组织切片的整个大脑成像的替代方法;它们涉及使用组织清除使大脑透明。在大多数组织清除方法中，通过去除脂质（因为它们是光散射的主要来源）以及在成像过程中将物体的折射率（RI）与样品浸没溶液的折射率（RI）相匹配来实现透明度。然后光可以穿过材料之间的边界而不会被散射6，7，8，9。
组织清除方法，如iDISCO+，通常与使用单光子激发显微镜的快速3D成像相结合，如LSFM6，7，10。在用荧光团标记的透明组织内，光片荧光显微镜通过用薄平面的光11激发对切片进行成像。LSFM的主要优点是一次照亮单个光学切片，该切片内分子的所有荧光都被激发，从而最大限度地减少了光漂白。此外，对整个光学切片进行成像可以基于相机检测激发切片，从而相对于点扫描12提高速度。LSFM无损地生产适合3D重建的配准良好的光学切片。
虽然iDISCO+方法允许在~3周内进行廉价的组织清除，但方案中的脱水步骤可能导致组织收缩和样品形态的潜在改变，从而影响体积测量6，10。在组织清除程序之前添加二次成像方法，例如MRI，可以测量整个样品的组织清除引起的收缩程度。在脱水步骤中，灰质和白质之间的机械性能差异可能导致脑物质变形不均匀，导致野生型和突变型样品之间不同的组织清除诱导的体积变形，并可能混淆对这些样品中体积差异的解释10，13.MRI是通过首先用造影剂（例如钆）灌注动物来进行的，然后在成像14之前将提取的目标组织在浸没溶液（例如fomblin）中孵育。MRI与组织清除和对同一样品进行LSFM兼容。
LSFM通常用于创建大规模显微镜图像，用于目标脑组织的定性可视化，而不是对脑结构进行定量评估（图1）。如果没有定量评估，就很难证明遗传或环境损害造成的结构差异。随着组织清除和成像技术的改进，以及存储和计算能力成本的降低，量化感兴趣组织内的细胞类型定位变得越来越容易，使更多的研究人员能够将这些数据纳入他们的研究中。
随着小鼠大脑中超过 1 亿个细胞15 和可以生成 TB 数据的全脑成像会话，对高级图像分析工具的需求不断增加，这些工具可以准确量化图像中的特征，例如细胞。对于组织清除图像存在许多分割方法，这些方法对核染色强度应用阈值并过滤具有预定义形状，大小或密度10，16，17，18的物体。然而，对结果的不准确解释可能是由于细胞大小、图像对比度和标记强度等参数的变化引起的。本文描述了我们建立的量化小鼠大脑细胞核的方案。首先，我们详细介绍了P4小鼠大脑组织收集的步骤，然后是根据公开可用的iDISCO+方法10优化的组织清除和免疫标记方案。其次，我们描述了使用MRI和光片显微镜进行的图像采集，包括用于捕获图像的参数。最后，我们描述并演示了NuMorph19，这是我们小组开发的一组图像分析工具，可以在组织清除后进行细胞类型特异性定量，使用核标记进行免疫标记以及注释区域的光片成像。
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Protocol
所有小鼠均按照北卡罗来纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）使用并得到其批准。
1.小鼠解剖和灌注
注意：使用注射器对P4和P14小鼠进行以下解剖。灌注液的体积将根据动物的年龄而变化。
- 灌注
注意：多聚甲醛（PFA）是一种危险化学品。在化学通风橱中执行所有灌注步骤。- 手术前，通过腹腔注射（100mg / kg） 给予 戊巴比妥，并使麻醉剂生效。
- 一旦动物达到手术麻醉平面，使用捏脚趾反应方法来确认无反应。
- 在肋骨下方做一个侧切口，露出动物的胸腔。
- 使用弯曲的手术剪刀，小心地从肋骨切开，直到动物一侧的锁骨，并在另一侧做一个相同的切口，让胸骨被抬起，露出心脏。
- 在不损伤降主动脉的情况下，小心修剪任何连接到心脏的组织，然后在右心房做一个小切口，让血液流出脉管系统。
- 使用基于注射器的方法，分别用 10 mL 和 7 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 通过左心室灌注小鼠，用于 P14 和 P4，灌注速率为 1.5 mL/min。
- 清除血液后，分别在4°C下再次用10mL的PBS + 4%PFA和7mL的PBS + 4%PFA对P14和P4进行灌注，灌注速率为1.5mL / min以固定动物。
注意：将观察到固定震颤，动物在完成后会僵硬。如果对样品使用 MRI，则在每个时间点灌注相似体积的 PBS 和 PFA + PFA 溶液中 20% 钆基 MRI 造影剂。 - 使用手术剪刀取出头部，并在4°C下用PBS + 4%PFA放置固定24小时以完全固定。
注意：在这个阶段，大脑保持完整，头骨在上（见第2节）。 暂停点： 大脑在这个阶段可以在4°C的PBS + 0.1%叠氮化钠中储存几个月。
2. 基于MR的完整颅骨脑结构成像和分析
注意：如上所述，大脑必须灌注并在钆中孵育，而不是从颅骨中取出。所有MRI均在从颅骨中取出大脑之前进行，以避免解剖过程中意外的组织损失。在样品制备和成像过程中，完整颅骨成像还为样品架（即注射器）中的大脑提供支持。
- 样品制备
注意：以下步骤针对 P4 和 P14 小鼠大脑样本进行了优化。所需的注射器尺寸将取决于样品的物理尺寸。- 如果对样品进行MRI，则从颅骨中取出皮肤，并在4°C下在PBS + 3%钆中孵育23天，然后再成像14。23天后，在PBS中快速冲洗样品。
- 使用5 mL注射器创建用于MRI的样品架，使用注射器活塞关闭用注射器20制成的支架的每一端。使用塑料片将头骨紧紧固定在支架中（图2A）。用乙醇去除注射器上的标记，以防止成像时出现伪影。
- 将头骨牢固地放入样品架中，并填充与MRI兼容的浸没溶液（参见 材料表）。关闭支架并使用注射器去除所有气泡。
注意： 暂停点： 在成像前，颅骨可以在浸没溶液中储存几个月。
- 脑大体结构成像 （MRI）
- 使用9.4T / 30 cm水平孔动物MRI系统使用15 mm体积线圈和基于自旋回波的序列对样品进行成像，参数如下：空间分辨率：60 μm x 60 μm x 60 μm;总扫描时间：7小时12分钟;回波时间 （TE）： 6.83 毫秒;重复时间： 40 毫秒;激发/重新聚焦翻转角度：90/180度;图像尺寸：166 x 168 x 209体素;视场： 9.9 毫米 x 10.1 毫米 x 12.4 毫米;带宽：100，000 kHz。
- 计算大脑结构分析
- 通过使用分割软件手动追踪小鼠大脑，从原始MRI图像中删除周围的头骨。接下来，在掩模图像和原始 MRI 图像之间应用体素乘法运算，以生成颅骨剥离的脑 MRI 图像。
注意：输出是一个二进制掩码图像，其中脑体素的强度设置为 1 和 0，否则。 - 使用FSL包21，22 中的“调情”应用刚性图像配准（仅估计平移和旋转），以将颅骨剥离的MRI图像（运动图像）与相应的光片显微镜图像（参考图像）对齐。
- 应用非刚性配准（在ANTS软件23中使用“SyN”）以查找步骤2.3.2中的刚性对齐MRI图像与光片图像（步骤2.3.2中的相同参考图像）之间的点对点对应关系。
注意：输出包括翘曲的MRI图像以及与从MRI到光片图像的体积变化相关的变形场。 - 计算步骤 2.3.3 中生成的变形场上的雅可比行列式，该行列式量化了 3 x 3 x 3 体素局部邻域中的体积变化。
- 使用可变形图像配准将颅骨剥离图像与艾伦发育小鼠大脑图谱对齐。
注意：建立的空间点对点对应允许在新鼠标图像中自动注释感兴趣的大脑区域（图 2C-H）。
- 通过使用分割软件手动追踪小鼠大脑，从原始MRI图像中删除周围的头骨。接下来，在掩模图像和原始 MRI 图像之间应用体素乘法运算，以生成颅骨剥离的脑 MRI 图像。
3. 颅骨脑解剖
- 沿着颅骨顶部从颈部到鼻子做一个中线切口，露出头骨。
- 通过修剪掉剩余的颈部肌肉和所有其他残留肌肉来暴露颅底。
- 使用锋利的手术剪刀，沿着颅骨内表面小心地切割，注意不要在用锋利的手术设备切割时保持温和的向上压力来损伤大脑。
- 用镊子将头骨的两半从大脑中剥离出来，并小心地修剪掉附着在大脑上的多余脂肪。
- 使用手术剪刀修剪任何连接大脑和头骨的硬脑膜，然后用刮刀轻轻地将大脑从头部移除。
- 取出大脑，用PBS洗涤，然后用0.1%叠氮化钠换成PBS，并保持在4°C长期储存。
4. 组织清除
注意：此协议改编自P4小鼠6的iDISCO+协议，略有变化。某些细节可能会因不同的时间点/物种/实验而变化）。注意：甲醇、二氯甲烷 （DCM） 和二苄基醚 （DBE） 是危险化学品。这些组织清除步骤在化学通风橱中进行。
- 抗体验证
注意：需要检查未经测试的抗体的甲醇相容性，因为它们可能会受到iDISCO+方案中要求的苛刻甲醇洗涤的负面影响。有关已在iDISCO+中起作用的抗体列表，请参阅网站24。- 将PFA固定感兴趣的组织的10μm冷冻切片收获到立体载玻片上。
- 将切片在100%甲醇中在室温下孵育3小时。
- 在进行标准免疫组织化学方案之前，在PBS中再水合，以确定甲醇洗涤后抗体是否显示出预期的荧光模式。对于阳性对照，使用未用甲醇处理的载玻片。
- 缓冲液制备
- 根据官方iDISCO协议准备缓冲液。有关该协议中使用的缓冲液和其他溶液的组成，请参见 材料表 。
- 预处理
- 用甲醇/PBS系列脱水样品：20%，40%，60%，80%，100%;室温下各1小时。
注意：在脱水期间使用PBS有助于防止样品在甲醇洗涤中破裂。 - 将样品在100%甲醇中洗涤1小时，然后在4°C下冷却1小时，然后在室温下在66%DCM / 33%甲醇中振荡孵育过夜。
- 在室温下用100%甲醇洗涤样品2x，然后在4°C下冷却。
- 使用新鲜的5%H2O2 在甲醇中将样品在4°C下漂白过夜。
- 用甲醇/ PBS系列对样品进行再水化：80%，60%，40%，20%，PBS;在室温下各1小时，并在室温下在PTx.2中洗涤2x1小时。
- 将样品在 1x PBS/0.2% TritonX-100/20% DMSO 中在 37 °C 下孵育过夜。
- 将样品在1x PBS / 0.1%吐温-20 / 0.1%TritonX-100 / 0.1%脱氧胆酸盐/ 0.1%NP40 / 20%DMSO中在37°C孵育过夜。
- 在室温下在PTx.2中洗涤1小时两次。
- 用甲醇/PBS系列脱水样品：20%，40%，60%，80%，100%;室温下各1小时。
- 免疫标记
- 将样品在37°C的透化溶液中孵育2天（~48小时）。
- 将样品在37°C封闭溶液中封闭2天（~48小时）。
- 将样品与一抗在PTwH / 5%DMSO / 3%血清中在37°C孵育4天（~96小时）（例如，兔（Rb）Brn2 / POU3F2 mAb（1：100）和抗Ctip2大鼠（Rt）抗体（1：400）（材料表）。
- 在PTwH中洗涤3 x 1小时。 在PTwH中再洗涤2小时。 在室温下在洗涤溶液中放置过夜。
- 将样品与二抗和核染料（如TO-PRO-3）在PTwH / 3%血清中在37°C孵育4天（~96小时;例如山羊抗Rb（1：50）和（山羊抗Rt（1：200））（材料表）。
- 在PTwH中洗涤3 x 1小时 在PTwH中再洗涤2小时。 在室温下在洗涤溶液中放置过夜。
- 空地
- 在甲醇/ PBS系列中脱水-室温下各20%，40%，60%，80%，100%-1小时。在室温下在66%DCM / 33%甲醇中振荡孵育3小时。
注意：样品可以在100%甲醇脱水后立即在室温下放置过夜。 - 在室温下（振荡）在100%DCM中孵育15分钟两次以洗涤MeOH。
- 在二苄基醚（DBE）中孵育，在室温下不摇动。确保试管几乎完全充满DBE，以防止样品氧化。在成像前倒置几次完成溶液混合。
- 在甲醇/ PBS系列中脱水-室温下各20%，40%，60%，80%，100%-1小时。在室温下在66%DCM / 33%甲醇中振荡孵育3小时。
5. 光片成像
注意：iDISCO组织清除的大脑使用光片显微镜成像，配备2X / 0.5 NA物镜，互补金属氧化物半导体相机以及显微镜操作和图像采集软件，P4时间点为0.75 x 0.75 x 4μm /体素，因为这允许皮层内的单细胞分辨率（图3A，B）。
- 样品安装
- 由于光片显微镜的额定工作距离（5.7 mm减去0.5 mm安全裕度），小心地将样品安装在正确的样品尺寸支架中，使样品的z尺寸深度不超过5.2 mm25。
- 将支架放在样品架中，支架的螺钉与支架支架成45°角（图1B）。放置底座，使光路垂直于样品（图1C）。
- 成像参数
- 将显微镜上的变焦主体设置为4倍放大 倍 率或更高，产生0.75μm/像素。
注意：P4光片图像的单细胞计算分析可以使用任何市售光片显微镜完成，其分辨率为0.75 x 0.75 x 4μm /体素或更高。较低的分辨率对于细胞核分布更稀疏的后期时间点的大脑来说已经足够了。 - 在图像采集软件中，选择NA = ~0.08（9 μm厚度/ 4 μm z步长）的单个光片。
注意：此设置与水平动态聚焦相结合，允许在合理的时间内以小鼠大脑的单细胞分辨率进行全脑成像。对于出生后第 4 天 （P4） 大脑，根据大脑的大小，三个通道的图像采集时间估计为 11-15 小时。 - 为确保沿图像宽度保持轴向分辨率，请选择 水平动态聚焦 并根据激光波长应用建议的步数。对于整个P4小鼠大脑，将水平动态聚焦设置为11。根据配准通道调整每个通道的 精细对焦 。
注意：在这里， TO-PRO-3通道（647 nm） 被注册到艾伦发育小鼠脑图谱中，因为它标记了所有细胞核。 - 根据通道属性调整每个通道的 激光功率 。
注意：与较短的波长相比，较长的波长需要更高的激光功率。例如，780 nm 需要在高激光功率 （70% - 75%） 和低曝光 （50 ms） 下成像，而 647 nm 通道需要平均激光功率 （40% - 45%） 和低曝光 （50 ms）。 - 将 光片宽度 调整为 ~50%， 以确保对于此样本大小，片材功效在 y 维度上最佳分布。
注意：结合水平动态聚焦，50%的纸张宽度在整个图像上提供平均功率分布，并降低光漂白的风险25。 - 根据样本大小设置“图块数”，建议在图块之间重叠 15%，并在给定图块位置为每个堆栈按顺序捕获每个通道的图像。
- 将显微镜上的变焦主体设置为4倍放大 倍 率或更高，产生0.75μm/像素。
6. 使用NuMorph进行图像处理
注意：NuMorph 管道有三个用于 3D 图像分析的主要部分：预处理、分析和评估。这些部分分别分为 NMp_template.m、NMa_template.m 和 NMe_template.m，下面将对此进行讨论。此外，还添加了NM_setup.m，以下载和安装NuMorph顺利运行所需的软件包。NM_samples.m还提供了输入图像采集信息的模板。
- NuMorph 设置
- 下载并安装 Linux26 的 conda 环境管理器。下载并安装 NuMorph19 图像处理工具。
- 在命令行上，运行 Matlab。从NuMorph运行NM_setup.m ，下载并安装分析所需的图像分析软件包。
注意：此步骤可确保正确设置 conda 环境，并确保正确下载和安装 Matlab 运行三个管道中的每一个所需的所有工具和附加组件。这里最值得注意的是用于运行配准的 Elastix 和用于细胞检测和计数的 3D-Unet。
- 通过编辑文件NM_samples.m，指定样本名称、输入和输出目录、通道信息和光片成像参数。
注意：在这里，建议仔细检查以确保正确指定了正确的信息，尤其是图像输入目录。在运行后续步骤之前，通常不会在此处调用错误。 - 图像预处理
- 强度调整
- 在NMp_template中，设置 强度调整 = true。
注意：如果需要调整强度，则设置为 true。如果没有，则设置 强度调整 = false。还有一个选项可以使用“更新”来覆盖以前的调整参数。 - 设置 使用处理的图像 = 使用一组 新图像时 false。否则，在输出目录中指示任何先前保存的图像数据集（例如，“对齐”、“拼接”），以用于后续处理步骤。
注意：在输入图像已预处理的情况下，将提供此选项。在这种情况下，预处理的图像将用作输入图像，并且该选项将设置为输出目录中子目录的名称。 - 设置 保存图像 = true。
注意：使用此选项可确保处理后的图像保存在输出目录中;否则，将仅计算并保存参数。 - 设置 保存样本 = true。
注意：此选项可确保为每个主要步骤保存示例结果。 - 设置调整瓷砖阴影=基本以使用BaSiC算法27应用阴影校正，或使用来自光片显微镜在特定光片宽度下的测量值手动应用瓷砖阴影校正。
注意： 此选项可校正由板材腰部形状引起的沿 y 尺寸的不均匀照明。
- 在NMp_template中，设置 强度调整 = true。
- 图像通道对齐
- 在NMp_template中，设置 通道对齐 = true。如果需要通道对齐，请将此选项设置为 true。如果不是，则设置为 false。将通道对齐方法设置为平移（刚性）或弹性（非刚性）。
注意：平移方法利用刚性 2D 配准方法来对齐多个通道，而弹性方法利用非刚性 B 样条曲线 28 来校正在长图像采集19 期间可能发生的旋转漂移。
- 在NMp_template中，设置 通道对齐 = true。如果需要通道对齐，请将此选项设置为 true。如果不是，则设置为 false。将通道对齐方法设置为平移（刚性）或弹性（非刚性）。
- 迭代图像拼接
- 在NMp_template中，设置 拼接图像 = true。
注意： 如果需要拼接，请将此选项设置为 true。 - 设置 筛选细化 = true。
注意： 此选项用于使用缩放不变特征变换29 进一步细化 xy 中的转换。 - 设置 荷载对齐参数 = true。
注意： 此选项在拼接期间使用通道对齐转换。对于多通道成像，建议使用此选项。否则，设置为 false。 - 设置 重叠 = 0.15 以匹配成像期间的切片重叠。
- 在NMp_template中，设置 拼接图像 = true。
- 要运行这些预处理步骤中的任何一个，请在环境外部的 Matlab 中运行以下命令NMp_template：
- 指定示例名称。设置配置 = NM_config（进程，样本）。
- 通过指定NM_process（config，stage）来运行任何预处理步骤，并使用任何过程的强度、对齐或拼接来指定阶段。检查输出目录中每个阶段的输出文件（图 3 和 图 4）。
- 强度调整
- 图像分析
- 在NuMorph之前
- 从 3D 图集图像和关联的注释图像开始，该图像将每个体素分配给特定结构。
注意：这里使用由麦哲伦映射器30 生成的P4艾伦发育小鼠大脑图谱。 - 对齐图集图像和注释文件，以确保它们在正确的方向上正确匹配。
- 从 3D 图集图像和关联的注释图像开始，该图像将每个体素分配给特定结构。
- 在NuMorph中
注意：现在图集及其注释已正确对齐，必须在NuMorph中“修改”或处理文件，以便可以保存以供以后使用。为此，请使用 munge_atlas 函数指定输入，如下所示。- 指定 Atlas_file：（字符串）。提供图集文件的完整路径。
- 指定 Annotation_file：（字符串）。提供关联批注的完整路径。
- 指定 分辨率：（1x3 数字）。将图集 y，x，z 分辨率指定为每像素微米。
- 指定 方向：（1 x 3 个字符）。提供图谱方向，并确保其与样品在摇篮中的设置相匹配（前（a）/后（p），上（s）/下（i），左（l）/右（r））。
- 指定半球：指定成像的大脑 半球（“左”、“右”、“两者”、“无”）。
- 指定 out_resolution:(int）。指定图集输出的各向同性分辨率（以微米为单位）。（默认值：25）。
- 运行命令“munge_atlas（atlas_file，annotation_file，分辨率，方向，半球）”，在/data/annotation_data中生成被破坏的注释，并在/data/atlas中生成图集图像的副本。
- 阅读 Matlab 结构和图集文件，验证这两个文件是否以正确的方向正确修改。
注意：可以执行额外的细胞分类步骤，以根据免疫标记蛋白标记物的共定位来量化细胞类型。
- 重采样
- 在NMa_template中，如果执行图像配准以引用图集或生成高分辨率数据集的缩减采样体积，则设置 重采样图像 = true。
注意：NMa_template.m 将用于设置重采样、配准、细胞核检测和细胞计数的参数。 - 设置重采样分辨率以匹配图集。
注意：这里使用25μm3/体素各向同性分辨率，因为参考图集处于此分辨率。 - 使用重采样通道 = [ ] 指定要重新采样的通道号。
注意：此处的通道号设置为与核通道匹配。如果此选项为空，则仅对配准通道进行重新采样。
- 在NMa_template中，如果执行图像配准以引用图集或生成高分辨率数据集的缩减采样体积，则设置 重采样图像 = true。
- 注册
- 在NMa_template中，设置 寄存器映像 = true。如果需要注册，则设置为 true。如果不是，则设置注册 = false。
- 指定图集文件以匹配图集目录中的文件。
- 设置 注册参数 = 默认值。
注意：此选项利用仿射后跟 B 样条变换来估计空间对应关系。否则，通过 Elastix 在 /data/elastix_parameter_files/atlas_registration 中定义一组新的注册参数。 - 设置 保存已注册的图像 = true。
注意：配准和重采样的输出文件可以在 Matlab 或其他可视化工具（如 FIJI31）中下载和目视检查。
- 细胞核检测、细胞计数和分类
注意：此处发生的错误可能是由于未正确指定注释文件或示例的年龄与正确的注释不匹配。- 在NMa_template中，设置 计数细胞核 和 分类细胞 = true。
- 设置 计数方法 = 3dunet。
注意：此选项允许使用经过训练的 3D-Unet 模型19。否则，请选择利用黑森州斑点检测方法的黑森州。 - 设置 min_intensity 以定义检测到的对象的最低强度阈值。
注：适当的阈值是根据核标记的信噪比凭经验确定的。 - 将classify_method设置为任一阈值（基于质心位置处的无监督荧光强度）或 svm（对监督线性支持向量机 （SVM） 分类器进行建模）。
注意：此步骤将通过3通道成像将所有检测到的细胞分为四个主要类别。使用此协议，将生成 Ctip2+/Brn2-、Ctip2-/Brn2+、Ctip2-/Brn2- 和异常值。
- 分析步骤
- 指定示例名称。设置配置 =NM_config（分析，样本）。
- 通过指定NM_analyze（配置，阶段）来运行任何分析步骤，并使用重采样、寄存器、计数或分类指定阶段。检查输出目录中每个阶段的输出文件（图 5）。
- 细胞类型分类和分组分析
- 在NMe_template中， 设置 update = true 并覆盖之前计算的所有统计信息。
注意：NMe_template.m 提供了跨被分析的同一大脑的大脑区域执行细胞类型组分析的选项。 - 将compare_structures_by设置为要按所有唯一批注进行比较的索引或设置为根据表比较结构的表。
- 设置 template_file，该指定所有可能的结构索引，并且必须存在于 /annotations 中。
- 设置 structure_table 并指定要评估的结构。
- 指定细胞计数和细胞类型分类，如 NMa_template.m 中所述。
- 设置 compare_groups 以指定要比较的组。
- 将配对设置为 true 或 false 以执行配对 t 检验或双样本 t 检验。
- 在NMe_template中， 设置 update = true 并覆盖之前计算的所有统计信息。
- 运行分析。
注意：要执行此步骤，请在 NMe_template.m 环境之外的 Matlab 中运行以下命令。- 指定示例名称。设置配置 =NM_config（评估，样本）。
- 通过指定 NM_evaluate（配置，阶段） 并指定阶段来运行分析步骤。检查输出目录中的输出文件以进行组分析。
- 在NuMorph之前
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Representative Results
由于iDISCO+协议引入了明显的组织收缩，肉眼很容易注意到（图2B），我们在组织清除之前向该管道中添加了一个MRI步骤，以量化组织清除引起的收缩。工作流程从从MR图像中去除非脑组织开始（图2C）。接下来，应用刚性变换（3个平移和3个旋转角度）将MR图像与光片图像对齐（图2D）。通过这样做，我们观察到组织清除程序引起的60%的总体积损失（图2E），这与肉眼估计的体积变化一致（图2B）。这一结果与之前的报告有很大不同，后者报告的收缩率为5%-10%10，32 。收缩的差异可能是由于两项研究之间的动物年龄差异（P4与成人大脑）或由于iDISCO+方案清除步骤中甲醇洗涤的时间差异（16小时与2小时）引起的。为了绘制大脑不同区域的组织收缩程度，我们进一步部署了一个可变形的图像配准，其中光片图像被用作参考。注册的MR图像如（图2F）所示。由于组织清除程序引起的估计体积变化是用颜色编码的，与其他大脑区域相比，在皮层中观察到更大程度的收缩（图2G）。
为了测量大脑区域的体积，我们通过注册到带注释的图谱来对MRI进行分割。如果参考图谱叠加与原始MRI图像中对比度差异确定的解剖边界紧密匹配，则认为MR成像大脑的分割是成功的（图2H）。配准过程中的叠加取决于良好的样品制备（图2A）、图像采集和颅骨剥离。颅骨剥离步骤对于良好的配准结果至关重要，因为配准将尝试将参考图像从图集扭曲到整个MR图像，包括图像中保留的任何头骨。配准中的颅骨包含可能会扭曲结果，并产生错误配准的分割 3D 体积渲染。然后可以使用ITK-SNAP 33可视化最终的3D 体积渲染（图2H）。该方法用于评估样本组之间的脑总体积差异。MRI发现的细胞基础体积差异可以使用细胞计数与组织清除，光片显微镜和NuMorph进行。
组织清除和分析的目标是通过使用NuMorph计数单个细胞核来评估不同细胞类型对不同实验条件（例如，基因型，环境暴露）差异的贡献。使用iDISCO+协议和神经元层特异性细胞核标记物进行组织清除，导致等皮层中上层和下层神经元的细胞群明确定义（图3）。
使用 NuMorph 进行细胞计数取决于成功的预处理步骤，包括强度调整、通道对齐和拼接（图 4A）。这些步骤中的任何一个中发生的错误都可能导致拼接不当（图4B，C）。例如，不正确的图像采集会导致图像在预处理过程中出现对焦和失焦图案（图4C）。为了计算来自特定大脑区域的细胞核，使用公开可用的图谱对拼接的图像进行注释。我们将拼接的图像注册到P4艾伦发育小鼠大脑图谱34的校正版本。在这里，拼接图像从高分辨率（0.75 x 0.75 x 4 μm³/体素）下采样到较低分辨率（25 μm³/体素各向同性分辨率）以匹配图集的分辨率。匹配图集的分辨率可确保将图像正确配准到图集，并在采集的图像中提供区域注释（图5A）。
为了进行特定的细胞类型特异性计数，我们标记了表达Brn2的上层神经元，表达Ctip2的下层神经元以及使用TO-PRO-3标记了所有细胞核（图3B）。以足够的空间分辨率进行成像以分离单个细胞核（0.75 x 0.75 x 4 μm3/体素）。用NuMorph中经过训练的3D-Unet模型检测细胞核的质心（图5B，C）。我们在等皮层中检测到~12×106 个To-Pro-3+ 的细胞核，包括~2.6×106 Brn2+ 和1.6×106 Ctip2+ 细胞核。我们还分别在基底神经节和海马同种异体皮层中检测到~3.7×106 和2.9×106 To-Pro-3+ 总核。在基底神经节和海马同种异体皮层中分别计数约1.5×106 和<1×6Ctip2 + 细胞，尽管检测到的Brn2 + 细胞数量可以忽略不计（图5D）。等皮层和海马异体皮层的总细胞核计数（~1500万个细胞）与先前报道的小鼠大脑皮层中的总细胞计数相似15。这些结果证明了MRI成像，iDISCO+组织清除方法和NuMorph计算分析的实用性，以揭示实验组之间小鼠大脑结构差异的体积，总细胞计数和细胞类型特异性计数。
图1：完整新生儿3D组织清除小鼠大脑的全脑单细胞分析概述 。 （A）iDISCO+组织清除，光片成像和3D图像分析概述。（B） 在光片显微镜上显示正确样品安装的图像。（C） 显示相对于光片路径的样品安装的卡通。缩写：ab = 抗体。 请点击此处查看此图的大图。
图2：使用MRI测量大体脑结构 。 （A）显示MRI样品制备的图像。（B）iDISCO+组织清除前后代表性P4大脑的图像。比例尺 = 5.0 厘米。 （C） 原始 MR 图像，头骨附着在 60 x 60 x 60 μm³。比例尺 = 800 μm。 （D） 25 x 25 x 25 μm³ 的小鼠大脑光片图像。总体积 = 68.7 mm3.请注意，在用箭头（白色）标记的解剖过程中，背侧等皮层的一小部分被无意中移除。比例尺= 800μm。 （E）颅骨剥离和刚性配准后小鼠大脑的MR图像。总体积 = 171.9 mm3.插入（黄色）显示光片图像中的大脑轮廓。比例尺 = 800 μm。 （F）参考光片图像的注册MR图像以评估变形。比例尺 = 800 μm。 （G） 体素脑映射，用于评估光片图像和 MR 图像之间的体积变化，其中蓝色和红色分别表示从 MR 图像到光片图像的收缩和扩展。总体而言，体积损失为60%，但某些区域（例如等皮层）相对于其他区域显示出更大的收缩。（H） 左图：MRI 图像的轴视图，上面覆盖了来自艾伦发育大脑图谱的注册分割。右图：分割的 3D 体积渲染。比例尺 = 800 μm。缩写：OB = 嗅球;Dpall = 背钝/等皮层;Mb = 中脑;Cb = 小脑。方向：R = 嘀嘀;L = 横向;D = 背侧。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：细胞分辨率图像和通道对齐。 （A）TO-PRO-3（TP3）核染色的光学轴向切片和P4小鼠大脑中Ctip2（下层神经元）和Brn2（上层神经元）标记物的免疫标记。比例尺 = 1 mm. （B） A（框）中皮质区域的扩大插图显示正确的通道对齐，符合 Brn2 免疫标记的上层和 Ctip2 免疫标记的下层神经元的预期定位。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：图像拼接示例。 （A） 来自 2D 迭代、正确拼接图像的样本结果。比例尺 = 1 毫米。“插入”显示了放大的正确拼接示例。比例尺 = 500 μm。 （B） 来自 2D 迭代、错误拼接图像的样本结果。比例尺 = 1 毫米。“插入”显示放大（悬垂）的拼接不正确的示例。比例尺 = 100 μm。 （C） 来自 2D 迭代错误拼接图像的样本结果。比例尺 = 1 毫米。“插入”显示放大（失焦）的错误拼接示例。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：P4 小鼠大脑中的低分辨率图像配准、高分辨率细胞核检测和细胞计数。 （A） 左图：全脑光片 3D 图像中的 z 切片示例，重新采样为 25 μm 各向同性分辨率。比例尺 = 1 毫米。中间面板：来自艾伦发育大脑图谱（P4）的注释，记录在显微镜图像上。比例尺 = 1 毫米。右面板：左侧和中间面板的叠加。比例尺 = 1 mm。 （B） 轴视图中强度调整的拼接图像示例。框内区域如 （C） 所示。比例尺 = 1 毫米。 （C） 自动检测细胞核（红色）。比例尺 = 50 μm。 （D） P4 大脑不同大脑区域（基底神经节、海马异体皮层和等皮层）细胞类型的定量。红色 = 用 Brn2 标记的上层神经元，绿色 = 用 Ctip2 标记的下层神经元，蓝色 = 所有用 To-Pro-3 染料标记的细胞核。缩写：DPall = 背钝（等皮层）;MPall = 内侧钝（海马同种异体皮层）;CSPall = 中央钝下（经典基底神经节）。 请点击此处查看此图的大图。
| NuMorph分析阶段 | 预计时间 |
| 强度调整 | 1 小时 |
| 通道对齐 | 2 分钟 |
| 2D 迭代拼接 | 12小时 |
| 重采样 | 3 分钟 |
| 注册 | 3 分钟 |
| 细胞计数 | 5小时 |
| 细胞分类 | 10 分钟 |
表1：NuMorph分析时间。
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Discussion
组织清除方法是测量大脑3D细胞组织的有用技术。文献中描述了许多组织清除方法，每种方法都有其优点和局限性6，7，8，9。用于分析组织清除图像中细胞类型的计算工具的选项相对有限。其他可用的工具已经实施到稀疏细胞群，其中分割难度较低10，35或利用了组织扩增16。本文描述了用于iDISCO+组织清除成像的小鼠大脑的准备，并展示了NuMorph，这是一种计算管道，用于处理和量化LSFM捕获的小鼠皮层结构内的细胞核。它旨在在成像时间的长度、细胞核的检测精度和计算资源之间取得适当的平衡。该管道与其他当前可用的工具形成对比，通过可靠地分割所有细胞核，而不是稀疏的标记细胞群10，36，37。我们之前已经证明，与其他方法相比，细胞检测精度很高，成像时间明显缩短，整个半球采集的采集数据量也大大减少19。NuMorph解决了分析多通道光片图像的许多重要挑战，例如提供通道对齐工具，使用拼接工具校正舞台运动以及校正图像图块中的信号亮度。本文中介绍的工作流程对更广泛的科学界很有用，研究机构的所有群体都可以访问。该过程的概述如图 1 所示。
从小鼠灌注到计算分析，整个过程有几个关键步骤会影响图像的下游质量、定量和结果。必须进行灌注，以便将所有血液从大脑中取出，因为血管具有自然的自发荧光，会影响图像中的强度，并且需要在管道中进行调整，从而对结果产生不利影响。PFA固定的持续时间也至关重要，因为将大脑浸没在4%PFA中超过24小时可能会导致样品“过度固定”并导致大脑破裂，在iDISCO+过程中变得脆弱。上述iDISCO协议与网站24上的官方协议略有修改。一个重要的修改是在甲醇/PBS系列中添加了PBS，而不是原始方案中的水。这是为了防止胚胎和出生后早期大脑的皮质破裂，这可能是由于神经胶质细胞、轴突突和细胞外基质发育不完全造成的。根据该方案中使用的组织，iDISCO+方案的每一步都可能需要进行修改，例如改变抗体浓度和增加较大组织样品的孵育时间，以优化理想参数以捕获所选标记物并准确分析。
已知组织收缩发生在iDISCO+组织清除过程中，这可能会改变下游的体积测量6，10。替代方法，例如在组织清除之前进行的MRI，可用于确定对照组与实验动物相比组织大小的任何变化程度，以确定任何体积差异是否是由于研究的表型而不是组织清除过程。突变体皮质区域体积的异质变化可能因区域细胞含量而异，因为大脑的灰质和白质可能受到甲醇脱水的不同影响。MRI数据可用于确定整个大脑亚区域中的组织收缩是否不均匀（图2G），并且可以在下游计算分析中调整清除方案引起的任何变化。此外，iDISCO+工艺使用苛刻的甲醇洗涤来脱水样品，这可能导致细胞核表面某些抗原的损伤或改变。建议首先在100%甲醇中洗涤~3小时的脑组织切片上测试所使用的任何抗体，以确保抗体与iDISCO+方案兼容。
对于需要较长处理时间的大型数据集，我们建议在 Linux 中使用 MATLAB 的无窗口版本，该版本允许实施“nohup”命令等策略，即使在与服务器的连接丢失后，该命令也会继续运行进程。此外，NuMorph需要高计算能力，因此我们建议至少使用10 GB内存进行分析。我们使用运行 CentOS 7 的 Linux 工作站分析样本，该工作站配备了 2.6 GHz 14 核处理器、8 x 64 GB DDR4 2400 LRDIMM 内存、4 x 11 GB GPU 和 2 个 4TB 外部 SSD。此处使用的原始光片数据为 620 GB，进程的内存要求为 10 GB。在这里，我们包括了一个表格，其中包含完成NuMorph分析每个步骤的估计时间，如 表1所示。
图像预处理步骤涉及每个 z 平面的 xy 维度强度调整、通道对齐和拼接。调整图像强度以考虑图块之间的强度差异和沿 y 维度的不均匀照明。强度的差异是由于光片在瓷砖25之间成像时的固有技术特性而发生的。接下来，执行通道对齐以确保图像通道在多通道成像中正确对齐。建议使用此步骤，因为多通道成像中的每个通道都是单独采集的，载物台的细微移动可能会导致样品漂移并导致空间错位19。最后，然后将每个 z 平面的图块拼接在一起，以在每个 z 平面中形成单个图像。最后，每个通道将有一堆拼接图像，代表样品的整个体积。所述迭代图像拼接基于定制方法，以在样品19的3D体积中组织每个通道的所有2D图像。该方法首先在轴向上实现成对 z 对应，以匹配在水平和垂直方向上重叠的切片区域。每个图块的最终 z 位移使用最小生成树38 确定。2D 迭代拼接在堆栈中执行，从堆栈中心的背景信号较少的位置开始。每次拼接迭代时，左上角的拼贴都放在最前面，以防止图像在 z 维度上的细微偏移。
建议按顺序运行每个预处理管道，尤其是在优化以更正错误时。主要问题经常发生在拼接步骤中。可能出现的一个问题是光片上的图像采集不正确。当水平动态聚焦在光片上设置不正确时，可能会出现此问题，并可能导致图像中交替的同相/异相图案（图4B，C）。如果样品未牢固固定，并且在采集过程中发生明显的样品移动，则可能会出现其他错误。在这些情况下，由于相邻图块之间缺乏成对对应关系，可能无法进行准确的拼接。其他潜在错误可能源于缝合起始部位。NuMorph大致确定堆栈中间的缝合起始位点。但是，当起始切片站点中存在重要背景时，图像磁贴中的成对比较可能会出现错误。这里建议选择信噪比高的起始位点。
此处描述的图像分析包括将拼接图像从高分辨率（0.75 x 0.75 x 4 μm³/体素）重新采样到较低的各向同性分辨率（25 μm³/体素）。我们从核通道重新采样拼接的图像，以在下一步34中将拼接的图像注册到艾伦发育小鼠大脑图谱中。然后使用经过训练的3D-Unet模型19，参考图集，参考图集，对图像注释区域中的每个通道的细胞进行计数。此方法还可用于检测和计数 blob 对象。在开发NuMorph时，我们测试了相对于训练期间从未见过的全新图像的分割精度，这些图像来自相同的组织清除程序，相同的显微镜和相同的核标记发现精度为0.99，召回率为0.9419。NuMorph的准确性尚未在不同的组织清除程序，显微镜或标记物上进行测试;因此，其他实验设计中分割的准确性是未知的。NM_setup.m 中的默认图集是成人 Nissl 染色的艾伦参考图集39 ，其中艾伦小鼠大脑通用坐标框架 （CCFv3） 的第三次迭代作为自定义注释。
虽然NuMorph可以有效地分析相对密集的组织，例如成年小鼠皮层，但更具挑战性的实验设计（例如胚胎小鼠大脑或高密度结构，例如小脑）可能需要开发额外的计算工具。目前基于社区的努力正试图产生足够的注释数据，用于训练用于分割这些更困难案例的深度学习模型40.光片成像技术的进步允许对亚细胞结构进行高通量定量研究，双视图倒置选择性平面照明显微镜（diSPIM）等新方法提高了细胞密集大脑区域的分辨率和准确性40，41。随着本研究中涉及的组织清除，成像和计算工具的进步，我们希望它们将导致组织清除方法的更广泛使用，以定量分析神经精神疾病如何源于遗传或环境风险因素引起的大脑结构改变。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH（R01MH121433，R01MH118349和R01MH120125到JLS和R01NS110791到GW）和希望基金会的支持。我们感谢显微镜服务实验室的Pablo Ariel协助样品成像。病理学和检验医学系的显微镜服务实验室得到了癌症中心核心支持拨款P30 CA016086对北卡罗来纳大学（UNC）Lineberger综合癌症中心的部分支持。神经科学显微镜核心由拨款P30 NS045892支持。本出版物中报告的研究部分得到了北卡罗来纳州生物技术中心机构支持补助金2016-IDG-1016的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB external SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
| gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
| Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
| ITK Snap | segmentation software | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
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