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Neuroscience

Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit les méthodes d’imagerie par résonance magnétique, d’effacement et d’immunomarquage de cerveaux de souris intacts à l’aide d’iDISCO+, suivies d’une description détaillée de l’imagerie à l’aide de la microscopie à feuille de lumière et des analyses en aval à l’aide de NuMorph.

Abstract

Le nettoyage des tissus suivi de la microscopie à feuille de lumière (LSFM) permet l’imagerie à résolution cellulaire de la structure cérébrale intacte, permettant une analyse quantitative des changements structurels causés par des perturbations génétiques ou environnementales. L’imagerie du cerveau entier permet une quantification plus précise des cellules et l’étude des différences spécifiques à la région qui peuvent être manquées avec la microscopie couramment utilisée des tissus sectionnés physiquement. L’utilisation de la microscopie à feuille de lumière pour imager les cerveaux dégagés augmente considérablement la vitesse d’acquisition par rapport à la microscopie confocale. Bien que ces images produisent de très grandes quantités de données structurelles sur le cerveau, la plupart des outils informatiques qui effectuent la quantification des caractéristiques dans les images de tissus clairsemés se limitent à compter des populations de cellules clairsemées, plutôt que tous les noyaux.

Ici, nous démontrons NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un groupe d’outils d’analyse, pour quantifier tous les noyaux et marqueurs nucléaires dans les régions annotées d’un cerveau de souris postnatal du jour 4 (P4) après élimination et imagerie au microscope à feuille de lumière. Nous décrivons l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour mesurer le volume cérébral avant le rétrécissement causé par les étapes de déshydratation de l’élimination des tissus, le nettoyage des tissus à l’aide de la méthode iDISCO +, y compris l’immunomarquage, suivi de la microscopie à feuille de lumière à l’aide d’une plate-forme disponible dans le commerce pour imager les cerveaux de souris à la résolution cellulaire. Nous démontrons ensuite ce pipeline d’analyse d’images à l’aide de NuMorph, qui est utilisé pour corriger les différences d’intensité, assembler des tuiles d’image, aligner plusieurs canaux, compter les noyaux et annoter les régions du cerveau grâce à l’enregistrement dans des atlas accessibles au public.

Nous avons conçu cette approche à l’aide de protocoles et de logiciels accessibles au public, permettant à tout chercheur disposant du microscope et des ressources informatiques nécessaires pour effectuer ces techniques. Ces outils de nettoyage tissulaire, d’imagerie et de calcul permettent de mesurer et de quantifier l’organisation tridimensionnelle (3D) des types cellulaires dans le cortex et devraient être largement applicables à toute conception d’étude de souris de type sauvage / knockout.

Introduction

L’imagerie du cerveau entier à une résolution unicellulaire est un défi important en neurosciences. Les images cérébrales à résolution cellulaire permettent une analyse détaillée et une cartographie au niveau du système des circuits cérébraux et de la façon dont ces circuits sont perturbés par des facteurs de risque génétiques ou environnementaux de troubles neuropsychiatriques, le comportement cellulaire dans les embryons en développement, ainsi que les circuits neuronaux dans le cerveau adulte 1,2,3. Il existe de multiples méthodes histologiques qui permettent d’obtenir des images haute résolution du cerveau 3D reconstruit; cependant, ces techniques nécessitent un équipement spécialisé coûteux, peuvent ne pas être compatibles avec l’immunomarquage, et la nature bidimensionnelle (2D) de certaines méthodes peut entraîner des lésions tissulaires et un cisaillement pendant la sectionnement 4,5.

Les progrès récents ont fourni une approche alternative pour l’imagerie de cerveaux entiers qui ne nécessite pas de section de tissu; Ils impliquent l’utilisation de l’élimination des tissus pour rendre les cerveaux transparents. La transparence est obtenue dans la plupart des méthodes de nettoyage tissulaire en éliminant les lipides, car ils sont une source majeure de diffusion de la lumière, et en faisant correspondre l’indice de réfraction (RI) de l’objet avec l’IR de la solution d’immersion de l’échantillon pendant l’imagerie. La lumière peut alors traverser la frontière entre les matériaux sans être dispersée 6,7,8,9.

Les méthodes de nettoyage tissulaire, telles que iDISCO+, sont souvent combinées à une imagerie 3D rapide utilisant la microscopie d’excitation monophotonique, telle que LSFM 6,7,10. Dans les tissus transparents marqués avec un fluorophore, la microscopie à fluorescence à feuille de lumière présente des coupes par excitation avec un mince plan de lumière11. Le principal avantage de LSFM est qu’une seule section optique est éclairée à la fois, toute la fluorescence des molécules de cette section étant excitée, ce qui minimise le photoblanchiment. De plus, l’imagerie d’une tranche optique entière permet de détecter cette tranche excitée par caméra, ce qui augmente la vitesse par rapport au balayage ponctuel12. LSFM produit de manière non destructive des sections optiques bien enregistrées qui conviennent à la reconstruction 3D.

Alors que la méthode iDISCO+ permet un nettoyage des tissus peu coûteux en ~3 semaines, les étapes de déshydratation du protocole peuvent entraîner un rétrécissement des tissus et une altération potentielle de la morphologie de l’échantillon, affectant ainsi les mesures volumétriques 6,10. L’ajout d’une méthode d’imagerie secondaire, telle que l’IRM, à utiliser avant la procédure de nettoyage des tissus peut mesurer le degré de rétrécissement induit par le nettoyage des tissus dans l’échantillon. Au cours des étapes de déshydratation, les différences de propriétés mécaniques entre la substance grise et la substance blanche peuvent entraîner des déformations non uniformes de la matière cérébrale, entraînant des déformations volumétriques dissemblables induites par la clairance tissulaire entre les échantillons de type sauvage et mutant, et peuvent confondre les interprétations des différences volumétriques dans ces échantillons10,13 . L’IRM est réalisée en perfusant d’abord l’animal avec un agent de contraste (p. ex. gadolinium), puis en incubant le tissu extrait d’intérêt dans une solution d’immersion (p. ex. fombline) avant l’imagerie14. L’IRM est compatible avec le nettoyage tissulaire et la réalisation de LSFM sur le même échantillon.

LSFM est souvent utilisé pour créer des images de microscopie à grande échelle pour la visualisation qualitative du tissu cérébral d’intérêt plutôt que pour l’évaluation quantitative de la structure du cerveau (Figure 1). Sans évaluation quantitative, il est difficile de démontrer les différences structurelles résultant d’agressions génétiques ou environnementales. À mesure que les technologies de nettoyage et d’imagerie des tissus s’améliorent, ainsi que la diminution des coûts de stockage et de puissance de calcul, la quantification des localisations des types cellulaires dans le tissu d’intérêt devient plus accessible, ce qui permet à un plus grand nombre de chercheurs d’inclure ces données dans leurs études.

Avec plus de 100 millions de cellules dans le cerveau de la souris15 et des séances d’imagerie du cerveau entier qui peuvent générer des téraoctets de données, il existe une demande accrue d’outils d’analyse d’images avancés qui permettent une quantification précise des caractéristiques des images, telles que les cellules. Il existe une foule de méthodes de segmentation pour les images effacées par les tissus qui appliquent un seuil pour l’intensité de la coloration nucléaire et filtrent les objets avec des formes, des tailles ou des densités prédéfinies10,16,17,18. Cependant, des interprétations inexactes des résultats peuvent résulter de variations de paramètres tels que la taille de la cellule, le contraste de l’image et l’intensité de l’étiquetage. Cet article décrit notre protocole établi pour quantifier les noyaux cellulaires dans le cerveau de la souris. Tout d’abord, nous détaillons les étapes de collecte de tissus du cerveau de souris P4, suivies d’un protocole de nettoyage tissulaire et d’immunomarquage optimisé à partir de la méthode iDISCO+10 accessible au public. Deuxièmement, nous décrivons l’acquisition d’images à l’aide de l’IRM et de la microscopie à feuille de lumière, y compris les paramètres utilisés pour capturer des images. Enfin, nous décrivons et démontrons NuMorph19, un ensemble d’outils d’analyse d’images que notre groupe a développés et qui permet la quantification spécifique du type cellulaire après nettoyage des tissus, l’immunomarquage avec des marqueurs nucléaires et l’imagerie par feuille de lumière des régions annotées.

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Protocol

Toutes les souris ont été utilisées conformément et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

1. Dissection et perfusion de souris

NOTE: Les dissections suivantes ont été effectuées sur des souris P4 et P14 à l’aide d’une seringue. Le volume de liquide de perfusion variera en fonction de l’âge de l’animal.

  1. Perfusion
    ATTENTION : Le paraformaldéhyde (PFA) est un produit chimique dangereux. Effectuer toutes les étapes de perfusion dans une hotte chimique.
    1. Avant la chirurgie, administrer du pentobarbital par injection intrapéritonéale (100 mg / kg) et laisser l’anesthésique faire effet.
    2. Une fois que l’animal a atteint un plan chirurgical d’anesthésie, utilisez la méthode de réponse par pincement des orteils pour confirmer l’absence de réponse.
    3. Faites une incision latérale sous la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique de l’animal.
    4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux incurvés, coupez soigneusement à travers la cage thoracique jusqu’à la clavicule d’un côté de l’animal et faites une coupe identique du côté opposé, permettant au sternum d’être soulevé, exposant le cœur.
    5. Sans endommager l’aorte descendante, coupez soigneusement tout tissu relié au cœur avant de faire une petite incision sur l’oreillette droite pour permettre au sang de s’écouler hors du système vasculaire.
    6. À l’aide d’une méthode à base de seringue, perfuser la souris à travers le ventricule gauche avec 10 mL et 7 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour P14 et P4, respectivement, avec un taux de perfusion de 1,5 mL/min à travers le système.
    7. Une fois le sang éliminé, perfuser à nouveau avec 10 mL de PBS + 4% PFA et 7 mL de PBS + 4% PFA pour P14 et P4, respectivement, à 4 °C avec un taux de perfusion de 1,5 mL/min pour fixer l’animal.
      REMARQUE: Des tremblements de fixation seront observés et l’animal sera raide à la fin. Si vous utilisez l’IRM sur des échantillons, perfuser avec des volumes similaires de PBS et de PFA pour chaque point temporel + 20% d’agent de contraste IRM à base de gadolinium dans la solution PFA.
    8. Retirer la tête à l’aide de ciseaux chirurgicaux et poser avec du PBS + 4% PFA pendant 24 h à 4 °C pour une fixation complète.
      REMARQUE: À ce stade, le cerveau reste intact avec le crâne (voir rubrique 2). Point de pause: les cerveaux peuvent être stockés pendant plusieurs mois à ce stade dans du PBS + 0,1% d’azoture de sodium à 4 °C.

2. Imagerie de la structure cérébrale globale basée sur l’IRM avec crâne intact et analyse

REMARQUE: Le cerveau doit être perfusé et incubé dans le gadolinium comme décrit ci-dessus sans être retiré du crâne. Toute IRM se produit avant l’ablation du cerveau du crâne pour éviter la perte tissulaire involontaire pendant la dissection. L’imagerie avec un crâne intact fournit également un soutien au cerveau dans le porte-échantillon (c.-à-d. seringue) pendant la préparation et l’imagerie de l’échantillon.

  1. Préparation des échantillons
    REMARQUE: Les étapes suivantes sont optimisées pour les échantillons de cerveau de souris P4 et P14. La taille de la seringue nécessaire dépendra de la taille physique de l’échantillon.
    1. Si vous effectuez une IRM sur l’échantillon, retirer la peau du crâne et incuber dans PBS + 3% de gadolinium pendant 23 jours à 4 °C avant l’imagerie14. Après 23 jours, rincer rapidement les échantillons dans PBS.
    2. Utilisez des seringues de 5 mL pour créer un porte-échantillon pour l’IRM, en utilisant des pistons de seringue pour fermer chaque extrémité du support fabriqué avec la seringue20. Utilisez des morceaux de plastique pour maintenir le crâne bien en place dans le support (figure 2A). Enlevez les marques sur la seringue avec de l’éthanol pour éviter les artefacts lors de l’imagerie.
    3. Placez solidement le crâne dans le porte-échantillon et remplissez-le avec une solution d’immersion compatible avec l’IRM (voir le tableau des matériaux). Fermez le support et retirez toutes les bulles d’air à l’aide d’une seringue.
      REMARQUE: Point de pause: Le crâne peut être stocké dans la solution d’immersion pendant plusieurs mois avant l’imagerie.
  2. Imagerie de la structure cérébrale globale (IRM)
    1. Imagez les échantillons avec un système d’IRM animale à alésage horizontal de 9,4 T/30 cm à l’aide d’une bobine de volume de 15 mm et d’une séquence basée sur l’écho de spin avec les paramètres suivants : Résolution spatiale : 60 μm x 60 μm x 60 μm ; Temps total d’analyse: 7 h 12 min; temps d’écho (TE): 6,83 ms; temps de répétition (TR): 40 ms; angles de retournement d’excitation/recentrage : 90/180 degrés ; Taille de l’image: 166 x 168 x 209 voxels; Champ de vision (FOV) : 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm ; bande passante : 100 000 kHz.
  3. Analyse computationnelle de la structure cérébrale globale
    1. Retirez le crâne environnant des images IRM brutes en traçant manuellement le cerveau de la souris à l’aide d’un logiciel de segmentation. Ensuite, appliquez l’opération de multiplication au niveau du voxel entre l’image du masque et l’image IRM brute pour générer l’image IRM cérébrale dénudée du crâne.
      REMARQUE: La sortie est une image de masque binaire où l’intensité pour les voxels cérébraux est définie sur 1 et 0 autrement.
    2. Appliquer l’enregistrement d’image rigide (estimation uniquement de la translation et de la rotation) en utilisant « flirt » dans le paquet FSL21,22 pour aligner l’image IRM dénudée du crâne (image en mouvement) à l’image de microscopie à feuille de lumière correspondante (image de référence).
    3. Appliquez l’enregistrement non rigide (en utilisant 'SyN' dans le logiciel ANTS23) pour trouver les correspondances point à point entre l’image IRM alignée rigide à l’étape 2.3.2 et l’image de feuille de lumière (même image de référence à l’étape 2.3.2).
      REMARQUE: La sortie inclut l’image IRM déformée et le champ de déformation associé aux changements de volume de l’IRM aux images de feuille de lumière.
    4. Calculer le déterminant jacobien sur le champ de déformation généré à l’étape 2.3.3, qui quantifie le changement de volume dans un voisinage local de 3 x 3 x 3 voxels.
    5. Alignez les images dénudées du crâne sur l’Atlas du cerveau de souris Allen Developmental à l’aide de l’enregistrement d’images déformables.
      REMARQUE : La correspondance spatiale point à point établie permet l’annotation automatique des régions cérébrales d’intérêt dans la nouvelle image de la souris (Figure 2C-H).

3. Dissection cérébrale du crâne

  1. Faites une incision médiane le long du haut du crâne, du cou au nez pour exposer le crâne.
  2. Exposez la base du crâne en coupant le muscle du cou restant et tout autre muscle résiduel.
  3. À l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants, coupez soigneusement le long de la surface interne du crâne, en prenant soin de ne pas endommager le cerveau en maintenant une légère pression ascendante tout en coupant avec l’équipement chirurgical tranchant.
  4. Utilisez une pince à épiler pour décoller les deux moitiés coupées du crâne loin du cerveau et couper soigneusement l’excès de graisse attaché au cerveau.
  5. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper toute dure-mère qui relie le cerveau au crâne, puis utilisez une spatule pour retirer doucement le cerveau de la tête.
  6. Retirer le cerveau, laver avec du PBS, puis passer au PBS avec de l’azoture de sodium à 0,1% et conserver à 4 °C pour un stockage à long terme.

4. Nettoyage des tissus

REMARQUE: Ce protocole est adapté du protocole iDISCO + pour les souris P46, avec des modifications mineures. Certains détails peuvent changer pour différents points temporels / espèces / expériences). ATTENTION : Le méthanol, le dichlorométhane (DCM) et l’éther dibenzylique (DBE) sont des produits chimiques dangereux. Ces étapes de nettoyage des tissus sont effectuées dans une hotte chimique.

  1. Validation des anticorps
    REMARQUE: La compatibilité au méthanol des anticorps non testés doit être vérifiée car ils peuvent être affectés négativement par les lavages sévères au méthanol requis dans le protocole iDISCO +. Pour une liste des anticorps qui ont fait leurs preuves dans iDISCO+, consultez le site Web24.
    1. Prélever des sections congelées de 10 μm du tissu d’intérêt fixé au PFA sur des lames stéréologiques.
    2. Incuber les sections dans du méthanol à 100% pendant 3 h à température ambiante.
    3. Réhydratez-vous dans PBS avant de procéder aux protocoles d’immunohistochimie standard pour déterminer si l’anticorps présente le modèle de fluorescence attendu après le lavage au méthanol. Pour un contrôle positif, utilisez une lame non traitée au méthanol.
  2. Préparation du tampon
    1. Préparez les tampons selon le protocole officiel iDISCO. Voir le tableau des matériaux pour la composition des tampons et autres solutions utilisées dans ce protocole.
  3. Prétraitement
    1. Déshydrater l’échantillon avec la série méthanol/PBS : 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 %; 1 h chacun à température ambiante.
      REMARQUE: L’utilisation de PBS pendant la déshydratation aide à prévenir la fissuration des échantillons lors des lavages au méthanol.
    2. Laver l’échantillon dans du méthanol à 100 % pendant 1 h, puis refroidir à 4 °C pendant 1 h avant d’incuber pendant une nuit en agitant dans du méthanol à 66 % de DCM/33 % à température ambiante.
    3. Lavez l’échantillon 2x dans du méthanol à 100% à température ambiante, puis refroidissez-le à 4 °C.
    4. Utiliser du méthanol frais à 5 %H2O2dans du méthanol pour blanchir l’échantillon pendant une nuit à 4 °C.
    5. Réhydrater l’échantillon avec la série méthanol/PBS : 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, PBS; 1 h chacun à température ambiante et laver 2x pendant 1 h dans PTx.2 à température ambiante.
    6. Incuber l’échantillon dans 1x PBS/0,2 % TritonX-100/20 % de DMSO à 37 °C pendant la nuit.
    7. Incuber l’échantillon dans 1x PBS/0,1 % Tween-20/0,1 % TritonX-100/0,1 % de désoxycholate/0,1 % NP40/20 % de DMSO à 37 °C pendant la nuit.
    8. Laver deux fois au PTx.2 à température ambiante pendant 1 h.
  4. Immunomarquage
    1. Incuber les échantillons dans une solution de perméabilisation à 37 °C pendant 2 jours (~48 h).
    2. Bloquer les échantillons dans la solution de blocage à 37 °C pendant 2 jours (~48 h).
    3. Incuber les échantillons avec des anticorps primaires dans le sérum PTwH / 5 % DMSO / 3 % à 37 °C pendant 4 jours (~96 h) (p. ex. anticorps monoclonal Brn2/POU3F2 (1:100) et anticorps anti-Ctip2 rat(Rt) (1:400) (tableau des matériaux).
    4. Lavez 3 x 1 h dans PTwH. Laver encore 2 h dans PTwH. Laisser dans la solution de lavage toute la nuit à température ambiante.
    5. Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire et un colorant nucléaire, tel que TO-PRO-3, dans du sérum PTwH / 3% à 37 °C pendant 4 jours (~96 h; par exemple, anti-Rb de chèvre (1:50) et (anti-Rt de chèvre (1:200)) (Tableau des matériaux).
    6. Laver 3 x 1 h dans PTwH Laver pendant encore 2 h dans PTwH. Laisser dans la solution de lavage toute la nuit à température ambiante.
  5. Clairière
    1. Déshydrater dans la série méthanol/PBS - 20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h chacun à température ambiante. Incuber pendant 3 h, en agitant, dans 66% DCM / 33% méthanol à température ambiante.
      NOTE: L’échantillon peut être laissé toute la nuit à température ambiante immédiatement après la déshydratation dans du méthanol à 100%.
    2. Incuber à 100% DCM pendant 15 min deux fois à température ambiante (avec agitation) pour laver le MeOH.
    3. Incuber dans l’éther dibenzylique (DBE) sans agiter à température ambiante. Assurez-vous que le tube est rempli presque complètement de DBE pour éviter l’oxydation de l’échantillon. Terminez de mélanger la solution en l’inversant plusieurs fois avant l’imagerie.

5. Imagerie par feuille de lumière

REMARQUE: Les cerveaux nettoyés par les tissus iDISCO ont été imagés avec un microscope à feuille de lumière, équipé d’un objectif 2X / 0,5 NA, d’une caméra semi-conductrice complémentaire à oxyde métallique et d’un logiciel de fonctionnement et d’acquisition d’images à 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel pour le point de temps P4, car cela permettait une résolution unicellulaire dans le cortex (Figure 3A, B).

  1. Montage de l’échantillon
    1. Montez soigneusement l’échantillon dans le porte-échantillon approprié de manière à ce que l’échantillon soit orienté avec une profondeur maximale de 5,2 mm de dimension z en raison de la distance de travail nominale du microscope à feuille de lumière (5,7 mm moins marge de sécurité de 0,5 mm)25.
    2. Placer le support dans le socle d’échantillon avec la vis du support à un angle de 45° par rapport aux supports du berceau (figure 1B). Positionner le berceau de manière à ce que le trajet de la lumière soit perpendiculaire à l’échantillon (figure 1C).
  2. Paramètres d’imagerie
    1. Réglez le corps du zoom sur le microscope sur un grossissement 4x ou supérieur pour obtenir 0,75 μm/pixel.
      REMARQUE: Les analyses informatiques à cellule unique sur des images de feuille de lumière P4 peuvent être effectuées avec n’importe quel microscope à feuille de lumière disponible dans le commerce qui permet une résolution de 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel ou plus. Une résolution plus faible est suffisante pour les cerveaux à des moments ultérieurs dans lesquels les noyaux sont plus peu distribués.
    2. Dans le logiciel d’acquisition d’images, sélectionnez une seule feuille de lumière avec un NA = ~0,08 (épaisseur 9 μm/pas de 4 μm z).
      REMARQUE: Ce réglage combiné à la focalisation dynamique horizontale permet l’imagerie du cerveau entier à une résolution unicellulaire du cerveau d’une souris dans un délai raisonnable. Pour un cerveau postnatal du jour 4 (P4), le temps d’acquisition d’images est estimé à 11-15 h pour trois canaux en fonction de la taille du cerveau.
    3. Pour vous assurer que la résolution axiale est maintenue sur toute la largeur de l’image, sélectionnez Mise au point dynamique horizontale et appliquez le nombre d’étapes recommandé en fonction de la longueur d’onde laser. Pour un cerveau de souris P4 entier, réglez la mise au point dynamique horizontale sur 11. Ajustez Fine Focus pour chaque canal par rapport au canal d’enregistrement.
      REMARQUE: Ici, le canal TO-PRO-3 (647 nm) est enregistré dans l’Atlas du cerveau de souris Allen Developmental car il marque tous les noyaux.
    4. Ajustez la puissance laser par canal par rapport aux propriétés du canal.
      REMARQUE: Les longueurs d’onde plus longues nécessitent une puissance laser plus élevée par rapport aux longueurs d’onde plus courtes. Par exemple, le 780 nm doit être imagé à une puissance laser élevée (70% - 75%) et une faible exposition (50 ms), tandis que le canal 647 nm nécessite une puissance laser moyenne (40% - 45%) et une faible exposition (50 ms).
    5. Ajustez la largeur de la feuille de lumière à ~50 % pour vous assurer que la puissance de la feuille est répartie de manière optimale dans la dimension y pour cette taille d’échantillon.
      REMARQUE: En combinaison avec la mise au point dynamique horizontale, une largeur de feuille de 50% fournit une répartition moyenne de la puissance sur l’image avec un risque réduit de photoblanchiment25.
    6. Définissez le nombre de tuiles par rapport à la taille de l’échantillon avec un chevauchement recommandé de 15 % entre les tuiles, et capturez des images pour chaque canal séquentiellement pour chaque pile à une position de tuile donnée.

6. Traitement d’images à l’aide de NuMorph

REMARQUE : Le pipeline NuMorph comporte trois parties principales pour l’analyse d’images 3D : prétraitement, analyse et évaluation. Ces parties ont été organisées en NMp_template heures, NMa_template heures et NMe_template heures, respectivement, qui sont examinées ci-dessous. De plus, NM_setup.m est ajouté pour télécharger et installer les packages logiciels nécessaires au bon fonctionnement de NuMorph. NM_samples.m fournit également un modèle pour saisir des informations d’acquisition d’images.

  1. Configuration de NuMorph
    1. Téléchargez et installez conda environment manager pour Linux26. Téléchargez et installez les outils de traitement d’image NuMorph19 .
    2. Sur la ligne de commande, exécutez Matlab. Exécutez NM_setup.m à partir de NuMorph pour télécharger et installer les logiciels d’analyse d’images nécessaires aux analyses.
      REMARQUE: Cette étape garantit que l’environnement conda est correctement configuré et que tous les outils et modules complémentaires nécessaires à Matlab pour exécuter chacun des trois pipelines sont téléchargés et installés correctement. Les plus remarquables ici sont Elastix pour l’enregistrement en cours d’exécution et 3D-Unet pour la détection et le comptage des cellules.
  2. Spécifiez les noms d’échantillons, les répertoires d’entrée et de sortie, les informations sur les canaux et les paramètres d’imagerie de feuille de lumière en modifiant le fichier NM_samples.m.
    REMARQUE: Ici, il est recommandé de vérifier pour s’assurer que les bonnes informations, en particulier le répertoire d’entrée d’image, sont spécifiées correctement. Les erreurs ne sont généralement pas appelées ici avant l’exécution des étapes suivantes.
  3. Prétraitement d’image
    1. Ajustement de l’intensité
      1. Dans le NMp_template, réglez le réglage de l’intensité = vrai.
        REMARQUE : Définissez sur true si un réglage de l’intensité est nécessaire. Si ce n’est pas le cas, réglez le réglage de l’intensité = false. Il existe également une option permettant d’utiliser 'update' pour écraser les paramètres de réglage précédents.
      2. Définir utiliser les images traitées = false lorsque vous travaillez avec un nouvel ensemble d’images. Sinon, indiquez tous les jeux de données d’images précédemment enregistrés dans le répertoire de sortie (par exemple, « aligné », « assemblé ») à utiliser pour les étapes de traitement suivantes.
        REMARQUE: Cette option est fournie dans le cas où les images d’entrée ont déjà été prétraitées. Dans ce cas, les images prétraitées seront utilisées comme images d’entrée et l’option sera définie sur le nom du sous-répertoire dans le répertoire de sortie.
      3. Définir enregistrer les images = true.
        REMARQUE: L’utilisation de cette option garantit que les images traitées sont enregistrées dans le répertoire de sortie; Sinon, seuls les paramètres seront calculés et enregistrés.
      4. Définir les échantillons de sauvegarde = true.
        Remarque : Cette option garantit que les résultats des exemples sont enregistrés pour chaque étape principale.
      5. Réglez l’ombrage des carreaux = basique pour appliquer la correction de l’ombrage à l’aide de l’algorithme BaSiC27 ou manuel pour appliquer la correction de l’ombrage des carreaux à l’aide des mesures du microscope à feuille de lumière à des largeurs de feuille de lumière spécifiques.
        REMARQUE: Cette option corrige l’éclairage inégal le long de la dimension y causé par la forme de la taille de la feuille.
    2. Alignement du canal d’image
      1. Dans NMp_template, définissez alignement des canaux = true. Définissez cette option sur true si l’alignement des canaux est requis. Si ce n’est pas le cas, définissez sur false. Définissez la méthode d’alignement des canaux sur translation (rigide) ou elastix (non rigide).
        REMARQUE: La méthode de translation utilise des approches d’enregistrement 2D rigides pour aligner plusieurs canaux tandis que la méthode elastix utilise des B-splines non rigides28 pour corriger la dérive de rotation, qui peut se produire lors de l’acquisition d’images longues19.
    3. Assemblage itératif d’images
      1. Dans NMp_template, définissez les images de point = true.
        Remarque : Définissez cette option sur true si l’assemblage est nécessaire.
      2. Définir le raffinement du tamis = true.
        Remarque : Cette option est utilisée pour affiner davantage la traduction dans xy à l’aide de la transformation de fonctionnalité d’invariant d’échelle29.
      3. Définir les paramètres d’alignement de charge = true.
        Remarque : Cette option utilise les translations d’alignement de canal pendant l’assemblage. Cette option est recommandée avec l’imagerie multicanal. Sinon, affectez la valeur false.
      4. Définissez le chevauchement = 0,15 pour faire correspondre les chevauchements de tuiles pendant l’imagerie.
    4. Pour exécuter l’une de ces étapes de prétraitement, exécutez la commande suivante dans Matlab en dehors de NMp_template environnement :
      1. Spécifiez le nom de l’exemple. Set config = NM_config(processus,exemple).
      2. Exécutez l’une des étapes de prétraitement en spécifiant NM_process(config,stage) et spécifiez l’étape à l’aide de l’intensité, de l’alignement ou de l’assemblage de l’un des processus. Vérifiez le répertoire de sortie des fichiers de sortie pour chacune des étapes (Figure 3 et Figure 4).
  4. Analyse d’images
    1. Avant NuMorph
      1. Commencez avec une image d’atlas 3D et une image d’annotation associée qui attribue chaque voxel à une structure particulière.
        REMARQUE: L’Atlas du cerveau de souris P4 Allen Developmental Mouse généré à partir du MagellanMapper30 est utilisé ici.
      2. Alignez l’image de l’atlas et le fichier d’annotation pour vous assurer qu’ils correspondent correctement dans la bonne orientation.
    2. Dans NuMorph
      REMARQUE: Maintenant que l’atlas et ses annotations sont correctement alignés, les fichiers doivent être « munged » ou traités dans NuMorph afin qu’ils puissent être enregistrés pour une utilisation ultérieure. Pour ce faire, utilisez la fonction munge_atlas pour spécifier les entrées comme indiqué ci-dessous.
      1. Spécifiez Atlas_file : (chaîne). Indiquez le chemin d’accès complet au fichier atlas.
      2. Spécifiez Annotation_file : (chaîne). Indiquez le chemin d’accès complet aux annotations associées.
      3. Spécifiez la résolution : (1x3 numérique). Spécifiez la résolution de l’atlas y,x,z en micron par pixel.
      4. Spécifiez l’orientation : (1 x 3 caractères). Fournir l’orientation de l’atlas et s’assurer qu’elle correspond à la configuration de l’échantillon dans le berceau (antérieur(a)/postérieur(p),supérieur(s)/inférieur(i),gauche(l)/droite(r)).
      5. Spécifier l’hémisphère : spécifiez quel hémisphère cérébral a été imagé (« gauche », « droite », « les deux », « aucun »).
      6. Spécifiez out_resolution:(int). Spécifiez la résolution isotrope de la sortie de l’atlas en microns. (valeur par défaut : 25).
      7. Exécutez la commande « munge_atlas(atlas_file, annotation_file, résolution, orientation, hémisphère) » pour générer des annotations munged dans /data/annotation_data et une copie de l’image de l’atlas dans /data/atlas.
      8. Lisez la structure Matlab et le fichier atlas pour vérifier que les deux fichiers sont correctement munged dans la bonne orientation.
        REMARQUE: Une étape supplémentaire de classification cellulaire peut être effectuée pour quantifier les types de cellules en fonction de la colocalisation de marqueurs protéiques immunomarqués.
    3. Rééchantillonnage
      1. Dans NMa_template, définissez resample images = true, si vous effectuez un enregistrement d’image pour référencer l’atlas ou pour générer des volumes sous-échantillonnés de jeux de données haute résolution.
        REMARQUE: Le NMa_template.m sera utilisé pour définir les paramètres de rééchantillonnage, d’enregistrement, de détection des noyaux et de comptage des cellules.
      2. Définissez la résolution de rééchantillonnage pour qu’elle corresponde à l’atlas.
        REMARQUE: Ici, une résolution isotrope 3 μm/ voxel est utilisée car l’atlas de référence est à cette résolution.
      3. Spécifiez le numéro de canal à rééchantillonner à l’aide des canaux de rééchantillonnage = [ ].
        REMARQUE: Ici, le numéro de canal est défini pour correspondre au canal nucléaire. Si cette option est vide, seul le canal d’enregistrement sera rééchantillonné.
    4. Inscription
      1. Dans NMa_template, définissez les images de registre = true. Affectez la valeur true si l’inscription est requise. Si ce n’est pas le cas, définissez registration = false.
      2. Spécifiez le fichier atlas correspondant au fichier du répertoire atlas.
      3. Définir les paramètres d’enregistrement = valeur par défaut.
        Remarque : Cette option utilise une affine suivie d’une transformation spline B pour estimer la correspondance spatiale. Sinon, définissez un nouvel ensemble de paramètres d’enregistrement via Elastix dans /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Définir enregistrer les images enregistrées = true.
        REMARQUE: Les fichiers de sortie de l’enregistrement et du rééchantillonnage peuvent être téléchargés et inspectés visuellement dans Matlab ou d’autres outils de visualisation tels que FIJI31.
    5. Détection des noyaux, comptage et classification des cellules
      Remarque : les erreurs qui se produisent ici peuvent être dues à ne pas spécifier correctement le fichier d’annotations ou ne pas correspondre à l’âge de l’échantillon avec l’annotation correcte.
      1. Dans NMa_template, définissez à la fois le nombre de noyaux et la classification des cellules = true.
      2. Définir la méthode de comptage = 3dunet.
        REMARQUE: Cette option permet l’utilisation du modèle 3D-Unet19 entraîné. Sinon, sélectionnez Hessian qui utilise la méthode de détection d’objets blob hessiens.
      3. Définissez min_intensity pour définir un seuil d’intensité minimal pour les objets détectés.
        NOTA: Un seuil approprié est déterminé empiriquement en fonction du rapport signal/bruit de l’étiquetage nucléaire.
      4. Réglez classify_method sur l’un ou l’autre seuil, qui est basé sur une intensité de fluorescence non supervisée aux positions centroïdes ou svm, qui modélise un classificateur SVM (Support Vector Machine) linéaire supervisé.
        REMARQUE: Cette étape classera toutes les cellules détectées en quatre classes principales avec imagerie à 3 canaux. Avec ce protocole, Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2- et les valeurs aberrantes sont générées.
    6. Étapes de l’analyse
      1. Spécifiez le nom de l’exemple. Set config =NM_config(analyse, échantillon).
      2. Exécutez l’une des étapes d’analyse en spécifiant NM_analyze(config,stage) et spécifiez l’étape à l’aide de resample, register, count ou classify. Vérifiez le répertoire de sortie des fichiers de sortie pour chacune des étapes (Figure 5).
    7. Classification des types de cellules et analyse des groupes
      1. Dans NMe_template, définissez update = true et remplacez toutes les statistiques précédentes calculées.
        REMARQUE: Le NMe_template.m offre la possibilité d’effectuer une analyse de groupe de type cellulaire dans les régions du cerveau du même cerveau analysé.
      2. Définissez compare_structures_by sur l’index pour comparer par toutes les annotations uniques ou sur la table pour comparer les structures en fonction de la table.
      3. Définissez le template_file, qui spécifie tous les index de structure possibles et doit exister dans /annotations.
      4. Définissez structure_table et spécifiez les structures à évaluer.
      5. Spécifiez le comptage et la classification des types de cellules comme décrit dans NMa_template.m.
      6. Définissez compare_groups pour spécifier les groupes à comparer.
      7. Définissez sur true ou false pour effectuer un test t apparié ou un test t à deux échantillons.
    8. Exécutez l’analyse.
      REMARQUE: Pour effectuer cette étape, exécutez ce qui suit dans Matlab en dehors de l’environnement NMe_template.m.
      1. Spécifiez le nom de l’exemple. Set config =NM_config(evaluer,sample).
      2. Exécutez l’étape d’analyse en spécifiant NM_evaluate(config,stage) et spécifiez l’étape. Vérifiez le répertoire de sortie pour les fichiers de sortie pour l’analyse de groupe.

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Representative Results

Comme le protocole iDISCO+ introduit un rétrécissement tissulaire important, facilement perceptible à l’œil nu (Figure 2B), nous avons ajouté une étape IRM à ce pipeline avant le nettoyage tissulaire pour quantifier le rétrécissement induit par le nettoyage des tissus. Le flux de travail commence par le retrait du tissu non cérébral de l’image IRM (Figure 2C). Ensuite, une transformation rigide (3 angles de translation et 3 angles de rotation) est appliquée pour aligner l’image MR sur l’image de la feuille de lumière (Figure 2D). Ce faisant, nous avons observé une perte de volume total de 60% induite par la procédure de nettoyage tissulaire (Figure 2E), ce qui était cohérent avec les estimations de changement de volume par œil (Figure 2B). Ce résultat est très différent d’un rapport précédent où un retrait de 5 % à 10 %10,32 avait été signalé. La différence de rétrécissement peut être causée par la différence d’âge de l’animal entre les deux études (P4 vs cerveau adulte) ou par des différences de temps dans le lavage au méthanol dans l’étape de nettoyage du protocole iDISCO+ (16 h vs 2 h). Pour cartographier les degrés de rétrécissement des tissus dans différentes régions du cerveau, nous avons déployé un enregistrement d’image déformable où l’image de feuille de lumière est utilisée comme référence. L’image MR enregistrée est illustrée à (Figure 2F). Le changement de volume estimé dû à la procédure de nettoyage des tissus est codé par couleur, où un plus grand degré de rétrécissement est observé dans le cortex par rapport à d’autres régions du cerveau (Figure 2G).

Pour mesurer les volumes des régions du cerveau, nous avons effectué une segmentation de l’IRM par enregistrement dans un atlas annoté. La segmentation des cerveaux imageés par IRM était considérée comme réussie si la superposition de l’atlas de référence correspondait étroitement aux limites anatomiques identifiées par les différences de contraste dans les images IRM brutes (Figure 2H). La superposition lors de l’enregistrement dépend d’une bonne préparation de l’échantillon (Figure 2A), de l’acquisition d’images et du décapage du crâne. L’étape de décapage du crâne est cruciale pour de bons résultats d’enregistrement, car l’enregistrement tentera de déformer l’image de référence de l’atlas à l’image RM entière, y compris tout crâne qui reste dans l’image. L’inclusion du crâne dans l’enregistrement peut fausser les résultats et produire un rendu de volume 3D mal enregistré de la segmentation. Le rendu final du volume 3D peut ensuite être visualisé à l’aide de l’ITK-SNAP33 (Figure 2H). Cette méthode est utilisée pour évaluer les différences de volume cérébral brut entre les groupes d’échantillons. La base cellulaire sous-jacente aux différences de volume découvertes avec l’IRM peut être poursuivie en utilisant le comptage cellulaire avec nettoyage des tissus, la microscopie à feuille de lumière et NuMorph.

L’objectif de la clairissance et de l’analyse tissulaires est d’évaluer les contributions de différents types de cellules aux différences entre les conditions expérimentales (p. ex. génotype, exposition environnementale) en comptant les noyaux individuels à l’aide de NuMorph. Le nettoyage des tissus à l’aide du protocole iDISCO+ et des marqueurs de noyaux spécifiques à la couche neuronale a permis de définir clairement des groupes cellulaires de neurones des couches supérieure et inférieure dans l’isocortex (Figure 3).

Le comptage des cellules à l’aide de NuMorph dépend de la réussite des étapes de prétraitement impliquant le réglage de l’intensité, l’alignement des canaux et l’assemblage (Figure 4A). Les erreurs survenant à l’une ou l’autre de ces étapes peuvent entraîner une couture incorrecte (figure 4B,C). Par exemple, une mauvaise acquisition d’image peut entraîner des images avec des motifs flous et flous pendant le prétraitement (Figure 4C). Pour compter les noyaux de régions spécifiques du cerveau, les images assemblées sont annotées à l’aide d’un atlas accessible au public. Nous avons enregistré nos images assemblées dans une version corrigée du P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas34. Ici, les images assemblées ont été sous-échantillonnées d’une haute résolution (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) à une résolution inférieure (résolution isotrope de 25 μm³/voxel) pour correspondre à la résolution de l’atlas. L’adaptation de la résolution de l’atlas garantit un enregistrement correct des images dans l’atlas et fournit des annotations régionales dans les images acquises (Figure 5A).

Pour effectuer un comptage spécifique du type de cellule, nous avons marqué les neurones de la couche supérieure exprimant Brn2, les neurones de la couche inférieure exprimant Ctip2 et tous les noyaux avec TO-PRO-3 (Figure 3B). L’imagerie est réalisée à une résolution spatiale suffisante pour séparer les noyaux individuels (0,75 x 0,75 x 4 μm3/voxel). Les centroïdes des noyaux sont détectés avec un modèle 3D-Unet entraîné dans NuMorph (Figure 5B,C). Nous avons détecté ~12 × 10 6 noyaux totaux qui étaient To-Pro-3+ dans l’isocortex, y compris ~2,6 × 10 6 Brn2+ et 1,6 × 106 Ctip2+ noyaux. Nous avons également détecté ~3,7 × 10 6 et 2,9 × 106 To-Pro-3+ noyaux totaux dans les noyaux gris centraux et l’allocortex hippocampique, respectivement. Environ 1,5 × 10 6 et <1 × 106 cellules Ctip2+ ont été comptées dans les noyaux gris centraux et l’allocortex hippocampique, respectivement, bien qu’un nombre négligeable de cellules Brn2+ ait été détecté (Figure 5D). Le nombre total de noyaux dans l’isocortex et l’allocortex hippocampique combinés (~15 millions de cellules) est similaire au nombre total de cellules précédemment rapporté dans le cortex cérébral de la souris15. Ces résultats démontrent l’utilité de l’imagerie IRM, de la méthodologie de nettoyage des tissus iDISCO+ et de l’analyse informatique NuMorph pour révéler le nombre volumétrique, le nombre total de cellules et le nombre spécifique de types cellulaires sous-jacents aux différences dans la structure du cerveau de souris entre les groupes expérimentaux.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble de l’analyse unicellulaire du cerveau entier de cerveaux de souris nettoyés en tissu néonatal intact. (A) Vue d’ensemble du nettoyage des tissus iDISCO+, de l’imagerie par feuille de lumière et de l’analyse d’images 3D. (B) Images montrant le montage correct de l’échantillon sur le microscope à feuille de lumière. (C) Caricature montrant le montage de l’échantillon par rapport au trajet de la feuille de lumière. Abréviation : ab = anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Mesures de la structure cérébrale globale par IRM. (A) Image montrant la préparation de l’échantillon pour l’IRM. (B) Images de cerveaux P4 représentatifs avant et après le nettoyage des tissus iDISCO+. Barre d’échelle = 5,0 cm. (C) Image IRM brute avec crâne attaché à 60 x 60 x 60 μm³. Barre d’échelle = 800 μm. (D) Image en feuille de lumière du cerveau de souris à 25 x 25 x 25 μm³. Volume total = 68,7 mm3. Notez qu’une petite section de l’isocortex dorsal a été enlevée involontairement lors de la dissection marquée par une pointe de flèche (blanche). Barre d’échelle = 800 μm. (E) Image IRM du cerveau de souris après décapage du crâne et enregistrement rigide. Volume total = 171,9 mm3. L’insertion (jaune) montre le contour du cerveau à partir de l’image de la feuille de lumière. Barre d’échelle = 800 μm. (F) Image MR enregistrée en référence à l’image de feuille de lumière pour évaluer la déformation. Barre d’échelle = 800 μm. (G) Cartographie cérébrale au niveau du voxel pour évaluer les changements de volume entre l’image de la feuille de lumière et l’image IRM, où le bleu et le rouge indiquent respectivement le rétrécissement et l’expansion de l’image IRM à l’image de la feuille de lumière. Dans l’ensemble, il y avait une perte de volume de 60%, mais certaines régions telles que l’isocortex ont montré un plus grand retrait par rapport à d’autres. (H) Panneau de gauche : Vue axiale de l’image IRM avec les segmentations enregistrées de l’Atlas du cerveau du développement Allen. Panneau de droite : rendu de volume 3D de la segmentation. Barre d’échelle = 800 μm. Abréviations : OB = bulbe olfactif; Dpall = pallium dorsal/isocortex; Mb = mésencéphale; Cb = cervelet. Orientation: R = Rostral; L = latéral; D = Dorsale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images de résolution cellulaire et alignement des canaux. (A) Coupe axiale optique de la coloration nucléaire TO-PRO-3 (TP3) et immunomarquage pour les marqueurs Ctip2 (neurone de la couche inférieure) et Brn2 (neurone de la couche supérieure) dans le cerveau de souris P4. Barre d’échelle = 1 mm. (B) Encart agrandi de zones corticales dans A (encadré) montrant l’alignement correct des canaux avec la localisation attendue de la couche supérieure immunomarquée par Brn2 et des neurones de la couche inférieure immunomarqués par Ctip2. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Exemples d’assemblage d’images. (A) Exemple de résultats à partir d’une image itérative 2D correctement assemblée. Barre d’échelle = 1 mm. Insérer montre un exemple d’assemblage correct zoomé. Barre d’échelle = 500 μm. (B) Exemple de résultats à partir d’une image itérative 2D mal assemblée. Barre d’échelle = 1 mm. Insérer montre un exemple d’assemblage incorrect zoomé (surplomb). Barre d’échelle = 100 μm. (C) Exemple de résultats d’une image itérative 2D mal assemblée. Barre d’échelle = 1 mm. L’option Insérer montre un exemple d’assemblage incorrect avec un zoom avant (flou). Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Enregistrement d’images basse résolution, détection de noyaux haute résolution et comptage de cellules dans le cerveau de souris P4. (A) Panneau de gauche : Exemple d’une tranche z à partir d’images 3D en feuille de lumière du cerveau entier rééchantillonnées à une résolution isotrope de 25 μm. Barre d’échelle = 1 mm. Panneau du milieu : Annotations de l’Atlas du cerveau du développement Allen (P4) enregistrées sur l’image de microscopie. Barre d’échelle = 1 mm. Panneau de droite : Superposition des panneaux gauche et central. Barre d’échelle = 1 mm. (B) Exemple d’image cousue ajustée en fonction de l’intensité en vue axiale. La région encadrée est indiquée en (C). Barre d’échelle = 1 mm. (C) Détection automatisée des noyaux (rouge). Barre d’échelle = 50 μm. (D) Quantification des types de cellules dans différentes régions du cerveau P4 (noyaux gris centraux, allocortex hippocampique et isocortex). Rouge = neurones de la couche supérieure marqués avec Brn2, Vert = neurones de la couche inférieure marqués avec Ctip2 et Bleu = tous les noyaux marqués avec un colorant To-Pro-3. Abréviations : DPall = pallium dorsal (isocortex); MPall = Pallium médial (allocortex hippocampique); CSPall = Sous-pallium central (noyaux gris centraux classiques). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Étape d’analyse NuMorph Temps estimé
Ajustement de l’intensité 1 h
Alignement des canaux 2 min
Couture itérative 2D 12 h
Rééchantillonnage 3 min
Inscription 3 min
Comptage de cellules 5 h
Classification des cellules 10 min

Tableau 1 : Temps d’analyse NuMorph.

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Discussion

Les méthodes de nettoyage des tissus sont des techniques utiles pour mesurer l’organisation cellulaire 3D du cerveau. Il existe une foule de méthodes de nettoyage des tissus décrites dans la littérature, chacune avec ses avantages et ses limites 6,7,8,9. Les options d’outils informatiques pour analyser les types de cellules dans les images effacées des tissus sont relativement limitées. D’autres outils disponibles ont été mis en œuvre pour disperser les populations cellulaires dans lesquelles la segmentation est moins difficile 10,35 ou ont tiré parti de l’expansion tissulaire16. Cet article décrit la préparation d’un cerveau de souris pour l’imagerie avec élimination des tissus iDISCO + et démontre NuMorph, un pipeline informatique pour le traitement et la quantification des noyaux dans les structures d’un cortex de souris capturé par LSFM. Il est conçu pour trouver un équilibre approprié entre la durée du temps d’imagerie, la précision de détection des noyaux cellulaires et les ressources informatiques. Ce pipeline contraste avec d’autres outils actuellement disponibles en segmentant de manière fiable tous les noyaux, plutôt que des populations clairsemées de cellules marquées 10,36,37. Nous avons déjà montré que la précision de détection des cellules est élevée, avec des temps d’imagerie significativement plus courts et des tailles de données acquises beaucoup plus réduites pour l’acquisition de l’hémisphère entier par rapport à d’autres méthodes19. NuMorph relève un certain nombre de défis importants pour l’analyse d’images de feuilles lumineuses multicanaux, tels que la fourniture d’outils pour l’alignement des canaux, la correction des mouvements de scène avec un outil d’assemblage et la correction de la luminosité du signal dans les tuiles d’image. Le flux de travail présenté dans ce document est utile pour la communauté scientifique au sens large et accessible à tous les groupes dans les établissements de recherche. Un aperçu du processus peut être vu à la figure 1.

Plusieurs étapes critiques tout au long de ce processus, de la perfusion de la souris à l’analyse informatique, peuvent affecter la qualité en aval des images, la quantification et les résultats. Il est essentiel que la perfusion soit effectuée de manière à ce que tout le sang soit retiré du cerveau, car les vaisseaux sanguins ont une autofluorescence naturelle qui affectera l’intensité des images et nécessitera des ajustements dans le pipeline, ce qui affectera négativement les résultats. La durée de la fixation du PFA est également cruciale, car laisser les cerveaux immergés dans 4% de PFA pendant plus de 24 heures peut entraîner une « surfixation » de l’échantillon et entraîner une fissure du cerveau, qui devient fragile pendant le processus iDISCO +. Le protocole iDISCO décrit ci-dessus a été légèrement modifié par rapport au protocole officiel trouvé sur le site24. Une modification importante est l’ajout de PBS à la série méthanol/PBS, au lieu de l’eau dans le protocole original. Il s’agit d’empêcher la fissuration corticale dans le cerveau embryonnaire et postnatal précoce, qui se produit probablement en raison du développement incomplet des cellules gliales, des projections axonales et de la matrice extracellulaire. Selon le tissu utilisé dans ce protocole, des modifications peuvent être nécessaires à chaque étape du protocole iDISCO+, telles que la modification des concentrations d’anticorps et l’augmentation des temps d’incubation d’échantillons de tissus plus volumineux, afin d’optimiser les paramètres idéaux pour capturer le marqueur de choix et l’analyser avec précision.

On sait que le rétrécissement des tissus se produit pendant le processus de nettoyage tissulaire iDISCO+, ce qui peut alors modifier les mesures volumétriques en aval 6,10. D’autres méthodes, telles que l’IRM effectuée avant le nettoyage des tissus, peuvent être utilisées pour déterminer l’ampleur de tout changement dans la taille des tissus chez les témoins par rapport aux animaux de laboratoire afin de déterminer si les différences volumétriques sont dues au phénotype étudié et non au processus de nettoyage des tissus. Les changements hétérogènes dans les volumes des régions corticales des mutants peuvent différer en fonction du contenu cellulaire régional, car la substance grise et blanche du cerveau peut être affectée différemment par les déshydratations au méthanol. Les données IRM peuvent être utilisées pour déterminer si le rétrécissement des tissus n’est pas uniforme dans les sous-régions du cerveau (Figure 2G), et tout changement encouru par le protocole de compensation peut être ajusté dans l’analyse informatique en aval. De plus, le procédé iDISCO+ utilise des lavages au méthanol sévères pour déshydrater l’échantillon, ce qui peut entraîner des dommages ou des altérations de certains antigènes à la surface des noyaux. Il est recommandé que tous les anticorps utilisés soient d’abord testés sur des coupes de tissu cérébral qui ont été lavées pendant ~3 h dans du méthanol à 100% pour s’assurer que l’anticorps est compatible avec le protocole iDISCO +.

Pour les grands ensembles de données qui nécessitent de longs délais de traitement, nous recommandons d’utiliser la version sans fenêtre de MATLAB sous Linux qui permet des stratégies telles que l’implémentation de la commande « nohup », qui continuera à exécuter un processus même après la perte de la connexion à un serveur. De plus, NuMorph nécessite une puissance de calcul élevée, nous recommandons donc au moins une mémoire de 10 Go pour les analyses. Nous analysons les échantillons à l’aide d’une station de travail Linux exécutant CentOS 7, équipée d’un processeur 2,6 GHz 14 cœurs, de 8 x 64 Go de mémoire DDR4 2400 LRDIMM, de 4 GPU de 11 Go et de 2 SSD externes de 4 To. Les données brutes de la feuille de lumière utilisées ici étaient de 620 Go et la mémoire requise pour les processus était de 10 Go. Ici, nous avons inclus un tableau avec les temps estimés pour compléter chaque étape des analyses NuMorph comme indiqué dans le tableau 1.

Les étapes de prétraitement de l’image impliquent un réglage de l’intensité dans la dimension xy pour chaque plan z, alignement de canal et assemblage. L’intensité de l’image est ajustée pour tenir compte des différences d’intensité entre les tuiles et de l’éclairage inégal le long de la dimension y. La différence d’intensité se produit en raison des propriétés techniques inhérentes de la feuille de lumière telle qu’elle image entre les tuiles25. Ensuite, l’alignement des canaux est effectué pour s’assurer que les canaux d’image s’alignent correctement dans une imagerie multicanal. Cette étape est recommandée car chaque canal en imagerie multicanal est acquis individuellement et des mouvements subtils de la scène peuvent provoquer des dérives d’échantillon et entraîner un désalignement spatial19. Enfin, les tuiles par plan z sont ensuite assemblées pour former une seule image dans chaque plan z. En fin de compte, il y aura une pile d’images assemblées par canal représentant tout le volume de l’échantillon. L’assemblage itératif de l’image est basé sur une méthode personnalisée pour organiser toutes les images 2D par canal dans un volume 3D de l’échantillon19. La méthode implémente d’abord une correspondance z par paires dans la direction axiale pour faire correspondre les régions de tuiles qui se chevauchent à la fois horizontalement et verticalement. Le déplacement z final de chaque tuile est déterminé à l’aide de l’arbre couvrant minimal38. L’assemblage itératif 2D est effectué dans une pile commençant à un endroit au centre de la pile avec moins de signal d’arrière-plan. La vignette en haut à gauche est placée en premier pour chaque itération d’assemblage afin d’éviter un décalage subtil des images dans la dimension z.

Nous vous recommandons d’exécuter chacun des pipelines de prétraitement de manière séquentielle, en particulier lors de l’optimisation pour corriger les erreurs. Les problèmes majeurs surviennent souvent lors des étapes de couture. Un problème qui peut survenir est l’acquisition incorrecte de l’image sur la feuille de lumière. Ce problème peut se produire lorsque la mise au point dynamique horizontale est mal réglée sur la feuille de lumière et peut entraîner une alternance de motifs en phase / hors phase dans les images (Figure 4B,C). D’autres erreurs peuvent survenir si l’échantillon n’était pas solidement sécurisé et si un mouvement important de l’échantillon s’est produit pendant l’acquisition. Dans ces cas, l’assemblage précis peut ne pas être possible en raison d’un manque de correspondance par paires entre les carreaux adjacents. D’autres erreurs potentielles peuvent provenir du site de départ du point de couture. NuMorph détermine le site de départ du point à peu près au milieu de la pile. Toutefois, lorsqu’il y a un arrière-plan significatif dans le site de tranche de départ, des erreurs peuvent se produire dans la comparaison par paires dans les vignettes d’image. Il est recommandé ici de choisir un site de départ qui a un rapport signal sur bruit élevé.

L’analyse d’image décrite ici comprend le rééchantillonnage d’images assemblées de haute résolution (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) à une résolution isotrope inférieure de 25 μm³/voxel. Nous rééchantillonnons les images assemblées du canal nucléaire pour enregistrer les images assemblées dans l’Atlas du cerveau de souris Allen Developmental à l’étapesuivante 34. Les cellules sont ensuite comptées pour chaque canal dans des régions annotées des images en référence à l’atlas à haute résolution (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) à l’aide d’un modèle 3D-Unet19 entraîné. Cette méthode peut également être utilisée pour détecter et compter les objets blob. Lors du développement de NuMorph, nous avons testé la précision de la segmentation par rapport à des images complètement nouvelles jamais vues pendant l’entraînement qui provenaient de la même procédure de nettoyage tissulaire, du même microscope et de la même précision de détermination du marquage nucléaire de 0,99 et du rappel de 0,9419. La précision de NuMorph n’a pas encore été testée sur différentes procédures de nettoyage tissulaire, microscopes ou marqueurs ; Par conséquent, la précision de la segmentation dans d’autres modèles expérimentaux est inconnue. L’atlas par défaut dans NM_setup.m est l’Atlas de référence Allen39 adulte coloré par Nissl avec la troisième itération du cadre de coordonnées communes Allen Mouse Brain (CCFv3) comme annotation personnalisée.

Bien que NuMorph analyse efficacement les tissus, qui sont relativement denses, tels que le cortex de souris adulte, des conceptions expérimentales plus difficiles (telles que des cerveaux de souris embryonnaires ou des structures très denses telles que le cervelet) peuvent nécessiter le développement d’outils de calcul supplémentaires. Les efforts communautaires actuels tentent de produire des données d’annotation adéquates pour la formation des modèles d’apprentissage profond utilisés pour segmenter ces cas plus difficiles40. Les progrès des technologies d’imagerie à feuille de lumière permettent une étude quantitative à haut débit des structures subcellulaires, avec de nouvelles approches telles que la microscopie à illumination sélective à plan inversé à double vue (diSPIM) conduisant à une résolution et une précision accrues dans les régions cérébrales denses cellulaires40,41. Au fur et à mesure que les progrès dans les outils de nettoyage tissulaire, d’imagerie et de calcul impliqués dans cette recherche évoluent, nous espérons qu’ils conduiront à une utilisation plus large des méthodes de nettoyage tissulaire pour les analyses quantitatives sur la façon dont les troubles neuropsychiatriques peuvent découler d’altérations de la structure du cerveau induites par des facteurs de risque génétiques ou environnementaux.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le NIH (R01MH121433, R01MH118349 et R01MH120125 à JLS et R01NS110791 à GW) et la Fondation de l’espoir. Nous remercions Pablo Ariel, du Laboratoire des services de microscopie, de son aide dans l’imagerie des échantillons. Le laboratoire des services de microscopie du département de pathologie et de médecine de laboratoire est soutenu en partie par la subvention P30 CA016086 du Cancer Center Core Support à l’Université de Caroline du Nord (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Le noyau de microscopie en neurosciences est soutenu par la subvention P30 NS045892. La recherche rapportée dans cette publication a été financée en partie par la subvention de soutien institutionnel 2016-IDG-1016 du North Carolina Biotech Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

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Neurosciences numéro 186
Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière
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Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., … More

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., McCormick, C. M., Dere, M., Khan, S., Kim, M., Wang, T. W. W., He, Q., Wu, G., Shih, Y. Y. I., Stein, J. L. Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64096, doi:10.3791/64096 (2022).

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