Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שימוש באלקטרודה דו-קוטבית ליצירת מודל עכבר אפילפסיה של האונה הרקתית על ידי הצתה חשמלית של האמיגדלה

Published: June 29, 2022 doi: 10.3791/64113
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2China Clinical Research Center for Epilepsy Capital Medical University, 3China Beijing Municipal Geriatric Medical Research Center
* These authors contributed equally

Summary

האמיגדלה ממלאת תפקיד מפתח באפילפסיה של האונה הרקתית, שמקורה במבנה זה ומתפשטת ממנו. מאמר זה מספק תיאור מפורט של ייצור אלקטרודות מוח עמוקות עם פונקציות הקלטה וגירוי כאחד. הוא מציג מודל של אפילפסיה של האונה הרקתית האמצעית שמקורה באמיגדלה.

Abstract

האמיגדלה היא אחד המקורות הנפוצים ביותר של התקפים, ומודל עכבר האמיגדלה חיוני להמחשה של אפילפסיה. עם זאת, מחקרים מעטים תיארו את פרוטוקול הניסוי בפירוט. מאמר זה ממחיש את כל התהליך של יצירת מודל אפילפסיה של הצתה חשמלית באמיגדלה, עם הצגת שיטה לייצור אלקטרודות דו-קוטביות. אלקטרודה זו יכולה גם לגרות וגם להקליט, ולהפחית פגיעה מוחית הנגרמת על ידי השתלת אלקטרודות נפרדות לגירוי והקלטה. למטרות הקלטה ארוכות טווח של אלקטרואנצפלוגרם (EEG), טבעות החלקה שימשו כדי למנוע את הפרעה להקליט הנגרמת על ידי סבכי כבלים ונפילה.

לאחר גירוי תקופתי (60 הרץ, שנייה אחת כל 15 דקות) של האמיגדלה הבזולטרלית (AP: 1.67 מ"מ, L: 2.7 מ"מ, V: 4.9 מ"מ) במשך 19.83 ± 5.742 פעמים, נצפתה הדלקה מלאה בשישה עכברים (המוגדרת כאינדוקציה של שלושה פרקים רציפים בדרגה V המסווגים לפי סולם ראסין). EEG תוך גולגולתי נרשם לאורך כל תהליך ההדלקה, ונצפתה הפרשה אפילפטית באמיגדלה שנמשכה 20-70 שניות לאחר ההדלקה. לכן, זהו פרוטוקול חזק למידול אפילפסיה שמקורה באמיגדלה, והשיטה מתאימה לחשיפת תפקידה של האמיגדלה באפילפסיה של האונה הרקתית. מחקר זה תורם למחקרים עתידיים על המנגנונים של אפילפסיה של האונה הרקתית המזיאלית ותרופות אנטי-אפילפטוגניות חדשניות.

Introduction

אפילפסיה של האונה הרקתית (TLE) היא סוג האפילפסיה השכיח ביותר ויש לה סיכון גבוה להמרה לאפילפסיה עמידה לתרופות. ניתוח, כגון amygdalohippocampectomy סלקטיבי, הוא טיפול יעיל עבור TLE, ואת epileptogenesis ו ictogenesis של המחלה עדיין תחת חקירה 1,2. פתוגנזה של TLE הוכחה להתרחש לא רק בהיפוקמפוס אלא גם באופן נרחב באמיגדלה 3,4. לדוגמה, הן טרשת אמיגדלה והן הגדלת אמיגדלה דווחו לעתים קרובות כמקור של התקפי TLE 5,6. אי אפשר להמעיט בחשיבותה של האמיגדלה; מודל אמיגדלה חיוני לחקר אפילפטוגנזה, ויש צורך דחוף בהמחשה ברורה של מודל זה.

הוצעו מספר גישות לגרימת התקפים במודלים של בעלי חיים. בעבר, תרופות פרכוסיות הוזרקו תוך צפקית בשלב מוקדם7. למרות ששיטה זו הייתה נוחה, מיקומם של מוקדים אפילפטיים לא היה ברור. עם התפתחות הטכנולוגיה הסטריאוטקטית ואטלס מוח מפורט של בעלי חיים, יושמה הזרקת תרופות תוך גולגולתית לפתרון בעיית הלוקליזציה8. עם זאת, חוסר התערבות בהתקפים קשים בשלב החריף הביא לשיעור תמותה גבוה, והתקפים ספונטניים כרוניים לוו בבעיה של אינטריקטל לא יציב ותדירות התקפים 9,10. לבסוף פותחה שיטת ההדלקה החשמלית; שיטה זו מגרה מעת לעת אזורים מסוימים במוח מספר פעמים, ומאפשרת לגרום להתקפים עם שליטה מוגדרת הן במיקום והן בזמן ההתחלה11.

היתרון של שיטה זו הוא שההשתלה התוך גולגולתית של אלקטרודות היא זעיר פולשנית12. יתר על כן, חומרת ההתקף ניתנת לשליטה על ידי הפסקת הגירויים, מה שמקטין את התמותה הנגרמת על ידי ההתקפים. שינויים אלה פתרו את החסרונות של הגישות הקודמות. יש לציין כי מודל זה יכול לחקות כראוי התקפים אנושיים והוא מתאים במיוחד לחקר סטטוס אפילפטיקוס (SE) בשל יכולתו לגרום לחומצה סליצילית במהירות13. זה יכול לשמש גם לבדיקת תרופות אנטי אפילפטיות14 ובמחקרים על מנגנון האפילפסיה. לבסוף, ידוע היטב שהאמיגדלה קשורה קשר הדוק עם אפנון זיכרון, עיבוד תגמול ורגש15. הפרעות של תפקודים מנטליים אלה נתקלים לעתים קרובות בחולי אפילפסיה, ולכן, מודל אפילפסיה של האמיגדלה עשוי להיות בחירה טובה יותר לחקר בעיות רגשיות באפילפסיה16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסוי זה אושר על ידי ועדת האתיקה הניסויית של בעלי חיים בבית החולים Xuanwu, האוניברסיטה הרפואית של הבירה. כל העכברים הוחזקו במעבדת החיות של בית החולים Xuanwu, האוניברסיטה הרפואית של הבירה. פרוטוקול זה מחולק לארבעה חלקים. שני החלקים הראשונים מציגים את שיטת בניית האלקטרודה והמעגל החשמלי באמצעות טבעת החלקה לחיבור האלקטרודות וציוד הקלטה/גירוי EEG. החלק השלישי מתאר את שיטת הפעולה של השתלת אלקטרודות, והחלק הרביעי מציג את פרמטרי הרישום והגירוי של EEG המשמשים למודל אפילפסיה של האמיגדלה.

1. ייצור אלקטרודות

  1. שמור את החומרים הבאים מוכנים מראש: שתי חתיכות באורך 3 ס"מ של חוט טונגסטן מצופה טפלון (קוטר חשוף: 76.2 מיקרומטר), חתיכה אחת של חוט כסף (קוטר חשוף: 127 מיקרומטר) באותו אורך, וסט אחד של 2 x 2 פיני שורה מודדים.
  2. השתמש במצית כדי לשרוף קצה אחד של כל חוט טונגסטן כדי להסיר 5 מ"מ מציפוי הבידוד.
    הערה: חוט הטונגסטן עם הבידוד שהוסר הופך לשחור; חלק זה של חוט הטונגסטן מכונה הקצה העליון.
  3. מקלפים קטע של חוט רב-גדילי דק במיוחד ועוטפים אותו מלמטה לקצה העליון, שם מתחיל להחשיך, וממשיכים למעלה. שלבו את החוט הסופר-דק הזה (בעל מרקם רך) עם חוט הטונגסטן על ידי צביטה של קצה אחד וסיבוב עדין של הקצה השני, מה שמאפשר לחבר בקלות את שני החומרים יחד.
  4. משוך בעדינות כדי לוודא שהם עטופים היטב וחתכו חוטים עדינים עודפים. נסו לשמור על חוט טונגסטן ישר לאורך כל התהליך.
  5. קבע את סיכת השורה למהדק בשולחן הריתוך כאשר הצד הארוך יותר של הפינים פונה כלפי חוץ. השתמש במחט המזרק כדי להרים משחת הלחמה ולמרוח אותה על הסיכות. מחממים את לפיד הריתוך ל 320 מעלות צלזיוס; ממיסים ומרחו חוט פח נטול עופרת עם קצה הלפיד.
  6. חפפו את הקצה העליון של חוט הטונגסטן עם מחט אחת של פיני השורה והשתמשו בהלחמה שעל הפנס כדי לחבר את חוט הטונגסטן לסיכה.
    הערה: יהיה קשה מאוד לרתך את חוט הטונגסטן ישירות עם הפינים ללא עזרת החוט הדק.
  7. רתכו חוט טונגסטן נוסף וחוט כסף נוסף לסיכת השורה באותו אופן, כך שכל חוט יתאים למחט (ראו איור 1,i).
  8. חותכים שני צינורות מתכווצים בחום מעט יותר מהקצה העליון של חוט הטונגסטן. שים אותם על מפרק הלחמה של שני חוטי טונגסטן, להבטיח כי החלק המוליך מכוסה במלואו בצינור, כך המעגל של שני חוטי טונגסטן אינו ממוקם בסדרה.
    הערה: למרות שיש שלושה חוטים, אם שניים מהם מבודדים, שלושת החוטים לא יהיו בסדרה; ניתן להוסיף גם צינור לחוט הכסף.
  9. הסר את האלקטרודה מהדק שולחן הריתוך והחזק את האלקטרודה בעדינות עם צבת גדולה, שכן קל לאלקטרודות לאבד את צורתן בעת חימום הצינור הניתן לכיווץ, באמצעות מהדק מוליכות תרמית טובה עם מעט יותר כוח.
  10. הפעל את צינור האוויר וחמם עד לטמפרטורה של 320 מעלות צלזיוס. נשפו את הצינור המתכווץ בחום למשך מספר שניות עד שהוא מהודק (ראו איור 1,ii).
  11. אם המחטים נפרדות מגוף הפלסטיק במהלך תהליך הריתוך, חתכו את חלק הריתוך ואת גוף הפלסטיק בעזרת דבק מותך חם (ראו איור 1,iii). היזהר לא למרוח אותו על הממשק מכיוון שזה ישפיע על הכנסת הממשק.
  12. החזיקו את שני חוטי הטונגסטן וסובבו אותם יחד, תוך שמירה על הקצוות שלהם בנפרד (ראו איור 1,iv). חתכו את חוטי הטונגסטן המעוותים לאורך של כ-10 מ"מ, כך שההפרדה בקצוות לא תעלה על 0.5 מ"מ.
    הערה: ניתן לבצע שלב זה גם לפני השתלת אלקטרודה כדי לאפשר התאמה גמישה של אורך האלקטרודה.
  13. מחממים את אקדח הדבק ומורחים את הדבק באופן שווה סביב האלקטרודה.
  14. בדוק את האלקטרודות עם מולטימטר: הנח מוט אחד של המולטימטר בצד הלא מרותך של פיני השורות, וגע בעדינות בקצה חוט טונגסטן או חוט כסף למוט השני, בדוק אם המעגל חלק. ודא שהקווים אינם ממוקמים בסדרות.

2. חיבור טבעת החלקה ותיאור מעגל

הערה: כאשר האלקטרודות על העכברים מחוברות להתקן EEG באמצעות כבלים במצב תנועה חופשית, הכבלים יכולים להסתבך כאשר העכברים נעים ומסתובבים. זה גורם לכבלים להיות קצרים יותר, ובסופו של דבר מפריע לעכברים לזוז או גורם לכבלים ליפול מראשיהם. בשיטה המתוארת כאן, טבעת החלקה בעלת ארבעה ערוצים מוצגת כדי למנוע את נפילת הכבלים. ארבעת הערוצים מיוצגים בארבעה צבעים באיור 1B.

  1. יש לקלף 5 מ"מ מהעור המבודד בכל קצה כדי לחשוף את חוט המתכת שבתוכו.
  2. הוסף קטע של צינור מתכווץ בחום לכל חוט סטטור.
  3. רתך כל חוט באמצעות תקע מחבר התקן EEG.
  4. כווצו את הצינור המתכווץ בחום עם אוויר חם.
  5. הוסף קטע של צינור מתכווץ בחום לכל חוט רוטור.
  6. הברג את החלקים המוליכים של החוטים האדומים והכתומים יחד ורתך אותם למפרק בכותרת כדי להתאים לסיכת השורה.
  7. רתכו את שני החוטים האחרים על הכותרת לכל מפרק.
    הערה: התעלה החומה המתאימה לחוט הכסף מחוברת למכשיר EEG להארקה. הערוצים האדומים והכתומים מקבלים אותות מאותו חוט טונגסטן, והערוץ הכתום משמש כנקודת ייחוס למכשיר ה-EEG. האותות בערוץ האדום הם חסרי משמעות, אך הם חייבים להתקיים יחד עם הערוץ השחור כדי ליצור גירוי נוכחי. האותות בערוץ השחור הם האותות החשמליים האמיתיים במוח. ניתן לתכנן מעגלים שונים עם טבעות החלקה רב ערוציות כך שיתאימו למכשירים שונים.

3. ניתוח להשתלה

  1. חיות
    1. יש להשתמש בעכברי בר זכרים בני 8 שבועות מסוג C57BL/6, במשקל 24-26 גרם, לניתוחים.
    2. אחסנו אותם עם מחזור אור-חושך של 12 שעות (זמן אור: 8:00-20:00) בסביבה מבוקרת טמפרטורה (22 ± 1 מעלות צלזיוס) וספקו מים והזנה עד לליביטום.
    3. השתמש בשטיחון חום נוסף כדי לשמור על חום בעלי החיים במהלך הניתוח.
    4. לאחר הניתוח, להזריק meloxicam תת עורית (10 מ"ג / ק"ג) כמו מתן הראשון של משככי כאבים. לאחר מכן, הניחו את בעלי החיים בכלובים נפרדים כדי לייעל את ההתאוששות. הוסף meloxicam לתזונה של החיה בשבוע הראשון לאחר הניתוח.
    5. לאחר הניסוי, להחדיר את החדרים השמאליים של העכברים עם 4% paraformaldehyde תחת הרדמה, ולאסוף את רקמות המוח לאימות היסטולוגי של המטרה אלקטרודה.
  2. לשקול את העכבר להרדים אותו על ידי הזרקה intraperitoneal של 1% פתרון pentobarbital. לעקר את כל כלי הניתוח והחומרים המתכלים שיש להשתמש בהם, כולל מקדחים, אלקטרודות, מלט דנטלי וכו ', על ידי autoclaving.
  3. כאשר העכבר מורדם לחלוטין, לגלח את השיער מהעין לאזור האוזן עם סכין גילוח.
  4. תקן את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית. הכניסו את השיניים העליונות הקדמיות למוט החותכת והכניסו את שני פסי האוזניים באופן שווה עמוק לתוך האוזניים. החל משחת עיניים אריתרומיצין על העיניים כדי למנוע יובש ועיוורון הנגרם על ידי אור בהיר במהלך הניתוח.
  5. יש לחטא את אזור הניתוח בשלושה מקלונים מתחלפים של יודופור ו-75% אלכוהול בתנועה מעגלית. לאחר מכן, בצע חתך sagittal קדימה מאמצע חתך זה, לחתוך את העור משני הצדדים של החתך כדי ליצור חלון משולש.
  6. גלגלו חתיכת כותנה קטנה לכדור והרטיבו אותה במי חמצן 3%. הסר את הרקמה הרכה המחוברת לגולגולת על ידי שפשוף עדין של האזור החשוף עם כדור צמר גפן קטן עד שהפונטנל הקדמי והאחורי נראים בבירור.
  7. התאימו את הגבהים הקדמיים והאחוריים כך שהפונטנל הקדמי והאחורי יהיה במצב אופקי. שקול את המיקום של פונטנל קדמי להיות המקור של הצירים.
  8. קבע בורג נירוסטה לגולגולת המוח הקטן השמאלית, באמצעות מקדחה ליצירת משטח שטוח. ודא שהבורג בולט באמצע הדרך החוצה מהגולגולת.
  9. ודא שהקואורדינטות להדלקת האמיגדלה הן -1.67 מ"מ אחורי, -2.7 מ"מ רוחבי, ו -4.9 מ"מ גחוני מהברגמה. התאם את ההתקן הסטריאוטקסי כדי לאתר נקודה זו ולסמן אותה.
  10. קדח חור במקום המסומן עם מקדח גולגולת בקוטר 0.5 מ"מ.
  11. מקבעים את האלקטרודות למוט האיתור של המכשיר הסטריאוטקסי, מניחים את האלקטרודה במאונך מעל החור, ומורידים את המיקום ל -4.9 מ"מ לאט. לעטוף את חוט הכסף סביב הבורג שלוש פעמים, נזהר לא לטלטל את גוף האלקטרודה במהלך הפעולה.
  12. מערבבים את המלט הדנטלי ומורחים אותו בעדינות על משטח האלקטרודה והגולגולת. כאשר המלט הדנטלי מתקשה, שנו את החלק החיצוני עד שהמלט התוחם את האלקטרודה הקבועה יהפוך לחרוט.
  13. כאשר המלט התקשה, שחררו את האלקטרודה מהמכשיר הסטריאוטקסי. תת עורית לתת meloxicam 10mg / kg כדי להקל על אי נוחות הנגרמת על ידי כאב אצל בעלי חיים. מתן meloxicam מזון מן החי עבור אפקט משכך כאבים בשבוע הראשון לאחר הניתוח. הסר את העכבר והחזיר אותו לכלוב, תוך שמירה על הפרדה משאר העכברים.

4. הדלקה חשמלית

  1. אפשרו לעכברים לנוח לפחות שבוע לאחר הניתוח לפני ההדלקה כדי לאפשר התאוששות לאחר הניתוח ולאפשר לדלקת לשכך.
    הערה: באופן כללי, עכברים שלא התאוששו כראוי אינם מגיבים היטב להדלקה.
  2. הכנס את העכבר לקופסה מותאמת אישית עם כבלי טבעת החלקה המחברים את האלקטרודה שעל ראש העכבר ואת התקן ה- EEG. העבר את הכבל דרך חור במכסה הקופסה והתאם את האורך שנותר בתיבה כדי לאפשר לעכבר לנוע בחופשיות.
  3. הפעל את מכשיר ה- EEG ובדוק אם הוא פועל כראוי. הגדר את הממריץ לספק פולסים של גל מרובע מונופאזי של 1 אלפית השנייה ב- 60 הרץ למשך רכבת של 1 שניות.
  4. התחל עם עוצמת זרם של 50 μA עבור הגירוי הראשון; לפקח על EEG עבור פריקה לאחר פריקה, אשר מאופיין קוצים בתדירות גבוהה. אם לא נצפתה פריקה לאחר מכן, הוסף 25 μA לגירוי הבא, והמשך בתהליך זה כל 10 דקות עד שנצפתה פריקה שלאחר מכן ונמשכת 5 שניות.
    הערה: אם הניסוי אינו דורש פריקה, ניתן לדלג על שלב 4.4; 300 μA חזק מספיק להדלקה.
  5. לעורר את העכבר עם עוצמת הנוכחי שנקבעה בשלב 4.3 כל 15 דקות, לא יותר מ 20 פעמים ביום.
  6. עקוב אחר התגובות ההתנהגותיות לגירוי.
    הערה: הופעתם של שלושה פרקים רצופים בדרגה V נחשבת להדלקה מלאה, בשילוב עם תקן ראסין דרגה17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האלקטרודה והמעגל מאפשרים ל-EEG להיקלט ולתפקד כגירוי (איור 1); מערך זה מונע את המורכבות של השתלת אלקטרודות, הקלטה וגירוי בנפרד וממזער את הנזק לרקמת המוח. יישום טבעות החלקה מאפשר חיבור אלקטרודות עם כל סוגי המכשירים.

ביצענו ניתוח השתלת אלקטרודות בשישה עכברים בוגרים בריאים C57BL/6, וגירוי חשמלי בוצע שבועיים לאחר הניתוח. רמת ההתקף ההתנהגותי עלתה בהדרגה ככל שמספר הגירויים גדל, הדירוג מבוסס על סולם ראסין: 1 = אוטומטיזם בפה או בפנים; 2 = שני מטומטמים מיוקלוניים או פחות; 3 = שלושה או יותר מטומטמים מיוקלוניים ו / או קלונוס הגפיים הקדמיות; 4 = טוניק-קלוני הגפה הקדמית והארכת הגב; 5 = טוניק-קלוני הגפה הקדמית והארכת הגב עם גידול והתמוטטות; 6 = סיומת קדמית ואחורית טונית-קלונית עם ריצה פרועה או קפיצה14. נרשם מספר הגירויים הדרושים להדלקה מלאה (טבלה 1).

התוצאות המייצגות של EEG לגירוי לאחר הדלקה מלאה מודגמות באיור 2. ההפרשות שלאחר מכן נמשכות 5-15 שניות; לאחר מכן, הפרשות ספונטניות תוך גולגולתיות מתגברות, ותסמינים התנהגותיים מתחילים. משך ההתקפים הוא בדרך כלל פחות מדקה, מה שמקטין את הסיכון למוות מפרכוסים חמורים וכתוצאה מכך דום נשימה.

הביטוי של c-Fos ברקמת המוח זוהה על-ידי אימונוהיסטוכימיה שעתיים לאחר הדלקה מלאה (איור 3); נעשה שימוש בנוגדן c-Fos וב-Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit IgG. התוצאות הראו כי הביטוי של c-Fos באמיגדלה ipsilateral גדל באופן משמעותי, אימות ההיתכנות של מודל זה.

כל החיות עברו אימות היסטולוגי בסוף הניסוי כדי לוודא שמטרת הגירוי מדויקת, נתיב האלקטרודות מוצג באיור 4.

Figure 1
איור 1: שלבי מפתח בייצור אלקטרודות. (A) הופעת אלקטרודות בשלבים שונים; השלבים המתאימים מסומנים בדיאגרמות. (ב) טבעת ההחלקה מתחברת לתקעי הממשק; מעגל הכותרת הנשית מוצג בכניסה (בפינה השמאלית העליונה). פסי קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות מייצגות של האלקטרואנצפלוגרפיה. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ביטוי c-Fos באמיגדלה. c-Fos (ירוק) בנוירונים של האמיגדלה; DAPI (כחול) מסמן את הגרעין; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (A) c-Fos באמיגדלה איפסילטרלית; (B) c-Fos באמיגדלה נגדית. קיצור: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenyindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אימות היסטולוגי של נתיב האלקטרודות. החיצים האדומים מצביעים על מסלול האלקטרודות, האליפסה המקווקו הלבנה היא האמיגדלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1 2 3 4 5 6
מספר גירויים 24 12 18 21 16 28
ממוצע: 19.83 סטיית תקן: 5.742

טבלה 1: מספר הגירויים הדרושים לכל אחד מששת העכברים כדי להדליק אותם במלואם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אפילפסיה היא קבוצה של מחלות עם ביטויים מרובים וגורמים מגוונים18; יש לציין כי לא ניתן להשתמש במודל יחיד לכל סוגי האפילפסיה, ועל החוקרים לבחור מודל מתאים למחקר הספציפי שלהם. המחקר הנוכחי מציג את אחת השיטות הנגישות ביותר לייצור אלקטרודות. ניתן להתאים חלקים שונים של שיטה זו כדי להסתגל לתנאי ניסוי שונים.

שיטה זו משתמשת באלקטרודות עם פונקציות גירוי והקלטה, אשר מפחיתה את הפגיעה במוחו של בעל החיים הנגרמת על ידי השתלת אלקטרודות נפרדות לגירוי ורישום EEG. בעת ייצור האלקטרודות, ניתן לבחור גדלים שונים של פיני שורה. סיכות שורת ג'מבו יכולות להתחבר לטבעת ההחלקה בצורה החזקה ביותר. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להשתיל חפצים מרובים בראשו של החיה; במקרה זה, ניתן לבחור פיני שורה קטנים מכיוון שהם תופסים פחות מקום וקלים יותר לתפעול, וניתן להשתמש בטבעת החלקה רב ערוצית לחיבור כל האלקטרודות המושתלות. טבעות החלקה יכולות לרתך סוגים שונים של ממשקים כדי לענות על הצרכים של מכשירי EEG מעבדה שונים. בנוסף, הם מאפשרים לחיה לנוע בחופשיות מבלי שהכבלים יסתבכו.

כדי להבטיח שהאלקטרודות לא ייפלו במשך תקופה ארוכה, יש צורך ליישם מלט דנטלי לאחר שהגולגולת יבשה לחלוטין. כמה חתכים אופקיים ואנכיים על פני הגולגולת מראש יכולים גם להגביר את המוצקות. לאחר הניתוח, בעלי חיים חייבים להתאושש לפחות שבוע כדי לאפשר לדלקת לשקוע, וניתן להשתמש בתרופות אנטי דלקתיות בהתאם לצורך כדי לסייע להתאוששות. ביצוע ניסויים אחרים אינו מומלץ במהלך שבוע זה.

למרות היתרונות של גישה זו, לשיטה יש מספר מגבלות. בגלל גודלו הקטן של מוח העכבר, ייתכן שהאלקטרודה לא תוטבע במדויק במיקום המטרה במהלך ניתוח סטריאוטקטי13. בהשוואה לשיטות דוגמנות אחרות, שיטה זו דורשת מהחיה לשאת את האובייקט המושתל במשך זמן רב; זה בהכרח משפיע על בעלי החיים. לדוגמה, מצאנו שבעלי חיים לעתים קרובות גירדו את ראשם כי לא היה להם נוח.

שיטה זו יכולה לשמש בשילוב עם מגוון רחב של טכנולוגיות, כגון אלקטרופיזיולוגיה19, מהדק תיקון20 וטכניקות אופטוגנטיות; עם זאת, הוא אינו מתאים לניסויים באמצעות גירוי בלולאה סגורה21. שיטות המשתמשות באותם פרמטרים של גירוי עשויות שלא לייצג התקף ספונטני טבעי, מה שאומר שהן אינן מתאימות ללמידת מכונה. לסיכום, שיטת הדלקה חשמלית זו שוללת את השפעת חילוף החומרים של התרופות על הניסוי והיא נגישה, יציבה, אמינה וישימה באופן נרחב למחקרים רבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82030037, 81871009) וועדת הבריאות העירונית של בייג'ינג (110000222T000000444685). אנו מודים ל-TopEdit (www.topeditsci.com) על עזרתה הלשונית במהלך הכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG invitrogen A-21206
c-Fos antibody ab222699
Cranial drill SANS SA302
dental cement NISSIN
EEG recording and stimulation equipment Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd NSHHFS-210803
lead-free tin wire BAKON
Pin header/Female header XIANMISI spacing of 1.27 mm
Silver wire A-M systems 786000
Slip ring Senring Electronics Co.,Ltd SNM008-04
Tungsten wire A-M systems 796000
ultrafine multi-stand wire Shenzhen Chengxing wire and cable UL10064-FEP
welding equipment BAKON BK881

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kurita, T., Sakurai, K., Takeda, Y., Horinouchi, T., Kusumi, I. Very long-term outcome of non-surgically treated patients with temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis: A retrospective study. PLoS One. 11 (7), 0159464 (2016).
  2. Choy, M., Duffy, B. A., Lee, J. H. Optogenetic study of networks in epilepsy. Journal of Neuroscience Research. 95 (12), 2325-2335 (2017).
  3. Aroniadou-Anderjaska, V., Fritsch, B., Qashu, F., Braga, M. F. Pathology and pathophysiology of the amygdala in epileptogenesis and epilepsy. Epilepsy Research. 78 (2-3), 102-116 (2008).
  4. Smith, P. D., McLean, K. J., Murphy, M. A., Turnley, A. M., Cook, M. J. Seizures, not hippocampal neuronal death, provoke neurogenesis in a mouse rapid electrical amygdala kindling model of seizures. Neuroscience. 136 (2), 405-415 (2005).
  5. Reyes, A., et al. Amygdala enlargement: Temporal lobe epilepsy subtype or nonspecific finding. Epilepsy Research. 132, 34-40 (2017).
  6. Fan, Z., et al. Diagnosis and surgical treatment of non-lesional temporal lobe epilepsy with unilateral amygdala enlargement. Neurological Sciences. 42 (6), 2353-2361 (2021).
  7. Dhir, A. Pentylenetetrazol (PTZ) kindling model of epilepsy. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9 37 (2012).
  8. Van Erum, J., Van Dam, D., De Deyn, P. P. PTZ-induced seizures in mice require a revised Racine scale. Epilepsy & Behavior. 95, 51-55 (2019).
  9. Carriero, G., et al. A guinea pig model of mesial temporal lobe epilepsy following nonconvulsive status epilepticus induced by unilateral intrahippocampal injection of kainic acid. Epilepsia. 53 (11), 1917-1927 (2012).
  10. Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience Biobehavioral Reviews. 37, 10 Pt 2 2887-2899 (2013).
  11. Fujita, A., Ota, M., Kato, K. Urinary volatile metabolites of amygdala-kindled mice reveal novel biomarkers associated with temporal lobe epilepsy. Scientific Reports. 9 (1), 10586 (2019).
  12. Li, J. J., et al. The spatiotemporal dynamics of phase synchronization during epileptogenesis in amygdala-kindling mice. PLoS One. 11 (4), 0153897 (2016).
  13. Wang, Y., Wei, P., Yan, F., Luo, Y., Zhao, G. Animal models of epilepsy: A phenotype-oriented review. Aging and Disease. 13 (1), 215-231 (2022).
  14. Fallah, M. S., Dlugosz, L., Scott, B. W., Thompson, M. D., Burnham, W. M. Antiseizure effects of the cannabinoids in the amygdala-kindling model. Epilepsia. 62 (9), 2274-2282 (2021).
  15. Chipika, R. H., et al. Amygdala pathology in amyotrophic lateral sclerosis and primary lateral sclerosis. Journal of the Neurological Sciences. 417, 117039 (2020).
  16. Kuchukhidze, G., et al. Emotional recognition in patients with mesial temporal epilepsy associated with enlarged amygdala. Frontiers in Neurology. 12, 803787 (2021).
  17. Soper, C., Wicker, E., Kulick, C. V., N'Gouemo, P., Forcelli, P. A. Optogenetic activation of superior colliculus neurons suppresses seizures originating in diverse brain networks. Neurobiology of Disease. 87, 102-115 (2016).
  18. Devinsky, O., et al. Epilepsy. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18024 (2018).
  19. Zhang, Z., et al. Interaction between thalamus and hippocampus in termination of amygdala-kindled seizures in mice. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2016, 9580724 (2016).
  20. Ghotbedin, Z., Janahmadi, M., Mirnajafi-Zadeh, J., Behzadi, G., Semnanian, S. Electrical low frequency stimulation of the kindling site preserves the electrophysiological properties of the rat hippocampal CA1 pyramidal neurons from the destructive effects of amygdala kindling: the basis for a possible promising epilepsy therapy. Brain Stimulation. 6 (4), 515-523 (2013).
  21. Hristova, K., et al. Medial septal GABAergic neurons reduce seizure duration upon optogenetic closed-loop stimulation. Brain. 144 (5), 1576-1589 (2021).

Tags

מדעי המוח גיליון 184
שימוש באלקטרודה דו-קוטבית ליצירת מודל עכבר אפילפסיה של האונה הרקתית על ידי הצתה חשמלית של האמיגדלה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, Y., Dai, Y., Ou, S., Miao, Y.,… More

Lu, Y., Dai, Y., Ou, S., Miao, Y., Wang, Y., Liu, Q., Wang, Y., Wei, P., Shan, Y., Zhao, G. Using a Bipolar Electrode to Create a Temporal Lobe Epilepsy Mouse Model by Electrical Kindling of the Amygdala. J. Vis. Exp. (184), e64113, doi:10.3791/64113 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter