Summary
A amígdala desempenha um papel fundamental na epilepsia do lobo temporal, que se origina e se propaga a partir dessa estrutura. Este artigo fornece uma descrição detalhada da fabricação de eletrodos cerebrais profundos com funções de gravação e estimulação. Introduz um modelo de epilepsia do lobo temporal medial originária da amígdala.
Abstract
A amígdala é uma das origens mais comuns de convulsões, e o modelo de rato amígdala é essencial para a ilustração da epilepsia. No entanto, poucos estudos descreveram o protocolo experimental em detalhes. Este artigo ilustra todo o processo de fabricação de modelos de epilepsia de acendimento elétrico da amígdala, com a introdução de um método de fabricação de eletrodos bipolares. Este eletrodo pode estimular e gravar, reduzindo a lesão cerebral causada pela implantação de eletrodos separados para estimulação e gravação. Para fins de registro de eletroencefalograma (EEG) de longo prazo, anéis deslizantes foram usados para eliminar a interrupção do registro causada por emaranhados de cabos e queda.
Após estimulação periódica (60 Hz, 1 s a cada 15 min) da amígdala basolateral (AP: 1,67 mm, L: 2,7 mm, V: 4,9 mm) por 19,83 ± 5,742 vezes, o acendimento completo foi observado em seis camundongos (definido como a indução de três episódios contínuos de grau V classificados pela escala de Racine). Um EEG intracraniano foi registrado durante todo o processo de acendimento e uma descarga epiléptica na amígdala com duração de 20-70 s foi observada após o acendido. Portanto, este é um protocolo robusto para modelar a epilepsia originária da amígdala, e o método é adequado para revelar o papel da amígdala na epilepsia do lobo temporal. Esta pesquisa contribui para estudos futuros sobre os mecanismos da epilepsia do lobo temporal mesial e novas drogas antiepileptogênicas.
Introduction
A epilepsia do lobo temporal (ELT) é o tipo mais prevalente de epilepsia e tem um alto risco de conversão em epilepsia resistente a medicamentos. A cirurgia, como a amigdalohipocampectomia seletiva, é um tratamento eficaz para a ELT, e a epileptogênese e a ictogênese da doença ainda estão em investigação 1,2. Demonstrou-se que a patogênese da ELT ocorre não apenas no hipocampo, mas também extensivamente na amígdala 3,4. Por exemplo, tanto a esclerose da amígdala quanto o aumento da amígdala têm sido frequentemente relatados como as origens das crises de ELT 5,6. A importância da amígdala não pode ser subestimada; um modelo de amígdala é essencial para o estudo da epileptogênese, e uma ilustração clara desse modelo é urgentemente necessária.
Várias abordagens têm sido propostas para induzir convulsões em modelos animais. No passado, drogas convulsivas eram injetadas por via intraperitoneal em um estágio inicial7. Embora este método fosse conveniente, a localização dos focos epilépticos era incerta. Com o desenvolvimento da tecnologia estereotáxica e um atlas cerebral animal detalhado, a injeção intracraniana de drogas foi aplicada para resolver o problema da localização8. No entanto, a falta de intervenção para crises graves durante o estágio agudo resultou em uma alta taxa de mortalidade, e as crises crônicas espontâneas foram acompanhadas pelo problema da frequência interictal e convulsiva instável 9,10. Finalmente, o método de acendimento elétrico foi desenvolvido; esse método estimula periodicamente regiões específicas do cérebro várias vezes, permitindo que as crises sejam induzidas com controle definitivo tanto da localização quanto do tempo de início11.
Uma vantagem desse método é que o implante intracraniano de eletrodos é minimamente invasivo12. Além disso, a gravidade da convulsão é controlável pelo término dos estímulos, reduzindo a mortalidade causada pelas convulsões. Estas alterações resolveram as deficiências das abordagens anteriores. Notavelmente, esse modelo pode imitar adequadamente as convulsões humanas e é especialmente adequado para o estudo do estado de mal epiléptico (SE) devido à sua capacidade de induzir a AE rapidamente13. Também pode ser usado para triagem de drogas antiepilépticas14 e em estudos sobre o mecanismo da epilepsia. Por fim, sabe-se que a amígdala está intimamente associada à modulação da memória, ao processamento de recompensas e à emoção15. Distúrbios dessas funções mentais são frequentemente encontrados em pacientes epilépticos e, portanto, o modelo de epilepsia da amígdala pode ser uma melhor escolha para o estudo de problemas emocionais na epilepsia16.
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Protocol
Este experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais do Hospital Xuanwu da Capital Medical University. Todos os ratos foram mantidos no laboratório de animais do Hospital Xuanwu, Capital Medical University. Este protocolo está dividido em quatro partes. As duas primeiras partes introduzem o método de construção do eletrodo e do circuito elétrico usando um anel deslizante para conectar os eletrodos e o equipamento de gravação / estimulação de EEG. A terceira parte descreve o método de operação do implante de eletrodos, e a quarta parte apresenta os parâmetros de registro e estimulação do EEG utilizados para o modelo de epilepsia da amígdala.
1. Fabricação de eletrodos
- Mantenha prontos os seguintes materiais previamente preparados: dois pedaços de 3 cm de comprimento de fio de tungstênio revestido de Teflon (diâmetro nu: 76,2 μm), um pedaço de fio de prata (diâmetro nu: 127 μm) do mesmo comprimento e um conjunto de pinos de linha calibre 2 x 2.
- Use um isqueiro para queimar uma extremidade de cada fio de tungstênio para remover 5 mm do revestimento de isolamento.
NOTA: O fio de tungstênio com o isolamento removido fica preto; esta parte do fio de tungstênio é referida como a extremidade superior. - Descasque uma seção de fio multifilamento ultrafino e envolva-o de baixo para a extremidade superior, onde começa a escurecer, continuando até o topo. Combine este fio superfino (tem uma textura macia) com o fio de tungstênio, apertando uma extremidade e torcendo suavemente a outra extremidade, o que permite que os dois materiais sejam facilmente entrelaçados.
- Puxe suavemente para garantir que eles estejam bem enrolados e corte o excesso de fios superfinos. Tente manter o fio de tungstênio reto durante todo o processo.
- Fixe o pino da linha na braçadeira na mesa de soldagem com o lado mais longo dos pinos voltado para fora. Use a agulha da seringa para pegar um pouco de pasta de solda e aplicá-la aos pinos. Aqueça a tocha de soldadura a 320 °C; derreta e espalhe um fio de estanho sem chumbo com a ponta da tocha.
- Sobreponha a extremidade superior do fio de tungstênio com uma agulha dos pinos da fileira e use a solda na tocha para ligar o fio de tungstênio ao pino.
NOTA: Seria muito difícil soldar o fio de tungstênio com os pinos diretamente sem a ajuda do fio superfino. - Soldar outro fio de tungstênio e outro fio de prata ao pino da fileira da mesma maneira, de modo que cada fio corresponda a uma agulha (ver Figura 1,i).
- Corte dois tubos termoencolhíveis um pouco mais longos do que a extremidade superior do fio de tungstênio. Coloque-os na junta de solda de dois fios de tungstênio, garantindo que a parte condutora esteja totalmente coberta no tubo para que o circuito dos dois fios de tungstênio não seja colocado em série.
NOTA: Embora existam três fios, se dois deles estiverem isolados, os três fios não estarão em série; um tubo também pode ser adicionado ao fio de prata. - Remova o eletrodo da braçadeira da mesa de soldagem e segure o eletrodo suavemente com um alicate grande, pois é fácil que os eletrodos percam sua forma ao aquecer o tubo encolhível, usando uma boa braçadeira de condutividade térmica com um pouco mais de força.
- Ligue a conduta de ar e aqueça até atingir uma temperatura de 320 °C. Soprar o tubo termoencolhível durante vários segundos até que esteja apertado (ver figura 1,ii).
- Se as agulhas se separarem do corpo de plástico durante o processo de soldadura, junte a parte de soldadura e o corpo de plástico com um adesivo hot melt (ver Figura 1,iii). Tenha cuidado para não manchar na interface, pois isso afetaria a inserção da interface.
- Segure os dois fios de tungstênio e torça-os juntos, mantendo suas extremidades separadas (ver Figura 1,iv). Aparar os fios de tungstênio torcidos a aproximadamente 10 mm de comprimento para que a separação nas extremidades não exceda 0,5 mm.
NOTA: Esta etapa também pode ser realizada antes do implante do eletrodo para permitir o ajuste flexível do comprimento do eletrodo. - Aqueça a pistola de cola e aplique a cola uniformemente ao redor do eletrodo.
- Verifique os eletrodos com um multímetro: coloque uma barra do multímetro no lado não soldado dos pinos da fileira e toque suavemente a extremidade do fio de tungstênio ou fio de prata na outra barra, verificando se o circuito está liso. Certifique-se de que as linhas não sejam colocadas em série.
2. Conexão do anel deslizante e descrição do circuito
NOTA: Quando os eletrodos nos mouses são conectados a um dispositivo de EEG através de cabos em uma condição de movimento livre, os cabos podem ficar emaranhados à medida que os mouses se movem e se voltam. Isso faz com que os cabos se tornem mais curtos, eventualmente impedindo que os ratos se movam ou fazendo com que os cabos caiam de suas cabeças. No método descrito aqui, um anel deslizante de quatro canais é introduzido para evitar que os cabos caiam. Os quatro canais estão representados em quatro cores na Figura 1B.
- Descasque 5 mm da pele de isolamento em cada extremidade para expor o fio de metal no interior.
- Adicione uma seção de tubo termoencolhível a cada fio do estator.
- Solde cada fio com o plugue do conector do dispositivo EEG.
- Reduza o tubo termoencolhível com ar quente.
- Adicione uma seção de tubo termoencolhível a cada fio do rotor.
- Parafuse as partes condutoras dos fios vermelho e laranja e solde-as a uma junta no cabeçalho para encaixar o pino da linha.
- Solde os outros dois fios no conector a cada junta.
NOTA: O canal marrom que corresponde ao fio prateado é conectado ao dispositivo EEG para aterramento. Os canais vermelho e laranja recebem sinais do mesmo fio de tungstênio, e o canal laranja serve como referência para o dispositivo de EEG. Os sinais no canal vermelho não têm sentido, mas devem coexistir com o canal preto para formar um estímulo atual. Os sinais no canal preto são os sinais elétricos reais no cérebro. Diferentes circuitos podem ser projetados com anéis deslizantes multicanal para se adequar a diferentes dispositivos.
3. Cirurgia para implantação
- Animais
- Use camundongos machos C57BL/6 do tipo selvagem de 8 semanas de idade, pesando 24-26 g, para cirurgias.
- Abrigue-os com um ciclo claro-escuro de 12 h (tempo claro: 8:00-20:00) em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 1 °C) e forneça água e alimentação ad libitum.
- Use um tapete de calor extra para manter os animais aquecidos durante a cirurgia.
- Após a cirurgia, injetar meloxicam por via subcutânea (10 mg/kg) como a primeira administração de analgésicos. Em seguida, coloque os animais em gaiolas separadas para otimizar a recuperação. Adicione meloxicam à dieta do animal durante a primeira semana após a cirurgia.
- Após o experimento, infundir os ventrículos esquerdos dos camundongos com paraformaldeído a 4% sob anestesia e coletar os tecidos cerebrais para verificação histológica do alvo do eletrodo.
- Pesar o rato e anestesiar-o por injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital a 1%. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e consumíveis a serem utilizados, incluindo brocas, eletrodos, cimento dental, etc., por autoclavagem.
- Quando o rato estiver completamente anestesiado, raspe o cabelo do olho para a área da orelha com uma navalha.
- Corrija o mouse no quadro estereotáxico. Coloque os dentes superiores da frente na barra incisiva e insira ambas as barras auriculares igualmente profundamente nas orelhas. Aplique pomada ocular eritromicina nos olhos para evitar a secura e cegueira causada por uma luz brilhante durante a cirurgia.
- Desinfetar a área cirúrgica com três swabs alternados de iodóforo e álcool a 75% em movimento circular. Em seguida, faça uma incisão sagital para a frente a partir do meio dessa incisão e corte a pele em ambos os lados da incisão para criar uma janela triangular.
- Enrole um pequeno pedaço de algodão em uma bola e molhe-o com 3% de peróxido de hidrogênio. Remova o tecido mole ligado ao crânio esfregando suavemente a área exposta com uma pequena bola de algodão até que a fontanela anterior e posterior seja claramente vista.
- Ajuste as alturas anterior e posterior para que a fontanela anterior e posterior esteja na posição horizontal. Considere a posição da fontanela anterior como a origem dos eixos.
- Fixe um parafuso de aço inoxidável no crânio cerebelar esquerdo, usando uma broca para criar uma superfície plana. Certifique-se de que o parafuso se projete até a metade do crânio.
- Certifique-se de que as coordenadas para o acendimento da amígdala sejam -1,67 mm posteriores, -2,7 mm laterais e -4,9 mm ventrais do bregma. Ajuste o dispositivo estereotáxico para localizar esse ponto e marcá-lo.
- Faça um furo no local marcado com uma broca de crânio de 0,5 mm de diâmetro.
- Fixe os eletrodos na haste de localização do dispositivo estereotáxico, coloque o eletrodo verticalmente acima do orifício e solte a posição para -4,9 mm lentamente. Enrole o fio de prata ao redor do parafuso três vezes, tomando cuidado para não agitar o corpo do eletrodo durante a operação.
- Misture o cimento dentário e aplique-o suavemente na superfície do eletrodo e do crânio. Quando o cimento dentário endurecer, modifique o exterior até que o cimento que envolve o eletrodo fixo se transforme em um cone.
- Quando o cimento tiver endurecido, solte o eletrodo do dispositivo estereotáxico. Por via subcutânea administrar meloxicam 10mg/kg para aliviar o desconforto causado pela dor em animais. Administrar meloxicam a alimentos de origem animal para efeito analgésico na primeira semana após a cirurgia. Remova o mouse e coloque-o de volta na gaiola, mantendo-o separado dos outros ratos.
4. Acender elétrico
- Permita que os ratos descansem por pelo menos 1 semana após a cirurgia antes de acender para permitir a recuperação pós-operatória e permitir que a inflamação diminua.
NOTA: Em geral, os ratos que não se recuperaram adequadamente não respondem bem ao acendalhamento. - Coloque o mouse em uma caixa personalizada com cabos de anel deslizante conectando o eletrodo na cabeça do mouse e o dispositivo de EEG. Passe o cabo através de um orifício na tampa da caixa e ajuste o comprimento deixado na caixa para permitir que o mouse se mova livremente.
- Ligue o dispositivo de EEG e verifique se ele está funcionando corretamente. Ajuste o estimulador para fornecer pulsos monofásicos de onda quadrada de 1 ms a 60 Hz por uma duração de trem de 1 s.
- Comece com uma intensidade de corrente de 50 μA para a primeira estimulação; monitorar o EEG para pós-descarga, que é caracterizada por picos de alta frequência. Se nenhuma pós-descarga for observada, adicione 25 μA ao próximo estímulo e continue esse processo a cada 10 minutos até que uma pós-descarga seja observada e dure 5 s.
NOTA: Se a experiência não necessitar de uma descarga, o passo 4.4 pode ser ignorado; 300 μA é forte o suficiente para acender. - Estimule o rato com a intensidade de corrente determinada no passo 4.3 a cada 15 min, não mais do que 20 vezes por dia.
- Monitore as respostas comportamentais ao estímulo.
NOTA: A ocorrência de três episódios consecutivos de grau V é considerada full kindling, combinada com o padrão de classificaçãoRacine 17.
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Representative Results
O eletrodo e o circuito permitem que o EEG seja registrado e funcione como uma estimulação (Figura 1); essa configuração evita a complexidade de implantar eletrodos de gravação e estimulação separadamente e minimiza os danos ao tecido cerebral. A aplicação de anéis deslizantes permite a conexão de eletrodos com todos os tipos de dispositivos.
Realizamos cirurgia de implante de eletrodo em seis camundongos adultos saudáveis machos C57BL/6, e a estimulação elétrica foi realizada 2 semanas após a cirurgia. O nível de convulsão comportamental aumentou gradualmente com o aumento do número de estímulos, a classificação é baseada na escala de Racine: 1 = automatismos bucais ou faciais; 2 = dois ou menos empurrões mioclônicos; 3 = três ou mais espasmos mioclônicos e/ou clônus do membro anterior; 4 = extensão tônico-clônica do membro anterior e das costas; 5 = extensão tônico-clônica do membro anterior e das costas com criação e colapso; 6 = extensão tônico-clônica do membro anterior e das costas com corrida ou salto selvagem14. O número de estímulos necessários para o kindling completo foi registrado (Tabela 1).
Os resultados representativos de um EEG para estimulação após o acendimento completo estão ilustrados na Figura 2. As pós-descargas duram 5-15 s; em seguida, as descargas espontâneas intracranianas se intensificam e os sintomas comportamentais começam. A duração da convulsão é geralmente inferior a 1 min, o que reduz o risco de morte por convulsões graves, resultando em apneia.
A expressão de c-Fos no tecido cerebral foi detectada por imuno-histoquímica 2 h após o acendimento completo (Figura 3); Foram utilizados o anticorpo c-Fos e a IgG anti-coelho conjugada com burro Alexa Fluor 488. Os resultados mostraram que a expressão de c-Fos na amígdala ipsilateral foi significativamente aumentada, verificando-se a viabilidade desse modelo.
Todos os animais foram submetidos à verificação histológica ao final do experimento para garantir que o alvo de estimulação fosse preciso, o trajeto do eletrodo é mostrado na Figura 4.
Figura 1: Principais etapas na fabricação de eletrodos. (A) Aparecimento de eletrodos em diferentes etapas; as etapas correspondentes são marcadas nos diagramas. (B) O anel deslizante se conecta aos plugues de interface; o circuito de cabeçalho feminino é mostrado na inserção (canto superior direito). Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos da eletroencefalografia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão de c-Fos na amígdala. c-Fos (verde) nos neurônios da amígdala; DAPI (azul) rotula o núcleo; barra de escala = 100 μm. (A) c-Fos na amígdala ipsilateral; (B) c-Fos na amígdala contralateral. Abreviação: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenindol. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Verificação histológica do trajeto do eletrodo. As setas vermelhas apontam para a trilha do eletrodo, o oval tracejado branco é a amígdala. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Número de estímulos | 24 | 12 | 18 | 21 | 16 | 28 |
| Média: 19.83 Desvio padrão: 5.742 | ||||||
Tabela 1: O número de estímulos necessários para que cada um dos seis camundongos seja totalmente aceso.
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Discussion
A epilepsia é um grupo de doenças com múltiplas manifestações e causas diversas18; deve-se notar que nenhum modelo único pode ser usado para todos os tipos de epilepsia, e os pesquisadores devem selecionar um modelo apropriado para seu estudo específico. O presente estudo apresenta um dos métodos mais acessíveis de fabricação de eletrodos. Várias partes deste método podem ser ajustadas para se adaptar a diferentes condições experimentais.
Este método utiliza eletrodos com funções estimulantes e de gravação, o que reduz a lesão no cérebro do animal causada pela implantação de eletrodos separados para estimulação e gravação de EEG. Ao fabricar os eletrodos, diferentes tamanhos de pinos de linha podem ser escolhidos. Os pinos de linha Jumbo podem se conectar ao anel deslizante com mais firmeza. No entanto, vários objetos podem precisar ser implantados na cabeça do animal; neste caso, pequenos pinos de linha podem ser selecionados porque ocupam menos espaço e são mais fáceis de operar, e um anel deslizante multicanal pode ser usado para conectar todos os eletrodos implantados. Os anéis deslizantes podem soldar diferentes tipos de interfaces para atender às necessidades de diferentes dispositivos de EEG de laboratório. Além disso, eles permitem que o animal se mova livremente sem que os cabos fiquem emaranhados.
Para garantir que os eletrodos não caiam por um longo período, é necessário aplicar cimento dental depois que o crânio estiver completamente seco. Alguns cortes horizontais e verticais na superfície do crânio com antecedência também podem aumentar a firmeza. Após a cirurgia, os animais devem se recuperar por pelo menos uma semana para permitir que a inflamação diminua, e os medicamentos anti-inflamatórios podem ser usados conforme apropriado para ajudar na recuperação. A realização de outros experimentos não é recomendada durante esta semana.
Apesar dos méritos dessa abordagem, o método tem várias limitações. Devido ao pequeno tamanho do cérebro do rato, o eletrodo pode não estar incorporado com precisão no local alvo durante a cirurgia estereotáxica13. Em comparação com outros métodos de modelagem, este método requer que o animal carregue o objeto implantado por um longo tempo; isso inevitavelmente tem um impacto sobre os animais. Por exemplo, descobrimos que os animais muitas vezes coçavam a cabeça porque estavam desconfortáveis.
Este método pode ser usado em combinação com uma variedade de tecnologias, como eletrofisiologia19, patch clamp20 e técnicas optogenéticas; no entanto, não é adequado para experimentos que utilizam estimulação de circuito fechado21. Métodos que usam os mesmos parâmetros de estímulo podem não ser representativos de uma convulsão espontânea natural, o que significa que eles não são adequados para aprendizado de máquina. Em conclusão, este método de acendimento elétrico exclui a influência do metabolismo da droga no experimento e é acessível, estável, confiável e amplamente aplicável a muitos estudos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
A pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82030037, 81871009) e pela Comissão Municipal de Saúde de Pequim (11000022T000000444685). Agradecemos à TopEdit (www.topeditsci.com) por sua assistência linguística durante a preparação deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG | invitrogen | A-21206 | |
| c-Fos antibody | ab222699 | ||
| Cranial drill | SANS | SA302 | |
| dental cement | NISSIN | ||
| EEG recording and stimulation equipment | Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd | NSHHFS-210803 | |
| lead-free tin wire | BAKON | ||
| Pin header/Female header | XIANMISI | spacing of 1.27 mm | |
| Silver wire | A-M systems | 786000 | |
| Slip ring | Senring Electronics Co.,Ltd | SNM008-04 | |
| Tungsten wire | A-M systems | 796000 | |
| ultrafine multi-stand wire | Shenzhen Chengxing wire and cable | UL10064-FEP | |
| welding equipment | BAKON | BK881 |
References
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