Summary
La amígdala juega un papel clave en la epilepsia del lóbulo temporal, que se origina y se propaga a partir de esta estructura. Este artículo proporciona una descripción detallada de la fabricación de electrodos cerebrales profundos con funciones de grabación y estimulación. Introduce un modelo de epilepsia del lóbulo temporal medial que se origina en la amígdala.
Abstract
La amígdala es uno de los orígenes más comunes de las convulsiones, y el modelo de ratón de la amígdala es esencial para la ilustración de la epilepsia. Sin embargo, pocos estudios han descrito el protocolo experimental en detalle. Este artículo ilustra todo el proceso de fabricación de modelos de epilepsia eléctrica de la amígdala, con la introducción de un método de fabricación de electrodos bipolares. Este electrodo puede estimular y grabar, reduciendo la lesión cerebral causada por la implantación de electrodos separados para la estimulación y el registro. Para fines de registro de electroencefalograma (EEG) a largo plazo, se utilizaron anillos colectores para eliminar la interrupción del registro causada por enredos de cables y caídas.
Después de la estimulación periódica (60 Hz, 1 s cada 15 min) de la amígdala basolateral (AP: 1,67 mm, L: 2,7 mm, V: 4,9 mm) durante 19,83 ± 5,742 veces, se observó un encendido completo en seis ratones (definido como la inducción de tres episodios continuos de grado V clasificados por la escala de Racine). Se registró un EEG intracraneal durante todo el proceso de encendido, y se observó una descarga epiléptica en la amígdala que duró 20-70 s después del encendido. Por lo tanto, este es un protocolo robusto para modelar la epilepsia que se origina en la amígdala, y el método es adecuado para revelar el papel de la amígdala en la epilepsia del lóbulo temporal. Esta investigación contribuye a futuros estudios sobre los mecanismos de la epilepsia del lóbulo temporal mesial y nuevos fármacos antiepileptogénicos.
Introduction
La epilepsia del lóbulo temporal (TLE) es el tipo más prevalente de epilepsia y tiene un alto riesgo de conversión en epilepsia resistente a los medicamentos. La cirugía, como la amigdalohipocampectomía selectiva, es un tratamiento eficaz para la TLE, y la epileptogénesis y la ictogénesis de la enfermedad aún están bajo investigación 1,2. Se ha demostrado que la patogénesis de la TLE ocurre no sólo en el hipocampo sino también extensamente en la amígdala 3,4. Por ejemplo, tanto la esclerosis de la amígdala como el agrandamiento de la amígdala han sido frecuentemente reportados como los orígenes de las convulsiones de TLE 5,6. La importancia de la amígdala no puede ser subestimada; Un modelo de amígdala es esencial para el estudio de la epileptogénesis, y se necesita urgentemente una ilustración clara de este modelo.
Se han propuesto varios enfoques para inducir convulsiones en modelos animales. En el pasado, los fármacos convulsivos se inyectaban por vía intraperitoneal en una etapa temprana7. Aunque este método era conveniente, la ubicación de los focos epilépticos era incierta. Con el desarrollo de la tecnología estereotáctica y un atlas cerebral animal detallado, se aplicó la inyección intracraneal de fármacos para resolver el problema de la localización8. Sin embargo, la falta de intervención para las convulsiones graves durante la etapa aguda resultó en una alta tasa de mortalidad, y las crisis crónicas espontáneas fueron acompañadas por el problema de la frecuencia interictal y convulsiva inestable 9,10. Finalmente, se desarrolló el método de encendido eléctrico; Este método estimula periódicamente regiones específicas del cerebro varias veces, permitiendo que las convulsiones sean inducidas con un control definido tanto de la ubicación como del tiempo de inicio11.
Una ventaja de este método es que la implantación intracraneal de electrodos es mínimamente invasiva12. Además, la gravedad de la convulsión es controlable por la terminación de los estímulos, reduciendo la mortalidad causada por las convulsiones. Estos cambios resolvieron las deficiencias de los enfoques anteriores. En particular, este modelo puede imitar adecuadamente las convulsiones humanas y es especialmente adecuado para el estudio del estado epiléptico (EE) debido a su capacidad para inducir SE rápidamente13. También se puede utilizar para el cribado de fármacos antiepilépticos14 y en estudios sobre el mecanismo de la epilepsia. Finalmente, es bien sabido que la amígdala está estrechamente asociada con la modulación de la memoria, el procesamiento de recompensas y la emoción15. Los trastornos de estas funciones mentales se encuentran a menudo en pacientes epilépticos y, por lo tanto, el modelo de epilepsia de la amígdala puede ser una mejor opción para estudiar los problemas emocionales en la epilepsia16.
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Protocol
Este experimento fue aprobado por el Comité de Ética de Animales Experimentales del Hospital Xuanwu, Universidad Médica Capital. Todos los ratones se mantuvieron en el laboratorio de animales del Hospital Xuanwu, Universidad Médica Capital. Este protocolo se divide en cuatro partes. Las dos primeras partes introducen el método de construcción del electrodo y el circuito eléctrico utilizando un anillo colector para conectar los electrodos y el equipo de registro / estimulación de EEG. La tercera parte describe el método de operación de implantación de electrodos, y la cuarta parte presenta los parámetros de registro y estimulación del EEG utilizados para el modelo de epilepsia de la amígdala.
1. Fabricación de electrodos
- Mantenga listos los siguientes materiales previamente preparados: dos piezas de alambre de tungsteno recubierto de teflón de 3 cm de largo (diámetro desnudo: 76,2 μm), una pieza de alambre de plata (diámetro desnudo: 127 μm) de la misma longitud y un juego de pasadores de fila calibrados 2 x 2.
- Use un encendedor para quemar un extremo de cada alambre de tungsteno para eliminar 5 mm del revestimiento aislante.
NOTA: El alambre de tungsteno con el aislamiento retirado se vuelve negro; Esta parte del alambre de tungsteno se conoce como el extremo superior. - Pele una sección de alambre multihilo ultrafino y envuélvalo desde la parte inferior hasta el extremo superior donde comienza a oscurecer, continuando hasta la parte superior. Combine este alambre superfino (tiene una textura suave) con el alambre de tungsteno pellizcando un extremo y girando suavemente el otro extremo, lo que permite que los dos materiales se entrelazen fácilmente.
- Tire suavemente para asegurarse de que estén bien envueltos y cortar el exceso de alambre superfino. Trate de mantener el alambre de tungsteno recto durante todo el proceso.
- Fije el pasador de fila a la abrazadera de la mesa de soldadura con el lado más largo de los pasadores hacia afuera. Use la aguja de la jeringa para recoger un poco de pasta de soldadura y aplíquela a los alfileres. Calentar el soplete de soldadura a 320 °C; Derrita y unte un poco de alambre de estaño sin plomo con la punta de la antorcha.
- Superponga el extremo superior del alambre de tungsteno con una aguja de los pines de la fila y use la soldadura en la antorcha para unir el alambre de tungsteno al pasador.
NOTA: Sería muy difícil soldar el alambre de tungsteno con los pasadores directamente sin la ayuda del alambre superfino. - Suelde otro alambre de tungsteno y otro alambre de plata al pasador de la hilera de la misma manera que cada alambre corresponda a una aguja (véase la figura 1,i).
- Corte dos tubos termorretráctiles ligeramente más largos que el extremo superior del alambre de tungsteno. Colóquelos en la junta de soldadura de dos cables de tungsteno, asegurándose de que la parte conductora esté completamente cubierta en el tubo para que el circuito de los dos cables de tungsteno no se coloque en serie.
NOTA: Aunque hay tres cables, si dos de ellos están aislados, los tres cables no estarán en serie; También se puede agregar un tubo al alambre de plata. - Retire el electrodo de la abrazadera de la mesa de soldadura y sostenga el electrodo suavemente con alicates grandes, ya que es fácil que los electrodos pierdan su forma al calentar el tubo retráctil, utilizando una buena abrazadera de conductividad térmica con un poco más de fuerza.
- Encienda el conducto de aire y caliente hasta alcanzar una temperatura de 320 °C. Sople el tubo termorretráctil durante varios segundos hasta que esté apretado (véase la figura 1, ii).
- Si las agujas se separan del cuerpo de plástico durante el proceso de soldadura, empalme la pieza de soldadura y el cuerpo de plástico con un adhesivo termofusible (véase la figura 1, iii). Tenga cuidado de no mancharlo en la interfaz, ya que esto afectaría la inserción de la interfaz.
- Sostenga los dos alambres de tungsteno y gírelos juntos, manteniendo sus extremos separados (véase la figura 1, iv). Recorte los alambres de tungsteno trenzados a aproximadamente 10 mm de longitud para que la separación en los extremos no exceda de 0,5 mm.
NOTA: Este paso también se puede realizar antes de la implantación del electrodo para permitir un ajuste flexible de la longitud del electrodo. - Caliente la pistola de pegamento y aplique el pegamento uniformemente alrededor del electrodo.
- Verifique los electrodos con un multímetro: coloque una barra del multímetro en el lado sin soldar de los pines de la fila y toque suavemente el extremo del alambre de tungsteno o el alambre de plata con la otra barra, verificando si el circuito es liso. Asegúrese de que las líneas no se colocan en serie.
2. Conexión del anillo colector y descripción del circuito
NOTA: Cuando los electrodos de los ratones se conectan a un dispositivo de EEG a través de cables en una condición de movimiento libre, los cables pueden enredarse a medida que los ratones se mueven y se dan la vuelta. Esto hace que los cables se vuelvan más cortos, lo que eventualmente impide que los ratones se muevan o hace que los cables se caigan de sus cabezas. En el método descrito aquí, se introduce un anillo colector de cuatro canales para evitar que los cables se caigan. Los cuatro canales se representan en cuatro colores en la Figura 1B.
- Despegue 5 mm de la piel de aislamiento en cada extremo para exponer el cable metálico en el interior.
- Agregue una sección de tubo termorretráctil a cada cable del estator.
- Suelde cada cable con el enchufe del conector del dispositivo EEG.
- Encoge el tubo termorretráctil con aire caliente.
- Agregue una sección de tubo termorretráctil a cada cable del rotor.
- Atornille las partes conductoras de los cables rojo y naranja y suéldelas a una junta en el cabezal para que quepan el pasador de fila.
- Suelde los otros dos cables del cabezal a cada unión.
NOTA: El canal marrón que corresponde al cable plateado está conectado al dispositivo EEG para la conexión a tierra. Los canales rojo y naranja reciben señales del mismo alambre de tungsteno, y el canal naranja sirve como referencia para el dispositivo EEG. Las señales en el canal rojo no tienen sentido, pero deben coexistir con el canal negro para formar un estímulo de corriente. Las señales en el canal negro son las señales eléctricas reales en el cerebro. Se pueden diseñar diferentes circuitos con anillos colectores multicanal para adaptarse a diferentes dispositivos.
3. Cirugía para implantación
- Animales
- Use ratones machos de tipo salvaje C57BL / 6 de 8 semanas de edad, con un peso de 24-26 g, para cirugías.
- Alójelos con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (tiempo de luz: 8:00-20:00) en un ambiente de temperatura controlada (22 ± 1 ° C) y proporcione agua y alimento ad libitum.
- Use una estera de calor adicional para mantener a los animales calientes durante la cirugía.
- Después de la cirugía, inyectar meloxicam por vía subcutánea (10 mg/kg) como primera administración de analgésicos. Luego, coloque a los animales en jaulas separadas para optimizar la recuperación. Agregue meloxicam a la dieta del animal durante la primera semana después de la cirugía.
- Después del experimento, infundir los ventrículos izquierdos de los ratones con paraformaldehído al 4% bajo anestesia y recolectar los tejidos cerebrales para la verificación histológica del objetivo del electrodo.
- Pesar el ratón y anestesiarlo mediante inyección intraperitoneal de solución de pentobarbital al 1%. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y consumibles a utilizar, incluyendo brocas, electrodos, cemento dental, etc., mediante autoclave.
- Cuando el ratón esté completamente anestesiado, afeite el pelo desde el ojo hasta el área de la oreja con una navaja de afeitar.
- Fije el ratón en el marco estereotáxico. Coloque los dientes superiores frontales en la barra incisiva e inserte ambas barras auriculares con la misma profundidad en las orejas. Aplique ungüento oftálmico de eritromicina en los ojos para prevenir la sequedad y la ceguera causadas por una luz brillante durante la cirugía.
- Desinfecte el área quirúrgica con tres hisopos alternados de yodóforo y alcohol al 75% en un movimiento circular. Luego, haga una incisión sagital hacia adelante desde el centro de esta incisión y corte la piel a cada lado de la incisión para crear una ventana triangular.
- Enrolle un pequeño trozo de algodón en una bola y humedézcalo con peróxido de hidrógeno al 3%. Retire el tejido blando adherido al cráneo frotando suavemente el área expuesta con una pequeña bola de algodón hasta que la fontanela anterior y posterior se vean claramente.
- Ajuste las alturas anterior y posterior para que la fontanela anterior y posterior quede en posición horizontal. Considere que la posición de la fontanela anterior es el origen de los ejes.
- Fije un tornillo de acero inoxidable al cráneo cerebeloso izquierdo, usando un taladro para crear una superficie plana. Asegúrese de que el tornillo sobresalga hasta la mitad del cráneo.
- Asegúrese de que las coordenadas para el encendido de la amígdala sean -1,67 mm posterior, -2,7 mm lateral y -4,9 mm ventral desde el bregma. Ajuste el dispositivo estereotáxico para localizar este punto y márquelo.
- Perfore un agujero en el lugar marcado con un taladro de cráneo de 0,5 mm de diámetro.
- Fije los electrodos a la varilla de localización del dispositivo estereotáxico, coloque el electrodo verticalmente sobre el orificio y deje caer la posición a -4,9 mm lentamente. Envuelva el alambre plateado alrededor del tornillo tres veces, teniendo cuidado de no sacudir el cuerpo del electrodo durante la operación.
- Mezcle el cemento dental y aplíquelo suavemente sobre el electrodo y la superficie del cráneo. Cuando el cemento dental se endurezca, modifique el exterior hasta que el cemento que encierra el electrodo fijo se convierta en un cono.
- Cuando el cemento se haya endurecido, suelte el electrodo del dispositivo estereotáxico. Administrar por vía subcutánea meloxicam 10mg/kg para aliviar las molestias causadas por el dolor en animales. Administrar meloxicam a alimentos de origen animal para el efecto analgésico en la primera semana después de la cirugía. Retire el ratón y colóquelo de nuevo en la jaula, manteniéndolo separado de los otros ratones.
4. Encendido eléctrico
- Permita que los ratones descansen durante al menos 1 semana después de la cirugía antes de encender para permitir la recuperación postoperatoria y permitir que la inflamación disminuya.
NOTA: En general, los ratones que no se han recuperado adecuadamente no responden bien al encendido. - Coloque el mouse en una caja personalizada con cables de anillo deslizante que conecten el electrodo en la cabeza del mouse y el dispositivo EEG. Pase el cable a través de un orificio en la tapa de la caja y ajuste la longitud que queda en la caja para permitir que el mouse se mueva libremente.
- Encienda el dispositivo EEG y compruebe si funciona correctamente. Ajuste el estimulador para que entregue pulsos monofásicos de onda cuadrada de 1 ms a 60 Hz durante una duración de tren de 1 s.
- Comience con una intensidad de corriente de 50 μA para la primera estimulación; monitorear el EEG para después de la descarga, que se caracteriza por picos de alta frecuencia. Si no se observa una descarga posterior, agregue 25 μA al siguiente estímulo y continúe este proceso cada 10 minutos hasta que se observe una descarga posterior que dure 5 s.
NOTA: Si el experimento no requiere una descarga, se puede omitir el paso 4.4; 300 μA es lo suficientemente fuerte para encender. - Estimule el ratón con la intensidad de corriente determinada en el paso 4.3 cada 15 minutos, no más de 20 veces al día.
- Monitoree las respuestas conductuales al estímulo.
NOTA: La ocurrencia de tres episodios consecutivos de grado V se considera encendido completo, combinado con el estándar de rangoRacine 17.
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Representative Results
El electrodo y el circuito permiten registrar el EEG y funcionar como una estimulación (Figura 1); Esta configuración evita la complejidad de implantar electrodos de grabación y estimulación por separado y minimiza el daño al tejido cerebral. La aplicación de anillos colectores permite la conexión de electrodos con todo tipo de dispositivos.
Realizamos cirugía de implantación de electrodos en seis ratones machos adultos sanos C57BL / 6, y la estimulación eléctrica se realizó 2 semanas después de la cirugía. El nivel de convulsiones conductuales aumentó gradualmente con el aumento del número de estímulos, la clasificación se basa en la escala de Racine: 1 = automatismos bucales o faciales; 2 = dos o menos sacudidas mioclónicas; 3 = tres o más sacudidas mioclónicas y/o clon de extremidades anteriores; 4 = extensión tónico-clónica de las extremidades anteriores y de la espalda; 5 = extensión tónico-clónica de las extremidades anteriores y de la espalda con crianza y colapso; 6 = extensión tónico-clónica de las extremidades anteriores y la espalda con carrera salvaje o salto14. Se registró el número de estímulos necesarios para la ignición completa (Tabla 1).
Los resultados representativos de un EEG para la estimulación después de la ignición completa se ilustran en la Figura 2. Las descargas posteriores duran 5-15 s; Luego, las descargas espontáneas intracraneales se intensifican y comienzan los síntomas conductuales. La duración de las convulsiones suele ser inferior a 1 minuto, lo que reduce el riesgo de muerte por convulsiones graves que resultan en apnea.
La expresión de c-Fos en el tejido cerebral se detectó por inmunohistoquímica 2 h después de la ignición completa (Figura 3); Se utilizó el anticuerpo c-Fos y la IgG anti-conejo anti-conejo conjugado Alexa Fluor 488. Los resultados mostraron que la expresión de c-Fos en la amígdala ipsilateral aumentó significativamente, verificando la viabilidad de este modelo.
Todos los animales se sometieron a una verificación histológica al final del experimento para garantizar que el objetivo de estimulación fuera preciso, la trayectoria del electrodo se muestra en la Figura 4.
Figura 1: Pasos clave en la fabricación de electrodos. (A) Aparición de electrodos en diferentes etapas; Los pasos correspondientes están marcados en los diagramas. (B) El anillo colector se conecta a los enchufes de interfaz; El circuito de cabecera hembra se muestra en el recuadro (arriba a la derecha). Barras de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de la electroencefalografía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: expresión de c-Fos en la amígdala. c-Fos (verde) en las neuronas de la amígdala; DAPI (azul) etiqueta el núcleo; barra de escala = 100 μm. (A) c-Fos en la amígdala ipsilateral; (B) c-Fos en la amígdala contralateral. Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-feninil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Verificación histológica de la trayectoria del electrodo. Las flechas rojas apuntan a la pista del electrodo, el óvalo blanco discontinuo es la amígdala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Número de estímulos | 24 | 12 | 18 | 21 | 16 | 28 |
| Promedio: 19.83 Desviación estándar: 5.742 | ||||||
Tabla 1: El número de estímulos necesarios para que cada uno de los seis ratones se encienda completamente.
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Discussion
La epilepsia es un grupo de enfermedades con múltiples manifestaciones y diversas causas18; Cabe señalar que no se puede utilizar un modelo único para todos los tipos de epilepsia, y los investigadores deben seleccionar un modelo apropiado para su estudio específico. El presente estudio presenta uno de los métodos más accesibles de fabricación de electrodos. Varias partes de este método se pueden ajustar para adaptarse a diferentes condiciones experimentales.
Este método utiliza electrodos con funciones de estimulación y registro, lo que reduce la lesión al cerebro del animal causada por la implantación de electrodos separados para la estimulación y el registro de EEG. Al fabricar los electrodos, se pueden elegir diferentes tamaños de pasadores de hilera. Los pines de fila Jumbo pueden conectarse al anillo deslizante con mayor firmeza. Sin embargo, es posible que sea necesario implantar múltiples objetos en la cabeza del animal; En este caso, se pueden seleccionar pasadores de fila pequeños porque ocupan menos espacio y son más fáciles de operar, y se puede usar un anillo deslizante multicanal para conectar todos los electrodos implantados. Los anillos colectores pueden soldar diferentes tipos de interfaces para satisfacer las necesidades de diferentes dispositivos EEG de laboratorio. Además, permiten que el animal se mueva libremente sin que los cables se enreden.
Para garantizar que los electrodos no se caigan durante un período prolongado, es necesario aplicar cemento dental después de que el cráneo esté completamente seco. Unos pocos cortes horizontales y verticales en la superficie del cráneo por adelantado también pueden aumentar la firmeza. Después de la cirugía, los animales deben recuperarse durante al menos una semana para permitir que la inflamación disminuya, y se pueden usar medicamentos antiinflamatorios según corresponda para ayudar a la recuperación. No se recomienda realizar otros experimentos durante esta semana.
A pesar de los méritos de este enfoque, el método tiene varias limitaciones. Debido al pequeño tamaño del cerebro del ratón, el electrodo puede no estar incrustado con precisión en la ubicación objetivo durante la cirugía estereotáctica13. En comparación con otros métodos de modelado, este método requiere que el animal lleve el objeto implantado durante mucho tiempo; Esto inevitablemente tiene un impacto en los animales. Por ejemplo, descubrimos que los animales a menudo se rascaban la cabeza porque se sentían incómodos.
Este método se puede utilizar en combinación con una variedad de tecnologías, como electrofisiología19, pinza de parche20 y técnicas optogenéticas; Sin embargo, no es adecuado para experimentos con estimulación de circuito cerrado21. Los métodos que utilizan los mismos parámetros de estímulo pueden no ser representativos de una convulsión espontánea natural, lo que significa que no son adecuados para el aprendizaje automático. En conclusión, este método de encendido eléctrico excluye la influencia del metabolismo del fármaco en el experimento y es accesible, estable, confiable y ampliamente aplicable a muchos estudios.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
La investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82030037, 81871009) y la Comisión Municipal de Salud de Beijing (11000022T000000444685). Agradecemos a TopEdit (www.topeditsci.com) por su asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG | invitrogen | A-21206 | |
| c-Fos antibody | ab222699 | ||
| Cranial drill | SANS | SA302 | |
| dental cement | NISSIN | ||
| EEG recording and stimulation equipment | Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd | NSHHFS-210803 | |
| lead-free tin wire | BAKON | ||
| Pin header/Female header | XIANMISI | spacing of 1.27 mm | |
| Silver wire | A-M systems | 786000 | |
| Slip ring | Senring Electronics Co.,Ltd | SNM008-04 | |
| Tungsten wire | A-M systems | 796000 | |
| ultrafine multi-stand wire | Shenzhen Chengxing wire and cable | UL10064-FEP | |
| welding equipment | BAKON | BK881 |
References
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