Het huidige protocol beschrijft een methode voor het injecteren van tekenembryo’s. Embryo-injectie is de voorkeurstechniek voor genetische manipulatie om transgene lijnen te genereren.
Teken kunnen verschillende virale, bacteriële en protozoaire pathogenen overbrengen en worden daarom beschouwd als vectoren van medisch en veterinair belang. Ondanks de groeiende last van door teken overgedragen ziekten, is het onderzoek naar teken achtergebleven bij insectenziektevectoren als gevolg van uitdagingen bij het toepassen van genetische transformatietools voor functionele studies op de unieke biologie van teken. Genetische interventies hebben aandacht gekregen om door muggen overgedragen ziekten te verminderen. De ontwikkeling van dergelijke interventies vereist echter een stabiele kiembaantransformatie door embryo’s te injecteren. Een dergelijke embryo-injectietechniek ontbreekt voor cheliceraten, waaronder teken. Verschillende factoren, zoals een externe dikke waslaag op tekenembryo’s, hard chorion en hoge intra-ovale druk, zijn enkele obstakels die eerder de ontwikkeling van embryo-injectieprotocollen bij teken verhinderden. Het huidige werk heeft deze obstakels overwonnen en een embryo-injectietechniek voor de zwartbenige teek, Ixodes scapularis, wordt hier beschreven. Deze techniek kan worden gebruikt om componenten, zoals CRISPR/Cas9, te leveren voor stabiele kiembaantransformaties.
Teken zijn vectoren van medisch en veterinair belang, die in staat zijn om een verscheidenheid aan virale, bacteriële, protozoaire pathogenen en nematoden over te brengen 1,2. In het oosten van de Verenigde Staten is de zwartpootteek Ixodes scapularis een belangrijke vector van de ziekte van Lyme (LD), de spirocheet Borrelia burgdorferi. Meer dan 400.000 gevallen van LD worden elk jaar gemeld in de Verenigde Staten, waardoor het de top vector-overgedragen infectieziekte in de VSis 1. Naast B. burgdorferi worden zes andere micro-organismen overgedragen door I. scapularis, waaronder vier bacteriën (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi en Ehrlichia muris eauclarensis), één protozoaire parasiet (Babesia microti) en één virus (Powassan-virus), waardoor deze tekensoort een belangrijk probleem voor de volksgezondheid is3 . Hoewel door teken overgedragen ziekten de afgelopen jaren vaker voorkomen, is onderzoek naar teken achtergebleven bij andere geleedpotige vectoren, zoals muggen, vanwege de unieke biologie van teken en uitdagingen in verband met het toepassen van genetische en functionele genomische hulpmiddelen 4,5.
Genbewerkingstechnieken, met name CRISPR/Cas9, hebben nu functionele genomicastudies mogelijk gemaakt in niet-modelorganismen. Voor het creëren van erfelijke mutaties in een organisme blijft embryo-injectie de voorkeursmethode voor het leveren van constructies voor het veranderen van de kiembaan 6,7,8,9. Tot voor kortwerden tekeneieren echter als te moeilijk of zelfs onmogelijk beschouwd om te injecteren zonder het embryote doden 10,11. Een dikke waslaag op eieren, hard chorion en hoge intra-ovale druk waren enkele van de belangrijkste obstakels die embryo-injectie bij teken verhinderden. Volwassen, met bloed gevoede I. scapularis zetten een enkele koppeling van maximaal 2.000 eieren12 af gedurende 3-4 weken (ongeveer 100 eieren / dag). Eieren worden afzonderlijk gelegd en elk ei is bedekt met was die wordt afgescheiden door uitsteeksels of “hoorns” van het klierorgaan van Gené 13,14,15 van de moeder. Deze was beschermt de eieren tegen uitdroging en bevat antimicrobiële stoffen15. Om tekeneieren met succes te injecteren, is het belangrijk om de waslaag te verwijderen, het chorion te verzachten en de eieren uit te drogen om de intraovaldruk te verlagen, zodat de injectie het ei niet onomkeerbaar beschadigt. Inzicht in het kritieke belang van embryo-injecties voor succesvolle kiembaantransformatie, wordt een protocol voor I. scapularis ontwikkeld, dat kan worden gebruikt om een CRISPR / Cas9-construct af te leveren en stabiele kiembaanmutaties te genereren4. Naast de bijdrage aan het I. scapularis-onderzoek zou dit protocol ook geoptimaliseerd kunnen worden voor andere tekensoorten.
Dit is het eerste protocol dat is ontwikkeld om vroege tekenembryo’s met succes te injecteren. Een overlevingspercentage van ~ 4% -8% is bereikt, wat vergelijkbaar is met embryo-injectie in andere gevestigde insectenmodellen5.
Aangezien dit het initiële protocol is, wordt verwacht dat dit protocol verder zal worden verfijnd en gespecialiseerd voor individuele tekensoorten. In het bijzonder zal de injectietiming variëren van soort tot soort, afhankelijk van embryogenes…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen Channa Aluvihare en Yonus Gebermicale, ITF, UMD, voor inzicht en ondersteuning tijdens de beginfase van protocolontwikkeling. Wolfraamnaalden waren een gulle gift van David O’Brochta, ITF, UMD. We zijn Dr. Ladislav Simo dankbaar voor het testen van dit protocol in I. ricinus en voor inzichtelijke discussies. Dit project werd gefinancierd door NIH-NIAID R21AI128393 en Plymouth Hill Foundation, NY naar MG-N, startup-fondsen van de Universiteit van Nevada tot AN, de National Science Foundation Grant No. 2019609 tot MG-N en AN, en een Peer-to-Peer Grant van IGTRCN tot AS.
Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |