Summary
本プロトコルは、ダニ胚を注入するための方法を記載する。胚注入は、トランスジェニック株を生成するための遺伝子操作のための好ましい技術である。
Abstract
ダニは、さまざまなウイルス性、細菌性、および原生動物の病原体を感染させる可能性があるため、医学的および獣医学的に重要なベクターと見なされます。ダニ媒介性疾患の負担が増大しているにもかかわらず、機能研究のための遺伝子形質転換ツールをダニのユニークな生物学に適用する際の課題のために、ダニに関する研究は昆虫病媒介動物に遅れをとっています。蚊が媒介する病気を減らすために遺伝的介入が注目を集めています。しかしながら、そのような介入の開発は、胚を注入することによる安定した生殖系列形質転換を必要とする。そのような胚注入技術は、ダニを含むキリセレートには欠けている。ダニ胚の外部の厚いワックス層、硬い絨毛膜、高い楕円形内圧などのいくつかの要因は、以前はダニの胚注入プロトコルの発達を妨げていたいくつかの障害です。本研究ではこれらの障害を克服し、クロマダニ Ixodes scapularis の胚注入技術について述べる。この手法は、安定した生殖細胞系列形質転換のためのCRISPR/Cas9などの成分を送達するために使用できます。
Introduction
ダニは医学的および獣医学的に重要なベクターであり、さまざまなウイルス性、細菌性、原生動物病原体および線虫を感染させることができます1,2。米国東部では、黒脚ダニ、Ixodes scapularisは、ライム病(LD)病原体であるスピロヘータボレリアブルグドルフェリの重要なベクターです。米国では毎年40万人以上のLDが報告されており、米国で最大のベクター媒介感染症となっています1。B. burgdorferiに加えて、4つの細菌(アナプラズマ食サイトフィルム、B. mayonii、B. miyamotoi、およびEhrlichia muris eauclarensis)、1つの原虫寄生虫(Babesia microti)、および1つのウイルス(Powassanウイルス)を含む6つの他の微生物がI.肩甲骨によって伝染し、このダニ種を主要な公衆衛生上の懸念事項にしています3。.ダニ媒介性疾患は近年より蔓延していますが、ダニの研究は、ダニの独特の生物学と遺伝的および機能的ゲノムツールの適用に関連する課題のために、蚊などの他の節足動物ベクターに遅れをとっています4,5。
遺伝子編集技術、特にCRISPR/Cas9により、非モデル生物での機能ゲノミクス研究が可能になりました。生物において遺伝性突然変異を作り出すために、胚注入は、生殖系列6、7、8、9を改変するための構築物を送達するための好ましい方法であり続ける。しかし、最近まで4、ダニの卵は胚を殺さずに注射することは難しすぎるか不可能でさえあると考えられていました10,11。卵の厚いワックス層、硬い絨毛膜、および高い楕円形内圧は、ダニへの胚注入を妨げる主な障害のいくつかでした。成体の、血液を与えられたI. scapularisは、3〜4週間で最大2,000個の卵12個の単一のクラッチを堆積させます(約100個の卵/日)。卵は単独で産まれ、各卵は母親の腺ジェネの器官13,14,15の突起または「角」によって分泌されるワックスでコーティングされています。このワックスは卵を乾燥から保護し、抗菌化合物を含んでいます15。ダニの卵をうまく注入するには、ワックス層を取り除き、絨毛膜を柔らかくし、卵を乾燥させて卵内圧を下げて、注射が卵を不可逆的に損傷しないようにすることが重要です。生殖系列の形質転換を成功させるための胚注射の決定的な重要性を理解し、肩甲骨菌のプロトコルが開発され、CRISPR/Cas9コンストラクトを送達し、安定した生殖系列変異を生成するために使用できます4。I. scapularis研究への貢献に加えて、このプロトコルは他のダニ種にも最適化される可能性があります。
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Protocol
Ixodes scapularis の成虫は、オクラホマ州立大学(OSU)から購入するか、ネバダ大学リノ校(UNR)で飼育されました(IACUCプロトコル#21-001-1118)。
1.胚採取のための雌ダニの準備
注: 適切な年齢の卵を集めるためには、産卵を同期させることが重要です。マダニの産卵の手がかりは不明であるが、標準的な昆虫条件(温度27°C、相対湿度>90%RH)では、 肩甲骨の雌は 宿主剥離後約8日で産卵を開始する。このタイムラインは、4°Cで十分なメスを保存することで長くすることができます。 採血された雌は、産卵に悪影響を及ぼさずに4°Cで最大8週間保存しました。これらの条件は、昆虫ごとに変更する必要があるかもしれません。
- マイクロインジェクションに使用されるまで、湿ったろ紙で裏打ちされた6クォートのプラスチックボックスに、4°Cで>90%RHで6°Cですべての雌を保管します。
- 注射の1週間前に、産卵の開始のために雌を4°Cから27°Cのインキュベーターに移します。
- 雌が産卵を開始したら(27°Cに移してから3〜4日後)、先端の細い絵筆を使用して卵を取り除き、ジェネの臓器(ワックス腺)の切除のために雌を準備します。
注:ジェネの器官は、胚盤と頭蓋骨の間の領域(口器の背側基部)から伸びており、口の部分は腹側の体表面(表面に平行)上で曲がり、拡張された遺伝子の器官は卵が産むとすぐに卵を覆います(図1)。ジェネの臓器除去またはワックスを空にする前に産まれた卵は、ワックスコーティングが施されており、注射には適していないため、廃棄する必要があります。 - ジェネの臓器を除去または空にするには、粘土を使用して、口の部分が腹側と背側の両方に見えるように向けられた顕微鏡下で、充血した女性をスライドガラスに配置します(図1B、C)。
- 以前に公開されたプロトコル16 に従って、タングステンワイヤーを使用して実験室で作られた細い鉗子とタングステン針を使用して、胚盤と口の部分の間の領域を正確に慎重に突く(針は市販品を購入し、マイクロ解剖プローブに取り付けることもできます、 材料の表を参照)。
- タングステン針で内側に向かって作業し、ワックス腺を引き出します(図1D、E)。腺を取り除くのに数分かかることがあります。ラボワイプを使用して、液体ワックスの分泌物を拭き取ります。
注:腺は、口の部分のすぐ下の腹側から取り外すこともできます。針と鉗子でスクトゥムに向かって後ろに手を伸ばすことによって。口の部分にシリコン接着剤を塗布すると、ジーンの臓器外転もブロックされ、ワックスを除去または空にする代わりに使用できます(フランス、INRAEのLadislav Simo博士との個人的なコミュニケーション)。充血したダニは両面テープにとどまりません。粘土を使用してダニを「くるむ」と、操作中にダニを所定の位置に保つのに役立ちます。鉗子を使用して、解剖のためにダニとタングステン針を保持します。腹側部分は針で穴を開けるのが簡単で、著者によって好まれています。
- 腺を空にするには、ステップ1.4で述べたように妊娠ダニを配置します。背側のマウスパーツの後ろの領域を慎重に穿刺し、鉗子を使用して腹側に圧力をかけます。
注意: あるいは、ワックス腺を取り外す必要はありません。ワックスの腺を空にすることは数日間続くでしょう。産卵雌は、ワックス腺の位置を示す口の部分の周りに白い領域があり、参照として使用できます。- 糸くずの出ないラボワイプの端を置き、穿刺部位から出てくる液体ワックスを取り除きます。わずかに黄色がかった粘性ワックスと比較して透明な液体である血リンパ分泌を避けるようにしてください。ほとんどのワックスが除去されるまで5〜10分かかる場合があります。
- 操作後、雌を27°C(>90%RH)のインキュベーターに入れ、1〜2日間回復させます。
注:治療を受けた女性は通常、回復して産卵を再開するのに1〜2日かかります。 - 雌が再び産卵を開始したら、細かい絵筆を使用して新たに産卵した卵(産卵後0〜18時間)を収集し、1.5mLの微量遠心チューブに入れます。
注:同じ女性の卵を長期間使用する場合、腺が除去されていない場合は、産卵の4〜5日後にこの手順を繰り返す必要があります。
2.マイクロインジェクションの胚治療
- 0〜18時間齢の卵が入ったチューブに、~200μL(または卵の数に応じて卵を覆うのに十分な量)の5%(重量/体積)塩化ベンザルコニウム/水( 材料の表を参照)を追加します。.卵がチューブの底に落ち着かないように、絵筆で卵を5分間静かに回転させます(詳細については、Sharmaら4を参照)。マイクロピペットを使用して上清を取り除き、卵をチューブに残します。
注意: 塩化ベンザルコニウムは皮膚や目に腐食性があり、手袋と目の保護具を着用してください。 - 卵の入ったチューブに蒸留(DI)水を~200μL加え、絵筆で渦巻き、マイクロピペットを使用してマイクロ遠心チューブから水を取り除きます。DI水でもう一度洗浄を繰り返します。
- 純水で洗浄した後、5%(w/v)塩化ナトリウム(NaCl)を~200μL加え、絵筆で5分間静かに旋回させます。5分後にチューブから溶液を取り出し、卵をDI水で2回洗浄します。
- 卵の入った微量遠心チューブに~100 μLの1%(w/v)NaCl溶液を加えます。卵が注射に使用されるまで、卵を1%(w / v)NaCl溶液に入れてください。
- 約1時間後にマイクロインジェクションを開始します。このタイムラインは、卵の適切な乾燥に役立ち、卵が破裂するのを防ぎます。
注:卵は、生存に大きな影響を与えることなく、1%(w / v)NaCl溶液に7〜8時間保持できます。卵が注入または破裂するのが難しい場合、卵は十分に乾燥されておらず、さらに5%(w / v)NaClでさらに5分間処理できます。
3.注射針の準備
- アルミノケイ酸塩キャピラリーガラス(フィラメント付き、 材料表を参照)を製造元の指示に従ってニードルプラーに挿入します。
- ニードルプラーを次の設定に調整します:熱:575、プル:20、速度:50、時間:200、および圧力:700。
- ニードルプラーのプル機能をアクティブにし、追加の針に対してこのプロセスを繰り返します。
- 引っ張った針は、きれいなペトリ皿にモデラーの粘土の線に刺して保管します。
- マイクロローダーチップを使用して注射混合物を針にロードします(材料の表を参照)。
注:ダニと蚊の胚注射に使用される針の比較を 図2に示します。
4. マイクロインジェクションのスライドセットアップ
- 両面テープを使用して、2つのガラス顕微鏡スライドを接着し、約0.5 cmの隙間を残して卵を整列させ、注射中に卵が横転するのを防ぎます(図3A)。
- スライド間の隙間にある両面テープに透明フィルムドレッシング( 材料表を参照)を貼ります。フィルムドレッシングを隙間に完全に合わせるようにしてください。
5.胚マイクロインジェクション
- 片毛の絵筆を使用して、スライドセットアップ(上)に一度に8〜10個の卵を揃えます。
注:スライドエッジに垂直な長軸(図3B)に整列した卵は、縦軸がエッジに平行に配置されている卵(図3C)よりも注入が容易です。垂直方向の卵(図3B)は注射に耐えることができ、生存率が向上します。 - 卵を揃えたスライドを複合顕微鏡のステージに置きます。糸くずの出ないワイプを使用して、それらが保存されている1%NaCl溶液を取り除きます。
- 充填された注射針をマイクロマニピュレーターに接続されたマイクロインジェクターに取り付けます( 材料表を参照)。
- マイクロインジェクターの高圧設定(>5,000hPa)を使用して、卵の表面に針をそっとこすりつけて針を開きます。
- 針を開いた後、針の開口部に応じてマイクロインジェクターの圧力(1,000〜2,500hPa)を下げます。
注意: 開口部が小さいほど比較的高い圧力が必要になり、開口部が大きいほど圧力が低くなります。これは、注入されるコンストラクトの体積を制御するためである。針の開口部のサイズに応じて、注入量は1〜5 pLの範囲で変化します。 - スライド上のすべての卵をできるだけ早く10°〜15°の角度で注入し、湿った紙で裏打ちされたペトリ皿でスライドをすぐに高湿度条件に移動します。卵が注入されるとすぐに、それらは乾燥し始めます。
注:一度に少数の卵を注入すると、注射の成功と生存確率が高まります。針は胚の逆流によって詰まります。先端がまだ鋭い場合は、詰まった針を取り除くために、スライドの端に追加された1%NaClの小さな液滴に針を移動します。毛細管現象は小さな詰まりを取り除きます。針がすでに鈍い場合は、交換してください。
6.胚の注射後のケア
- 注入された胚を含むスライドを、湿ったろ紙で裏打ちされた大きなペトリ皿に入れます。
注:少なくとも5〜6時間は卵を乱さないことが重要です。これにより、注射創を適切に密閉することができます。攪拌すると注射創が開き、細胞質がにじみ出て卵子が死亡することがあります。 - 5〜6時間後、注入された胚を付着させた透明フィルムドレッシングに少量のDI水を加える。絵筆を使用して、卵をそっと動かします。卵を小さなペトリ皿(10 cm)に移し、DI水に浸します。
注:フィルムドレッシングにより、注射後の卵子を簡単に除去できます。フィルムドレッシングに水滴を加えると、卵は水と一緒に動き始めます。 - 卵を水に沈めたまま、ペトリ皿を27°C、>90%RHのインキュベーター内の6クォートのプラスチック箱に入れます。
- 卵を定期的に、最初の数日間は毎日、その後幼虫が孵化し始めるまで3〜4日ごとにチェックします。
注意: マイクロインジェクション中に多数の卵が損傷した場合は、1週間後にDI水をそっと排水すると、死んだ卵の真菌の成長を防ぐことができます。 - 幼虫が注入された胚から孵化し始めたら(現在の実験室のセットアップでは注射後21〜25日)、それらを毎日チェックし、孵化した幼虫を上部にスクリーンを備えたガラスバイアルに移します。幼虫は水中で孵化し、~1〜2週間生存することができます。
- 卵に目に見える表現型をもたらす可能性のある構築物を注入した場合、幼虫4 をスクリーニングします。
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Representative Results
I. scapularisの成功した胚注入プロトコルは、この記事で説明されています。産卵雌は、部分的にワックスをかけた卵の乾燥を避けるために高湿度に保たれました。ワックス層を除去し、妊娠した雌の遺伝子器官(ワックス腺)を切除することによりダニ胚を注入した(図1A-E)。首の短いアルミノケイ酸塩ガラス針を使用しました(図2)。この形状は、昆虫卵注射に使用される長首(テーパー)針よりも圧力に耐えることができるため、ダニの卵の注入に理想的でした。ダニの卵の球形は、針の挿入中にスライドから卵が転がらないようにするために、舞台裏にスライドプラットフォーム(図3A)を必要とします。肩甲骨I.の初期の胚発生は不明であるため、生殖細胞形成のタイミングと場所も不明です。したがって、発育の早い段階(12〜18時間齢)に卵を注入することを選択し、卵の長軸をスライドの端に垂直に揃えると生存率が高くなることがわかりました(図3B、C)。このプロトコルを使用して、数千個の卵が注入されました。これらの注射された卵のうち、最大8.5%が生存し、幼虫が孵化した(表1)。処理されたが注射されていない卵ははるかに高い生存率(最大70%)を示し、注射の改善(タイミング、注射部位、または針のいずれかによる)が卵子の生存を改善する可能性があることを示唆しています。このプロトコルは、胚形成の初期(12〜18時間齢)に卵子を注入するために開発されました。ただし、これはNaClと塩化ベンザルコニウムによるより長い治療で10日齢までの卵に使用できます。
図1: 肩甲骨I.ジェ ネの臓器の操作 。 (A)遺伝子の臓器の図。上:胚盤の下の遺伝子の器官。下:エバート腺と口の部分が折りたたまれています。(B)粘土で固定された顕微鏡下の完全な女性。(C)メスは、産卵中に腹面で口の部分を動かして、ジーンの臓器を拡張します。黄色の矢印は白いパッチを示しており、Geneの臓器位置の参照として使用できます。これらの領域は、2〜3週間産卵する女性に見られます。(D,E)遺伝子の器官( D では小さな泡で Eでは伸びている)は、胚盤と頭蓋骨の間に見えます。ジェネのオルガンの角は、口の部分が下向きに曲がるにつれて伸びます(E)。青い矢印は、腺を取り除くためにタングステン針を挿入する位置を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ガラス注射針の形状比較。 真ん中のものはダニの胚に使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:注射のための卵の位置合わせ 。 (A)胚注射に使用されるスライドガラスのセットアップ。顕微鏡のスライドガラスを取り付け、両面テープを使用して隙間を残し、透明フィルムドレッシングをテープ上に置きます。卵はスライドの端に揃えられています。(B)スライドの端に垂直な長軸を持つ卵の最適な位置合わせ。(C)スライドセットアップの端に平行な長軸との卵の配置の効果が低い。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 挿入されたコンストラクト | 産卵後の時間 | 注入された卵の数 | 孵化した幼虫の数 | 生存率 |
| sgRNA + Cas9 | ≤12時間 | 2,396 | 147 | 6.14 |
| 遺伝子1 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12時間 | 3, 135 | 269 | 8.58 |
| 遺伝子2 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12時間 | 2, 460 | 139 | 5.65 |
| 遺伝子3 | ||||
| ボルバキア | ≥ 24時間(24-36時間) | 1, 765 | 72 | 4.08 |
| sgRNA + Cas9 | 48-60時 | 191 | 5 | 2.62 |
| 遺伝子2 |
表1: Ixodes scapularisにおける卵注入と幼虫の孵化の成功。
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Discussion
これは、初期のダニ胚をうまく注入するために開発された最初のプロトコルです。生存率は~4%-8%で、これは他の確立された昆虫モデルの胚注入に匹敵します5。
これは最初のプロトコルであるため、このプロトコルはさらに洗練され、個々のダニ種に特化することが期待されます。特に、注入のタイミングは、胚形成、特に細胞化のタイミングに応じて、種ごとに異なります。予備データは、 I. scapularis の卵が産卵後の最初の24時間で急速な核分裂を経ず、数日後に細胞化が起こることを示唆しています(未発表データ)。このプロトコルは、プラスミド送達4、CRISPRを介した遺伝子ノックアウト4、および細菌(ボルバキア)の送達にすでに使用されています(表1)。この胚注入プロトコルは、トランスジェニックダニを生成する機会を提供し、遺伝子ノックアウトおよびノックイン研究をあらゆる研究室で実行可能にすることが期待されています。これは、ダニの生物学とダニ-病原体-宿主のインターフェースを調査する研究を加速するために価値があることが証明されます。
プロトコル内の重要なステップ
このプロトコルは初期胚用に標準化されているため、産卵後24時間以内に卵子を収集することが重要です。この時間以降に卵を採取する場合、塩化ベンザルコニウムとNaClのより長い処理が必要であり、高齢の卵では生存率が低下します(表1)。絨毛膜は時間とともに硬化し、24時間以上経過した卵のマイクロインジェクションのための制御された乾燥を行うことを困難にします。処理された卵は1%NaCl溶液から除去されると急速に乾燥する傾向があるため、一度に注入する卵の数を減らすと生存に役立つことが注目されました。卵の乾燥が多すぎると死んでしまいますが、適切に乾燥させないとマイクロインジェクション中に破裂します。したがって、適切な乾燥時間を最適化することは、異なるダニ種または株に対して必要である。さらに、高湿度条件でのマイクロインジェクション後に卵を乱さないようにすることが重要です。
限界と今後の方向性
胚は脱ろうされると急速に乾燥する傾向があるため、スライド上で胚を揃えて注入するプロセスは迅速に行う必要があります。スピードと精度の急速な向上は、絶え間ない練習と忍耐によってのみ達成できます。今後の研究では、注射後の胚の生存率を改善し、生殖細胞形成のタイミングを特定し、遺伝性の突然変異を確実にすることに焦点を当てます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、プロトコル開発の初期段階における洞察と支援について、チャンナ・アルビヘアとヨヌス・ゲベルミカレ(ITF、UMD)を認めている。タングステン針は、ITF、UMDのデビッドオブロチタからの寛大な贈り物でした。I . ricinus でこのプロトコルをテストし、洞察に満ちた議論をしてくれたLadislav Simo博士に感謝します。このプロジェクトは、NIH-NIAID R21AI128393とニューヨーク州プリマスヒル財団からMG-N、ネバダ大学からANへのスタートアップ資金、MG-NとANへの国立科学財団助成金番号2019609、IGTRCNからASへのピアツーピア助成金によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
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