Summary
Denne protokollen beskriver en metode for injeksjon av flåttembryoer. Embryoinjeksjon er den foretrukne teknikken for genetisk manipulasjon for å generere transgene linjer.
Abstract
Flått kan overføre forskjellige virale, bakterielle og protozoiske patogener og betraktes derfor som vektorer av medisinsk og veterinær betydning. Til tross for den økende byrden av flåttbårne sykdommer, har forskning på flått ligget bak insektsykdomsvektorer på grunn av utfordringer med å anvende genetiske transformasjonsverktøy for funksjonelle studier til den unike biologien til flått. Genetiske inngrep har fått oppmerksomhet for å redusere myggbårne sykdommer. Utviklingen av slike inngrep krever imidlertid stabil kimlinjetransformasjon ved å injisere embryoer. En slik embryoinjeksjonsteknikk mangler for chelicerates, inkludert flått. Flere faktorer, for eksempel et eksternt tykt vokslag på flåttembryoer, hardkorion og høyt intra-ovalt trykk, er noen hindringer som tidligere forhindret embryoinjeksjonsprotokollutvikling i flått. Det foreliggende arbeidet har overvunnet disse hindringene, og en embryoinjeksjonsteknikk for svartbenet flått, Ixodes scapularis, er beskrevet her. Denne teknikken kan brukes til å levere komponenter, for eksempel CRISPR / Cas9, for stabile germline transformasjoner.
Introduction
Ticks er vektorer av medisinsk og veterinær betydning, som er i stand til å overføre en rekke virale, bakterielle, protozoiske patogener og nematoder 1,2. I det østlige USA er svartbenet kryss, Ixodes scapularis, en viktig vektor av Lyme-sykdommen (LD) patogen, spirochete Borrelia burgdorferi. Over 400 000 tilfeller av LD rapporteres hvert år i USA, noe som gjør den til den beste vektorbårne smittsomme sykdommen i USA1. I tillegg til B. burgdorferi overføres seks andre mikroorganismer av I. scapularis- inkludert fire bakterier (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi og Ehrlichia muris eauclarensis), en protozoa parasitt (Babesia microti) og ett virus (Powassan-virus), noe som gjør denne flåttarten til et stort folkehelseproblem3 . Mens flåttbårne sykdommer har blitt mer utbredt de siste årene, har forskning på flått falt bak andre leddyrvektorer, som mygg, på grunn av den unike biologien til flått og utfordringer forbundet med å anvende genetiske og funksjonelle genomiske verktøy 4,5.
Genredigeringsteknikker, spesielt CRISPR / Cas9, har nå gjort funksjonelle genomikkstudier gjennomførbare i ikke-modellorganismer. For å skape arvelige mutasjoner i en organisme, forblir embryoinjeksjon den foretrukne metoden for å levere konstruksjoner for å endre kimlinjen 6,7,8,9. Men inntil nylig4 ble flåttegg ansett som for vanskelig eller umulig å injisere uten å drepe embryoet10,11. Et tykt vokslag på egg, hardkorion og høyt intra-ovalt trykk var noen av de største hindringene som forhindret embryoinjeksjon i flått. Voksen, blodmatet I. scapularis deponerer en enkelt kobling på opptil 2000 egg12 over 3-4 uker (ca. 100 egg/dag). Egg legges enkeltvis, og hvert egg er belagt med voks som skilles ut ved fremspring eller "horn" av glandular Genés organ13,14,15 av moren. Denne voksen beskytter eggene mot uttørking og inneholder antimikrobielle forbindelser15. For å lykkes med å injisere kryssegg, er det viktig å fjerne vokslaget, myke korionen og tørke eggene for å redusere det intraovale trykket slik at injeksjonen ikke irreversibelt skader egget. For å forstå den kritiske betydningen av embryoinjeksjoner for vellykket germline-transformasjon, utvikles en protokoll for I. scapularis, som kan brukes til å levere en CRISPR / Cas9-konstruksjon og generere stabile germlinemutasjoner4. I tillegg til sitt bidrag til I. scapularis-forskning, kan denne protokollen også optimaliseres for andre flåttarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ixodes scapularis voksne ble enten kjøpt fra Oklahoma State University (OSU) eller oppdrettet ved University of Nevada, Reno (UNR) (IACUC protokoll # 21-001-1118).
1. Forberedelse av kvinnelige flått for embryoinnsamling
MERK: For å samle egg av passende alder, er det viktig å synkronisere egglegging. Selv om eggleggingssignaler i flått forblir uklare, begynner I. scapularis-hunnene å legge egg omtrent 8 dager etter vertsløsningen under standard insektforhold (27 ° C temperatur og >90% relativ fuktighet (RH)). Denne tidslinjen kan forlenges ved å lagre fylte hunner ved 4 °C. Vi har lagret blodfôrede hunner ved 4 °C i inntil 8 uker uten negativ effekt på eggleggingen. Disse forholdene må kanskje endres for hvert insekt.
- Oppbevar alle fylte hunner ved 4 °C med >90 % RF i en 6-liters plastboks foret med fuktig filterpapir til den brukes til mikroinjeksjoner.
- En uke før injeksjoner, overfør hunnene fra 4 °C til en 27 °C inkubator for oppstart av egglegging.
- Når hunnene begynner å legge egg (3-4 dager etter at de er flyttet til 27 °C), fjern eggene med en finspisset pensel og klargjør hunnene til Genés ablasjon av orgel (vokskjertel).
MERK: Genés organ strekker seg fra området mellom scutum og capitulum (dorsal base av munndelene), munndeler bøyes over den ventrale kroppsoverflaten (parallelt med overflaten), og det utvidede genets organ belegger egg så snart eggene er lagt (figur 1). Egg lagt før Genés organfjerning eller tømming av voks vil ha et voksbelegg og er ikke egnet for injeksjoner og må kastes. - For å enten fjerne eller tømme Genés orgel, bruk leire til å plassere den oppslukte kvinnen på et glassglass under et mikroskop orientert slik at munndelene er synlige på både ventrale og dorsale sider (figur 1B, C).
- Stikk forsiktig området nøyaktig mellom scutum og munndeler ved hjelp av fine tang og wolframnåler laget i laboratoriet ved hjelp av wolframtråd etter en tidligere publisert protokoll16 (nåler kan også kjøpes kommersielt og festes til en mikrodissekeringssonde, se materialtabell).
- Arbeid deg inn med wolframnålen, trekk vokskjertelen ut (figur 1D,E). Det kan ta flere minutter å fjerne kjertelen. Tørk bort eventuell flytende vokssekresjon ved hjelp av laboratorieservietter.
NOTAT: Kjertelen kan også fjernes fra ventralsiden rett under munndelene; ved å strekke seg i ryggen mot scutum med nål og tang. Påføring av silisiumlim rundt munndeler blokkerer også Genes organeversjon og kan brukes i stedet for å fjerne eller tømme voksen (personlig kommunikasjon med Dr. Ladislav Simo, INRAE, Frankrike). Engorged flått vil ikke holde seg på dobbeltsidig tape. Bruk av leire for å "svøpe" flåtten bidrar til å holde dem på plass under manipulering. Bruk tang for å holde flåtten og wolframnålen for disseksjon. Den ventrale delen er lettere å pierce med en nål og foretrukket av forfatterne.
- For å tømme kjertelen, ordne gravid kryss som nevnt i trinn 1.4. Punkter forsiktig området bak munndelene på dorsalsiden og trykk på ventralsiden ved hjelp av tang.
MERK: Alternativt er det ikke nødvendig å fjerne vokskjertelen; Tømming av vokskjertelen varer i flere dager. Eggleggende hunner har et hvitt område rundt munndelene som indikerer plasseringen av vokskjertelen og kan brukes som referanse.- Plasser kanten på en lofri laboratorieserviett og fjern den flytende voksen som kommer ut av punkteringsstedet. Sørg for å unngå hemolymfesekresjon, som er en klar væske sammenlignet med litt gulaktig viskøs voks. Det kan ta 5-10 min før det meste av voksen er fjernet.
- Etter manipulering, plasser kvinner i en inkubator ved 27 ° C (>90% RF) og la dem komme seg i 1-2 dager.
MERK: Behandlede kvinner tar vanligvis 1-2 dager å komme seg og begynne å legge egg igjen. - Når hunnene begynner å legge egg igjen, bruk en fin pensel til å samle nydeponerte egg (0-18 timer etter egglegging) og legg dem i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
MERK: Hvis du bruker egg fra samme kvinne over tid, må denne prosedyren gjentas etter 4-5 dager med egglegging hvis kjertlene ikke ble fjernet.
2. Embryobehandling for mikroinjeksjoner
- Tilsett ~200 μL (eller tilstrekkelig volum til å dekke eggene, avhengig av antall egg) på 5% (vekt / volum) benzalkoniumklorid / vann (se materialtabell) i røret som inneholder 0-18 timer gamle egg. Virvle eggene forsiktig med penselen i 5 minutter for å unngå at eggene legger seg i bunnen av røret (for detaljer, se Sharma et al.4). Fjern supernatanten ved hjelp av en mikropipette, og la eggene ligge igjen i røret.
FORSIKTIG: Benzalkoniumklorid er etsende for hud og øyne, bruk hansker og øyevern. - Tilsett ~ 200 μL destillert (DI) vann til røret som inneholder egg, virvle med en pensel og fjern vannet fra mikrosentrifugerøret ved hjelp av en mikropipette. Gjenta vasken med DI-vann en gang til.
- Etter vask med DI-vann, tilsett ~200 μL 5% (w / v) natriumklorid (NaCl) og virvle forsiktig med en pensel i 5 minutter. Fjern løsningen fra røret etter 5 minutter og vask eggene to ganger med DI-vann.
- Tilsett ~100 μL 1% (w/v) NaCl-oppløsning i mikrosentrifugerøret som inneholder egg. Oppbevar eggene i 1 % NaCl-oppløsning til de brukes til injeksjonsvæsker.
- Start mikroinjeksjoner etter omtrent en time. Denne tidslinjen hjelper til med riktig uttørking av eggene og forhindrer dem i å sprekke.
MERK: Egg kan oppbevares i 1% (w / v) NaCl-løsning i 7-8 timer uten å påvirke overlevelsen betydelig. Hvis eggene er vanskelige å injisere eller sprekke, blir eggene ikke uttørket nok og kan behandles videre med 5% (w / v) NaCl i ytterligere 5 minutter.
3. Tilberedning av kanyler
- Sett inn et aluminosilikat kapillærglass (med filament, se materialtabell) i nåletrekkeren i henhold til produsentens instruksjoner.
- Juster nåletrekkeren til følgende innstillinger: Varme: 575, Trekk: 20, Hastighet: 50, tid: 200 og Trykk: 700.
- Aktiver trekkfunksjonen til nåletrekkeren og gjenta prosessen for ytterligere nåler.
- Oppbevar de trukket nålene ved å stikke dem inn i linjer med modellerers leire i en ren petriskål.
- Legg kanylen sammen med injeksjonsblandingen ved hjelp av en mikrolasterspiss (se Materialtabell).
MERK: Sammenligningen av nåler som brukes til flått- og myggembryoinjeksjon er vist i figur 2.
4. Skyv oppsett for microinjections
- Ved hjelp av dobbeltsidig tape fester du to glassmikroskopglass sammen, og etterlater et gap på ca. 0,5 cm for å støtte justering av egg og forhindre at de ruller over under injeksjoner (figur 3A).
- Påfør et stykke gjennomsiktig filmdressing (se Materialtabell) på dobbeltsidig tape i gapet mellom lysbildene. Sørg for å justere filmdressingen perfekt med gapet.
5. Mikroinjeksjoner av embryoer
- Juster 8-10 egg om gangen på lysbildeoppsettet (over) ved hjelp av en enhåret pensel.
MERK: Egg justert med den lengre aksen vinkelrett (figur 3B) på glidekanten er lettere å injisere enn egg hvis lengdeakse er justert parallelt med kanten (figur 3C). Egg i vinkelrett retning (figur 3B) tåler injeksjon bedre, noe som gir høyere overlevelse. - Plasser lysbildet med justerte egg på scenen av et sammensatt mikroskop. Bruk en lofri klut for å fjerne 1% NaCl-løsningen de er lagret i.
- Fest den fylte kanylen til en mikroinjektor koblet til en mikromanipulator (se Materialtabell).
- Åpne nålen ved å gni den forsiktig mot eggoverflaten ved hjelp av en høytrykksinnstilling på mikroinjektoren (>5000 hPa).
- Etter at nålen er åpnet, reduser trykket (1,000-2,500 hPa) av mikroinjektoren avhengig av åpningen av nålen.
MERK: En liten åpning vil kreve relativt høyere trykk, mens en større åpning vil kreve et lavere trykk. Dette er for å kontrollere volumet av konstruksjonen som injiseres. Avhengig av størrelsen på kanyleåpningen vil injeksjonsvolumet variere fra 1-5 pL. - Injiser alle eggene på lysbildet i en vinkel på 10°-15° så raskt som mulig, og flytt lysbildet umiddelbart til forhold med høy luftfuktighet i en petriskål foret med fuktig papir. Så snart eggene er injisert, begynner de å tørke ut.
MERK: Injisering av et lite antall egg om gangen øker injeksjonssuksessen og overlevelsessannsynligheten. Nåler blir tilstoppet av embryo refluks. Hvis spissen fortsatt er skarp, for å fjerne tilstoppede nåler, flytt nålen til en liten dråpe på 1% NaCl lagt til kanten av lysbildet. Kapillærvirkningen vil løsne den lille treskoen. Hvis nålen allerede er stump, bytt den.
6. Pleie av embryoer etter injeksjon
- Plasser lysbildet som inneholder injiserte embryoer i en stor petriskål foret med fuktig filterpapir.
MERK: Det er viktig å ikke forstyrre eggene i minst 5-6 timer. Dette gjør at injeksjonssåret kan forsegles ordentlig. Injeksjonssåret kan åpne seg når det blir omrørt, og cytoplasma kan begynne å ose ut, noe som resulterer i eggdødelighet. - Etter 5-6 timer, legg til en liten dråpe DI-vann til den gjennomsiktige filmdressingen med injiserte embryoer festet. Bruk en pensel til å forskyve eggene forsiktig. Overfør eggene til en liten petriskål (10 cm) og senk dem ned i DI-vann.
MERK: Filmdressingen gjør det enkelt å fjerne egg etter injeksjoner. I det øyeblikket en vanndråpe legges til filmdressingen, vil eggene begynne å bevege seg sammen med vannet. - Hold eggene nedsenket i vann og legg petriskålen i en 6-liters plastboks i en inkubator ved 27 °C og >90 % RF.
- Sjekk eggene regelmessig, daglig de første dagene, og deretter hver 3-4 dag til larvene begynner å klekkes.
MERK: Hvis et stort antall egg blir skadet under mikroinjeksjoner, vil forsiktig drenering av DI-vannet etter en uke forhindre soppvekst på de døde eggene. - Når larvene begynner å klekkes fra de injiserte embryoene (21-25 dager etter injeksjon for det nåværende laboratorieoppsettet), kontroller dem daglig og overfør eventuelle klekkede larver til glassflasker med en skjerm på toppen. Larver kan klekkes under vann og overleve i ~ 1-2 uker.
- Screen larvene4 hvis eggene ble injisert med en konstruksjon som kan resultere i en synlig fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket embryoinjeksjonsprotokoll for I. scapularis er beskrevet i denne artikkelen. Eggleggende hunner ble holdt ved høy luftfuktighet for å unngå uttørking av delvis voksede egg. Vokslaget ble fjernet for å injisere flåttembryoer ved å forkaste genets organ (vokskjertel) hos den gravide kvinnen (figur 1A-E). Vi brukte aluminiuminosilikatglassnåler med kortere hals (figur 2). Denne formen var ideell for flåttegginjeksjon, da den kunne tåle trykket bedre enn den langhalsede (koniske) nålen som ble brukt til insektegginjeksjoner. Den sfæriske formen på flåttegg krever en glideplattform backstage (figur 3A) for å unngå å rulle egget av lysbildet under nålestikk. Den tidlige embryonale utviklingen av I. scapularis er ukjent, så tidspunktet og plasseringen av kimcelledannelse er også ukjent. Vi valgte derfor å injisere egg tidlig i utviklingen (12-18 timer gamle) og fant at justering av eggets lengre akse vinkelrett på skredkanten gir høyere overlevelse (figur 3B,C). Ved hjelp av denne protokollen ble flere tusen egg injisert. Av disse injiserte eggene overlevde opptil 8,5%, og larver klekket (tabell 1). Behandlede, men uinjiserte egg hadde en mye høyere overlevelse (opptil 70%), noe som tyder på forbedring i injeksjoner (enten ved timing, injeksjonssted eller nål) kan forbedre eggoverlevelsen. Denne protokollen ble utviklet for å injisere egg tidlig i embryogenesen (12-18 timer gammel); Dette kan imidlertid brukes til egg opptil 10 dager gamle med lengre behandling med NaCl og benzalkoniumklorid.
Figur 1: Manipulering av I. scapularis Genés organ. (A) Diagram over Genes organ. Øverst: Genets organ under scutum. Bunn: everted kjertel og munndeler brettet ned. (B) En fylt kvinne under mikroskopet sikret av leire. (C) En kvinne beveger munndelene på den ventrale overflaten under egglegging for å forlenge Genes organ. Gule piler viser hvite flekker og kan brukes som referanse for Genes organplassering. Disse områdene er synlige hos kvinner som legger egg i 2-3 uker. (D,E) Genets organ (en liten boble i D og utvidet i E) er synlig mellom scutum og capitulum. Hornene på Genés orgel strekker seg når munndelene bøyes nedover (E). Den blå pilen viser stedet for å sette inn en Wolframnål for å fjerne kjertelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammenligning av formen på glassinjeksjonsnåler. Den midterste brukes til kryssembryoer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eggjustering for injeksjoner . (A) Oppsett av glassglass som brukes til embryoinjeksjoner. Mikroskopglassglass er festet, og etterlater et gap ved hjelp av dobbeltsidig tape, og den gjennomsiktige filmdressingen er plassert på båndet. Eggene er justert på kanten av lysbildet. (B) Optimal justering av egg med en lang akse vinkelrett på kanten av lysbildet. (C) Mindre effektiv justering av egg med den lange aksen parallelt med kanten av lysbildeoppsettet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Konstruer injisert | Tid etter egglegging | Antall egg injisert | Antall larver klekket | Overlevelsesprosent |
| sgRNA + Cas9 | ≤12 timer | 2,396 | 147 | 6.14 |
| Gen 1 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 timer | 3, 135 | 269 | 8.58 |
| Gen 2 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 timer | 2, 460 | 139 | 5.65 |
| Gen 3 | ||||
| Wolbachia | ≥ 24 timer (24–36 timer) | 1, 765 | 72 | 4.08 |
| sgRNA + Cas9 | 48-60 timer | 191 | 5 | 2.62 |
| Gen 2 |
Tabell 1: Vellykket egginjeksjon og larveklekking i Ixodes scapularis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette er den første protokollen utviklet for å injisere tidlige flåttembryoer vellykket. En overlevelsesrate på ~ 4% -8% er oppnådd, noe som kan sammenlignes med embryoinjeksjon i andre veletablerte insektmodeller5.
Siden dette er den første protokollen, forventes det at denne protokollen vil bli ytterligere raffinert og spesialisert til individuelle flåttarter. Spesielt vil injeksjonstidspunktet variere fra art til art, avhengig av embryogenese, spesielt tidspunktet for cellularisering. De foreløpige dataene tyder på at I. scapularis-egg ikke går gjennom rask kjernefysisk deling i de første 24 timene etter legging og cellularisering skjer noen dager senere (upubliserte data). Vi har allerede brukt denne protokollen for plasmidlevering 4, CRISPR-mediert gen knockout4 og levering av bakterier (Wolbachia) (tabell 1). Det forventes at denne embryoinjeksjonsprotokollen vil gi muligheter til å generere transgene flått og vil gjøre gen knockout og knock-in studier gjennomførbare i ethvert laboratorium. Dette vil vise seg verdifullt for å akselerere studier som utforsker flåttbiologi og krysspatogen-vert-grensesnitt.
Kritiske trinn i protokollen
Det er viktig å samle egg innen 24 timer etter legging fordi denne protokollen er standardisert for tidlige embryoer. Dersom egg samles inn etter dette tidspunktet, er det nødvendig med en lengre behandling av benzalkoniumklorid og NaCl, og overlevelsen er lavere hos eldre egg (tab 1). Korionen herdes over tid, noe som gjør det vanskelig å gjøre kontrollert uttørking for mikroinjeksjoner i egg eldre enn 24 timer. Det ble lagt merke til at injeksjon av færre egg om gangen hjelper med overlevelse fordi de behandlede eggene har en tendens til å tørke ut raskt når de fjernes fra 1% NaCl-løsningen. Hvis eggene tørker ut for mye, vil de dø, men de vil sprekke under mikroinjeksjon hvis de ikke tørkes ut på riktig måte. Derfor er optimalisering av riktig uttørkingstid nødvendig for forskjellige flåttarter eller stammer. Videre er det viktig å holde eggene uforstyrret etter mikroinjeksjoner under høy luftfuktighet.
Begrensninger og fremtidige retninger
Når embryoene er devokst, har de en tendens til å tørke ut raskt, så prosessen med å justere dem på lysbildet og injisere dem må utføres raskt. Den raske forbedringen i hastighet og nøyaktighet kan bare oppnås gjennom konstant praksis og tålmodighet. Vårt fremtidige arbeid vil være fokusert på å forbedre overlevelsesprosenten av embryoer etter injeksjon og identifisere tidspunktet for kimcelledannelse for å sikre arvelige mutasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Channa Aluvihare og Yonus Gebermicale, ITF, UMD, for innsikt og støtte i den innledende fasen av protokollutviklingen. Wolframnåler var en sjenerøs gave fra David O'Brochta, ITF, UMD. Vi er takknemlige til Dr. Ladislav Simo for å teste denne protokollen i I. ricinus og for innsiktsfulle diskusjoner. Dette prosjektet ble finansiert av NIH-NIAID R21AI128393 og Plymouth Hill Foundation, NY til MG-N, oppstartsmidler fra University of Nevada til AN, National Science Foundation Grant No. 2019609 til MG-N og AN, og et Peer-to-Peer Grant fra IGTRCN til AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
